PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL

PRIMER CUATRIMESTRE

Lugar:

Laboratorio de docencia de Fisiologa Vegetal

Departamento de Ciencias de la Vida (U.D. Fisiologa Vegetal)

Material necesario:
-

Pinzas, bistur, tijeras, esptula

Trapo o toallitas

Una patata grande

Una cebolla

Rotulador de vidrio

Una regla

Los alumnos debern traer la bata de laboratorio

SEPARACIN Y CUANTIFICACIN DE PIGMENTOS DE

CLOROPLASTOS
Introduccin
En los cloroplastos se diferencian dos tipos de pigmentos:
Clorofilas: Son pigmentos fotosintticos cuya estructura est constituida por un tetrapirrol
cerrado con varios sustituyentes laterales (Figura 1). El anillo tetrapirrlico contiene un in Mg2+
en el centro complejado con los nitrgenos de dicho ncleo y un sistema de dobles enlaces
conjugados cuyos electrones son los responsables de la absorcin de la radiacin del espectro
visible. En el anillo IV se encuentra unido el fitol, una cadena hidrocarbonada que forma un
enlace ster con un propionilo del anillo. En las plantas existen dos tipos de clorofilas (a y b)
que se diferencian en el sustituyente R en el ciclo II del anillo tetrapirrlico (Figura 1). Las
clorofilas presentan mximos de absorcin prximos a los 400 y 600 nm (Figura 3). Ninguna de
ellas absorbe en el verde, lo que les da su color caracterstico.
Carotenoides: Son molculas hidrocarbonadas de 40 tomos de carbono. Los carotenoides
que participan en la fotosntesis son de dos tipos: tipo caroteno y tipo xantofila (Figura 2). Los
carotenoides tipo caroteno constan exclusivamente de carbono e hidrgeno. Los carotenoides
tipo xantofila contienen oxgeno adems de carbono e hidrgeno. El sistema conjugado de
dobles enlaces es el responsable de la absorcin de luz en el espectro visible. Su espectro de
absorcin muestra mximos de absorcin entre los 450 nm y 500 nm, correspondientes al azul
y al verde (Figura 3), por lo que la luz roja-anaranjada-amarilla que reflejan les proporciona su
color caracterstico.

Clorofilas

Figura 1. Estructura de la clorofila

Carotenoides
Carotenos

Xantofilas

Violaxantina

-caroteno

Lutena

-caroteno

-caroteno

Zeaxantina

Figura 2. Estructura de algunos carotenoides

Figura 3. Espectro de absorcin de algunos pigmentos fotosintticos

PARTE 1.- Separacin de pigmentos mediante cromatografa en papel

Objetivo y desarrollo de la prctica
El objetivo de la prctica es extraer y separar los diferentes tipos de pigmentos de cloroplastos
por cromatografa en papel en funcin de su polaridad relativa. Una vez separados, se
analizar su migracin a lo largo de la fase estacionaria.

Extraccin de pigmentos:
Comenzamos la experimentacin con la extraccin de los pigmentos de cloroplastos de 0.5
gramos de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde, con 5 ml de acetona
al 80%, disgregando el tejido vegetal en un mortero, de modo que se extraigan los pigmentos y
se disuelvan en acetona. Cuando la acetona est bien verde, el macerado se introduce en un
tubo de centrfuga de plstico y se centrfuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Despus de
centrifugar se obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos.

Realizacin de la cromatografa:
Se dispone de una tira de papel whatman n1 (fase estacionaria) en la que se dibuja con lpiz
una lnea a 1-2 cm de uno de sus extremos. Sobre el centro de esta lnea se deposita una gota
pequea del sobrenadante verde con una pipeta pasteur de vidrio. Esperamos a que se seque
y aplicamos una nueva gota en el mismo punto de aplicacin que la anterior, repitiendo la
operacin hasta aadir 7 a 8 gotas. Se introduce con cuidado la tira de papel con la muestra en
un tubo de ensayo que contiene 2 ml de la fase mvil (acetona:ter de petleo, 1:9 en
volumen).
El extremo del papel que ha de quedar ms prximo a la fase mvil es el que tiene la muestra.
Esta no puede quedar sumergida en la fase mvil. Se deja durante unos 30 minutos en la
oscuridad. Al cabo de este tiempo se saca la tira de papel del tubo, se seca y se analizan los
resultados (Figura 4).

Figura 4. Desarrollo de una cromatografa en papel

Nombre y Apellidos:...........

Grupo de Prcticas:......................................................................
RESULTADOS Y DISCUSIN

Calcular la movilidad relativa de los distintos pigmentos.

Explicar razonadamente los resultados.

PARTE 2.- Cuantificacin de clorofilas

Objetivo y desarrollo de la prctica

El objetivo de esta parte de la prctica es extraer los de pigmentos de cloroplastos de un
material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo.

Extraccin de pigmentos:

PROTOCOLO 1: Extraccin con acetona

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier
otro material verde, con 5 ml de acetona al 80%, disgregando el tejido vegetal en un mortero,
de modo que los pigmentos salgan al exterior y se disuelvan en acetona. Cuando la acetona
est bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrfuga de vidrio/plstico resistente
y se centrfuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Despus de centrifugar se obtiene un
sobrenadante verde que contiene los pigmentos. Ajustar el volumen final a 6 ml con acetona al
80%.

PROTOCOLO 2: Extraccin con etanol

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier
otro material verde cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0.5 cm que se
introducen en un tubo de ensayo con 6 ml de etanol al 80% de modo que los segmentos
queden bien sumergidos en el etanol. Incubar durante 20 minutos en un bao a 80 para que
las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo de este tiempo los
segmentos debern quedar totalmente decolorados y el etanol queda de color verde.

Medida de clorofila:
Se toman 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml con
acetona al 80% en la extraccin con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la extraccin
con etanol (protocolo 2). Despus se mide en un espectrofotmetro a longitudes de onda de
645 y 663 nm.

Para calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente frmula:

Clorofila total (g/ml o mg/l) = (20.2 DO645)+ (8.02 DO663)

Nombre y Apellidos:...........
Grupo de Prcticas:.................................................................................

RESULTADOS Y DISCUSIN

Calcula los g de clorofila que hay por gramo de hoja extrada con cada uno de los protocolos.

Relaciona la frmula utilizada para la cuantificacin de clorofilas con los espectros de absorcin
de los pigmentos fotosintticos.

REACCIN DE HILL
Introduccin
En 1939, Robin Hill observ que, al iluminar una suspensin de cloroplastos en presencia de
compuestos oxidados capaces de aceptar electrones se produca desprendimiento de oxgeno
y reduccin de estos aceptores segn la reaccin que lleva su nombre:
Luz

2A + 2H2O

cloroplastos

2AH2 +O2

Este es el proceso que tiene lugar durante la fase lumnica de la fotosntesis, en la que el
aceptor de electrones es el NADP+. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la
fotosntesis pudo ser separado del de la fijacin de CO2.

Figura 5.- Esquema del transporte electrnico fotosinttico y fotofosforilacin

Objetivo y desarrollo de la prctica
El objetivo de esta prctica es reproducir la reaccin de Hill utilizando 2,6-diclorofenol indofenol
(DPIP) como aceptor artificial de electrones y observar el efecto de diferentes factores sobre el
transporte electrnico fotosinttico. El DPIP, en las condiciones del experimento planteado, es
azul en estado oxidado (forma quinnica) pero se decolora lentamente cuando se reduce
(forma fenlica). La reaccin que tiene lugar es la siguiente:
Luz
2 DPIP(ox) + 2 H2O
Azul

cloroplastos

2 DPIP-H2(red) + O2
Incoloro

Sigue el protocolo siguiente:

Tomar 30 g de hojas de espinaca, lavarlas y secarlas. Cortar las hojas en trozos de
aproximadamente 2 cm y aadirles 150 ml de tampn A (0.4M Sacarosa, 0.03M KCl, 0.02M
Tricina pH 7.5) fro. Homogeneizar las hojas y filtrar a travs de cuatro capas de gasa. El
filtrado se reparte en tubos de centrfuga (10 ml por grupo) y se centrifuga a 2000 rpm durante
10 minutos. Se toma el precipitado (cloroplastos) y se descarta el sobrenadante con la mayora
de los componentes celulares. El precipitado de cada tubo se resuspende con una pipeta
pasteur en un pequeo volumen de tampn A. Ajustar el volumen final de la suspensin a 5 ml.
Un alcuota de 1 ml de esta suspensin se hierve. Otro alcuota de 1 ml se utiliza para preparar
una dilucin 1/2 con tampn A.

Prepara los siguientes tubos:

Tubos (Volmenes en ml)

Tampn A

4.7

4.7

4.7

4.7

4.4

Cloroplastos sin tratar

0.3

0.3

0.3

Cloroplastos diluidos 50%

0.3

Cloroplastos hervidos

0.3

DCMU 50 M

0.3

Estos tubos se mantienen en fro y oscuridad hasta el momento de medir la reaccin. Unos
momentos antes de comenzarla, se atemperan a temperatura ambiente.
La reaccin comienza al aadir 0.02 ml de DPIP 0.2% a cada tubo. Se sigue la variacin de la
absorbancia a 600 nm cada 2 minutos durante 10 minutos.
El tubo 1 se guardar en oscuridad y solo se realizar la lectura de absorbancia a tiempo 0 y a
tiempo final.
El resto de los tubos estarn expuestos a un foco luminoso durante el transcurso de la
reaccin.

Nombre y Apellidos:...........
Grupo de Prcticas:.................................................................................

RESULTADOS Y DISCUSIN
Representa grficamente la evolucin de la absorbancia a 600nm en los cinco tubos. Explica
los resultados obtenidos.

Abs600nm
Tubo 1

0 minutos

2 minutos

4 minutos

6 minutos

8 minutos

---

---

---

---

Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5

10

10 minutos

POTENCIAL HDRICO
Introduccin
Los movimientos del agua dentro de una planta dependen de las diferencias de valor del
potencial hdrico entre los distintos compartimentos. El potencial hdrico () depende
fundamentalmente del potencial osmtico (o) y del potencial de presin (p) de acuerdo con
la frmula:
= o + p
El valor de o depende del contenido en solutos:
o = R T [solutos]
El valor de p se corresponde con el de la presin a la que est sometida el agua:
p = P
Se puede determinar el valor del potencial hdrico y de sus componentes en los tejidos
vegetales mediante tcnicas relativamente sencillas.

Objetivo y desarrollo de la prctica

El objetivo de esta prctica es determinar el valor del potencial hdrico en clulas de tubrculo
de patata. Para ello utilizaremos un mtodo gravimtrico.
Sumergiremos discos de patata en una serie de soluciones de sacarosa de concentracin
creciente, de modo que, en funcin de las diferencias de entre la solucin externa y el
interior de las clulas del disco, tender a entrar o a salir agua. Esto se traducir en un
incremento o una disminucin del peso del disco, respectivamente, como se muestra en la
Figura 6.
La concentracin de sacarosa con la que no se produzca variacin en el peso tendr un valor
de igual al de las clulas de la patata.

Figura 6. Variacin del peso de un disco de tubrculo de patata en funcin de las diferencias de
potencial hdrico entre las clulas del disco y la solucin de sacarosa.

11

Metodologa

1. Preparar en placas Petri soluciones de sacarosa (20 mL de cada una) con

concentraciones 0.0M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M y 0.6M. Para ello, se utilizar una
solucin de sacarosa 1M y agua destilada.
2. Utilizando un sacabocados, obtener cilindros de patata libres de capas suberizadas. A
partir de los cilindros, cortar discos delgados de aproximadamente el mismo grosor
(unos 2-3 mm). Hay que cortar 10-20 discos por cada disolucin de sacarosa.
3. Pesar cada grupo de discos y anotar el valor como peso inicial.
4. Introducir cada grupo de discos en una de las disoluciones de sacarosa. Incubarlos a
temperatura ambiente durante 1 hora.
5. Sacar los discos de cada disolucin, secar su superficie ligeramente y pesarlos. Anotar
el valor como peso final.
6. Representar grficamente el incremento relativo de peso frente a la concentracin de
sacarosa.
7. Calcular el valor de para la concentracin de sacarosa con la que no se produce
variacin neta de peso en la patata, teniendo en cuenta que:
- Para la disolucin, p = 0
- Expresando [sacarosa] en moles m-3, el valor de o se obtiene en pascales (Pa).
- R = 8.3143 J mol-1 K-1
- T = 300 K
8. Calcular en valor de para las clulas del tubrculo de patata.

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Nombre y Apellidos:...........
Grupo de Prcticas:.................................................................................

RESULTADOS Y DISCUSIN

[Sacarosa]

Peso inicial

Peso final

0.0M
0.1M
0.2M
0.3M
0.4M
0.5M
0.6M

Clculo del de las clulas de tubrculo de patata:

13

Incremento relativo de peso

POTENCIAL OSMTICO
Introduccin
Los movimientos del agua dentro de una planta dependen de las diferencias de valor del
potencial hdrico entre los distintos compartimentos. El potencial hdrico () depende
fundamentalmente del potencial osmtico (o) y del potencial de presin (p) de acuerdo con
la frmula:
= o + p
El valor de o depende del contenido en solutos:
o = R T [solutos]
El valor de p se corresponde con el de la presin a la que est sometida el agua:
p = P
Se puede determinar el valor del potencial hdrico y de sus componentes en los tejidos
vegetales mediante tcnicas relativamente sencillas.

Objetivo y desarrollo de la prctica

El objetivo de esta prctica es determinar el valor del potencial osmtico en clulas de la
tercera hoja de una cebolla.
Determinacin del potencial osmtico en clulas de cebolla
Para determinar el valor del potencial osmtico vamos a utilizar la epidermis interna de una
hoja de bulbo de cebolla, que incubaremos en una serie de soluciones de sacarosa de
concentracin creciente. Como ocurra en el caso de la patata, en funcin de las diferencias de
entre la solucin externa y el interior de las clulas epidrmicas, tender a entrar o a salir
agua. Cuando entra agua, aumenta la turgencia de las clulas; cuando sale, se contrae la
vacuola y las clulas experimentan plasmolisis:

exterior > interior:

exterior < interior:

Clulas turgentes

Clulas en plasmolisis

Figura 7. Clulas epidrmicas de una hoja de cebolla en estado turgente (izquierda) y en

plasmolisis (derecha)

A concentraciones relativamente bajas de sacarosa, pero cuando el valor del exterior ya es

inferior al del interior, se produce una prdida leve de agua en la clula que no resulta en un

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cambio de volumen, sino en una reduccin del valor de la presin del agua en su interior.
Cuando el valor de p llega a cero, se considera que las clulas se encuentran en un estado
denominado plasmolisis incipiente. En esa situacin, el valor de se iguala al de o.
Consideramos que las clulas de epidermis de cebolla estn en plasmolisis incipiente cuando
el 50% de las mismas se encuentran plasmolizadas. La concentracin de sacarosa con la que
se produzca plasmolisis incipiente tendr un valor de igual al del o las clulas de cebolla.

Metodologa

1. Preparar en tubos de ensayo soluciones de sacarosa (10 mL de cada una) con

concentraciones 0.0M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M y 0.6M. Para ello, se utilizar una
solucin de sacarosa 1M y agua destilada.
2. Extraer la epidermis interna de la tercera hoja del bulbo de cebolla y cortar siete
cuadraditos de 1 cm de lado.
3. Introducir los fragmentos de epidermis en las soluciones de sacarosa, cuidando que
queden bien cubiertos. Incubarlos 15 minutos.
4. Extraer los fragmentos de epidermis y colocarlos en portaobjetos con un poco del
lquido en el que estaban sumergidos.
5. Observar 25 clulas y anotar cuntas aparecen turgentes y cuntas plasmolizadas.
(Recomendacin: comenzar por observar las muestras de 0.0M y 0.6M).
6. Representar grficamente el porcentaje de plasmolisis frente a la concentracin de
sacarosa.
7. Calcular para la concentracin de sacarosa con la que se produce plasmolisis
incipiente.
8. Calcular el valor de o para las clulas de epidermis de cebolla.

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Nombre y Apellidos:...........
Grupo de Prcticas:.................................................................................

RESULTADOS Y DISCUSIN
[Sacarosa]

N clulas en plasmolisis

0.0M
0.1M
0.2M
0.3M
0.4M
0.5M
0.6M

Clculo del o de las clulas de epidermis de cebolla:

16

% plasmolisis

OBSERVACIN DE ESTOMAS Y MEDIDA DE LA TRANSPIRACIN

Introduccin
La transpiracin es la evaporacin de agua desde la superficie de la planta. Tiene lugar
principalmente en las hojas, que son las mayores superficies evaporantes expuestas a la
atmsfera. En general, las plantas pierden por transpiracin grandes volmenes de agua. Por
ejemplo, se ha determinado que ciertas variedades de maz transpiran alrededor de 225 kg de
agua para producir 1 kg de biomasa (materia seca). En principio, esta aparentemente excesiva
prdida de agua ocurre porque el CO2, necesario para el proceso de fotosntesis, se encuentra
muy diluido en la atmsfera (0.03% en volumen) y los lugares por donde ste ingresa a la
planta son los mismos por los cuales se pierde el agua desde la hoja, los estomas.

La epidermis foliar y los estomas

La epidermis es una capa o estrato simple de clulas que recubre enteramente la superficie
foliar (Figura 8A). Protege al tejido de la desecacin y de los daos mecnicos. Est formada
por varios tipos de clulas como las clulas epidrmicas tabulares tpicas (no fotosintticas), los
pelos o tricomas y las clulas oclusivas de los estomas o clulas guardianas. Las clulas
guardianas son arrionadas y se encuentran unidas por los extremos pero se pueden separar
por la parte central de la zona de contacto formando una abertura o poro denominado ostolo
(Figura 8B). El complejo formado por las clulas guardianas y el poro se denomina estoma. A
menudo se aplica el trmino aparato estomtico incluyendo tambin las clulas adyacentes,
llamadas clulas accesorias subsidiarias.

(A)

(B)

Figura 8. Seccin transversal de una hoja (A). Detalle del aparato estomtico (B)

La velocidad de la transpiracin est relacionada con el grado de abertura de los estomas y

con su ubicacin y frecuencia. Adems, la velocidad de transpiracin depende de las

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condiciones ambientales en que se encuentra la planta como, por ejemplo, la disponibilidad de

agua en el suelo, la temperatura y la velocidad del aire en contacto con la planta, la intensidad
de luz, etc. En condiciones de baja disponibilidad de agua, la planta reduce la velocidad de
transpiracin mediante la sntesis de cido abscsico (ABA), que provoca el cierre de los
estomas.

Medida de la transpiracin
Existen diversas metodologas que permiten estimar la velocidad de la transpiracin. En las
prcticas de Fisiologa Vegetal se emplear el denominado Mtodo gravimtrico para estudiar
el efecto de diversos factores ambientales sobre la tasa transpiratoria.
El mtodo gravimtrico consiste bsicamente en pesar peridicamente, en balanza de
precisin, una planta en maceta (con el suelo sellado para evitar prdidas de agua desde el
mismo) durante un periodo relativamente corto de tiempo (pocas horas). Se asume que todo
cambio en el peso de la planta durante el intervalo de tiempo considerado se debe a la
transpiracin, comparada con la cual la incidencia de otros procesos es despreciable.

Objetivo y desarrollo de la prctica

Se va a determinar el efecto de la luz, la temperatura y la velocidad del aire sobre la tasa
transpiratoria y el grado de abertura estomtica en plantas que se encuentran bien provistas de
humedad en el sustrato.

a) Medida de la transpiracin
Cada grupo de trabajo dispondr de 4 macetas, con plantas de 10 das de edad (con 1-2
hojas expandidas), mantenidas con riego por sub-irrigacin hasta el da anterior a la
prctica. Una de ellas se habr incubado en oscuridad durante 24 horas. Antes de la
primera pesada se debe cubrir con film transparente la maceta, incluyendo la superficie del
sustrato expuesta al aire, para evitar prdidas de agua por evaporacin.
Despus de registrar el peso inicial de cada maceta,
- una de ellas permanecer en condiciones estndar de laboratorio (luz, 20C),
- otra se expondr a una corriente suave de aire dentro del laboratorio (luz, 20C)
- otra se llevar a cmara cultivo, a 30C y luz.
- otra se mantendr en oscuridad a 20C.
Se seguir la evolucin del peso de cada maceta mediante medidas cada 30 min, hasta los
90 min. Las diferencias de peso observadas correspondern a la masa de agua (g o ml de
agua/90 min) transpirada en ese perodo. Representa grficamente la evolucin del peso de
cada maceta, expresado en incremento relativo de peso:
peso final - peso inicial
peso inicial

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b) Observacin del grado de abertura estomtica

El grado de abertura estomtica se va a estimar mediante observacin directa al
microscopio ptico. Para ello, se obtendrn impresiones de la epidermis foliar de una hoja
de una planta monocotilednea y otra dicotilednea.
Metodologa:
-

Depositar una capa de esmalte de uas transparente sobre la superficie del envs de
una hoja.

En cuanto est seco el esmalte, colocar encima un trozo de cinta adhesiva transparente
y, con cuidado, despegarla arrastrando la capa esmalte (la impresin foliar).

Pegar en un portaobjetos la cinta adhesiva con la impresin foliar y observarla al

microscopio. Se obtendr una imagen similar a sta:

Imagen de una impresin

de la epidermis de una
dicotilednea, obtenida
con un microscopio ptico
a 400x.

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Nombre y Apellidos:...........
Grupo de Prcticas:.................................................................................

RESULTADOS Y DISCUSIN
a) Medida de la transpiracin

Incremento relativo de peso

peso final - peso inicial / peso inicial

Tratamiento

0 min
1.- 20C, luz, sin movimiento de aire
2.- 20C, luz, con movimiento de aire
3.- 30C, luz, sin movimiento de aire
4.- 20C, oscuridad, sin movimiento de aire

Explica razonadamente los resultados obtenidos.

20

30 min

60 min

90 min

b) Observacin del grado de abertura estomtica

Observar diez estomas y hacer un dibujo que represente el grado de abertura estomtica en
dos plantas, una monocotilednea y otra dicotilednea.

MONOCOTILEDNEA

DICOTILEDNEA

Haz

Envs

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