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Resumen
Abstract
A partir de la emisin de los permisos de liberacin al ambiente de maz (Zea mays L.) genticamente modificado (GM) en
el ao 2009, en Mxico fue necesario realizar la deteccin,
identificacin y cuantificacin de organismos genticamente modificados (OGM) de los cultivos en el pas. El objetivo
del presente estudio fue validar la tcnica de cuantificacin
absoluta de mezclas de hoja en fraccin masa de maz GM a
travs de la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) en tiempo real (qPCR) y digital (dPCR). Mezclas de
hojas de maz modificado con el evento MON810 se prepararon con hojas de maz convencional, fueron analizadas con la
tcnica de qPCR, y como calibrantes se usaron un plsmido
de referencia certificado y ADN obtenido de una hoja con
la modificacin MON810, y con la tcnica de dPCR, la cual
permite la medicin precisa del nmero de copias iniciales
de ADN en las muestras y no usa calibrantes. La prueba en
qPCR cumpli con los criterios de validacin, como lmite
de cuantificacin, intervalo dinmico, eficiencia de amplificacin, coeficiente de correlacin y estimacin de la incertidumbre. Adems, se valid la tcnica de dPCR previo a la
cuantificacin de las mezclas, usando materiales de referencia
certificados (MRC). Una vez validada la tcnica de dPCR se
cuantific la cantidad de material GM en las mezclas y los resultados entre ambas tcnicas fueron comparables, indicando
que pueden aplicarse para cuantificar la modificacin gentica en los cultivos y emitir los resultados en fraccin masa o en
nmero de copias. Los resultados muestran que se puede realizar la cuantificacin de material genticamente modificado
de cultivos en Mxico con resultados confiables.
Introduction
Introduccin
n Mxico, entr en vigor la Ley de Bioseguridad de Organismos Genticamente Modificados en 2005 y su reglamento en 2008, por
lo cual la Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA), a
travs del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y
Calidad Agroalimentaria (SENASICA) inici las actividades de inspeccin, vigilancia y monitoreo de los
cultivos genticamente modificados (GM) en todo el
pas. El Centro Nacional de Referencia en Deteccin
de Organismos Genticamente Modificados (CNRDOGM), donde se desarroll este estudio, valida los
mtodos para asegurar la confianza en los resultados
emitidos. El SENASICA enva las muestras al CNRDOGM para su anlisis. Las muestras deben ser de
las primeras etapas de crecimiento de la planta, para
dar a la autoridad un periodo suficiente para el ejercicio de sus facultades si es necesario. La mayora de
los mtodos validados en el mundo para el anlisis de
OGM usan muestras de harina de las semillas, como
maz, soya o algodn (Luque-Perez et al., 2013; Mazzara et al., 2013), por lo cual, es conveniente tener
mtodos validados aplicables a las matrices que se
analizan en el pas, como las hojas de plantas de maz.
La PCR es la tcnica ms usada para el anlisis
de ADN de los organismos derivados de la biotecnologa moderna. La PCR en tiempo real o qPCR es
una tcnica sensible, rpida y cuantitativa; pero, las
limitaciones son la necesidad de usar un calibrante,
realizarla en un laboratorio que trabaje en un Sistema
de Gestin basado en la norma internacional ISO/
IEC 17025:2005, y usar MRC generados por una
institucin competente (el et al., 2006), los cuales, en muchos eventos con modificacin gentica,
no estn disponibles inmediatamente en la mayora
de los pases, incluyendo Mxico. Estas limitaciones
pueden ser superadas por la nueva tcnica dPCR,
la cual permite cuantificar el nmero de copias de
una secuencia de ADN en una muestra a travs de
la amplificacin desde una sola copia por divisin de
la muestra en arreglos digitales. Esta tcnica permite
obtener molculas individuales de ADN en cada uno
de los cientos de pozos pequeos donde se realiza la
reaccin; esta cuantificacin es una respuesta lineal y
no necesita calibrante como referencia. Se basa en el
concepto de diluciones lmite usadas para enriquecer
secuencias minoritarias por un proceso de particin.
En este proceso no hay diferencias potenciales por
374
efectos de la matriz entre el estndar y la muestra investigada, como en la qPCR, donde el ciclo de amplificacin determina la concentracin inicial de la
secuencia de ADN analizada por interpolacin con
una curva de calibracin (Corbisier et al., 2010). La
tcnica de dPCR no se usa para cuantificar muestras
en hoja de maz GM.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la cuantificacin de mezclas en fraccin masa y
en nmero de copias del evento MON810. El evento MON810 es una construccin gentica generada
con fines comerciales por Monsanto Company (Monsanto Company, 2002) que contiene una parte del
marco abierto de lectura (ORF) del gen cry1Ab de la
bacteria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Monsanto Company, 2002; CERA, 2012), construccin
que se introdujo en el genoma de maz (maz comercial: YielGard-Monsanto Company). La transformacin permite expresar a este tipo de maz MON810
un fragmento de la protena CryA1b de 91 kDa
(CERA, 2012), un pptido que confiere resistencia a
dao por insectos del orden Lepidptera (Monsanto
Company, 2002) y cuya liberacin al ambiente fue
primero en los EE.UU. en 1995 (CERA, 2012).
Materiales y Mtodos
Toma de muestra
El estudio se realiz en el CNRDOGM del SENASICA. A
partir del permiso de liberacin al ambiente 094/2010 (CIBIOGEM, 2010), en julio de 2011 se recolectaron aleatoriamente
51 hojas de maz (Zea mays) de un cultivo GM proveniente de
Chihuahua, que contena el evento MON810 y 32 hojas de maz
convencional. A cada hoja (convencional y GM) se le asign un
cdigo con el cual se identificaron durante todo el estudio.
Acondicionamiento
La presencia del evento MON810 o la ausencia de modificacin se verific en segmentos, menores de 3 cm, del pice de
todas las hojas. Con el resto de cada hoja se formaron lotes de
10.05 g, se etiquetaron y almacenaron a -20 C.
Liofilizacin
Las hojas se almacenaron 48 h a -70 C y se deshidrataron
en una liofilizadora (LABCONCO, Kansas City, MO, USA) a
-52 C y 0.22 mBar. Las muestras se pesaron a las 6, 24 y 48 h
hasta peso constante y se almacenaron a -20 C.
GUTIRREZ-ANGOA et al.
375
Extraccin de ADN
El ADN genmico se extrajo con el mtodo comercial Fast
ID Genomic DNA Extraction Kit (Genetic ID NA, Inc. Fairfield, IA, USA). En tubos de 15 mL se mezclaron 2 g de la muestra y 6 mL de solucin de lisis, se homogeneiz y se agregaron
30 mL de proteinasa K, se homogeneiz con vortex, se incub 1 h
a 65 C y centrifug 5 min a 4500 g. Un mL de sobrenadante,
por duplicado, se transfiri a un tubo de 2 mL y se agreg un
volumen igual de cloroformo, se agit en vortex y se centrifug
5 min a 9391 g. De la fase acuosa se transfirieron 900 mL a tubos
de 2 mL, se agreg un volumen igual de solucin de unin y
se agit en vortex. La mezcla se centrifug 3 min a 9391 g, el
sobrenadante se pas a travs de una columna de unin de ADN
colocada en el sistema de vaco para columnas de unin a ADN
QIAvac 24 Plus (QUIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU.). En el
mismo equipo se lavaron las columnas con 800 mL de solucin
de lavado y se realizaron tres lavados con 800 mL de etanol al
75 %; la ltima centrifugacin se realiz a 9391 g por 3 min. La
columna se transfiri a microtubos de 1.6 mL y se agregaron 50 mL
de amortiguador 1X TE, se incub 5 min a 65 C, se centrifug
3 min a 9391 g y se repiti una vez el procedimiento con
50 mL de amortiguador 1X TE, para obtener un volumen final
de 100 mL de amortiguador 1X TE con ADN en suspensin. La
extraccin de ADN del material liofilizado se hizo con 200 mg
de muestra, se mezclaron con 2 mL de amortiguador de lisis y se
adicionaron 10 mL de proteinasa K; despus se realiz el mismo
procedimiento para el Fast ID Genomic DNA Extraction Kit.
La concentracin se determin con un espectrofotmetro de ultra bajo volumen NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,
Wilmington, DE, USA) y las muestras se estandarizaron a una
concentracin 50 ng mL-1 con agua estril. Todas las muestras se
almacenaron a -20 C.
Identificacin del evento especfico MON810
La identificacin del gen endgeno hmgA y del evento especfico MON810 en cada muestra se realiz por duplicado, en el
equipo de PCR tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems Inc.,
Foster City, CA, USA) con TaqMan Universal PCR Master Mix,
iniciadores y sondas TaqMan (ABI, ibid). Las secuencias fueron
tomadas del mtodo validado por la European Union Reference
Laboratory for GM Food and Feed y la European Network of
GMO Laboratories (EURL-GMFF y ENGL, 2010). hmgA con
un producto de amplificacin de 79 pb: (f ) 5-TTG GAC TAG
AAA TCT CGT GCT GA-3, (r) 5-GCT ACA TAG GGA
GCC TTG TCC T-3, (s) 5-(FAM)-CAA TCC ACA CAA
ACG CAC GCG TA-(TAMRA)-3; y MON810 con un producto de amplificacin de 92 pb: (f ) 5-TCG AAG GAC GAA
376
GGA CTC TAA CGT-3 (r) 5-GCC ACC TTC CTT TTC
CAC TAT CTT-3; (s) 5-(FAM)-AAC ATC CTT TGC
CAT TGC CCA GC-(TAMRA)-3. Cada reaccin se prepar
a un volumen final de 20 m L, con 10 m L de Master Mix, sonda
e iniciadores, con concentracin final de 180 nM y 300 nM, respectivamente, 2 m L (100 ng) de ADN molde y la cantidad suficiente de agua estril para completar los 20 m L. Cada anlisis por
PCR incluy testigos negativos, con ADN de semilla de algodn
(Gossypium hirsutum) para la respuesta a la secuencia endgena de
maz hmg, una muestra de maz no modificado para la secuencia
MON810, y un blanco de reactivos (sin ADN), por duplicado.
Las condiciones de termociclado fueron 1 ciclo a 50 C por 2 min,
luego 1 ciclo a 95 C por 10 min y 40 ciclos de amplificacin de
95 C por 10 s, alineamiento y extensin de 60 C por 1 min.
Elaboracin de mezclas GM
Mezclas GM al 0.1, 1 y 10 % se prepararon con hojas hmedas
y liofilizadas identificadas como positivas (GM) y negativas (convencionales) a la presencia del evento especfico MON810 (Cuadro 1). Las hojas con humedad se colocaron en un mortero, se
trituraron con nitrgeno lquido hasta que el tamao de partcula
pareciera homogneo. La cantidad de hoja GM correspondiente
al porcentaje masa fue pesada, se agreg hoja convencional hasta
completar 10 g y la mezcla se homogeneiz. De los 10 g se obtuvieron cuatro submuestras, de 20.2 g, y cada una se coloc
en un mortero limpio. El mismo procedimiento se realiz para
las mezclas de 0.1 y 1 %. Las mezclas se sometieron al proceso
de reduccin de tamao de partcula, con nitrgeno lquido, en
mortero, hasta alcanzar el tamao menor y homogneo de partcula posible. El mismo procedimiento se aplic a las mezclas con
hojas liofilizadas, pero las mezclas tuvieron 2 g de peso total y se
dividieron en cuatro submuestras de 20020 mg cada una. El
ADN fue extraido despus del acondicionamiento con el mtodo
ya descrito.
Mezcla GM
Hoja de maz
no filizada)
Hoja de maz
(liofilizada)
GM
(%)
10.0
1.0
0.1
10.0
1.0
0.1
Rplicas de las
mezclas
Cantidad de mezcla
para extraccin de
ADN
Rplicas de ADN
4
4
4
4
4
4
2 0.2 g
2 0.2 g
2 0.2 g
200 20 mg
200 20 mg
200 20 mg
8
8
8
8
8
8
hmgA
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
GUTIRREZ-ANGOA et al.
377
ng de secuencia GM
OMG(%) =
100
ng de secuencia hmgA
(1)
OMG(%) =
cantidad de secuencia GM
100
cantidad de secuencia hmgA
(2)
Para estas pruebas, cada muestra se analiz por cuadruplicado empleando las plataformas LightCycler 480 (LC480) (Roche
Inc., Indianapolis, IN, USA ), ABI7500 y ViiA 7 (ABI, ibid);
correspondientemente, se utiliz en cada reaccin de PCR Light
Cycler 480 Probes Master (Roche, ibid) y TaqMan Universal
PCR Master Mix (ABI, ibid). En todos los casos, iniciadores y
sondas TaqMan (ABI, ibid) para MON810 y hmgA ya descritas,
en un volumen final de 20 mL, que incluan 10 mL de Master
Mix, sonda e iniciadores a una concentracin final de 180 nM y
300 nM, respectivamente, 2 mL de ADN y la cantidad suficiente
de agua estril para completar 20 mL.
Cada anlisis por PCR incluy testigos negativos con ADN
de una especie diferente a maz, en este caso ADN de semilla de
algodn para la respuesta a la secuencia endgena de maz hmg, y
para la secuencia MON810 una muestra de maz no modificado,
as como un testigo reactivos (sin ADN), ambas por duplicado.
Las condiciones de termociclado fueron: 1 ciclo a 95 C por 10
min, y 40 ciclos de amplificacin de 95 C por 10 s, alineamiento
de 60 C por 30 s y elongacin de 60 C por 1 min. Las curvas
378
OMG(%) =
ng de secuencia GM
100
ng de secuencia hmgA
(1)
OMG(%) =
cantidad de secuencia GM
100
cantidad de secuencia hmgA
(2)
d i + buRSD g
uc = u Cref
IP
(3)
donde uc: incertidumbre tpica combinada; u(Cref): incertidumbre del componente o material de referencia; u(RSDIP): incertidumbre del componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad.
uc = u RSDIP =
SD
n
(4)
U=(uc)k
(5)
d i + buRSD g
uc = u Cref
IP
(3)
uc = u RSDIP =
SD
n
(4)
(5)
U Relativa =
U Relativa =
U (%)
100
x (%)
(6)
U (%)
100
x (%)
(6)
GUTIRREZ-ANGOA et al.
379
copias de secuencia GM
OGM (%) =
100
copias de secuencia hmgA
(7)
Anlisis de dPCR
En la fase final de anlisis, el programa OpenArray Digital PCR genera el valor en nmero de copias y el intervalo de
380
OGM (%) =
copias de secuencia GM
100
copias de secuencia hmgA
(7)
Analysis of dPCR
In the final phase of analysis, the OpenArray Digital PCR
software generates the value in copy number and the confidence
interval of each analyzed sample on the OpenArray Digital PCR
plate. For each sample, the software generates the copy numberof
each sub-array with a confidence interval of 95 % by counting
the number of positive reactions, relative to the number of
partitions, using the Poisson binomial approximation based on
the number of partitions that the amplification products contain
OpenArray
384-Well
Sample plate
OpenArray AccufillTM
System
1
10
11
12
A
B
C
D
Subarray
a
b
c
d
e
f
g
h
OpenArray Digital
PCR Plate
33 nL per reaction
1 2
3 4
5 6 7
Figura 1. Distribucin de la mezcla de reaccin desde la placa de 384 pozos a placa OpenArrayDigital PCR.
Figure 1. Distribution of the reaction mixture from a 384 wells plate to the well OpenArrayDigital PCR plate.
FG logFG1 H IJ IJ
H H C KK
M=
FG logFG1 1 IJ IJ
H H CKK
(8)
FG logFG1 H IJ IJ
H H C KK
M=
FG logFG1 1 IJ IJ
H H CKK
(8)
GUTIRREZ-ANGOA et al.
381
50 L
50 L
150 L TE
Starting concentration
2 x 105 copies
of MON810 / L
expected
copies per reaction
200 L TE
5 x 105
copies / L
200 L TE
2 x 104
copies / L
105
copies / L
Dilution 1:10 (10 L ADN + 90 L TE)
until the following concentrations
50
copies / L
100
copies / L
0.33
copies
0.66
copies
200
copies / L
1.32
copies
DRM 436IIa
5 L
5 L
5 L
45 L H2O
Starting concentration
50 ng / L
5 ng / L
45 L H2O
0.5 ng / L
(x2 L)
45 L H2O
0.05 ng / L
(x2 L)
1 ng / L
0.1 ng / L
hmgA
0.24 copies
2.42 copies
MON810
0.09 copies
0.90 copies
Figura 3. Diluciones del MRC DRM 436IIa para su cuantificacin por dPCR.
Figure 3. Dilutions of MRC DRM 436IIa for quantification by dPCR.
382
donde M: nmero de molculas por panel; H: nmero de particiones que contienen producto amplificado; C: nmero total de
particiones analizadas.
Anlisis estadstico de los resultados del dPCR
El programa Digital PCR genera el valor promedio y un
intervalo de confianza para cada cuantificacin en nmero de
copias. Para las mezclas GM, donde los resultados se expresan
en porcentaje de la secuencia GM con respecto a la secuencia
endgena, el anlisis estadstico se realiza con las ecuaciones 3
a 6, considerando U(ref ) igual a 0 porque no se usa material
de referencia. Las frmulas de incertidumbre estn referenciadas
a la gua de medicin de incertidumbre publicada por la JRC
(Trapman et al., 2009), pero la incertidumbre del material de
referencia en el clculo es cero debido a que la PCR digital no
necesita un material de referencia para la cuantificacin.
Resultados y Discusin
Anlisis del material recolectado
La identificacin de la modificacin gentica
MON810 se realiz en las 51 hojas recolectadas (Figura 4) a partir del permiso de liberacin al ambiente
094/2010 (CIBIOGEM, 2010), y se comprob en
47 de ellas; pero en ninguna de las 31 hojas convencionales se detect la modificacin gentica. Adems
de la identificacin de la modificacin gentica de
MON810, en todas las hojas se realiz la amplificacin de la secuencia endgena del maz (hmgA),
que sirvi como secuencia normalizadora para las
pruebas cuantitativas en qPCR. La amplificacin
de esta secuencia fue positiva en todas las hojas, con
valor experimental promedio CthmgA=23.5 y para la
secuencia transgnica de CtMON810=26.3 (Figura 5).
La diferencia entre la secuencia endgena y la GM
fue 2.8 ciclos, que es mayor al esperado de 1 Ct. Lo
anterior tiene como base la ecuacin de la PCR (2n),
donde n es el nmero de ciclos de amplificacin, y la
composicin gentica terica del ADN de la hoja de
maz GM, en la cual 50 % del material gentico proviene de la herencia paterna o materna. En este caso,
comercialmente se usan lneas de herencia paterna, y
se esperaba que el nmero de copias GM en el tejido
vegetal se encontrara en esa proporcin, y genera una
reaccin de qPCR con Ct de amplificacin del gen
endgeno con un ciclo antes que Ct de la secuencia
GUTIRREZ-ANGOA et al.
383
Figura 4. Recoleccin de muestras a partir del permiso de liberacin al ambiente 094/2010 ubicado en el estado de Chihuahua
(CIBIOGEM, 2010), de un cultivo de maz genticamente modificado conteniendo el evento MON810 y de maz convencional.
Figure 4. Sample collection of genetically modified maize containing the MON810 event, based on permit 094/2010 for release
into the environment, in the state of Chihuahua (CIBIOGEM, 2010), and of conventional maize.
GM. Los resultados permitan esperar que las mezclas presentaran un comportamiento atpico, ya que
el valor calculado no correspondi al 50 % del valor
terico.
Elaboracin de mezclas GM y extraccin de ADN
Las mezclas GM con hojas frescas y liofilizadas
se analizaron segn el diagrama en la Figura 6 y las
cantidades del Cuadro 2. En todos los casos se obtuvieron concentraciones de ADN mayores a 50 ng
mL-1, por lo cual se cuantificaron las mezclas.
Cuantificacin de las mezclas por qPCR
Los resultados de la cuantificacin de las mezclas
con muestras hmedas y uso de la curva de calibracin
384
10
Rn
0.1 0.1
0.01
MON810
0.001
10
12 14
hmg
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Cycle
de la hoja 100 % GM estuvieron lejos de los valores tericos, inclusive cuando se consider la incertidumbre relativa asociada con los valores promedio
esperados (Cuadro 3). Una sobre estimacin en la
cantidad de OGM se observ respecto a los valores
tericos. Se descart que los factores analticos fueran
el origen de la desviacin en los resultados de cuantificacin, ya que los valores de eficiencia de amplificacin en las curvas de calibracin se encontraron dentro de los rangintervalos permitidos (Mazzara et al.,
2008; ENGL Working Group on Method Verification, 2011), 98.3 y 90.3 % para hmgA y MON810,
y ambas con R20.98. Adems, los valores calculados de la desviacin estndar relativa en condiciones
de repetibilidad (RSDr) mostraron que el ensayo es
preciso, pues las desviaciones fueron menores de 25 %,
de acuerdo con la normativa europea (Mazzara et
al., 2008; ENGL Working Group on Method Verification, 2011). La incertidumbre relativa, aplicable
slo a la cuantificacin experimental, es aceptable y
comparable con resultados de publicaciones similares
GUTIRREZ-ANGOA et al.
385
10
Rn
Identification of
MON810 event
0.1 0.1
0.01
MON810
0.001
hmg
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Cycle
or
Preparation of mixtures:
10 %, 1 % y 1 % GM
Quantification of the % GM
dPCR assay
qPCR assay
Comparision of results
vs
Figura 6. Diagrama experimental del estudio para la comparacin en la medicin del % OGM mediante las tcnicas de qPCR y
dPCR.
Figure 6. Experimental diagram of the study for comparison of % GMO measurement with the techniques qPCR and dPCR.
Cuadro 2. Muestras para la elaboracin de las mezclas de maz genticamente modificado (GM).
Table 2. Samples for preparation of the mixtures of genetically modified (GM) maize.
Mezcla en %
terico (mm)
Hoja con humedad
Hoja liofilizada
10.0
1.0
0.1
10.0
1.0
0.1
Hoja GM
(g)
1.0486
0.1031
0.0100
0.2010
0.0260
0.0024
386
Mezcla
(g)
10.0915
10.0351
9.9996
1.9967
2.0019
2.0017
Cuadro 3. Resultados de cuantificacin por qPCR de mezclas de maz genticamente modificado (GM) hmedas.
Table 3. Results of the qPCR quantification of mixtures of moist genetically modified (GM) maize leaves.
Parmetro estadstico
Valor promedio en fraccin masa
Valor promedio experimental
S
RSDr
U(RSDIP)
Ucombinada (uc)
Uexpandida
Urelativa
Mezclas % GM (m/m)
0.100
0.424
0.105
6.160
0.026
0.026
0.052
12.322
1.030
2.194
0.662
7.540
0.165
0.165
0.331
15.088
10.390
16.496
3.660
5.550
0.915
0.915
1.830
11.092
Donde S: desviacin estndar, RDRr: componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): Incertidumbre del componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condition in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
Cuadro 4. Resultados de cuantificacin por qPCR de mezclas de maz genticamente modificado (GM) liofilizadas.
Table 4. Results of qPCR quantification of lyophilized genetically modified (GM) maize mixtures.
Parmetro estadstico
Valor promedio en fraccin masa
Valor promedio experimental
S
RSDr
U(RSDIP)
Ucombinada (uc)
Uexpandida
Urelativa
Mezclas % GM (m/m)
0.120
0.083
0.025
9.640
0.008
0.008
0.016
18.940
1.300
1.010
0.139
4.360
0.044
0.044
0.088
8.800
10.070
11.310
0.925
2.580
0.292
0.292
0.585
5.170
Donde S: desviacin estndar, RDRr: componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): incertidumbre del componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condition in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
GUTIRREZ-ANGOA et al.
387
Parmetro de aceptacin
Eficiencia (90-110 %)
Pendiente (-3.1 a -3.6)
R2 0.98
94.574
-3.459
1.000
92.593
-3.513
0.999
Cuadro 6. Evaluacin de las mezclas de maz genticamente modificado (GM) liofilizadas por qPCR el plsmido EMR AD-413
usado como calibrante certificado.
Table 6. Evaluation of lyophilized mixtures of genetically modified (GM) maize using the qPCR technique; the EMR-AD413
plasmid used as a certified calibrant.
Parmetro estadstico
Valor % GM (m/m)
Valor terico esperado
Valor promedio experimental
S
RSDr
U(RSDIP)
Ucombinada (uc)
Uexpandida
Urelativa
1.30
0.65
0.86
0.07
0.03
10.07
5.04
4.29
0.14
0.07
0.01
0.01
14.88
0.03
0.07
7.91
0.07
0.14
3.35
100.00
50.00
45.47
1.20
0.60
0.60
1.20
2.65
Donde S: desviacin estndar, RDRr: componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U(RSDIP): Incertidumbre del componente de medicin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, U: incertidumbre. v S: standard deviation,
RDRr: measurement component in conditions of repeatability and reproducibility, U(RSDIP): Uncertainty of the measurement condition in conditions of repeatability and reproducibility, U: uncertainty.
388
1.32
0.88
0.76
0.66
0.44
0.46
0.33
0
0.17
0.22
Expected
Undigested
plasmid
Digested
plasmid
Samples
Figura 7. Resultados obtenidos de la medicin en dPCR del material de referencia ERM-AD413 digerido y sin digerir. Las barras
en la figura representan los intervalos de confianza generados por el software OpenArray Real-Time PCR.
Figure 7. Results obtained of dPCR measure of the reference material ERM-AD413, digested and undigested. The bars in the
figure represent the confidence intervals generated by the software OpenArray Real-Time PCR.
GUTIRREZ-ANGOA et al.
389
DMR-436IIa quantification
54
52.55
52
50
48
45.69
47.27
46
44
42
42.13
39.22
40
38
37.35
36
41.49
38.57
35.48
34
32
0
0.1 ng
Expected
1 ng
Sample
Figura 8. Resultados obtenidos de la cuantificacin por dPCR en fraccin masa del MRC DMR-436IIa. Las barras en la figura
representan los valores de la incertidumbre expandida.
Figure 8. Results obtained in the quantification by dPCR in mass fraction of MRC DMR-436IIa.The bars in the figure represent
expanded uncertainty values.
390
Fluorescence
Fluorescence
429.422
387.670
Amplification of hmgA
sequence of 10 % GM
mixture with 1 ng of DNA
per subarray
339.338
249.253
143.668
69.054
62.334
0
8
A1
32
7
A3
A2
Cycle number
A4
A5
A7
A6
A9
A8
A10
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
16
24
32
56
48
40
64
72
80
36
31
27
22
18
13
9
4
0
A11
C1
19.000
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
B1
16
24
88
24
Amplification of hmgA
sequence of 1 % GM
mixture with 1 ng of DNA
per subarray
272.457
C2
D2
D1
24
A2
A3
B2
B3
Cycle number
A4
B4
A5
A6
A7
B5
B6
B7
A8
A9
B8
B9
A10
B10
B11
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
0
8
16
Fluorescence
24
32
56
48
40
64
72
80
36
31
27
22
18
13
9
4
0
A11
C1
32
88
24
32
96
C11
32
D6
D7
D8
D9
D10
D11
40
48
56
64
72
80
88
96
B2
C1
D1
D2
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Cycle number
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
16
24
32
48
40
56
64
72
80
88
36
31
27
22
18
13
9
4
0
96
397.408
4
A2
7
A3
230.845
Cycle number
A5
A7
A6
A9
A8
A10
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
24
32
40
56
48
64
72
80
35
31
27
22
18
13
9
4
0
A11
B1
16
19.000
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
A4
Amplification of MON810
sequence of 0.1 % GM
mixture with 100 ng of DNA
per subarray
314.126
88
96
0
ETF17-Ct
22.000
C2
64.282
72.261
32
B11
C10
D5
A3
147.563
24
B10
C9
D4
24
A2
166.522
16
B9
C8
D3
A1
16
Amplification of hmgA
sequence of 0.1 % GM
mixture with 1 ng of DNA
per subarray
260.783
B8
C7
C5
Fluorescence
355.044
A1
B7
C6
B5
C4
1%
449.305
B6
B4
C3
35
31
26
22
18
13
9
4
0
A11
Amplification of MON810
sequence of 1 % GM
mixture with 100 ng of DNA
per subarray
20.000
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
ETF19-Ct
B1
A10
B3
237.654
65.885
16
A9
A6
323.539
75.486
A8
A5
16
151.770
ETF18-Ct
B2
C1
173.971
23.000
ETF14-Ct
B1
A7
A4
409.424
370.943
A1
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fluorescence
469.429
10 %
Cycle number
A3
16
Fluorescence
A2
A1
32
96
0
ETF13-Ct
ETE96-Ct
225.002
159.169
21.000
Amplification of MON810
sequence of 10 % GM
mixture with 10 ng of DNA
per subarray
306.336
A2
A3
B1
B2
C1
C2
D2
A1
16
24
32
D1
16
10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Cycle number
A7
A8
A9
A10
B6
B7
B8
B9
B10
B11
C6
C7
C8
C9
C10
C11
D6
D7
D8
D9
D10
D11
A4
A5
A6
B3
B4
B5
C3
C4
C5
D3
D4
D5
24
0.1 %
32
40
48
56
64
72
80
36
31
27
22
18
13
9
4
0
A11
88
96
Figura 9. Curvas y mapas de amplificacin de Mezcla GM al 10, 1 y 0.1 %. Columna A, resultados de amplificacin secuencias
hmgA. Columna B, resultados de amplificacin de secuencia MON810.
Figure 9. Amplification curves and maps of the 10, 1 and 0.1 % GM mixtures. Column A, results of amplification of the hmgA
sequences. Column B, results of amplification of the MON 810 sequence.
GUTIRREZ-ANGOA et al.
391
Cuadro 7. Resultados de la cuantificacin de 0.1, 1, 10 y 100 % de la hoja de maz genticamente modificado (GM) por las tcnicas qPCR y dPCR.
Table 7. Results of quantification of 0.1, 1, 10 and 100 % genetically modified (GM) maize leaf using the qPCR and dPCR
techniques.
Muestra
%GM
Mezcla 0.1 %
Mezcla 1 %
Mezcla 10 %
Hoja GM
dPCR
0.031
0.300
3.690
41.870
Conclusiones
En el presente estudio la tcnica de PCR digital
se valid usando materiales de referencia certificados
por institutos de metrologa nacional e internacional.
Los resultados fueron comparables entre los valores
reportados en los certificados y los determinados
experimentalmente con la plataforma OpenArray
Real-Time PCR System. Adems, los resultados se
expresaron en nmero de copias para ERM-AD413,
y en porcentaje GM para DMR-436IIa, lo cual contribuye a la validacin de la tcnica en la cuantificacin de secuencias transgnicas. La cuantificacin de
hojas de maz por PCR en tiempo real y PCR digital con la presencia del evento MON810 despus de
validar la tcnica permiti obtener los resultados de
392
Urelativa
%GM
12.98
7.70
10.39
2.45
0.07
0.86
4.29
45.45
qPCR
Urelativa
89.13
7.01
1.39
0.13
Conclusions
In this study, the digital PCR technique was
validated using reference materials certified by
national and international metrology institutes.
cuantificacin de mezclas por PCR digital ms cercanos a los porcentajes en fraccin masa de las mezclas
realizadas que los obtenidos por la tcnica tradicional
de PCR en tiempo real.
La caracterizacin de cada hoja recolectada permiti establecer la presencia o ausencia del evento
MON810; a la vez, esto condujo a realizar las mezclas
genticamente modificadas en fraccin masa al 0.1, 1
y 10 %, con una hoja 100 % GM como calibrante
para los ensayos por PCR en tiempo real y el tejido
liofilizado, lo cual mejor la cuantificacin. Con las
mezclas liofilizadas se obtuvieron resultados comparables entre las dos tcnicas PCR en tiempo real y
digital. Los resultados por PCR digital son los ms
prximos a los valores esperados en fraccin masa de
las mezclas.
En conclusin, la tcnica de PCR digital a travs
de la plataforma OpenArray Real-Time PCR System es aplicable para cuantificar el material vegetal
genticamente modificado y puede utilizarse en la
caracterizacin de materiales de referencia, usados
como calibrantes, en pruebas de PCR en tiempo real.
Literatura Citada
Bhat, S., J. Hermann, P. Armishaw, P. Corbisier, and K. R. Emslie, K. 2009. Single molecule detection in nanofluidic digital
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CIBIOGEM (Comisin Intersecretarial de Bioseguridad de los
OGM). 2010. Registro Nacional de Bioseguridad de los Organismos Genticamente Modificados. CIBIOGEM, CONACYT. http://www.conacyt.gob.mx/cibiogem/index.php/
resoluciones/permisos. (Consulta: agosto de 2013).
Corbisier, P., Broeders, S., Charles, S., Trapmann, S., Vincent,
S. and Emons, H. 2007. Certification report. Certification
of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA fragments. Certified Reference Material ERM-AD413. Institute for Reference Material and Measurements (IRMM)
and European Reference Materials (ERM). 37 p. https://
ec.europa.eu/jrc/sites/default/files/rm/ERM-AD413_report.
pdf. (Consulta: agosto de 2013.
Corbisier, P., S. Bhat, L. Partis, V. R. D. Xie, and K. R. Emslie. 2010a. Absolute quantification of genetically modified
MON810 maize (Zea mays L.) by digital polymerase chain
reaction. Anal. Bioanalytical. Chem. 396: 2143-2150.
ENGL Working Group on Method Verification. 2011. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. Joint Research
Centre and Office for Official Publications of the European
Communities, 23 p. http://publications.jrc.ec.europa.eu/
pppvPPP
GUTIRREZ-ANGOA et al.
393
394