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PRACTICA N 10
Docente:
Auxiliar:
Nombre:
Potos - Bolivia
VISITA AL CENTRO DE INVESTIGACIN DE MINERA AMBIENTAL CIMA-JIKA
- OBJETIVOS:
Aprender y observar sobre los equipos utilizados en el centro de investigacin CIMA-JICA.
- FUNDAMENTO TERICO:
CROMATOGRAFIA DE GASES:
Existen dos tipos de cromatografa de gases: la cromatografa gas-liquido (CGL) y la cromatografa gassolido (CGS). La primera tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia; su denominacin se
suele abreviar a cromatografa de gases (CG).1 La segunda se basa en una fase estacionaria slida en
que la retencin de los analitos ocurre porque hay adsorcin. Su aplicacin es limitada debido a la
retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elucin con
colas muy notables. La formacin de las colas es resultado de la naturaleza no lineal del proceso de
adsorcin. Por tanto, esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de
ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.
En la cromatografa gas-liquido el analito se divide entre una fase mvil gaseosa y una fase liquida
inmovilizada sobre la superficie de un relleno solido inerte o en las paredes de un tubo capilar. El
concepto de cromatografa gas-liquido fue enunciado por primera vez en 1941 por Martin y Singer,
quienes tambin perfeccionaron la cromatografa de distribucin liquido-liquido.
Sin embargo, tuvo que pasar ms de una dcada antes de que la importancia de la cromatografa gas
lquido se demostrara en forma experimental2 y la tcnica se empezara a utilizar en forma rutinaria como
herramienta de laboratorio. En 1955 apareci en el mercado el primer aparato comercial para
cromatografa gas-liquido. Desde entonces, sus aplicaciones han crecido de una forma espectacular. En
la actualidad hay casi un milln de cromatgrafos en todo el mundo.
INSTRUMENTOS PARA LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO
Los instrumentos de cromatografa de gases que han aparecido en el mercado presentan muchos
cambios y mejoras desde su introduccin en el comercio. En los aos setenta se volvieron comunes los
integradores electrnicos y los equipos para procesar datos apoyados en una computadora. Los aos
ochenta vieron como las computadoras se utilizaban para el control automtico de la mayora de los
parmetros instrumentales, como la temperatura de la columna, las tasas de flujo y la inyeccin de la
muestra; el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a un precio moderado y, tal vez lo ms
importante, de las columnas abiertas capaces de separar los componentes de mezclas complejas en un
tiempo relativamente corto. En la actualidad, ms de 50 fabricantes de instrumentos ofrecen varios
cientos de modelos de equipo para cromatografa de gases a precios que varan de casi 1000 a ms de
50 000 dlares. Los componentes bsicos de un instrumento caracterstico para cromatografa de gases
se muestran en la figura:
Cuando se aprieta una pera de goma que contiene una solucin acuosa de jabn o detergente se forma
una pelcula de jabn en el camino del gas; a continuacin se mide el tiempo necesario para que esta
pelcula se desplace entre dos divisiones de la bureta y se calcula entonces el flujo volumtrico. Muchos
Cromatgrafos de gases modernos controlados mediante computadora estn equipados con medidores
de flujo electrnicos que se pueden regular para mantener el flujo en un nivel deseado.
Sistema de inyeccin de la muestra
Con el fin de tener una alta eficiencia de la columna se requiere que la muestra sea de un tamao
adecuado y que se introduzca como un tapn de vapor; la inyeccin lenta o muestras demasiado
grandes causan dispersin de las bandas y una mala resolucin. Las micro jeringas calibradas, como las
que se ilustran en la figura:
Se utilizan para inyectar muestras liquidas, a travs de un diafragma de goma de silicn, en una cmara
caliente especial para la muestra que se ubica en la cabeza de la columna. La cmara de la muestra est
casi siempre a unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
En el caso de las columnas analticas rellenas ordinarias, el tamao de la muestra vara desde unas
pocas dcimas de micro litro a 20 L. Las columnas capilares requieren muestras menores por un factor
de 100 o mas. En estos casos se emplea un sistema divisor de la muestra que permite entregar una
pequea fraccin conocida (1:50 a 1:500) de la muestra inyectada y el resto se desecha. Los
cromatgrafos de gases comerciales con columnas capilares estn equipados con dichos divisores;
tambin permiten la inyeccin sin divisin para mejorar la sensibilidad o para usarse con columnas
empacadas. En el caso de entradas sin divisin, la vlvula de purga cierra la inyeccin y permanece
cerrada de 30 a 60 segundos. Durante este tiempo, el vapor de la muestra solo puede avanzar por la
columna. Al abrirse la vlvula de purga, cualquier vapor remanente sale con rapidez. En la cromatografa
de gases con capilares tambin hay inyectores en la columna, con las cuales la muestra entera se
inyecta en la columna como lquido que luego se vaporiza al programar la temperatura de la columna o
de la entrada. En este caso, el analito se separa del solvente por efectos trmicos y del mismo solvente.
Sistemas de deteccin
Durante las separaciones mediante cromatografa de gases se han investigado y utilizado docenas de
detectores. A continuacin se describen primero las caractersticas ideales del detector para la
cromatografa de gases y luego se analizan los sistemas de deteccin ms utilizados. En algunos casos
los cromatgrafos de gases se acoplan a instrumentos espectroscpicos como los de infrarrojo. En este
caso, el dispositivo espectro mtrico sirve no solo para detectar la aparicin de los analitos, sino tambin
para identificarlos.
Caractersticas del detector ideal
El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientes caractersticas:
1. Sensibilidad adecuada. Justo lo que constituye una adecuada sensibilidad no puede evaluarse de
forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los electores que se describen en esta seccin
difieren por un factor de 107. Aunque todos se utilizan extensamente y son satisfactorios en ciertos
casos, los menos sensibles no son adecuados para algunas aplicaciones. En general, las sensibilidades
de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10_8 a 10_15 g de soluto/s.
2. Buena estabilidad y reproductibilidad.
3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios ordenes de magnitud.
4. Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400C.
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo.
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debera estar a prueba de la impericia de operadores
inexpertos, si es posible.
7. Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una respuesta selectiva y altamente
predecible para uno o ms tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra.
Por desgracia, no hay un detector que rena todas estas caractersticas. Algunos de los detectores ms
comunes son los que se mencionan en la tabla.
inerte; 4) caractersticas de solvente tales que los valores de k y . de los solutos por resolver estn
dentro de un intervalo satisfactorio.
El tiempo de retencin de un analito en una columna depende de su constante de distribucin, que a su
vez est relacionada con la naturaleza qumica de la fase estacionaria liquida. Para separar diversos
componentes de la muestra, sus constantes de distribucin tienen que ser muy diferentes para poder
lograr una separacin clara. Al mismo tiempo, estas constantes no tienen que ser ni muy grandes ni muy
pequeas porque las constantes de distribucin grandes ocasionan tiempos de retencin muy largos y las
pequeas dan como resultado tiempos de retencin tan cortos que las separaciones son incompletas.
Para que un analito tenga un tiempo de residencia razonable en la columna, debe presentar cierto grado
de compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria. Aqu se aplica el principio de lo semejante
disuelve a lo semejante, donde semejante se refiere a las polaridades del analito y del lquido
inmovilizado. La polaridad de una molcula, segn la indica su momento dipolar, es una medida del
campo elctrico producido por la separacin de carga dentro de ella. Las fases estacionarias polares
contienen grupos funcionales, como CN, CO y OH. Las fases estacionarias del tipo de los
hidrocarburos y dialquilsiloxanos son no polares y las fases polister son muy polares. Entre los analitos
polares estn: alcoholes, cidos y aminas; entre los solutos de polaridad intermedia estn teres, cetonas
y aldehdos. Los hidrocarburos saturados son no polares. Por lo general, la polaridad de la fase
estacionaria debe corresponder con la de los componentes de la muestra. Cuando la correspondencia es
buena, el orden de elucin est determinado por el punto de ebullicin de los fluyentes.
Clasificacin de fases estacionarias
Se han publicado muchos esquemas diferentes para clasificar las fases estacionarias y as simplificar su
eleccin. La mayora de ellos se basa en sondas de soluto que prueban interacciones especificas entre el
soluto y la fase liquida al medir las caractersticas de retencin del soluto. Dos de las clasificaciones ms
importantes se basan en las investigaciones de Rohrschneider y McReynolds.10 El resultado fue la
elaboracin de listas de fases estacionarias y las clases de compuestos que puede separar cada una. De
manera similar, los valores numricos, conocidos como constantes de Reynolds, estn disponibles para
que el usuario tenga una gua al seleccionar la fase estacionaria para separar analitos que tienen
distintos grupos funcionales, como alcoholes de aldehdos o cetonas.
tendencia importante en este campo ha sido en la direccion de combinar las notables cualidades para la
separacin que tiene la GC con las mejores propiedades de identificacin que poseen instrumentos como
los espectrmetros de masas, de infrarrojo y de resonancia magntica nuclear.
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS:
En el inicio de la cromatografa de liquidos (LC), esta se llevaba a cabo en columnas de vidrio con
dimetros de 10 a 50 mm. Las longitudes rellenas de la columna eran de 50 a 500 cm de particulas
solidas cubiertas con un liquido adsorbido que formaba la fase estacionaria. Para asegurar tasas de flujo
razonables a traves de este tipo de fase estacionaria, las dimensiones de las partculas solidas se
mantenia en mas de 150 a 200 m. Incluso asi, las tasas de flujo eran bajas, de un maximo de una pocas
decimas de mililitro por minuto. Por consiguiente, los tiempos de separacin eran largos, a menudo de
varias horas. Los intentos para acelerar el procedimiento clasico mediante la aplicacin de vacio o por
bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento en la tasa de flujo originaba un aumento de la
altura de plato por encima del minimo caracteristico que se observa en las graficas de altura de plato
contra tasa de flujo y el resultado era una menor eficiencia.
En las primeras etapas de desarrollo de la cromatografa de liquidos, los cientificos se dieron cuenta de
que podian conseguir aumentar en forma notable la eficiencia de la columna al disminuir el tamano de las
partculas del empaque. Sin embargo, fue apenas a finales de los anos sesenta cuando se perfecciono la
tecnica adecuada para producir y utilizar empaques de tamano de particula tan pequenos como del orden
de 3 a 10 m. Esta tecnica requeria instrumentos complejos para poder trabajar a altas presiones, lo que
contrasta de manera notable con las sencillas columnas de vidrio de la cromatografa de liquidos clasica
cuyo flujo se debia a la gravedad. Para diferenciar estos procedimientos mas nuevos de los metodos
originales de flujo por gravedad se empleo en un principio la denominacin de cromatografa de liquidos
de alta resolucion (HPLC, por sus siglas en ingles). En la actualidad, toda la cromatografa de liquidos se
efectua con flujo presurizado y se utilizan las siglas LC o HPLC sin distincin.
CAMPO DE APLICACION DE LA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION
La cromatografa de liquidos es la tecnica analitica de separacin mas ampliamente utilizada. Las
razones de su popularidad son su sensibilidad, su facil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volatiles o termolabiles,
pero sobre todo, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos
campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales son
aminoacidos, proteinas, acidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, farmacos, terpenoides,
plaguicidas, antibioticos, esteroides, especies organometalicas y una variedad de sustancias inorganicas.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA EN LA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
El analisis del ensanchamiento de banda se aplica en general a la cromatografa de liquidos. En esta
seccin se ilustra el importante efecto del tamano de las particulas del relleno que forma la fase
estacionaria y se describen otras dos causas de la dispersin de zona, que a veces son de importancia
notable en la cromatografa de liquidos.
INSTRUMENTOS PARA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
Con el objetivo de alcanzar flujos razonables con rellenos de tamano de particula de entre 3 y 10 m, que
por otra parte son comunes en la cromatografa de liquidos moderna, se requieren presiones de bombeo
de varios cientos de atmosferas. Debido a estas presiones elevadas, el equipo necesario para la
cromatografa de liquidos de alta resolucion tiende a ser mas complejo y caro que el que se utiliza en
otros tipos de cromatografa. En la figura se muestra un esquema de los componentes fundamentales de
un cromatgrafo de liquidos caracteristico.
Sistemas de bombeo
Entre los requisitos para las bombas en cromatografa de liquidos esta 1) la generacion de presiones de
hasta 6000 psi (lb/in.2) o 414 bares, 2) salida libre de pulsos, 3) tasas de flujo de 0.1 a 10mL/min, 4)
reproducibilidad del flujo de 0.5% relativo o mejor y 5) componentes resistentes a la corrosion a causa de
la diversidad de solventes. Debe subrayarse que las presiones elevadas que generan las bombas de
cromatografa de liquidos no constituyen un riesgo de explosion, porque los liquidos no son muy
compresibles. Por tanto, la rotura de un componente del sistema solo supone una perdida de solvente. Lo
que si es evidente es que esta puede representar un riesgo de incendio o de contaminacion del ambiente.
Sistemas de inyeccin de muestra
A menudo, el factor limitante en la precision de las mediciones en cromatografa de liquidos es la
reproductibilidad con que se pueden introducir las muestras en el relleno de la columna. El problema se
acentua por el ensanchamiento de banda que acompana al tapon o sobrecarga de inyeccin. Por
consiguiente, los volmenes de muestra que se emplean tienen que ser muy pequenos, de unas pocas
decimas de microlitro hasta quiz unos 500 L. Adems, lo apropiado es introducir la muestra sin
despresurizar el sistema. El medio que mas se usa para la introduccin de las muestras en la
cromatografa de liquidos se basa en los rizos de muestreo, como el que se ilustra en la figura.
Con frecuencia, estos dispositivos forman parte del equipo cromatografico y hay rizos intercambiables
que permiten la eleccion de tamanos de muestra desde 1 hasta 100 L o mas. Con rizos de este tipo se
puede introducir la muestra a presiones de hasta 7000 psi con una desviacion estandar relativa de unas
decimas porcentuales.
La mayor parte de los cromatgrafos actuales se venden con autoinyectores. Dichas unidades tienen la
capacidad de inyectar muestras en el cromatgrafo de liquidos a partir de frascos que estn en un
carrusel o desde placas microtituladoras. Por lo regular, contienen rizos de muestreo y una bomba de
jeringa para inyectar volumenes desde menos de 1 L hasta mas de 1 mL. Algunos poseen medios
controlados por temperatura que facilitan el almacenamiento de la muestra y efectan reacciones de
derivacion antes inyectarla. La mayor parte de los equipos se puede programar para facilitar las
inyecciones automaticas en el sistema de cromatografa de liquidos.
Tipos de rellenos de la columna
En cromatografa de liquidos se utilizan dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y de particula porosa. Las
partculas peliculares originales eran cuentas esfericas de vidrio o de polimero no porosas cuyos
dimetros caracteristicos eran de 30 a 40 m. En la superficie de estas se depositaba una fina capa
porosa de slice, de alumina o de una resina sintetica de poliestireno-divinilbenceno, o bien, una resina de
intercambio ionico. Las microparticulas porosas reemplazaron por completo a las particulas peliculares.
En los anos recientes se han reintroducido rellenos peliculares de (_5 m) para separar proteinas y
biomoleculas grandes.
Los rellenos de particulas porosas caracteristicos para cromatografa de liquidos estn formados por
microparticulas porosas cuyos dimetros varan entre 3 y 10 m; para un tamano de particula dado es
deseable tener una distribucin muy estrecha de dimensiones de particula. Las particulas son de slice,
alumina, de una resina sintetica de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio ionico. La slice
es el material de relleno mas comn en cromatografa de liquidos; las particulas se preparan aglutinando
particulas de slice de dimensiones inferiores al micrmetro en condiciones tales que se forman particulas
mayores con dimetros muy uniformes. Las particulas que resultan se recubren muchas veces con
peliculas organicas que se unen quimica o fisicamente a la superficie.
Detectores
No hay detectores para cromatografa de liquidos tan universalmente aplicables como los detectores de
ionizacin por llama y de conductividad termica para cromatografa de gases. Los detectores de
cromatografa de gases fueron especificamente perfeccionados para medir pequeas concentraciones de
analitos en flujos de gas. Por otro lado, los detectores de cromatografa de liquidos han sido instrumentos
analiticos tradicionales adaptados con celdas de flujo para medir concentraciones bajas de solutos en
flujos de liquidos. El problema principal en el mejoramiento de la cromatografa de liquidos es la
adaptacion y perfeccionamiento de dichos dispositivos.
Tipos de detectores
Los detectores para cromatografa de liquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una
propiedad de la solucion son sensibles a una propiedad de la fase mvil, como el indice de refraccion, la
constante dielectrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En cambio, los
detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades de este ultimo,
como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusion, que no son inherentes a la fase
mvil.
En la tabla se mencionan los detectores de uso mas comn en cromatografa de liquidos de alta
resolucin y algunas de sus propiedades mas importantes. Los detectores mas ampliamente usados se
apoyan en la absorcion de radiacion UV o visible. Los detectores de fluorescencia, indice de refraccion y
electroquimicos tambin son muy utilizados. Los detectores de espectrometria de masas tienen gran
aceptacion en la actualidad. Sistemas como los de cromatografa de liquidos-espectrometria de masas
representan una gran ayuda para identificar los analitos que salen de una columna HPLC.
- Observaciones y notas:
El Centro de Investigacin de Minera Ambiental (CIMA), con sede en Potos.
CIMA se inici como proyecto con el apoyo de la Agencia Internacional de Cooperacin del Japn (JICA)
a partir de 2002. El director de la Agencia de Cooperacin Internacional del Japn, Hirofumi Matsuyama.
Actualmente, la institucin brinda servicios como el anlisis de aguas, de minerales, de suelos, de sedimentos, y ms.
CDD-10Avp Detector de Conductividad venta Sistema Shimadzu VP Series HPLC
Caractersticas CDD-10Avp
Bajo nivel de ruido, baja deriva y amplio rango dinmico asegurar el funcionamiento de la serie VP HPLC
Shimadzu probados. Los datos adquiridos por el CDD-10AVP se transfiere al controlador del sistema SCL
a travs de un interfaz de fibra ptica y se procesan digitalmente por estacin de trabajo. Mediante la
adicin de la celda opcional (kit dual NS), un bajo costo y compacto tipo no supresor doble de iones
cromatgrafo, que detecta aniones y cationes de forma simultnea, se puede hacer.
Cada mdulo de la serie LC-VP Shimadzu ha sido diseado para cumplir los estndares para
proporcionar un sistema ptimo de HPLC. Esto hace que un anlisis de alta sensibilidad posible incluso
con un sistema sin supresin. Tan poco como 1 ppb de F-pueden ser analizados sin ningn
procedimiento de preconcentracin.
Especificaciones CDD-10AVP (Cat. No. 228-41.300-xx)