MTODOS DE SECUENCIACIN MASIVA

FECHA:20/11/2014

Mtodos de Secuenciacin Masiva

Por el mtodo automtico de secuenciacin de Sanger se han conseguido
enormes logros y avances, incluyendo la secuenciacin del genoma humano
completo, pero esta tecnologa tiene la limitacin de solo poder realizar 96 o
384 reacciones en paralelo, lo que conlleva a un gasto considerable de tiempo
y de costos. En cambio, hoy en da, un genoma humano puede secuenciarse en
27 horas, y cuesta entre cinco mil y ocho mil dlares, esto gracias al uso de
mtodos de secuenciacin masiva, con la cual se pueden analizar muchas
muestras a la vez, teniendo la capacidad de producir una enorme cantidad de
datos de una manera muy barata.
Para la realizacin de estos mtodos se pueden emplear diversas formas de
preparar la hebra molde y secuenciar el DNA en estudio.
Preparacin de la hebra molde.
En general, la hebra molde se inmoviliza sobre un soporte, que corresponde a
una superficie slida, facilitando la realizacin de miles, e incluso millones, de
reacciones de secuenciacin simultneamente.
-

Clonally amplified templates.

La mayora de los sistemas de imgenes no pueden detectar (no tienen
suficiente sensibilidad) seales de fluorescencia muy bajas, por lo que se
necesita la amplificacin del DNA molde. Uno de los mtodos de
amplificacin ms habituales es la Emulsin PCR, en que el DNA se
amplifica dentro de una gota de agua en un sistema libre de clulas
(emulsiones en microrreactores) y se crea una librera de fragmentos, a
los cuales se les unen una serie de adaptadores universales en los
extremos, permitiendo amplificar toda una serie de genomas complejos
con un mismo juego de primers. Despus de la unin de los adaptadores,
el dsDNA se separa en ssDNA y se captura sobre la superficie de unas
bolas, las cuales se inmovilizan en un gel de poliacrilamida sobre un
portaobjetos, para as unirse qumicamente sobre una superficie de
vidrio o depositarse en pocillos individuales de una placa de muy
pequeo volumen donde se realizar la posterior secuenciacin.
Otro mtodo usado para preparar el DNA es la Amplificacin en fase
slida, o bridge PCR, en que los primers forward y reverse se unen
covalentemente al portaobjetos. Se pueden obtener entre 100 y 200
millones de clusters de hebras molde separados espacialmente con
extremos libres a los que se puede hibridar un primer universal para
iniciar la secuenciacin.

Single-molecules templates.

Este tipo de tecnologa requiere de menor cantidad de primers (<1 g)

que el mtodo anterior y adems no requiere de un PCR previo que
pueda ocasionar mutaciones.
Antes de realizar la secuenciacin, se inmovilizan las molculas de DNA
sobre un soporte slido mediante la unin covalente de los primers, las
hebras molde o la polimerasa al soporte para unir el resto de las
molculas sobre las que se encuentran junto al soporte y lograr el
aumento en un gran nmero de copias.
Secuenciacin del DNA.
En general, existen cuatro grandes mtodos de secuenciacin:
-

Cyclic Reversible Termination (CRT).

Primero, La DNA polimerasa unida al DNA con el primer, incorpora (por
complementariedad de bases) un solo nucletido marcado con
fluorescencia, para que luego se laven los nucletidos no incorporados y
se lea la fluorescencia mediante lseres para determinar la identidad del
nucletido incorporado. Luego, sigue un paso de ruptura para eliminar el
grupo terminador.

Sequencing by ligation (SBL).

Al igual que el anterior, es mtodo cclico pero que utiliza la DNA ligasa
en lugar de la DNA polimerasa y sondas marcadas con fluorescencia.
La sonda marcada hibrida con su regin complementaria que es
adyacente al molde con el primer y luego se aade la DNA ligasa que
une la sonda con el primer. Luego, se lee la fluorescencia para
determinar la identidad de la sonda ligada.
El ciclo se repite usando sondas hidrolizables para eliminar el fluorforo o
eliminando e hibridando un nuevo primer al DNA molde.

Single Nucleotide Addition (SNA) o Pyrosequencing.

Es un mtodo no electrofortico basado en bioluminiscencia que mide la
liberacin de pirofosfatos inorgnicos convirtindolos en luz visible
mediante reacciones enzimticas. A diferencia del resto de mtodos de
que utilizan nucletidos modificados para terminar la sntesis de DNA,
este mtodo manipula la DNA polimerasa aadiendo uno de los dNTPs en
cantidades limitantes. Luego de esto, la DNA polimerasa extiende el
primer y se para hasta despus de la adicin del siguiente dNTP
complementario en el siguiente ciclo.
El orden e intensidad de los picos de luz se miden como diagramas de
flujo ("flowgrams") que muestran la correspondiente secuencia del DNA.

Real Time Sequencing.

El mtodo implica la continua incorporacin de dNTPs marcados con

fluorforos al mismo tiempo que se lee la fluorescencia del DNA
sintetizado.

Aplicaciones.
En el ltimo tiempo, los Mtodos de Secuenciacin Masiva han permitido su
aplicacin a diversos mbitos:
-

Esta nueva generacin de mtodos de secuenciacin ha tenido un

importante impacto en la investigacin genmica. Se han utilizado para
aplicaciones de secuenciacin estndar, tales como la secuenciacin del
genoma y la resecuenciacin, y para nuevas aplicaciones an sin
explorar mediante el mtodo de secuenciacin de Sanger. Algunas de los
avances que se han podido conseguir son la secuenciacin del
transcriptoma y el anlisis de las modificaciones epigenticas de las
histonas y el DNA

En el rea clnica, esta poderosa tecnologa puede ahora tambin abrir

vas para permitir a los mdicos realizar un diagnstico gentico
integral. Por ejemplo, las miocardiopatas son enfermedades
multignicas que requieren del uso de estos mtodos para su anlisis.
Adems, estos mtodos permiten crear estrategias de diagnstico
prenatal dirigidas a la deteccin de aneuploidas y sndromes de
delecin/duplicacin.

Tambin, se estn utilizando estos mtodos para el descubrimiento y

desarrollo de nuevos frmacos. Las primeras aplicaciones se han
centrado en las reas teraputicas de la oncologa y las enfermedades
infecciosas, aunque, ahora emerge su uso en el desarrollo
biofarmacutico y de produccin de vacunas en pruebas.

Bibliografa
-

Secuenciacin masiva. Next Generation Sequencing (NGS). (s.f.).

Recuperado
el
19
noviembre
de
2014,
de

http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?
p=Aplicacion_Secuenciacion_Masiva
Morozova, O. & Marra, M.. (2008, noviembre). Applications of nextgeneration sequencing technologies in functional genomics. Genomics,
92, pp.255264.
Haas, J.,Katus, H. & Meder, B.. (2011, octubre). Next-generation
sequencing entering the clinical arena. Molecular and Cellular Probes,
25, pp.206-211.
Woollard, P.,Mehta, M., Vamathevan, J., Van Horn, S., Bonde, B. & Dow,
D.. (2011, junio). The application of next-generation sequencing
technologies to drug discovery and development. Drug Discovery Today,
16, pp.512-519.
Rodrguez-Santiago, B. & Armengol, L.. (2012, abril). Resumen - Abstract
- Texto completo - PDF Tecnologas de secuenciacin de nueva
generacin en diagnstico gentico pre- y postnatal. Diagnstico
Prenatal, 23, pp.56-66.