TEMA 8 LOCALIZACIN DE ANTGENOS

1) TISSUE PRINTING

Aprovechando que hay membranas que absorben protenas, usamos esta caracterstica
para hacer una impresin de un tejido consistente.
A) Tallo de un vegetal hacemos un corte y ese corte lo puedo imprimir sobre el papel.
B) Hacemos una rplica sobre el papel, una vez realizada la impresin dejamos secar y las
protenas se quedan en el papel, ese papel lo puedo tratar, primero saturamos con unas
protena inespecfica incubamos con el primario luego con el secundario y puedo
localizar protenas y saber en qu estadio del desarrollo se expresa esa protena.

Se puede hacer con tejidos animales, podemos saber en qu zona anatmica est
expresndose la protena, tambin en patgenos para seguir como avanza la
patognesis.

Lo ms habitual son las tcnicas de inmunohistoqumica, vamos a utilizar 3 tipos de tcnicas, las histolgicas, la
inmunolgica y la bioqumica para localizar un determinado Ag en un corte histolgico y vamos a ver dnde se
expresa o dnde estn localizados. Se localizan por la reaccin con su Ab correspondiente, debemos marcar el
Ab para poderlo detectar. Se mezcla la histologa (inclusin,fijar,mo) con la reaccin Ab-Ag y despus detectar
la marca (reaccin bioqumica) adems de enzimas se pueden utilizar fluorforos o metales.
Muchas veces los protocolos histoqumicos llevan un paso de fijacin pero se debe saber que las fijaciones son muy
invasivas para los Ags. A veces los Ab no reconocen a los Ag despus de los tratamientos histolgicos a los que
sometemos las muestras despus de esos cortes finos. En los casos en los que se pueda se deber evitar la fijacin.
Es crucial tener en cuenta como son las fijaciones y es mejor usar la congelacin.

Los marcajes enzimticos: normalmente son indirectos (ab secundario marcado con una enzima) cuando es directo
se marca con enzima el ab primario, el indirecto amplifica la seal, cuando queremos aumentar la sensibilidad y hay
muy poco ag , debemos amplificar al mximo porque hay muy poca seal y por eso usamos los indirectos. Los
sustratos son de 3 tipos: cromognicos, fluorescentes, luminiscentes.

Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reaccin Ag-Ac especfica, en la que el complejo inmune formado se
mide por una reaccin colorimtrica catalizada por una enzima acoplada qumicamente a uno de los reactivos, en
presencia del sustrato adecuado.

Muchas veces nos dan KITs en los protocolos, es muy importante al principio bloquear para aumentar la
especificidad con protenas especficas de forma que el Ab no se pegue de manera inespecfica y busque el Ag.

Tabla de diferentes sustratos cromognicos, la peroxidasa de rbano es la enzima que ms se utiliza, lo que tienen
son sustratos comerciales. Muchos tejidos los debemos teir y debemos tener en cuenta si el producto de reaccin
lleva asociado un color. Debemos tener en cuenta el precipitado del producto de la reaccin para elegir un tinte y
que se haga un buen contraste.

Un problema es la baja cantidad de Ag que tenemos y con ello problema de amplificacin, lo

normal es hacer un marcaje indirecto a veces debemos hacer un tercer paso que es amplificar la
seal. Para visualizar mejor muchas veces se adicionan metales. Si le aadimos plata hacemos que
los precipitados se vean muy bien (aumentan la sensibilidad de la deteccin) otro sistema es tener
Ab contra el enzima que vamos a utilizar. Si pueden ser Ab hechos en el mismo organismo que
tenga el Ab primario. Cuando utilicemos los Ab 2 estos al tener 2 brazos por un lado m reconocen al
primario q tengo contra el Ag y el otro al primario asociado a la peroxidasa.

Otros mtodos: Biotina/avidina en rojo los Ab primarios en gris los secundarios que son usados
para amplificar. Biotinizamos los ab secundarios y usamos Avidina que tiene el enzima, utilizando
ab secundarios y el sistema este puedo conseguir un montn de ab-enzima unido covalentemente
a la avidina
Sistema ABC: El complejo abc es aquel en el que la avidina forma una red entre el enzima
biotinilado y los ab biotinilados, la avidina hace de puente entre esas molculas biotinilados.

Uso de fluorforos marcando los ab, se usa en inmunofluorescencia , fotobleaching se deben tener
ciertas precauciones.

Se utiliza mucho microscopia confocal que permite eliminar el ruido de la fluorescencia no

enfocada.

Si es directa IF y si es indirecta IFI y marcamos un ab2. Se puede hacer la tcnica de sndwich y se

consigue ampliar la seal cuando hacemos los test indirectos. Los fluorforos que ms se utilizan:
los Alexa fluor y FITC lo importante es que los espectros no sean solapantes.

Nos permite distinguir las clulas beta y alfa pancreticas, tengo que tener un marcador especfico
de cada una de las clulas. Tengo un fluorforo asociado a un ab contra una carboxilasa que es
especfica de un tipo celular. Debemos tener otro marcador que reconozca el otro tipo de clula y
marcar con otro fluorforo distinto.

Estos marcajes multiples permiten hacer cosas como vienen ah, en tcnicas de localizacin nos piden que
tengamos los controles con sueros preinmunes porque nos puede dar ruido de fondo, este control negativo me
debe servir para ver como es la fluorescencia base. Es muy importante tener los controles negativos y los positivos y
ver una diferencia clara. Para tintar usamos dapi que me sirve para orientarme en el tejido y saber donde esta
localizado mi protena. Debemos solapar esas imgenes y ver si realmente se ha marcado en el sitio de inters .

Anlisis reciente de la parte inmunolgica, pruebas de autoinmunidad.

Citometro de flujo: las poblaciones celulares se pueden distinguir porque expresan

diferentes marcadores. Podemos tener anticuerpos antiCD3..
Con una poblacin celular podemos aadir ab marcador con distintos fluoroforos y
cada uno de ellos me reconocen un marcador celular. Las clulas quedaran marcadas
cada una con un fluoroforo segn lo que estn expresando. Nos permite el citometro
pasar las clulas de una en una para que las clulas se alineen de una en una y nos
permite determinar los fluoroforos y nos dara un resultado de las poblaciones
celulares para saber que tipos tengo.
FACs separacin de las clulas asociadas, estos tienen unos imanes que lo que hace
es que segn la fluorescencia de esta celula se va a desviar, desvia las clulas segn la
fluorescencia que llevan asociada. Podremos recoger y separar las clulas segn la
marca que llevan.

Conjugacin con metales que se utilizan para microoscopia electrnica, hay diferentes tipos de
microoscopios electrnicos, se dividen en transmisin y barrido, segn el que sea deben ser cortes
ultrafinos, en el barrido es en la superficie. Se deben conjugar los ab en una protena que almacena
hierro que se llama ferritina, el hierro es denso al paso de electrones y acumula un atomo de hierro
en su interior y nos permite verlo al microscopio.

La distancia si importa, queremos saber exactamente donde en una celula en un

determinado orgnulo se determina un ag, en mo electrnica a veces lo que se
utilizan son fragmentos de ab. Un nanoab debemos reducir al mximo el tamao. Se
utiliza tradicionalmente oro coloidal, son sales de oro que al reducirla forma unos
coloides.

Como unir el oro a los ab se hace de manera covalente.

Podemos seguir el procesado de un determinado ag con una forma no procesada que lleva un tamao de oro
diferente en el mismo corte

Puentes de metileno y tb entrecruzamientos de aldehdos entre las proteinas y esto impiden q los ab
puedan actuar con los ag, se llama enmascaramiento.

Solucin: recuperacin de la antigenicidad y hay dos tipos de tcnicas:

enzimtica: las proteasas que rompen las uniones covalentes y dejan los determinantes ag otra vez expuestos
Tcnicas qumicas: calentar y usar unos tampones adecuados haciendo que se recupere esta actividad antignica