DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571

RESUMEN
En el presente trabajo se ha desarrollado el cultivo celular de la cepa Kluyveromyces
Marxianus NRRL Y-7571 realizando su manipulacin desde su estado inactiva en agar.
El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales tales como activacin en
estufa, inoculacin en agar, dndole todas las condiciones y facilidades para que pueda
crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico
(30ml), el cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere para su ptimo
desarrollo.
Luego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido
dentro de otro medio al que se denomina mnimo (300 ml) por sus limitaciones en cuanto a
nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el
microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue
Fructosa.
Se trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular
con los nutrientes exactamente necesarios para tal accin y al mismo tiempo como va
disminuyendo

el sustrato en este caso principalmente la fructosa. Y esto es posible

determinar haciendo evaluaciones tales como

crecimiento de biomasa mediante

absorbancia (640 nm en el espectrofotmetro) y el ensayo con reactivo DNS para el caso

del sustrato con una absorbancia de 540 nm en el espectrofotmetro y la generacin de
productos como el etanol el cual ser medido mediante CG (cromatografa de gases)
usando como factor externo n-propanol.
Se obtuvo un rendimiento promedio de: biomasa de 0,237 g/g glucosa. A partir de la
biomasa obtenida se pudieron obtener los parmetros cinticos los cuales fueron un max =
0,225 hr-1, YP/S =1,736 x 10-3 g de Etanol/g de Fructosa, QX/S = 0,056 g de Biomasa/hora.

Pgina 3

INTRODUCCION
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y
conocimiento del crecimiento de

microorganismos. Resulta entonces importante

el

conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus

productos. Para ello la preparacin de medios de cultivo para estos microorganismos es un
buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as como tambin el
seguimiento de la cintica nos proporciona datos mucho ms prcticos y exactos sobre la
velocidad y caractersticas del crecimiento del microorganismo tratado.
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios
constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en
los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin
de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente
respecto de los nutrientes que pueden necesitar.
Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el tratamiento de
un microorganismo (Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571), iniciando desde su
siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico,
empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rpida activacin, para que
luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mnimo;
es decir con los mnimos requerimientos; en el cual es ms factible determinar la cintica
de crecimiento.
Dentro de su importancia en la agroindustria la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y757 1es muy valiosa para la conversin de fructosa en etanol que puede mejorar la
economa de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. Con la
conversin de la fructosa, la potencial reduccin del precio est en funcin de tres
parmetros de fermentacin: el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad.
Pgina 3

Asumiendo altos valores para estos parmetros, la reduccin mxima puede volverse de
40%. Hoy en da es conocido que un nmero de levaduras fermenta fructosa en etanol,
siendo Kluyveromyces Marxianus de las ms eficientes, especialmente en relacin con el
rendimiento y la proporcin volumtrica. Empleando esta levadura para la fermentacin de
la D-xilosa, la reduccin en el precio del etanol alcanza el 70% del mximo asequible.
Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571es una de las mejores cepas de levadura
natural capaz de convertir el azcar hexosa, fructosa, en etanol. Para desarrollar una ms
eficiente pentosa en el proceso de fermentacin, la nutricin se basa en estrategias para
mejorar la vitalidad de levadura y la fermentacin se explor la eficiencia mediante el
estudio de variadas culturas en nutrientes tales como: aminocidos, urea, vitaminas, y
minerales.
A. CULTIVO POR LOTES
La fermentacin por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde todos
los materiales requeridos estn cargados en el fermentador, previamente desinfectados
antes del proceso de fermentacin y los residuos removidos al final. Los nicos
materiales extrados y agregados durante el curso de una fermentacin por lotes son el
intercambio de gases y las soluciones de control de pH, respectivamente. En este modo
de funcionamiento, las condiciones estn cambiando continuamente con el tiempo, y el
fermentador es un sistema de estado inestable.
La ventaja principal es el menor riesgo de contaminacin con respecto a otros procesos
de fermentacin (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado.
La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre lotes,
comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza, esterilizacin y
procesos de salida. Otra desventaja es la inhibicin del crecimiento por metabolitos
primarios, secundarios y por la ausencia de nutrientes.

Pgina 3

B. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO

Si el microorganismo crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las
clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente
formndose una suspensin de clulas libres.
En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio lquido, se pueden
diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento
microbiano:
1.- Fase latencia o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y
el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a
velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas
durante esta fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a
continuacin.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u

otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un
Pgina 3

metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una

acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia
industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente
esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la
fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con
mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes
naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del
cultivo.
C. FACTORES

FISICOQUMICOS

QUE

AFECTAN

LA

RAPIDEZ

DE

CRECIMIENTO.
Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento
Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde
pH=2 para los acidfilos hasta pH=11 para alcalfilos. En general los
microorganismos que toleran pH cidos no toleran pH alcalinos y viceversa.
Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante
conocer cul es el pH ptimo para el crecimiento. En la fig. 11 est representada en
forma general la variacin de un con el pH para hongos y bacterias. De la misma
surge claramente que en general los hongos tienen un pH ptimo cercano a 5
mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; adems debido a la forma
"achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del ptimo
no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican
el pH del medio de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es
frecuente incluir en las medias sustancias que acten como tampn (buffer) a fin de
evitar que el pH se aleje del ptimo.

Pgina 3

El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada

reaccin qumica individual, de todas las que conforman el metabolismo, es
afectada por la temperatura, por lo que un incremento de sta resulta en una mayor
velocidad de reaccin. Esto se traduce en un aumento de pH con la temperatura.
Por otra parte, aumentos

posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo
que el valor de un decrece rpidamente. La temperatura ptima resulta de la
interaccin de estos dos efectos.
La temperatura: La temperatura ejerce una influencia determinante en el conjunto
de la actividad celular microbiana .A temperaturas bajas esa actividad puede ser
bloqueada totalmente .Dado que es una propiedad comn a todas las reacciones
qumicas, el crecimiento microbiano es acelerado por un aumento de temperatura y
se puede considerar, globalmente, que la velocidad de crecimiento se duplica
cuando la temperatura se eleva en 10 C.
De acuerdo a la temperatura en la cual se observa este fenmeno, las levaduras son
microorganismos mesfilos que prefieren temperaturas intermedias vecinas a
30C .Su crecimiento no se efecta por debajo de 15C , ni por arriba de los 45C
para la mayor parte de ellos. La temperatura ptima para Kluyveromyces marxianus
var. se encuentra entre 30 45 C, Elsevier, 1990.
El pH: Es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que estos slo
pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El
Pgina 3

pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que,
en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de
una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana
citoplsmica. Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH
del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH
se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de cidos
orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico). Por consiguiente, es necesario
controlar el pH de los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir
la auto esterilizacin del cultivo
El potencial redox y el oxgeno: Son factores determinantes del crecimiento y del
metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su
capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus caractersticas oxidantes o
reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el
nico, es la concentracin de oxgeno, O2. Hay microorganismos que requieren
ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes
reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe
confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se
produzca el crecimiento.
Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio
cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios aerotolerantes
como las bacterias lcticas o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios
estrictos como los clostridios). El rendimiento Yx/sde los procesos fermentativos es
menor que el de los respiratorios: las bacterias y las levaduras producen menos
biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.
La concentracin de los compuestos que se necesitan para el crecimiento
Es importante porque puede provocar una disminucin de la tasa de crecimiento a
causa de la alta presin osmtica del medio. Hemos visto que en el curso de la fase
exponencial del crecimiento , las tasas de crecimiento era independiente de la
concentracin de los distintos componentes del medio de cultivo .Por debajo de
Pgina 3

cierto nivel de concentracin esto ya no es verdad .Si se cultiva un microbio en un

medio sinttico que tiene un exceso de todos los compuestos que necesita a
excepcin de uno , el crecimiento no se puede efectuar .Cuando se suministran los
compuestos en cantidades pequeas y variables de un ensayo a otro , la tasa de
crecimiento permanece inferior a tasa mxima mientras la concentracin no es
suficiente , y aumenta al incrementar esa concentracin .
Para todas las concentraciones superiores a S, la tasa de crecimiento es igual a la de
crecimiento mxima .Esto nos explica porque la tasa de crecimiento es constante en
la fase exponencial, aunque las concentraciones sean superiores a S .Esto , nos
explica tambin , al menos en parte , lo que se produce en la fase de disminucin de
velocidad. Tambin algunos alcoholes superiores pueden ser utilizados como fuente
de carbono y ser transformado en cido lctico (Montao Ortega. M, 1991)

CUADRO DE CLASIFICACION
Especies ms frecuentes
Gnero

Caractersticas
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyce unisporus
Candida kefir
Kluyveromyces marxianus var.
marxianus.

LEVADURAS

Levaduras no fermentadoras de
la lactosa, que producen alcohol
y CO2 a partir de glucosa.
Levaduras fermentadoras de la
lactosa.
Responsables de formacin de
CO2 y contribuyendo al
caracterstico sabor y aroma.

D. LEVADURA:
Pgina 3

Las levaduras constituyen una rama menor de los hongos en cuanto a nmero de
especies (350 especies reagrupadas en 39 gneros) Tienen una importancia grande por
sus actividades bioqumicas .Algunas realizan fermentaciones que se utilizan desde los
orgenes de la civilizacin (fermentacin alcohlica) Estas actividades tienen
aplicaciones industriales muy importantes.
Su carcter comn es el estado unicelular permanente o predominante en ausencia de un
verdadero micelo cenoctico.
CONDICIONES NECESARIAS PARA LA FERMENTACION:

EL pH para KluyveromycesMarxianus NRRL Y-7571 est en el rango de 4.0 a 5.0

Las levaduras son microorganismos mesfilos, esto hace que la fermentacin pueda
tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13-14C hasta los 33-35C.
Dentro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura mayor ser la velocidad
del proceso fermentativo siendo tambin mayor la proporcin de productos
secundarios. Sin embargo, a menor temperatura es ms fcil conseguir un mayor
grado alcohlico, ya que parece que las altas temperaturas que hacen fermentar ms
rpido a las levaduras.
Debido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aerbicas, no utilizan los
azcares por va fermentativa sino oxidativa, para obtener con ello mucha ms
energa.
Las levaduras fermentativas necesitan los azcares para su catabolismo, es decir
para obtener la energa necesaria para sus procesos vitales, pero adems necesitan
otros substratos para su anabolismo como son nitrgeno, fsforo, carbono, azufre,
potasio, magnesio, calcio y vitaminas, especialmente tiamina (vitamina B1). Por
ello es de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada
para poder llevar a cabo la fermentacin alcohlica.

Pgina 3

 Las levaduras tienen necesidad de oxgeno para desarrollarse, pero ellas se adaptan
durante un cierto tiempo a la vida anaerbica.

La levadura usada es la KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571 siendo el sustrato

la glucosa. La frmula qumica de KluyveromycesMarxianuses la siguiente:

C1.94 H1.79 O0.60 N0.17

La va metablica que utiliza es: las Pentosas.

La concentracin mxima celular es de 2 g/L.

mx. = 0.25 h-1. referencial por el paper

Metabolismo celular

Macronutrientes

C, N, Mg, S, K y P

Micronutrientes

Ca, Na, Fe, Cu, Mn, Mo, Co y Zn

Autotrfico

Pgina 3

A. Estado: Medio lquido

B. Composicin: Medio sinttico o qumicamente definido
Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo mnimo.
Fuente de carbono y energa :

Glucosa C6H12O6

Fuente de N

Sulfato de amonio (NH4)2SO4

Fuente de S

Sulfato de amonio (NH4)2SO4

Fuente de P

Fosfato dicido de potasio KH2PO4

Fuente de K

Fosfato dicido de potasio KH2PO4

Fuente de Mg

Sulfato de magnesio heptahidratado

MgSO4.7H2O

Fuente de S

Sulfato de magnesio heptahidratado

MgSO4.7H2O

OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVOS GENERALES:
Disear un medio de cultivo celular por lotes en matraces, usando como
fuente de carbono glucosa y empleando una cepa de Pichiastipitis NRRL Y7124
Determinar los parmetros cinticos de la cepa Pichiastipitis NRRL Y-7124
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
Determinar la cintica de crecimiento de Pichiastipitis NRRL Y-7124
Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono glucosa.
Determinar la cintica de generacin de etanol
Determinar el M ,YX/S, YP/S.
Evaluar el valor del pH durante la cintica.

MATERIALES Y METODOS
Material Biolgico: Cepa liofilizada de KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571
PREPARACIN DE SLIDO DE MANTENCIN:
Materiales y Equipos:
Pgina 3

Balanza analtica

Matraz Erlenmeyer de 250 ml.

Mechero Bunsen

Gradilla

6 Tubos de ensayo con tapas.

Pipeta de 10 ml.

Vaso de precipitado.

Cocina a gas

Olla a presin.

Varilla de vidrio

Guantes.

Esptula

Reactivos y nutrientes:
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta
Agar.
PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:
Materiales y Equipos:

Balanza analtica

2 Matraz de 125 ml.

Una probeta de 100ml

Micropipeta

Estufa

Algodn

Pgina 3

Gasa

Varilla de vidrio

Esptula

Reactivos y nutrientes:

Glucosa

Extracto de levadura

Solucin de sales

Agua destilada

Alcohol

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:

Materiales y Equipos:

Matraz de 1 L

2 Matraces de 125 ml.

Varilla de vidrio

Balanza analtica

Gasa y algodn

Olla a presin

Reactivos y nutrientes:

Glucosa

(NH4)2SO4

Solucin de sales

KH2PO4

MgSO4.7H2O

Extracto de Levadura

Agua destilada

Alcohol

Pgina 3

 INOCULACIN AL MEDIO DE ACTIVACIN:

Materiales y equipos

Matraz de 125 ml.

Algodn

Gasa

Agua destilada

Aza bacteriolgica

Shaker

Mechero Bunsen, trpode y rejilla

Espectrofotmetro

Balanza Analtica

Centrfuga

Horno Esterilizacin

Agitador

Autoclave

Incubadora

Shaker

Pgina 3

RESULTADOS Y DISCUSION
A.
N

Hora

Tiempo

ABS 640nm

1
09:00
0
0.245
2
10:30
1.5
0.441
3
12:00
3
0.746
4
01:00
4
0.346
5
02:00
5
0.375
6
03:30
6.5
0.411
7
05:00
8
0.448
8
06:30
9.5
0.562
9
08:00
11
0.488
10
09:30
12.5
0.564
11
11:00
14
0.563
12
12:00
15
0.557
CULTIVO CELULAR POR LOTES

X g/L

fd

0.34928315
0.70053763
1.24713262
1.59086022
1.74677419
1.94032258
2.13924731
2.75215054
2.35430108
2.76290323
2.75752688
2.72526882

1
1
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3

CINE
TICA
DE

A continuacin se darn a conocer los datos obtenidos en todo el desarrollo

fermentativo de la levadura Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571 para la
produccin d ETANOL, utilizando como fuente de carbono a la FRUCTOSA.

Pgina 3

El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para las sntesis
celulares y para cubrir las necesidades energticas de las levaduras.
La presencia de una concentracin elevada de extracto de levadura y la inclusin de
factores (temperatura y agitacin) de crecimiento en el medio de cultivo
favorecieron el crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571.
Probablemente el incremento del crecimiento fue por la inclusin de estos factores
fue debido a que la fructosa es un monosacrido y es fcil para la levadura
aprovechar la fuente de carbono que esta molcula pose, lo cual favorece a la
produccin de etanol como producto de la fermentacin.

Graficando los datos obtenidos, tendremos que:

CRECIMIENTO MICROBIANO
3
2.5
2
CONCENTRACION g/l

BIOMASA

1.5
1
0.5
0
0

10

TIEMPO

hr.

12

14

16

Pgina 3

Figura N1. Cintica de Crecimiento de la Levadura Kluyveromyces Marxianus

NRRL Y 7571
En la figura se pueden distinguir tres zonas:
Fase de latencia. En esta fase, el microorganismo, sometido a un crecimiento
previo en un inculo, se adapta a las condiciones del caldo de fermentacin.
Bsicamente es un periodo de ajuste metablico. El crecimiento es bajo, y
prcticamente no se presenta produccin de etanol. Debido a la transferencia del
microorganismo del inculo al nuevo medio, ste puede verse afectado por
cambios en el pH, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en los
inhibidores de crecimiento
Fase exponencial. Esta fase es la ms importante para el proceso, ya que la
mayor parte del etanol se produce en este periodo. Depende parcialmente de la
concentracin inicial del sustrato, y la cantidad de etanol a producir est
condicionada por la duracin de esta fase. El tiempo en esta fase duro 9 horas.
Fase estacionaria. En este punto se detiene el crecimiento, debido al
agotamiento de los nutrientes en el caldo de fermentacin, as como al efecto
inhibidor que provoca la concentracin de etanol en el medio. La masa de los
microorganismos permanece constante en esta fase, por el equilibrio que se da
entre los que permanecen vivos y los muertos.
No se pudo determinar la fase de muerte o decaimiento ya que se par la
fermentacin por motivos de tiempo.
En la tabla 01 se muestra los valores experimentales del crecimiento en funcin al
tiempo de fermentacin y en la Fig. 01 se observ que el crecimiento celular se
realiz rpidamente, esto probablemente ocurri por la fuente de carbono utilizada,
la FRUCTOSA, que como se recuerda en la ruta metablica todo nace en la
GLUCOSA, la cual todava tiene que existir una enzima isomerasa para formar la
FRUCTOSA, entonces todo estas reacciones bioqumicas ya no ocurren, entonces

Pgina 3

existe un ahorro de energa, lo que demuestra que la levadura reconoci fcilmente

al medio.
El crecimiento microbiano de la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 se dio
debido a que utilizamos fructosa como fuente de carbono y una alta concentracin
de extracto de levadura, entre los dems nutrientes y sales. Los compuestos
carbonados son utilizados por las levaduras a la vez como fuente de energa y como
fuente de carbono.
El nitrgeno es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el medio
de cultivo. Es utilizado por las clulas en los aminocidos, los nucletidos y algunas
vitaminas. Pueden ser utilizadas numerosas fuentes de nitrgeno. Todas las
levaduras son capaces de utilizar el nitrgeno en forma de ion amonio. Los iones
amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro amoniaco, el nitrato
amnico, el fosfato amnico y sobre todo el sulfato amnico, mejor compuesto pues
aporta al mismo tiempo el azufre necesario para la sntesis de ciertos aminocidos.
(KREGER VAN RIJ, 1984).
Los

extractos

de

levadura

son

excelentes

substratos

para

muchos

microorganismos. Son productos a partir de la levadura de panadera mediante

autolisis a 50 55C.
El extracto de levadura contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua
y carbohidratos. (WOLG, 1989)
La temperatura corriente de cultivo de las levaduras se sita entre 25 y 30C que
permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras. Sin
embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas ptimas de
crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hbitat natural. Siendo la
membrana citoplasmtica de las clulas cultivadas a temperatura elevada mas
resistente a las desnaturalizaciones trmicas que la de las clulas cultivadas a baja
temperatura. (WALTON y PRINGLE 1980).
Pgina 3

De acuerdo la composicin del medio de cultivo se observa que el crecimiento de la

Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 es ptimo lo cual demuestra que el
medio es propicio para el desarrollo del cultivo y cumple con los requerimientos
mnimos que necesita las clulas para crecer.

Determinacin Del MX Del Microorganismo Kluyveromyces Marxianus NRRL Y

7571 en un Cultivo por Lote con FRUCTUOSA como Fuente de Carbono
Ajustando nuestros puntos, reconocimos la zona de fase exponencial en el cual se tuvo un
mximo crecimiento celular de las levaduras Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571.
Tiempo
0
1.5
3
4

LN
(X/Xo)
0
0.6959651
7
1.2727193
7
1.5161472
4

Sabemos que la cintica de crecimiento microbiano, est dado matemticamente por la

siguiente ecuacin:
dx
= . x
dt

dx
= . dt
x

INTEGRANDO:
ln (

xf
)= .t
xo

Graficando:

Pgina 3

LN(X/Xo) vs. TIEMPO

2
1.5 f(x) = 0.38x + 0.06
R = 0.99
1
LN(X/Xo)

LN(X/Xo)
Linear (LN(X/Xo))

0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Tiempo

(h)

Entonces, tendremos que:

CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
dx
= . x
dt
INTEGRANDO:
xf
ln ( )= .t
xo

dx
= . dt
x

y=0.3833 x +0.0567

mx=0.3833

h-1
Pgina 3

Entonces:

td= ln (2)/0.3833=1.8h
En la tabla 02 y fig. 02 se observa que la cintica de consumo de la fructosa se
encuentra en funcin a la velocidad de crecimiento de la Kluyveromyces Marxianus

NRRL Y 7571, probablemente debido a que la fuente de carbono es destinado a la

formacin de productos y a la manutencin de las clulas por esta razn el crecimiento
se ve afectado y solo se observa un crecimiento mximo de 1.516 g/l estando el medio
de cultivo diseado para 2 g/l; esto se debi a la buena fuente de nutrientes. Asimismo,
se observ que el crecimiento celular aumento debido al extracto de levadura como
fuente de aminocidos, favoreci a que no exista una fase de latencia tan prolongada y
as obtener una curva de crecimiento ms notoria y pronunciada
Tericamente, el kluyveromyces marxianus presenta un =0.48 h-1 pero como se puede
notar el calculado prcticamente, es mucho menor que el terico, esto debido a que
inicialmente se tuvieron todas las condiciones favorables, para su crecimiento, motivo
por el cual, no se tuvo una fase de latencia prolongada, pero con el pasar de las horas,
posiblemente la levaduras haya comenzado a sintetizar el etanol, por lo que su
velocidad de crecimiento disminuyo, asimismo por la expulsin del CO 2, producto de la
fermentacin el cual no es removido.
Tambin, mencionemos a cada uno de los nutrientes, como el fsforo se halla incluido
en los cidos nucledos y los nucletidos di y tri fosfato. Se encuentra tambin en forma
de polmeros lineales de polifosfato que juegan un papel importante en la regulacin del
metabolismo celular. (KULAEV y VAGABOV 1983).

La concentracin en iones fosfatos (

) regula la sntesis de los lpidos y los

glcidos. El fosforo es asimilado por la clula en forma de iones ortofosfato (

las fuentes de fosforo en el medio de cultivo deben estar constituidas por el

dihidrogenofosfato de potasio (

) o por el hidrogenofosfato disdico (

Pgina 3

). En condicin limitante de fosforo en el medio, la clula sintetiza una

fosfatasa acida (fosfomonoesteresa), localizada en la pared que libera fosforo a partir de
los esteres fosfricos (SCHURR y YAGIL, 1971).
EL 60% del azufre est incorporado en las protenas. El 5% est en forma de sulfato
inorgnico libre el resto est en forma de enlace disulfuro y en aminocidos sulfurados
libres. El azufre esta igualmente presente en algunas vitaminas. La fuente de azufre
ms frecuentemente utilizada en los medios de cultivo es el sulfato amnico. (PARRY y
col, 1976).
El potasio es el elemento mineral cualitativamente ms importante en la levadura. Tiene
papeles fisiolgicos importantes:

Catin regulador: por cada penetracin de un catin metlico divalente, hay

excrecin de 2K+ (FUHRMANN y ROTHSTEIN, 1968).
A PH acido, el potasio estimula la fermentacin y la respiracin (PENA,
1980).
Acta como efector de numerosas enzimas: piruvato quinasa, aldolasa,
aldehdo deshidrogenasa y permeasa (ATPasa) (MAIORELLA Y col. 1984).
Interviene en la estructura de los ARN.
El magnesio es necesario para el buen funcionamiento de un centenar de enzimas del
metabolismo; juega el papel:

De activador de las enzimas glicoliticas.

De estimador de la sntesis de los cidos grasos.
De regulador de las ATPasas de las membranas.
Participa con el potasio en la penetracin del fosfato.

B. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES (FRUCTUOSA):

MTODO DEL DNS (CIDO DINITROSALICLICO)
Pgina 3

A continuacin se darn a conocer los datos obtenidos en el consumo de sustrato por

parte de la levadura Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571 para la produccin
d ETANOL, utilizando como fuente de carbono a la FRUCTOSA.

Tiemp
o
0
1.5
3
4
5
6.5
8
9.5
11
12.5

ABS 540nm

Sf g/L

0.594
0.459
0.042
0.014
0.04
0.108
0.116
0.125
0.126
0.123

3.69666457
2.84707363
0.22278162
0.04657017
0.21019509
0.2127124
0.22949444
0.24837424
0.25047199
0.24417873

Graficando:

CONSUMO DE SUSTRATO
4
3.5
3
2.5
CONCENTRACION g/l

SUSTRATO

2
1.5
1
0.5
0
0

TIEMPO

8 10 12 14
hr.

FIGURA 3: Curva de Consumo de sustrato de Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y 7571

Pgina 3

En la figura 3, se puede ver el consumo de sustrato en el medio de fermentacin que

comenz rpidamente, motivo por el cual anteriormente se observ una
insignificante fase de latencia. Vemos que el microorganismo metaboliz
rpidamente al sustrato, esto en parte se debi a las buenas condiciones iniciales
que se tuvo tales como el pHptimo, temperatura, buena aireacin y por su puesto
un rico medio de cultivo.
Segn Kosaric et al, 1987, 609 refiere En la fermentacin por lotes, se cargan en el
reactor el caldo de fermentacin (sustrato) y una solucin esterilizada previamente
inoculada
con
los
microorganismos. A lo largo de
la fermentacin suele aadirse
algo de oxgeno (en forma de
aire), agente antiespumante,
cidos o bases para controlar el
pH, nutrientes (si se requieren)
y antibiticos; asimismo se
aade inculo fresco si es
necesario.
La conversin de azcares en
un sistema por lotes simple es
de 75-95% del valor terico, con una concentracin final de etanol de 10-16% en
volumen. La productividad usual de procesos por lotes simples y convencionales es
de 1.8-2.5 g de etanol por litro del volumen del fermentador por hora.
C. DESARROLLO DEL INOCULO EN EL TIEMPO DE FERMENTACION
n

Hora

Tiempo

ABS

X g/l

ABS S

Sf g/L

0.34928315
0.70053763
1.24713262
1.59086022
1.74677419
1.94032258
2.13924731
2.75215054
2.35430108
2.76290323
2.75752688
2.72526882

0.594
0.459
0.042
0.014
0.04
0.108
0.116
0.125
0.126
0.123

3.69666457
2.84707363
0.22278162
0.04657017
0.21019509
0.2127124
0.22949444
0.24837424
0.25047199
0.24417873

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

09:00
10:30
12:00
01:00
02:00
03:30
05:00
06:30
08:00
09:30
11:00
12:00

0
1.5
3
4
5
6.5
8
9.5
11
12.5
14
15

0.245
0.441
0.746
0.346
0.375
0.411
0.448
0.562
0.488
0.564
0.563
0.557

Graficando:
Pgina 3

CRECIMIENTO DE BIOMASA
4
3.5
3
2.5
CONCENTRACION

BIOMASA

SUSTRATO

1.5
1
0.5
0
0

10 12 14 16

TIEMPO

FIGURA 3: Curva de crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y 7571 y

consumo de sustrato en el tiempo de fermentacin.

En la presente grafica se puede observar la relacin que existes entre el crecimiento

microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando
consume ms rpido el sustrato ah se da el crecimiento exponencial.
Pgina 3

El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentracin inicial del sustrato

limitante, esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de
sustrato a otro de carencia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores
que la mxima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar su
estructura interna a las nuevas condiciones.
Ahora se observa un decaimiento en el consumo rpido del sustrato, en las 4 primeras
horas, ahora pero se observa que el microorganismo sigue creciendo, esto se debe al
extracto de levadura, una fuente rica en aminocidos, vitaminas, minerales. Asimismo,
vemos que se llevara a cabo a la produccin de etanol la que tambin sirve de medio para
esta levadura para producir otros cidos, en otro proceso fermentativo.

RENDIMIENTO DE FRUCTOSA EN BIOMASA

Yx /s=

X
S
REEMPLAZANDO

Yx /s=

(1.590860220.34928315)
(0.046570173.69666457)
YX/S = 0.3401493

Ahora, segn la teora se tiene un rendimiento de Yx/s=0.568g/g. Ahora vemos que

obtenemos un rendimiento menor, los motivos por lo cual suceda esto es porque la
fructosa aqu tiene un doble papel de generar energa y material de construccin
celular.

PRODUCTIVIDAD EN BIOMASA
Productividad Mxima:
Pgina 3

Qx=

X
t
REEMPLAZANDO

Qx=

( 1.590860220.34928315)
(40)

Qx=0.31039427 g/l.h
Productividad Total :
Qx=

X
t
REEMPLAZANDO

Qx=

( 2.725268820.34928315)
(150)

Qx= 0.15839904 g/l.h

Entonces, se puede decir que se tiene una mayor productividad en la zona de
crecimiento exponencial esto es debido, a que existe una mayor aumento de
la biomasa celular.
Aireacin: Es un factor muy importante, ya que contribuye considerablemente al
adecuado crecimiento de los microorganismos. El oxgeno es especialmente necesario
cuando se lleva a cabo una fermentacin por lotes con altos niveles de azcares que
requieran un crecimiento prolongado de la levadura, o en procesos continuos, ya que la
levadura es incapaz de crecer por ms de cuatro o cinco generaciones en condiciones
totalmente anaerbicas (Kosaric et al, 1987, 603). Para ello, es necesario disponer de un
sistema adecuado de agitacin, de tal forma que haya un contacto permanente entre las
clulas y el sustrato nutritivo; asimismo, es importante desalojar el dixido de carbono
que se va produciendo, ya que en concentraciones relativamente pequeas inhibe el
crecimiento celular.
ANALISIS DEL pH
Pgina 3

La variacin del pH fue debido a la produccin de metabolitos producto de la

fermentacin la cual estuvo en mayor concentracin que los iones H + que se
libera al consumir el cloruro de amonio, lo cual implica que en vez que el pH
baje este tienda a subir y se vuelva casi un pH neutro. Las levaduras crecen bien
en medios con el pH ajustado entre 3.5 y 3.8, el grado de tolerancia a los cidos
vara segn la cepa y la especie, desde pH 2.2 a 8.0. (Pelczar J. Michael, 1982)
En los medios de cultivo, los nitritos forman a pH inferior a 6 acido nitroso que
es toxico para las clulas. La mayor parte de los aminocidos pueden ser
utilizados como fuente de nitrgeno. Sin embargo, segn los aminocidos, la
tasa de crecimiento de la levadura vara. Las mezclas de aminocidos permiten
un mejor crecimiento que un solo aminocido.

Si estn disponibles

simultneamente varias fuentes de nitrgeno estas no van hacer utilizadas a la

misma velocidad sino que la levadura va a consumir preferencialmente la
mejor. (COOPER 1982) define una buena fuente de nitrgeno por tres
criterios: penetracin rpida, conversin rpida en la clula con el mnimo de
tapas en amoniaco o acido glutmico o en los dos y sin efecto secundario toxico.

Parmetros cinticos determinados en la experiencia realizada de la Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y-7571 utilizando fructosa como fuente de carbono.

Parmetro cintico

Valor obtenido experimentalmente

m (h-1)

0,38

td (h)

1,81

Yx/s (g/g)

0,34

Xmax (g/l)

2.76

CONCLUSIONES

Pgina 3

Se logr disear el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr el
crecimiento de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571

El medio adecuado para la mantencin de un cultivo debe poseer una fuente de

carbono, nitrgeno y sales en cantidades adecuadas para as satisfacer los
requerimientos nutricionales del microbio.

La activacin celular permiti poner en funcionamiento nuevamente todas las

actividades metablicas de la Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 con el
desarrollo del inculo se alcanz una cantidad inicial de biomasa para iniciar la
fermentacin.

En el desarrollo de la fermentacin notamos que el consumo del nutriente es ms

acelerado que el crecimiento de la biomasa.

El diseo de los diferentes medios tanto activacin como fermentacin debe tener la
adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono, vitaminas (extracto de
levadura) y otros (las dems sales usadas) para que Kluyveromyces Marxianus
NRRL Y-7571pueda desarrollarse.

Se determin el contenido de azcares reductores mediante el mtodo del DNS,

para lo cual se realizaron diluciones 1:3 y 1:2, ya que el medio liquido de activacin
se encontraba con valores muy elevados de concentracin.

Se determin que para el medio de cultivo mnimo utilizado de la

KluyveromycesMarxianusNRRL Y-7571 los valores cinticos experimentales de
mx = 0,3833 h-1 , un td= 1.81 hr, YX/S = 0,34g de Biomasa/g de Fructosa.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Pgina 3

Biotecnologa.

Manual

de

Microbiologa

Industrial.

Wolf.

Grueguer.

AmmelieseCuerga. Editorial Acribia S.A. Zaragoza (Espaa). 1989. Tercera

Edicin. Pag 67 71.

D.VGuebel , A Cordenons , sobre La influencia de la tasa de transferencia de

oxigeno (OTR) y media composicin sobre la fermentacin de D-xilosa por
Pichiastipitis NRRL Y 7124 . 1990

Koch,A.L(1975). The kinetics of mycelial grown.J.Gen.Microbiol.89,209

Leveau, J. Y. y Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial. Los Microorganismos

de Inters Industrial. Editorial Acribia S. A. Zaragoza. Pag. 20-63

Microbiologia, Pelczar J. M.; Reid D. R. y Chan E.C.S. 2da Edicin, 1982.

Editorial McGraw-Hill de Mexico, S. A. De C. V.

QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera Bioqumica

E. Merck; Manual de Medios de Cultivo, Laboratorio. MICROBIOLOGIA

BIOQUMICA.

Leveau, J. Y. y Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial. Los Microorganismos

de Inters Industrial. Editorial Acribia S. A. Zaragoza. Pag. 20-63

Biotecnologa. Manual de Microbiologia Industrial. Wolf. Grueguer. Ammeliese

Cuerga. Editorial

Principles of Microbe and Cell Cultivation. S.J. Pirt. Blackwel l Scientific

Publications, 1975. Citado en http://mediosdefermentacion.pdf

Pgina 3

ANEXOS

DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACIN Y DE FERMENTACIN

Pgina 3

... (1)
Para fuente de carbono,
Para otra fuente,

=0.5

=1

Donde:

(2)

(3)
De (3):

(4)
De (4):

Si

. Entonces;

(5)

Para fuente de carbono,

Para otra fuente,
Ahora,

FUENTE

=1

=1.5

g/L

% CELULA

FRUCTOSA

ELEMENT
O
C

MgSO4.7H2O

0.01

MgSO4.7H2O

Mg

(NH4)2SO4

% NUTRIENTE
40

Yx/s

S (G/L)

S (G/L)

0.40

4.950

7.4250

11.55

1155.00

0.002

0.0026

0.1

19.86

198.60

0.010

0.0150

21.21

2.36

0.840

1.2603

Pgina 3

(NH4)2SO4

0.01

24.24

2424.00

0.001

0.0012

KH2PO4

28.68

28.68

0.069

0.1036

KH2PO4

0.25

22.79

91.160

0.022

0.0326

A. INOCULACIN AL MEDIO DE ACTIVACIN

Para la inoculacin partimos de la cepa incubada en medio slido de mantencin
(Pichia stipitis NRRL Y-7124)

Tomar

una azada e inocular en un matraz con 20 ml del medio de

activacin, con la ayuda del mechero.

Tapar el matraz que contiene el medio de activacin con un tapn de gasa y

algodn.

Llevar al Shaker a 220 rpm, T = 30C y un t=12 horas hasta alcanzar un

desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del
medio.

B. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL DNS

(CIDO DINITROSALICLICO)
La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)

200 ml/l de NaOH 2N

300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o

600 ml de agua, paralelamente se disuelve el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan
en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los
componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:

Tomar 1 ml de la solucin resultante y aplicar 1 ml de DNS.

Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para luego

dejar enfriar en agua con hielo por 3 minutos.

Pgina 3

Se aaden 10 ml de agua destilada.

Se deja reposar por 15 minutos y se agita en el agitador de tubos.

Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando tubo N 1 como blanco.

La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de

calibrado.

ml sol. estndar

1
2
3
4
5
6
7

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.05
0

ml agua
destilada
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.45
0.5

[FRUCTUOSA
]
2
1,6
1,2
0.8
0.4
0,2
0

ABS 540
nm
0.941
0.775
0.585
0,420
0,195
0,086
0
Pgina 3

CURVA DE CALIBRACIN DE AZUCARES REDUCTORES

1
f(x) = 0.48x + 0.01
R = 1

0.9
0.8
0.7
0.6
ABSORBANCIA 540 NM

abs

0.5

Linear (abs)

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

0.5

1.5

2.5

CONCENTRACION DE AZCAR

ECUACIN GENERAL:
GLUCOSA= ABS. 0.0066
0.4767

C. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR D.O

Pgina 3

El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la

concentracin de microorganismos, esto puede ser detectado fcilmente por
espectrofotometra a 640 nm. Para sta determinacin es necesario que previamente se
elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en
el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm. Durante 20

minutos.

Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada.

Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de

sustrato que pudieran alterar la determinacin.

Se elimina el sobrenadante, se redisuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80

C hasta peso constante.
CURVA DE CALIBRACION DE BIOMASA

N
Capacho

ml.
caldo
m.o

ml.
agu
a

ABS
(:640nm)

(g) P1
Peso
capacho

(g) P2
Peso
capacho+clula

(g/L)
X

0.1888

(g) P1
Peso
seco
clula
0.0073

2.5

2.5

0.838

0.1815

0.735

0.1998

0.2059

0.0061

1.22

0.444

0.2478

0.2506

0.0028

0.56

0.5

4.5

0.237

0.2298

0.2316

0.0018

0.36

0.3

4.7

0.148

0.2223

0.2233

0.0010

0.2

0.15

4.85

0.086

0.2096

0.2102

0.0006

0.12

1.46

Pgina 3

Curva de Calibracin de Biomasa

1
0.8
0.6

ABS 640 NM

f(x) = 0.56x + 0.05

R = 0.98

0.4

ABS
Linear (ABS)

0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

Concentracin de biomasa g/l

ECUACIN GENERAL
BIOMASA= ABS. 0.0501
0.558
D. CRECIMIENTO CELULAR
El medio rico se prepara y se esterilizara por separado
Para nuestro inoculado al medio rico, se har con cepas ya sembradas en el medio
de activacin, se realizara una azada en el matraces de 1 L.
El matraz preparado se llevara al shaker a 240 rpm, temperatura de 30 C haciendo
un seguimiento por cada hora.

Se toma datos por cada hora y se ira colocando en una tabla de datos.

E. ESTERILIZACIN DE PIPETAS

Las pipetas, sern lavados y secados en la estufa

Luego en cada pipeta se colocara un filtro de algodn para no contaminarlo al

momento de ser utilizada.
Pgina 3

 Las pipetas sern forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por un tiempo
20 minutos a temperatura de 140-150 C.
F. TCNICA DE ASEPSIA
Se usara en los das en que hay sembrado e inoculacin de clulas.

Para realizar la inoculacin es necesario y muy importante tener el lugar bien

desinfectado, por lo que se limpiara con paos de algodn toda la zona de
trabajo hasta 3 veces, as como tambin el total acomodo de las herramientas de
trabajo (tubos de ensayo y gradilla) a utilizar, etc.

Los tubos de ensayo y los matraces que sern utilizados en el medio rico
primero sern lavados, secados y esterilizados en la estufa por un tiempo 20
minutos a temperatura de 140-150 C.

Pgina 3