TRABAJO FIN DE GRADO

QO-1: Aplicacin de la interaccin carbohidrato protena

al aislamiento de lectinas de fuentes naturales

Alberto Valero Delgado

Granada, Junio 2015

Grado en Bioqumica
Curso 2014-2015

Lista de abreviaturas
Orden alfabtico

BSA

albmina de suero bovino

ConA

concanavalina A.

-1

cm

centmetros recprocos.

H2O2

perxido de hidrgeno.

HEPES

cido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etano-sulfnico.

Lectina-HRP

lectina-peroxidasa de rbano picante, siglas del ingls horseradish peroxidase.

nm

nanmetros.

PBS

tampn fosfato salino, siglas del ingls phosphate buffered saline.

PBST

tampn fosfato salino con tween 20.

PHA

fitohemaglutinina

PNA

aglutinina del cacahuete, siglas del ingls peanut agglutinin.

r.p.m.

revoluciones por minuto.

Tox

temperatura de oxidacin.

UEA

aglutinina de Ulex europeanus.

WGA

aglutinina del germen de trigo, siglas del ingls wheat germ agglutinin.

Resumen
Las lectinas son protenas que poseen la capacidad de reconocer determinadas secuencias de
carbohidratos. Este reconocimiento propicia una unin no covalente y reversible entre la lectina
y los carbohidratos. Las lectinas se encuentran mayoritariamente en vegetales, lo que las hace un
componente presente en la dieta. Adems, se ha demostrado que muchas de ellas resisten la
protelisis estomacal e incluso altas temperaturas. Estas caractersticas permiten a las lectinas
pasar la barrera estomacal y unirse a enterocitos intestinales, donde pueden afectar el metabolismo
local. Incluso se ha descrito que un pequeo porcentaje de estas lectinas pueden pasar al torrente
sanguneo y producir problemas sistmicos, convirtindose en agentes alrgenos. Para saber ms
acerca de las lectinas son necesarias resinas o polmeros capaces de aislarlas a gran escala
mediante cromatografa de afinidad. Con las resinas comerciales actuales, el escalado se convierte
en una tarea cara y son necesarias alternativas econmicas y fiables. Entre estas alternativas, el
entrecruzamiento de glicoprotenas supone una forma rpida, barata y reproducible de lograr una
resina con un amplio abanico de carbohidratos expuestos a la unin de lectinas. En este trabajo la
fuente de glicoprotenas empleada fue la clara de huevo de gallina. Se obtuvo un polmero
funcional que se utiliz para la deteccin de lectinas resistentes a un proceso de coccin. Se
emplearon alubias rojas cocinadas (Phaseolus vulgaris) como posible fuente de lectinas
resistentes. Alubias procedentes de un plato precocinado y enlatado de fabada. Los resultados
confirmaron una posible existencia de lectinas de unin a N-acetilglucosamina y resistentes a las
altas temperaturas de coccin en esta especie.

Abstract
Lectins are proteins that can recognize several sequences of carbohydrates. This recognition
allows a non-covalent and reversible union between lectin and carbohydrates. Lectins are mainly
found in vegetables this means they are a common component in our diet. Furthermore, it has
been proved that many of them can withstand stomach proteolysis and even high temperature.
These features allow lectins to go through the stomach wall and join intestinal enterocytes and
so they may affect local metabolism. Besides, it has been proved that a small amount of it can
even enter the blood flow and cause systemic difficulties becoming into allergenic elements.
Resins or polymers are necessary in order to know more about lectins and for large-scale
isolation of them by affinity chromatography. Using present day commercial resins, escalate
becomes an expensive task and that is the reason why trustable and economical alternatives are
necessary. Amongst these alternatives, crosslinking of glycoprotein becomes a cheap, inexpensive
and reproducible way to achieve a resin with a wide range of carbohydrates exposed to protein
bound. In this study the source of glycoprotein used was the albumen of hen eggs. A functional
polymer was obtained which was used to detect lectins resistant to a boiling process. Cooked
kidney beans (Phaseolus vulgaris) as a possible source of resistant lectins were used, just beans
from a pre-cooked and canned meal. Results confirmed a possible existence of lectins that bind
N-acetylglucosamine and resist high cooking temperatures in this specie.

ndice
1.
2.
3.
4.

Introduccin.1
Objetivos...5
Plan de trabajo.7
Metodologa..9
4.1 Sntesis y extraccin de los polmeros9
4.2 Caracterizacin de los polmeros9
4.2.1 Anlisis elemental y anlisis termogravimtrico...9
4.2.2 Espectro infrarrojo...10
4.2.3 Medida de la funcionalidad del polmero frente a lectina-HRP..10
4.3 Ensayo frente a fuente natural...11
5. Resultados y discusin...13
5.1 Sntesis de los polmeros...13
5.1.1 Sntesis con divinil sulfona..13
5.1.2 Sntesis con epiclorhidrina...14
5.2 Extraccin y secado de los polmeros sintetizados...15
5.3 Caracterizacin de los polmeros sintetizados..15
5.3.1 Anlisis elemental16
5.3.2 Espectro infrarrojo...16
5.3.3 Anlisis termogravimtrico..17
5.3.4 Ensayo con lectinas-HRP.18
5.4 Aislamiento y deteccin de lectinas en fabada cocinada..20
6. Conclusiones...24
Bibliografa.25

Introduccin

Introduccin

1. Introduccin
Las lectinas son un tipo de protenas que tienen la capacidad de unirse especficamente a
monosacridos u oligosacridos. Estas uniones son no covalentes y reversibles. Comprenden
puentes de Hidrgeno, interacciones hidrofbicas, de Van Der Waals o atracciones dipolo. Una
lectina tiene, por tanto, la capacidad de discriminar entre secuencias de carbohidratos y ser
selectiva en su unin a ellos. Aunque las lectinas alcanzan su mayor expresin en tejidos
vegetales, estn presentes tambin en animales e incluso microorganismos. Su amplia presencia
en la naturaleza est vinculada con fenmenos regulatorios, adhesivos y de defensa.[1] Se ha
demostrado que algunas lectinas son expresadas en plantas como mecanismo de defensa ante el
ataque de agentes patgenos e incluso algunas tienen efectos insesticidas.[2]
Las lectinas comprenden un grupo ampliamente heterogneo desde el punto de vista bioqumico
y estructural. Existen lectinas con un nico sitio de unin a carbohidratos (Merolectinas), con dos
o ms sitios de unin (Hololectinas) o incluso con dominios catalticos (Quimerolectinas).
La alta expresin de las lectinas en los vegetales provoca que stas estn muy presentes en
alimentos consumidos diariamente, siendo un componente de nuestra dieta. Se ha demostrado que
algunas lectinas son resistentes a las condiciones proteolticas del estmago as como a la
temperaturas alcanzadas durante una coccin.[1] A su vez, lectinas que resisten estas duras
condiciones pueden unirse a los enterocitos intestinales, va reconocimiento de carbohidratos
superficiales, e interferir en el metabolismo local.[3] Estudios en ratas, incluso han demostrado la
entrada al torrente circulatorio de un pequeo porcentaje de lectinas ingeridas, desencadenando
problemas sistmicos.[1] Estos problemas son fruto de la capacidad hemaglutinadora de las
lectinas, siendo sta una propiedad a tener en cuenta a la hora de catalogar la toxicidad de una
lectina.
Todos estos hallazgos generaron el inicio de una corriente a finales de los 90, encabezada por
Peter J. DAdamo, en la cual se defenda y se defiende la instauracin de una dieta personalizada
basada en el tipo sanguneo del individuo. DAdamo argumenta que la secuencia de carbohidratos
expuesta por las clulas sanguneas determina los alimentos a ingerir, dependiendo de las lectinas
mayoritarias en estos. De esta forma cataloga a los alimentos en tres grupos: muy beneficiosos,
neutros y no aconsejables.[4] Esta organizacin se basa en las posibles uniones lectina-eritrocito.
DAdamo sostiene que parte de las lectinas ingeridas pasan a la sangre, donde pueden reconocer
especficamente el patrn glucdico expuesto en la superficie de los glbulos rojos. Como este
patrn vara de uno a otro tipo sanguneo, cada grupo debe adaptar su nutricin, evitando ciertas
lectinas. Pese a haber auto-publicado algunos ensayos en los que pone a prueba la dieta del tipo
sanguneo, DAdamo cuenta con detractores en el mbito cientfico, ante la falta de pruebas
concluyentes sobre los beneficios reales de dicha dieta. Este debate quiz sirvi para que las
lectinas atrajesen la atencin de la comunidad cientfica y es, en parte, un incentivo ms para la
realizacin de este trabajo fin de grado.
Diversos estudios nutricionales, basados en la toxicidad de lectinas, han sido realizados desde
entonces. Un ejemplo de ello son los estudios que conciernen a la toxicidad de las alubias rojas,
especie Phaseolus vulgaris. Las alubias rojas son ampliamente consumidas a nivel mundial
debido a su alto contenido en protenas y su valor nutricional. Sin embargo, existen casos
detallados en los que el consumo de alubias rojas desencadena efectos adversos como vmitos,
nuseas o diarrea.[1] Esto se achaca al alto contenido en lectinas presentes en la alubia roja. De
hecho, es en Phaseolus vulgaris donde la fitohemaglutinina (PHA) se encuentra en mayor
1

Introduccin
cantidad. Estos elevados niveles de PHA en la alubia roja han hecho que pases como Sudfrica
prohban la importacin de este producto, debido a la recopilacin de casos toxicolgicos
registrados.[5] Adems de PHA, lectina capaz de aglutinar clulas sanguneas, en P. vulgaris han
sido descritas otras lectinas.[5] Aunque procesos de coccin suelen destruir gran parte de ellas,
algunas pueden conservar su funcionalidad. La capacidad de muchas de ellas de resistir las
condiciones estomacales hace que se puedan producir reacciones adversas tras la ingestin de
alubias. Entre estas reacciones adversas se encuentran la unin a enzimas digestivas,
inactivndolas; o la unin al epitelio de enterocitos, mermando la reparacin de la membrana o
alterando el borde en cepillo con una consiguiente absorcin de nutrientes irregular.[5] Estas
reacciones explican, en parte, los sntomas anteriormente descritos.
Por otro lado, es grande el potencial que se les intuye a las lectinas, en aspectos como su papel en
la respuesta a patgenos en plantas o su papel en microorganismos o animales. Este potencial,
junto a las complicaciones nutricionales, fuerza la necesidad de aislar lectinas de sus fuentes
naturales para facilitar su estudio. Sus condiciones de unin a carbohidratos las hacen idneas
para su extraccin y purificacin mediante cromatografa de afinidad, donde una elucin con
azcares las liberara de la matriz cromatogrfica.
Para el aislamiento de lectinas mediante cromatografa de afinidad, en primer lugar, las lectinas
deben ser liberadas de su oclusin en la fuente natural. Para ello, mtodos de lisis y homogenizado
suelen ser suficientes. La solucin obtenida es, en ocasiones, tratada con diferentes tipos de
eritrocitos. Esta medida tiene como objetivo dilucidar la especificidad de las lectinas presentes en
el extracto, en base a la deteccin de actividad aglutinadora. Posteriormente, la solucin con
lectinas es pasada a travs de una resina, encargada de realizar la cromatografa. En las resinas
comerciales el agente adsorbente es usualmente un carbohidrato, ya sea mono-, di- o polisacrido.
Estos agentes adsorbentes se encuentran unidos covalentemente a matrices de carcter glucdico.
En ocasiones, estos enlaces se realizan mediante divinil sulfona o epxidos como la
epiclorhidrina,[6] ambos compuestos empleados en este trabajo fin de grado. Comercialmente,
existen varias matrices de estas caractersticas (Sefarosa, Mini-leak agarosa, Toyopearl, Synsorb,
Seralosa y Spheron entre otras).
En algunos estudios son necesarias cantidades elevadas de lectina y los soportes comerciales,
cuando son aplicados a extracciones a gran escala, se convierten en una losa econmica. Adems,
en muchas ocasiones se desconoce la especificidad de algunas lectinas que se desean purificar, lo
que dificulta la eleccin de la resina a emplear. Esta dificultad es fruto de que la mayor parte de
las resinas comerciales exponen un limitado abanico de carbohidratos.
Ante esta problemtica, nuevas alternativas son exploradas. Para una purificacin a gran escala,
una matriz debe tener tres condiciones fundamentales: expresar una amplia diversidad de sitios
de unin con lectinas; ser econmicamente asequible; ser almacenable a condiciones normales.[7]
Una buena alternativa, para lograr estos tres puntos, es el entrecruzamiento directo de
glicoprotenas. Entrecruzando glicoprotenas mediante la porcin proteica, la resina o polmero
sintetizados lograran exponer una amplia variedad de secuencias de carbohidratos. Esta
inespecificidad creara un material polivalente que permitira el aislamiento de lectinas no
descritas. Adems se evita el uso de matrices comerciales, disminuyendo notablemente los gastos.
Una fuente barata de glicoprotenas es el huevo de gallina. La clara de huevo de gallina contribuye
en aproximadamente un 60% del peso total de un huevo, en ella hay del orden de un 13% de

Introduccin
protena y un 1% de carbohidratos.[8] Es decir, en una clara de huevo de unos 36 gramos, puede
haber en torno a 5 gramos de glicoprotena.
Este trabajo se centra en la sntesis de polmeros a partir de las glicoprotenas presentes en la clara
de huevo. Estos polmeros permitieron un aislamiento selectivo mediante la elucin con distintos
azcares. Para la sntesis de los polmeros se emplearon, por lado, divinil sulfona y por otro
epiclorhidrina como agentes de entrecruzamiento. Posteriormente, los polmeros fueron
evaluados en bsqueda del ms eficiente en la unin con lectina. El polmero elegido se emple
para la bsqueda de lectinas resistentes a procesos de coccin en la alubia roja (Phaseolus
vulgaris). Las alubias rojas empleadas procedan de un plato precocinado y enlatado de fabada.

Objetivos

Objetivos

2. Objetivos
El objetivo principal del trabajo realizado fue la deteccin de lectinas funcionales en alimentos
cocinados. Para alcanzar este objetivo principal fueron necesarios unos avances previos. Se podra
decir, por lo tanto, que los objetivos especficos fueron:
-

Sntesis de polmeros polivalentes a partir del entrecruzamiento de glicoprotenas

presentes en la clara de huevo de gallina.
Utilidad de estos polmeros ante la unin especfica con un rango variado de lectinas.
Aislamiento y deteccin de lectinas que resistan procesos de coccin, empleando uno de
los polmeros sintetizados.

Plan de trabajo

Plan de trabajo

3. Plan de trabajo
El plan de trabajo se puede resumir en tres bloques principales, detallados a continuacin por
orden cronolgico.
1. Sntesis de polmeros a partir del entrecruzamiento de glicoprotenas presentes en la clara
de huevo.
1.1 Bsqueda de las condiciones ptimas para la sntesis.
En la bsqueda de las condiciones ptimas se probaran dos agentes de
entrecruzamiento y se variaran las condiciones de obtencin para cada polmero.
Estos experimentos determinaran la mejor combinacin pH, tampn y volumen de
reactivo.
2. Caracterizacin de los polmeros sintetizados.
2.1 Anlisis elemental.
El anlisis elemental tendra como fin conocer los componentes y su proporcin en
los polmeros. Se podran detectar posibles anomalas en la sntesis o se confirmara
la correcta ejecucin de stas.
2.2 Espectro IR.
El espectro IR, adems de caracterizar los polmeros, se podra usar para comprobar
las caractersticas de los mismos.
2.3 Medida de su funcionalidad mediante el uso de diferentes lectinas-HRP comerciales.
Este es el anlisis que determinara si los polmeros seran vlidos para el bloque 3.
2.4 Anlisis termogravimtrico.
El anlisis termogravimtrico servira como una medida ms de caracterizacin de
los polmeros. Determinara el grado de resistencia a la descomposicin trmica. Esta
medida generara un perfil nico para cada polmero.
3. Aislamiento y deteccin de lectinas presentes en alimentos cocinados.
3.1 Incubacin del mejor polmero sintetizado con extracto de alubias rojas (Phaseolus
vulgaris) procedentes de una lata de fabada Litoral. Tras incubacin, elucin
secuencial con soluciones de distintos azcares.
3.1.1 Medida de la absorbancia de los eluatos a 280nm.
Un pico de absorbancia en el eluato de alguno de los azcares determinara
la presencia de lectina eluida.

Metodologa

Metodologa

4. Metodologa
4.1 Sntesis y extraccin de los polmeros
Se emplearon huevos de gallina tamao L, a los cuales se les extrajo la clara. La yema fue
desechada. En un matraz de fondo redondo se aadieron las claras y el tampn de reaccin (Tabla
1). Se homogeniz en agitacin hasta que la mezcla perdi el aspecto gelatinoso propio de la clara
de huevo. En uno de los casos este homogenizado fue calentado a 80C durante 30 minutos en un
bao de aceite. Posteriormente se aadi el reactivo de entrecruzamiento, divinil sulfona o
epiclorhidrina y se dej reaccionando durante toda la noche en agitacin.
Tabla 1. Condiciones de reaccin
Polmero

Caractersticas homogenizado

Reactivo

V de reaccin

D8

6 claras (256,5 g), 30 ml tampn HEPES 0,5M pH8.

Bao 80C 30 min.

Divinil sulfona (9 ml)

310 ml

D10

6 claras (270g), 500 ml tampn carbonato 0,3M

pH10.

Divinil sulfona (3 ml)

775 ml

E10

5 claras (227g), 250 ml tampn carbonato 0,3M

pH10.

Epiclorhidrina (22 ml)

480 ml

E12

5 claras (227g), 250 ml tampn carbonato 0,3M,

pH12.

Epiclorhidrina (22 ml)

480 ml

Bajo las condiciones resumidas en la Tabla 1, se obtuvieron partculas insolubles en suspensin

en los dos primeros casos (polmeros D8 y D10). Se bloque con -mercaptoetanol a razn 0,7
ml por ml de divinil sulfona en reaccin. Para la extraccin de las partculas insolubles, ambas
soluciones fueron tratadas con NaCl al 20% p/v. El material precipitado fue filtrado mediante
succin. Durante el filtrado se lav el material con abundante agua hasta prdida casi total de
absorbancia a 280 nm del lquido difundido. Posteriormente el material fue lavado con metanol y
ter. El material obtenido tras los lavados se introdujo en una estufa de ventilacin forzada a
temperatura mxima de 45C y presin mnima de 150 mb, hasta su completo secado. En las otras
dos condiciones (E10 y E12) el volumen de reaccin gelific totalmente tras estar reaccionando
toda la noche. El material gelificado fue introducido directamente en la estufa de ventilacin
forzada bajo las mismas condiciones que para D8 y D10.
Tras el secado, los materiales fueron pulverizados y caracterizados. La pulverizacin se llev a
cabo con la ayuda de un mortero.

4.2 Caracterizacin de los polmeros

Se realizaron anlisis elemental, espectroscopa infrarroja, anlisis termogravimtrico y ensayo
frente a lectinas-HRP para la caracterizacin de los polmeros sintetizados.
4.2.1 Anlisis elemental y anlisis termogravimtrico
Ambos anlisis fueron realizados por el centro de instrumentacin cientfica de la Universidad de
Granada.
9

Metodologa
4.2.2 Espectro infrarrojo
Se realiz colocando una muestra de polmero pulverizado en el detector de un espectrofotmetro
infrarrojo Spectrum Two de Perkin-Elmer.
4.2.3 Medida de la funcionalidad del polmero frente a lectina-HRP comercial
4.2.3.1 Incubacin
Se prepararon cuatro soluciones de concentracin 1:1000 de cada una de las cuatro lectinas-HRP
a ensayar (ConA, PNA, UEA y WGA). Fueron empleadas lectinas-HRP comerciales de la casa
Sigma-Aldrich. Cada lectina posea distinta especificidad por carbohidratos. La especificidad de
las lectinas queda reflejada en la Tabla 2. Se suplement la solucin de ConA con 1mM de iones
Ca2+ y Mn2+. Alcuotas de cada polmero fueron repartidos en cuatro tubos eppendorf, a los cuales
fueron aadidos 800 l de solucin de lectina-HRP. Se incub durante toda la noche a temperatura
ambiente. Tras la incubacin se centrifug a 14000 r.p.m. durante 5 minutos y se recolect el
sobrenadante. Se lav dos veces aadiendo a cada tubo 1 ml de PBST, y dejando en agitacin
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifug a 14000 r.p.m. durante 5 minutos en
cada ocasin y se midi la actividad del sobrenadante tras el segundo lavado, verificando la
ausencia de actividad peroxidasa.
Tabla 2. Especificidad lectina-azcar

Lectina

Azcar ms afn

ConA

Manosa

PNA

Lactosa

UEA

Fucosa

WGA

N-Acetilglucosamina

4.2.3.2 Elucin
Se prepararon soluciones de Manosa, Fucosa, N-Acetilglucosamina 0,5 M y Lactosa 0,25 M. La
solucin de Manosa fue suplementada con 1mM de iones Ca2+ y Mn2+. Se aadieron 300 L de
solucin del azcar correspondiente en cada tubo eppendorf y se incub 25 minutos a temperatura
ambiente en agitacin. Se centrifug a 14000 r.p.m. 5 minutos y se recogi el sobrenadante.
4.2.3.3 Medida de la actividad peroxidasa
Se aadieron 50 l de cada muestra a revelar en un microplaca de 96 pocillos. Se emplearon como
muestras a medir las cuatro soluciones de lectina-HRP a concentracin 1:1000, los sobrenadantes
extrados tras la primera incubacin y los sobrenadantes extrados tras la elucin con soluciones
de azcar.
Se prepar solucin de revelado con 10 mL de tampn citrato, 5 mg de 1,2-fenilendiamina
dihidrocloruro y 30 l de H2O2. Para el revelado se dosificaron 150 l de esta solucin de revelado
a cada pocillo. La medida de actividad se realiz a 492 nm mediante un lector de placas en 15
ciclos de 2 minutos desde adicin de la solucin de revelado.

10

Metodologa
4.3 Ensayo frente a fuente natural
4.3.1 Obtencin del extracto de alubias
El extracto de alubias se obtuvo a partir de una lata de fabada asturiana cocinada Litoral de 435
gramos. Con la ayuda de una licuadora se produjo un homogenizado exclusivamente con las
alubias, eliminando todos los dems ingredientes. Para la homogenizacin se aadieron 200 ml
de tampn PBS. Se obtuvo un volumen de licuado de 300 ml. Este licuado se filtr mediante
succin. El lquido difundido fue el extracto empleado para el ensayo.
4.3.2 Incubacin
Se introdujeron en dos tubos Falcon de 50 ml alcuotas de 1g de polmero E10. Las muestras de
polmero se lavaron 3 veces. Para su lavado se aadieron 45 ml de PBS a cada tubo y se mantuvo
en agitacin durante 5 minutos. Se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 5 minutos eliminando el
sobrenadante y repitiendo el proceso hasta prdida casi total de absorbancia a 280 nm de estos
sobrenadantes.
Uno de los tubos (control) se llen con 45 ml de PBS, el otro tubo (problema) se llen con 45 ml
de extracto de fabada. Al tubo problema se le aadieron iones Ca2+ y Mn2+ a razn 3 mM. Ambos
tubos se dejaron incubar durante 3 horas en agitacin y temperatura ambiente. Tras el periodo de
incubacin se centrifugaron a 3000 r.p.m. 5 minutos y se eliminaron los sobrenadantes.
Posteriormente se realizaron hasta un total de 6 lavados con 45 ml de PBS para eliminar posibles
contaminantes que no hubiesen hibridado con el polmero.
4.3.3 Eluciones
Tras la incubacin, la extraccin de las posibles lectinas presentes en el polmero se realiz
mediante eluciones con soluciones de azcar. Las soluciones empleadas fueron Nacetilglucosamina, Manosa, Glucosa, Fucosa, todas ellas a concentracin 0,5 M y Lactosa a 0,25
M. Se realizaron periodos de incubacin de 15 minutos en agitacin, con 4 ml de cada solucin
de azcar. Se recogieron todos los eluatos para su posterior medida de absorbancia. Entre
incubaciones se lav con 45 ml de PBS 2 veces, hasta prdida de absorbancia a 280 nm. Todos
los pasos fueron mimetizados en el tubo control.
4.3.4 Medida a 280 nm
Se midi la absorbancia a 280 nm de los eluatos mediante un espectrofotmetro ultravioletavisible. La bsqueda de picos de absorbancia se realiz mediante la diferencia entre eluatos
problema y control.

11

Resultados y discusin

Resultados y discusin

5. Resultados y discusin
5.1 Sntesis de los polmeros
Se probaron dos reactivos de entrecruzamiento a diferentes condiciones. Divinil sulfona se
emple por ser un reactivo comn en el equipo de investigacin en el que se realizaron los
experimentos. El uso de epiclorhidrina se sustent en datos bibliogrficos.[6, 9, 10]
5.1.1 Sntesis con divinil sulfona
El entrecruzamiento mediante divinil sulfona de las glicoprotenas presentes en la clara de huevo
demostr muy poco rendimiento. Este rendimiento fue superado en ms de diez veces por los
polmeros sintetizados con epiclorhidrina (Tabla 3).
Tabla 3. Rendimiento de los polmeros sintetizados
Polmero

Peso clara
(g)

Peso material Rendimiento

sintetizado (g) (%)

D8

256,5

4,1

1,59

D10

270

1,61

0,59

E10

227

40,4

17,79

E12

227

41,3

18,19

El rendimiento en la sntesis de D8 fue un 1% superior al alcanzado en la sntesis de D10. Se

intuye que la desnaturalizacin de las glicoprotenas de la clara en D8 antes de la reaccin de
entrecruzamiento expuso en mayor medida los grupos reactivos de stas. Sin embargo, se
hipotetiza que esta diferencia en el rendimiento, as como el bajo rendimiento de ambos en
comparacin con E10 y E12, fue debido a las condiciones alcalinas del medio de reaccin, pH 8
para D8 y pH 10 para D10. El pH alcalino era necesario para que se desarrollase la reaccin
esperada (Imagen 1). Esta reaccin consista en la unin de los dos extremos de la molcula de
divinil sulfona a dos grupos amino de dos glicoprotenas diferentes, producindose as el
entrecruzamiento entre ambas. La unin de las glicoprotenas mediante grupos tiol o hidroxilo era
tambin contemplada. La alcalinidad del medio era necesaria para que los grupos amino, tiol o
incluso hidroxilo, procedentes de la protena, adoptasen un carcter nucleoflico suficiente para
iniciar el mecanismo detallado abajo.

Imagen 1. Mecanismo de reaccin con divinil sulfona esperado

La reaccin (Imagen 1) transcurre gracias a la presencia de dos zonas con densidad de carga
positiva en los extremos de la molcula de divinil sulfona (1). La tendencia a la atraccin de
electrones por parte del tomo de azufre hace que estos extremos (carbonos beta) sean
13

Resultados y discusin
susceptibles al ataque de un nuclefilo. En medio bsico, las aminas procedentes de las
glicoprotenas se desprotonan, convirtindose en buenos agentes nuclefilos. Estas aminas atacan,
por tanto, a estos carbonos beta electrn deficientes (1 y 3) de manera secuencial. Se producen
sendas adiciones nucleoflicas que originan la adhesin covalente de dos glicoprotenas al reactivo
de entrecruzamiento (2 y 4).
Sin embargo, al aumentar la alcalinidad del medio a valores de pH 8 o superiores, se intuye que
lo que sucedi mayoritariamente fue lo mostrado en la Imagen 2.

Imagen 2. Mecanismo de reaccin con divinil sulfona a pH elevado

Al aumentar el pH del medio la amina secundaria, procedente de la glicoprotena que ha

interaccionado en primera instancia con la divinil sulfona, se torna muy reactiva. Esto hace que
el ataque nucleoflico intramolecular (b) sea ms probable que un ataque nucleoflico
intermolecular, en el que se incorporara una nueva glicoprotena al otro extremo de la molcula
de divinil sulfona. Como resultado se obtienen glicoprotenas cuyos grupos amino son bloqueados
con divinil sulfona, formando un compuesto cclico muy estable, la tiomorfolina (c).
Este mecanismo intramolecular justificara el bajo rendimiento obtenido en la sntesis de ambos
polmeros, ya que realmente son poco probables los entrecruzamientos intermoleculares entre dos
glicoprotenas en estas condiciones. A su vez, esta hiptesis tambin responde al mayor
rendimiento obtenido a pH 8, ya que a este pH las aminas secundarias no son tan reactivas como
a pH 10, con lo que las interacciones intermoleculares son algo ms probables.
5.1.2 Sntesis con epiclorhidrina
Ante el bajo rendimiento obtenido con divinil sulfona, se opt por emplear epiclorhidrina como
agente de entrecruzamiento en la sntesis de otros dos polmeros, E10 y E12. Adems de por
sustento bibliogrfico en el uso de este reactivo para el entrecruzamiento de protenas, el
mecanismo molecular de accin de dicho proceso con epiclorhidrina (Imagen 3) evitaba el
problema surgido con divinil sulfona.
En el rango de pH empleado para la sntesis de ambos polmeros, las aminas primarias presentes
en las glicoprotenas del huevo ejecutan un ataque nucleoflico sobre el carbono CH2 del epxido
de la epiclorhidrina (1 Imagen 3). Se genera un intermediario (2 Imagen 3) en el cual se
produce un ataque nucleoflico intramolecular del grupo hidroxilo sobre el carbono unido al
tomo de cloro. Se genera as un nuevo epxido (3 Imagen 3) y se libera el tomo de cloro. El
carbono CH2 de este segundo epxido es otro punto con densidad de carga positiva, por lo que es
susceptible al ataque por un nuclefilo (3 Imagen 3). Sin embargo, en esta ocasin, la reaccin
intramolecular llevada a cabo por la amina secundaria es muy poco favorable, debido a un fuerte
14

Resultados y discusin
impedimento estrico (3 Imagen 3). Por lo tanto, la adicin nucleoflica por parte de una amina
procedente de una segunda protena est mucho ms favorecida. De esta manera, se genera un
entrecruzamiento entre dos protenas (4 Imagen 3).

Imagen 3. Mecanismo de reaccin con epiclorhidrina

5.2 Extraccin y secado de los polmeros sintetizados

Las reacciones de entrecruzamiento con divinil sulfona dieron como resultado soluciones de
aspecto mucilaginoso con partculas de polmero en suspensin. El filtrado por succin de estas
soluciones gomosas no dio resultado. Se emple NaCl al 20% p/v para poder romper esa
estructura viscosa y al mismo tiempo precipitar el polmero. La elevada fuerza inica aplicada
sobre la solucin desestabiliz las estructuras de carcter glucdico, enlazadas no covalentemente,
desapareciendo el aspecto mucilaginoso. A su vez, la sal ejerci una competitividad por el soluto
(agua) con las protenas que formaban el polmero. Esto provoc un descenso en la solubilidad
del polmero, que acab precipitando. Este precipitado fue filtrado mediante succin. Abundantes
lavados con agua destilada fueron aplicados para la eliminacin de las sales y las posibles
protenas no entrecruzadas. Los lavados con metanol y ter eliminaron gran cantidad del agua
presente en los polmeros, acelerndose el posterior proceso de secado en la estufa.
Por otro lado, se produjo una gelificacin en las reacciones con epiclorhidrina. La reaccin
evolucion con un alto rendimiento, por lo que no existan partculas en suspensin, como en los
casos con divinil sulfona. Ambos geles fueron introducidos directamente en la estufa de secado.
Una vez secos, conformaran los polmeros E10 y E12.

5.3 Caracterizacin de los polmeros sintetizados

La caracterizacin de los polmeros dio pruebas sobre su composicin, propiedades y
funcionalidad. Se obtuvieron anlisis elementales y termogravimtricos, se realiz un espectro IR
y para culminar se realiz un ensayo con lectinas-HRP.

15

Resultados y discusin
5.3.1 Anlisis elemental
Datos sobre la composicin de los cuatro polmeros sintetizados fueron aportados por el anlisis
elemental. En la Tabla 4 se recogen las cantidades proporcionales de Nitrgeno, Carbono y
Azufre que contenan los cuatro polmeros. Tambin se muestran las relaciones
Nitrgeno/Carbono y Azufre/Carbono.
Tabla 4. Resultados anlisis elemental
Polmero

Proporcin elemental (mmoles/g)

Relaciones

N/C

S/C

D8

9,75

38,13

1,3

0,25

0,034

D10

9,23

38,15

1,12

0,24

0,029

E10

6,95

34,69

0,17

0,2

0,004

E12

6,62

34,61

0,11

0,19

0,003

Las relaciones N/C revelaron una marcada similitud entre los cuatro polmeros. Al mismo tiempo,
valores que rondan el 0,2 en esta razn N/C, mostraron un indicio de la naturaleza proteica de los
materiales sintetizados. Por otro lado, las relaciones S/C presentaron marcadas diferencias entre
los polmeros sintetizados con divinil sulfona y los sintetizados con epiclorhidrina. Valores,
aproximadamente, 10 veces mayores fueron obtenidos para las relaciones S/C de los polmeros
D8 y D10 con respecto a las relaciones S/C en los polmeros E10 y E12. Esta diferencia demuestra
la presencia de divinil sulfona en los dos primeros polmeros, ya que como ha sido detallado
anteriormente (Imagen 1) este reactivo contiene un tomo de Azufre en su estructura molecular,
tomo que no se pierde en el proceso de entrecruzamiento. Al mismo tiempo, que el valor de esta
razn S/C sea mayor en el polmero D8 que en el D10 se justifica por el rendimiento sutilmente
superior (1%) obtenido en la sntesis del primero con respecto al obtenido en la sntesis del
segundo. Por lo tanto, al entrecruzar con divinil sulfona, cuanto ms Azufre haya en el polmero
final, ms entrecruzamientos se habrn producido, y por ello ms pesar el material sintetizado.
Este peso aumentar en mayor medida que la cantidad de azufre ya que por cada tomo de Azufre
se suman dos protenas al peso final.
En los otros dos casos (E10 y E12) la diferencia entre la relacin S/C de uno y otro se debi a
condiciones experimentales. Al no ser polmeros entrecruzados con divinil sulfona, la cantidad
diferencial de Azufre corresponde a las caractersticas de las protenas que los forman.
5.3.2 Espectro IR
La similitud general entre los espectros de polmero y el espectro de la BSA (Imagen 4) demostr
la naturaleza proteica de los polmeros sintetizados. El pico de absorcin situado a la frecuencia
de 3279,7 cm-1 en el espectro de E10 se convierte en la diferencia ms notable en esa regin con
respecto a los dems espectros. En esta regin situada entre los 3200 y los 3550 cm-1, es el lugar
del espectro donde absorben los grupos OH unidos a estructuras moleculares.[11] El amplio margen
entre la absorbancia de E10 en este punto y la absorbancia de los dems polmeros pudo ser un
indicio de una alta presencia de carbohidratos expuestos en la superficie de E10. Aunque es cierto
que a una frecuencia cercana (entre 3580 y 3650 cm-1) absorben tambin los grupos OH libres, y
que este pico se pudo deber a la presencia de agua en el polmero, la muestra empleada estaba
completamente seca, con lo que se asumi que E10 expona muchos ms carbohidratos que el
resto de polmeros, reuniendo las mejores condiciones para el aislamiento de lectinas.

16

Resultados y discusin

Imagen 4. Espectros IR. En color negro se muestra el espectro de BSA. En morado y azul los espectros de E10 y E12
respectivamente. En naranja el espectro de D8 y en rojo el de D10. La similitud con el espectro de BSA demostr la
naturaleza proteica de los polmeros sintetizados. Los valores de transmitancia de los distintos espectros se muestran
normalizados para su comparacin.

5.3.3 Anlisis termogravimtrico

Se obtuvieron termogramas para cada polmero. Estos termogramas reflejan la descomposicin
del material frente a un aumento de temperatura. La temperatura de oxidacin (Tox) determina el
momento en el que la descomposicin es ms rpida. Variaciones en el valor de Tox (Tabla 5)
entre polmeros similares (E10-E12 y D8-D10) se deben al tamao de pulverizacin con la que
se realizaron los anlisis, ya que tericamente, deberan ser casi idnticos.
Tabla 5. Tox polmeros

Polmero
D8
D10
E10
E12

Tox (C)
309,61
292,54
318,65
320,64

En definitiva, el anlisis termogravimtrico aporta informacin sobre la robustez del polmero

analizado, generndose una curva termogravimtrica caracterstica de cada uno. Al mismo
tiempo, se suele representar tambin la curva DTG. Esta curva es la primera derivada de la curva
termogravimtrica frente al tiempo o a la temperatura, es decir, la velocidad de prdida de peso
del material. La temperatura de oxidacin se obtiene gracias a esta curva, siendo el punto de
temperatura donde existe un mnimo o un mximo en el parmetro que mide la velocidad de
descomposicin del material. En la Imagen 6, la Tox se corresponde con un mnimo en la grfica,
ya que la velocidad descomposicin se representa como mg/min.
17

Resultados y discusin

Imagen 5. Termograma de E10. En el eje x se representan el tiempo y la temperatura, en el eje y el peso del polmero.
Se observa que la prdida de masa tiene una mayor velocidad entre los 300 C y los 500C, lugar donde se encuentra la
Tox (318,65 C).

Imagen 6. Curva DTG del polmero E10. Esta curva es resultado de la derivacin de la curva TG (termograma). En
este caso se representa en el eje x la temperatura y el tiempo, mientras que en el eje y se representa la velocidad de
prdida de materia como mg/min. El punto mnimo corresponde con la Tox, punto en el que la descomposicin es ms
rpida.

5.3.4 Ensayo con lectinas-HRP

Para evaluar la funcionalidad de los polmeros sintetizados, se realiz un ensayo con lectinas
comerciales unidas a la enzima peroxidasa de rbano picante (lectinas-HRP). De esta forma, la
interaccin de la peroxidasa de estas lectinas con el perxido de hidrgeno, presente en el medio
de revelado, generara agentes oxidantes que atacaran al agente cromgeno (diclorhidrato de
fenilendiamina), tornndose la solucin de un color detectable a 492 nm. Tras la primera
incubacin entre estas lectinas-HRP y los polmeros sintetizados y una posterior centrifugacin,
la medida de absorbancia del sobrenadante dara una impresin de la cantidad de lectina que se
haba adherido especficamente a la matriz polimrica. Teniendo como referencia la absorbancia
de alcuotas de cada una de las lectinas-HRP, se pudo estimar el porcentaje de lectina que se uni
a cada uno de los polmeros.

18

Resultados y discusin

Imagen 7. Actividad peroxidasa procedente de lectina-HRP. En los grficos se analizan 3 fracciones: el control de
lectina-HRP, el sobrenadante tras la incubacin de los polmeros con lectina-HRP y la elucin con solucin de azcar.
En los grficos de la izquierda se muestra una comparativa entre la actividad peroxidasa del control (gris) y
sobrenadante (color). En los grficos de la derecha se visualiza la actividad peroxidasa de los eluatos. La primera
comparativa permite saber qu porcentaje de lectina se ha unido especficamente a la resina, los grficos de la derecha
revelan si existe lectina tras la elucin de la resina. Las barras representan el error tpico.

En la Imagen 7 se muestran grficamente las absorbancias de tres fracciones, medidas en los

cuatro polmeros. La primera fraccin fue la solucin lectina-HRP empleada para la incubacin.
La segunda, el sobrenadante tras la incubacin y centrifugacin del polmero. La tercera fraccin
fue el eluato tras la incubacin del polmero (unido a lectinas-HRP) con soluciones de
monosacrido. La comparativa entre las dos primeras fracciones revel los porcentajes de
retencin de lectina detallados en la Tabla 6.

19

Resultados y discusin

Tabla 6. Capacidad de retencin de los polmeros

Polmero

% lectina-HRP retenida
ConA

PNA

UEA

WGA

E10

78,76

90,95

89,54

92,54

E12

79,89

91,95

86,37

94

D8

79,88

79,28

66,91

87,88

D10

75,29

55,13

82,48

86,68

Estos porcentajes revelaron una mayor capacidad de retencin de las lectinas PNA, UEA y WGA
por parte de los polmeros sintetizados con epiclorhidrina (E10 y E12), en comparacin con los
dos sintetizados con divinil sulfona (D8 y D10). La unin de ConA result ser similar para todo
los polmeros. Esto ltimo pudo deberse a la insuficiencia en el medio de iones Ca2+ y Mn2+,
necesarios para el correcto funcionamiento de esta lectina y que pudieron convertirse en factores
limitantes en la incubacin con E10 y E12.
La medida de absorbancia en la tercera fraccin sirvi para demostrar la presencia de lectina-HRP
en los polmeros. La elucin secuencial con soluciones de azcares hizo que estos se uniesen
especficamente a su lectina-HRP correspondiente, mediante una reaccin de competicin contra
los carbohidratos expuestos en la matriz polimrica. Esta unin (azcar libre)-lectina-HRP
desencaden el desprendimiento de las lectinas-HRP de los polmeros y la presencia de actividad
peroxidasa en el eluato.

5.4 Aislamiento y deteccin de lectinas en fabada cocinada

Ante los resultados obtenidos en la caracterizacin de los cuatro polmeros, se opt por E10 para
el ensayo frente a una fuente natural. El uso de uno de los polmeros sintetizados con
epiclorhidrina era una opcin natural tras los resultados obtenidos en la interaccin con lectinasHRP. Adems, el hecho de poseer mucha ms cantidad de estos dos materiales que de D8 o D10
decant an ms la balanza. Seleccionar E10 en lugar de E12 tuvo que ver, en menor medida, por
el resultado obtenido en IR y en mayor medida por las condiciones a las que se obtuvo este
material. E10 se obtuvo a unas condiciones menos agresivas de pH que E12, lo que supone una
mayor economa atmica y un menor riesgo medioambiental, en caso de ser reproducido.
El uso de Phaseolus vulgaris, es objeto bibliogrfico comn en la deteccin y aislamiento de
lectinas, ya que existen varias lectinas descritas para esta especie. Sin embargo, el objetivo aqu
fue aislar lectinas funcionales que hayan resistido un proceso de coccin. Para ello se pens en
las alubias rojas contenidas en una lata de fabada cocinada Litoral. El extracto obtenido de una
de estas latas fue puesto en contacto con E10 mediante una incubacin a temperatura ambiente.
Posteriormente, eluciones secuenciales con distintos azcares permitiran, no slo averiguar si la
lata contena lectinas funcionales, sino saber a qu azcar eran especficas.
Para detectar la presencia de lectinas en el eluato, se midi la absorbancia de ste a 280 nm. Los
resultados quedan reflejados en los grficos de la Imagen 8.

20

Resultados y discusin

Imagen 8. Densidad ptica a 280nm de los eluatos con cada uno de los cinco azcares. Se encontr un pico de
absorbancia en el eluato de N-acetilglucosamina. Las barras representan el error tpico.

La elucin con N-acetilglucosamina present absorbancia a 280 nm, mientras que con el resto de
eluciones no se detect densidad ptica. En vista de este resultado, se podra decir que se aislaron
uno o varios tipos de lectinas funcionales que se unen especficamente a N-acetilglucosamina.
Datos bibliogrficos sustentan este hallazgo. En la especie Phaseolus vulgaris han sido
identificadas lectinas con especificidad por NAG.[12, 13, 14] Una bsqueda en la base de datos
LectinDB mostr, en concentro, las cuatro lectinas de unin especfica a este azcar. Estas lectinas
son Arcelin-5A, Arcelin-1, Alpha-AI-1 y PHA-L.
Arcelin-5A posee actividad defensiva[12] y Arcelin-1 incluso actividad insecticida.[14] Apha-AI-1
es una lectina inhibidora de la -amilasa pancretica porcina[13] y PHA-L es la fitohemaglutinina,
protena capaz de aglutinar clulas sanguneas.[5] La bsqueda bibliogrfica de estas lectinas en
Phaseolus vulgaris dio como resultado un caso de intoxicacin por elevadas cantidades de PHA
en alubias rojas cocinadas inapropiadamente[1], reforzando los resultados obtenidos. La
fitohemaglutinina es un agente txico descrito en P. vulgaris.[5] Los sntomas de una elevada
ingestin de PHA son vmitos, nuseas y diarrea, sntomas que desaparecen a las horas de
haberlas consumido.[5] Una incorrecta desactivacin de esta lectina (mediante altas temperaturas)
la hace convertirse en un alrgeno a tener en cuenta.[5]
En posteriores estudios, que escapan de los objetivos planteados para este trabajo fin de grado, se
podra producir una primera caracterizacin de las lectinas aisladas mediante una electroforesis
SDS-PAGE. Esta electroforesis permitira la identificacin del nmero de lectinas de diferente
peso molecular presentes en el eluato, as como su aislamiento. La banda o bandas reveladas en
la electroforesis se someteran a una nueva fase de estudio a fin de realizar una huella peptdica
de cada una de las lectinas aisladas. En la obtencin de esta huella peptdica se realizaran,
mediante colaboracin externa, una digestin con Tripsina y una posterior espectrometra de
masas de los fragmentos digeridos. Los espectros obtenidos para cada protena se enfrentaran a
la base de datos Mascot. Esta base de datos se encarga de realizar anlisis estadsticos
comparativos entre los espectros introducidos por el usuario y los espectros presentes en la base
21

Resultados y discusin
de datos. Los espectros contenidos en Mascot son los de protenas ya conocidas. Por lo tanto, este
ltimo paso revelara si las lectinas aisladas son algunas de las descritas para Phaseolus vulgaris.
En caso de encontrarse la fitohemaglutinina (PHA) entre las lectinas eluidas, el respaldo
bibliogrfico anteriormente mencionado hara suponer que la presencia funcional de esta lectina
en el plato precocinado y enlatado usado para este trabajo, sera el origen de posibles reacciones
adversas gastrointestinales tras su ingestin. Por otro lado, si las lectinas aisladas por el polmero
no se corresponden con ninguna presente en la base de datos, se podra concluir que son necesarios
ms estudios en esta especie a fin de conocer las caractersticas de estas nuevas lectinas.

22

Conclusiones

Conclusiones

6. Conclusiones
La capacidad del material sintetizado, a partir de clara de huevo, de atrapar lectinas funcionales
presentes en un plato cocinado, aporta las siguientes conclusiones:
-

La especie Phaseolus vulgaris posee lectinas de unin especfica a NAG que resisten un
proceso largo de coccin. Aunque se requieren estudios ms exhaustivos, la presencia
funcional de estas lectinas en alubias cocinadas podra tener que ver con posibles
reacciones gastrointestinales tras su ingestin.
La sntesis de un polmero polivalente, para la unin especfica de lectinas, a partir de las
glicoprotenas presentes en una fuente natural es sencilla y funcional. Podra constituir
una forma econmica de obtencin de polmeros universales. Polmeros aplicables a
multitud de estudios que se centren en el aislamiento y deteccin de lectinas.
Ante la problemtica en la obtencin qumica de una resina universal para la extraccin
de cualquier tipo de lectina, presente en una fuente natural, as como el elevado costo del
uso de estas resinas para una extraccin a gran escala; el hecho de sintetizar un polmero
entrecruzando glicoprotenas supone el abordaje de un problema qumico con
planteamientos biolgicos, para su posterior aplicacin en un campo bioqumico. Todo
esto es reflejo del actual flujo interdisciplinario de conocimientos en el mtodo cientfico.
Este trabajo fin de grado es una pequea muestra de que la lnea que delimita a las
disciplinas cientficas clsicas se estrecha ante el nacimiento de nuevas corrientes
experimentales ms eclcticas.

Conclusions
The capability of synthesized material, from the albumen of hen eggs, to catch functional
lectins in a cooked meal contributes the following conclusions:
-

Phaseolus vulgaris species has specific NAG bound lectins that resists a long boiling
process. Even though further studies are necessary, the functional presence of lectins in
cooked beans could be related to gastrointestinal reactions after consumption.
Synthesizing a polyvalent polymer for a specific bound of lectins from glycoproteins
present in a natural source is easy and functional. It might be an economical way to
obtain universal polymers applied to different studies focused on isolation and detection
of lectins.
Facing the problems of chemically obtaining a universal resin present in a natural
source, as well as the high expense of employing these resins at large-scale, synthesizing
a polymer by the crosslinking of glycoprotein means to deal with a chemical problem by
a biological approach for its subsequent application to a biochemical field. All this is a
reflection of the present interdisciplinary flow of knowledge in the scientific method. The
present work is a small sample showing that the defining line among different scientific
disciplines is narrowing as a result of eclectic, new-born experimental trends.

24

Bibliografa
1.

Vasconcelos, I. M. & Oliveira, J. T. a. Antinutritional properties of plant lectins. Toxicon

44, 385403 (2004).

2.

Vandenborre, G., Smagghe, G. & Van Damme, E. J. M. Plant lectins as defense proteins
against phytophagous insects. Phytochemistry 72, 15381550 (2011).

3.

Pusztai, A. Dietary lectins are metabolic signals for the gut and modulate immune and
hormone functions. Eur. J. Clin. Nutr. 47, 691699 (1993).

4.

Adamo, P. J. D. Eat right 4 your type. Hoop-a-Joop LCC. (1996).

5.

Kumar, S., Verma, A. K., Das, M., Jain, S. K. & Dwivedi, P. D. Clinical complications
of kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) consumption. Nutrition 29, 821827 (2013).

6.

Pohleven, J., trukelj, B. & Kos, J. Affinity Chromatography of Lectins.

Researchgate.Net (2009). disponible en
<http://www.researchgate.net/publication/221929571_Affinity_Chromatography_of_Lec
tins/file/3deec528478194d0ac.pdf>

7.

Zoccatelli, G. et al. Egg-matrix for large-scale single-step affinity purification of plant

lectins with different carbohydrate specificities. Protein Expr. Purif. 27, 182185 (2003).

8.

Abdou, A. M., Kim, M. & Sato, K. Functional Proteins and Peptides of Hens Egg
Origin, Bioactive Food Peptides in Health and Disease. Dr. Blanca Hernndez-Ledesma
(2013). disponible en <http://www.intechopen.com/books/bioactive-food-peptides-inhealth-and-disease/functional-proteins-and-peptides-of-hen-s-egg-origin>

9.

Braga, R. C. et al. Evaluation of Caesalpinia pulcherrima endospermic gum as affinity

matrices for galactose-binding lectins interaction. Brazilian Arch. Biol. Technol. 54,
283292 (2011).

10.

Teixeira, D. M. a et al. Spondias purpurea Exudate polysaccharide as affinity matrix for

the isolation of a galactose-binding-lectin. Carbohydr. Polym. 70, 369377 (2007).

11.

Gillie, J. K., Hochlowski, J. & Arbuckle-Keil, G. a. Infrared spectroscopy. Analytical

chemistry 72, 71R79R (2000).

12.

Goossens, a, Dillen, W., De Clercq, J., Van Montagu, M. & Angenon, G. The arcelin-5
gene of Phaseolus vulgaris directs high seed-specific expression in transgenic Phaseolus
acutifolius and Arabidopsis plants. Plant Physiol. 120, 10951104 (1999).

13.

Santimone, M. et al. Porcine pancreatic -amylase inhibition by the kidney bean

(Phaseolus vulgaris) inhibitor (-AI1) and structural changes in the -amylase inhibitor
complex. Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics 1696, 181190 (2004).

14.

Fabre, C. et al. Characterization and sugar-binding properties of arcelin-1, an insecticidal

lectin-like protein isolated from kidney bean (Phaseolus vulgaris L. cv. RAZ-2) seeds.
Biochem. J. 329 ( Pt 3, 551560 (1998).

25