Relatorio Final de Estágio

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FRMACIA
RELATRIO FINAL DE ESTGIO
Ana Paula Silvrio da Silva
MESTRADO EM ANLISES CLNICAS
LISBOA, 2014
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FRMACIA
Relatrio de Estgio no Laboratrio Dr. Joaquim Chaves
Ana Paula Silvrio da Silva
Relatrio de Estgio orientado pelo Dr. Carlos Oliveira
MESTRADO EM ANLISES CLNICAS
LISBOA, 2014
MESTRADO EM ANLISES CLNICAS Ana Paula Silvrio da Silva
ndice
ndice de tabelas e figuras ............................................................................................... III
Abreviaturas .................................................................................................................... VI
Introduo ......................................................................................................................... 1
1.
Hematologia ........................................................................................................ 5
1.1.
Anemias .............................................................................................................. 5
1.2.
Hemoglobinopatias e Talassemias .................................................................... 10
1.3.
Regulao do metabolismo do ferro - Hemosiderose e Hemocromatose ......... 17
1.4.
Alteraes dos leuccitos .................................................................................. 19
1.5.
Hemostase e Coagulao .................................................................................. 24
1.6.
Teste de agregao plaquetria ......................................................................... 30
1.7.
Velocidade de sedimentao eritrocitria ......................................................... 32
1.8.
Fenotipagem sangunea - Sistema ABO e Rh ................................................... 33
2.
Bioqumica Clnica ........................................................................................... 37
2.1.
Exame Sumrio de urina (Urina Tipo II): ......................................................... 38
2.2.
Protenas ............................................................................................................ 42
2.3.
Metabolismo dos Hidratos de Carbono............................................................. 47
2.4.
Funo Renal .................................................................................................... 49
2.5.
Equilbrio cido-base ........................................................................................ 54
2.6.
Funo Heptica................................................................................................ 56
2.7.
Funo Pancretica ........................................................................................... 59
2.8.
Funo cardaca ................................................................................................ 61
2.8.1.
Marcadores de necrose ...................................................................................... 61
2.8.2.
Marcadores de dislipidmia .............................................................................. 64
2.9.
Funo Tiroideia ............................................................................................... 67
3.
Imunologia ........................................................................................................ 71
3.1.
Sistemas Automatizados nos Imunoensaios ..................................................... 71
3.2.
Alergologia ....................................................................................................... 74
3.3.
Endocrinologia .................................................................................................. 77
3.4.
Serologia infeciosa Reaes de aglutinao .................................................. 84
3.5.
Immunodifuso radial ....................................................................................... 88
3.6.
Nefelometria ..................................................................................................... 90
3.7.
Tcnicas cromatogrficas.................................................................................. 92
I
3.8.
Marcadores sricos de doenas infeciosas ........................................................ 93
3.8.1.
Vrus da Hepatite C ........................................................................................... 93
3.8.2.
Vrus da Imunodeficincia Humana ................................................................. 95
3.8.3.
Citomegalovrus ................................................................................................ 97
3.8.4.
Toxoplasma gondii............................................................................................ 99
3.9.
ELISA ............................................................................................................. 101
3.10.
Imuno Fluorescncia Indireta ......................................................................... 102
3.11.
Auto-imunidade .............................................................................................. 103
4.
Microbiologia .................................................................................................. 105
4.1.
Equipamentos em Microbiologia .................................................................... 105
4.2.
Meios de cultura e suas caractersticas ........................................................... 108
4.3.
Procedimentos em microbiologia ................................................................... 113
4.4.
Teste de Suscetibilidade aos Antibiticos....................................................... 118
4.5.
Produtos Biolgicos ........................................................................................ 120
4.5.1.
Hemoculturas .................................................................................................. 121
4.5.2.
Lquido Cefalorraquidiano .............................................................................. 122
4.5.3.
Exsudado ocular e auricular ............................................................................ 124
4.5.4.
Exsudado nasal, farngeo e amigdalino .......................................................... 125
4.5.5.
Expetorao..................................................................................................... 127
4.5.6.
Urina asstica .................................................................................................. 130
4.5.7.
Exsudado Vaginal /Vulvar .............................................................................. 132
4.5.8.
Exsudado uretral ............................................................................................. 135
4.5.9.
Esperma........................................................................................................... 136
4.5.10.
Fezes ........................................................................................................... 139
4.5.11.
Feridas e fludos purulentos ....................................................................... 143
4.6.
Resistncias a Antibiticos ............................................................................. 144
4.6.1.
Beta-lactamase de espectro alargado .............................................................. 144
4.6.2.
Staphylococcus aureus meticilina resistente ................................................... 145
Bibliografia ................................................................................................................... 146
II
ndice de tabelas e figuras

Tabela 1 - Percentagens de referncia de Hb A, Hb F e Hb A2 no recm-nascido e no
adulto. ............................................................................................................................. 11
Tabela 2 Classificao fenotpica das hiperlipidemias (Fredrickson) .......................... 65
Tabela 3 - Principais auto-anticorpos, patologias associadas e percentagem da
ocorrncia. .................................................................................................................... 104
Tabela 4 - Classificao de amostras segundo o critrio de Murray e Washington ..... 128
Figura 1- Plataforma do CORE laboratorial ..................................................................... 3

Figura 2- Gesto de Dados ............................................................................................... 4
Figura 3 - ADVIA 2120 Hematology System esquerda e o mesmo acoplado a ADVIA
Autoslide Slide Maker Stainer direita. ........................................................................... 5
Figura 4- Citograma de Peroxidase. ................................................................................. 6
Figura 5 - Citograma de Baso ........................................................................................... 6
Figura 6 - Em cima esfregao sanguneo bem corado, em baixo rea ideal para
observao de esfregaos ao centro (2) e franjas direita (3). ......................................... 7
Figura 7 Neutrfilo hipersegmentado no contexto de anemia megaloblstica. ........... 10
Figura 8 - As diferentes cadeias de globinas ao longo do desenvolvimento................. 11
Figura 9- ADAMSTM A1C HA-8180V .......................................................................... 15
Figura 10 - Capillarys 2 Flex Percing Sebia. .................................................................. 15
Figura 11 - Padro eletrofortico (ECZ) da amostra do sangue de controlo (AFSC). ... 16
Figura 12 Linfcitos reativos....................................................................................... 19
Figura 13 Pseudo-anomalia de Pelger-Hut ................................................................ 20
Figura 14 Mieloblasto com corpo de Aer Corpos de fuso de grnulos
caracterstico da LMA. ................................................................................................... 21
Figura 15 Hairy cells. .................................................................................................. 23
Figura 16 Clulas de Szary. ....................................................................................... 23
Figura 17- Vias intrnseca, extrnseca e comum da coagulao (a cheio) e vias de
anticoagulao (a tracejado). .......................................................................................... 25
Figura 18 - Sistema de Coagulao BCS XP ................................................................ 26
Figura 19- Curvas de agregao plaquetria .................................................................. 31
Figura 20- Vesmatic cube 200 ........................................................................................ 32
III
Figura 21 - ORTHO AutoVue System ........................................................................ 34

Figura 22 - Critrio de positividade: .............................................................................. 35
Figura 23 - Exemplo de Cassete do Sistema Ortho BioVue........................................... 35
Figura 24 - ADVIA2400 ............................................................................................. 37
Figura 25 - Clinitek Atlas com manipulador de amostras tipo porta amostras. .......... 38
Figura 26 - Cristais de tirosina ( esquerda), e cristais de cistina ( direita) .................. 40
Figura 27 - Sebia Hydraplus pipeta as amostras- esquerda. ........................................ 42
Figura 28 - Capillarys 2 Sebia ........................................................................................ 44
Figura 29 - Perfil eletrofortico Zonas de localizao das protenas. ......................... 45
Figura 30 Variaes de Protena Total, Albumina, zonas alfa-1 e alfa-2, zona beta e
zona gama, para screening de vrias patologias. ............................................................ 46
Figura 31 Principais processos de transporte no nefrnio. .......................................... 52
Figura 32 Reao envolvida no processo do sistema tampo cido
carbnico/bicarbonato. Envolvimento do sistema pulmonar e do renal. ........................ 54
Figura 33 Alteraes do equilbrio cido-base e compensaes renal e respiratria. . 55
Figura 34 Histria natural das doenas do fgado. ....................................................... 56
Figura 35 Marcadores de necrose cardaca aps enfarte agudo do miocrdio. ............ 63
Figura 36- Estratgia de diagnstico da tiroide usando TSH como passo inicial. ......... 67
Figura 37 - Analisadores Automticos de Imunoensaios: esquerda ADVIA Ceutaur e
direita IMMULITE 2000. ............................................................................................... 71
Figura 38 - Analisador cobas e 411 ................................................................................ 73
Figura 39 - Analisador de Alergologia ImmunoCAP 250........................................... 74
Figura 40 - Eixos endocrinolgicos da hipfise ............................................................. 77
Figura 41- Radioimunoensaio competitivo ou indirecto ................................................ 82
Figura 42-Radioimunoensaio no competitivo, direto ou imunomtrico ....................... 82
Figura 43- Placa do teste TP-PA .................................................................................... 86
Figura 44 - Sistemas BN ProSpec ............................................................................... 90
Figura 45- Sistema VIDAS ............................................................................................ 96
Figura 46 - Equipamento EUROIMMUN Analyzer I, racks dos reagentes esquerda e
placas de diluio de amostra direita. .......................................................................... 98
Figura 47 - Placa de ELISA aplicao de branco, controlos e amostras. .................. 101
Figura 48 - Padres ANA por imunofluorescncia indireta em clulas HEp2. ............ 103
Figura 49 - Analisador automtico de partculas de urina citmetro de fluxo Sysmex
UF 1000i .................................................................................................................... 105
IV
Figura 50 - Estao de Trabalho ( esquerda) e Cartas ( direita) do Sistema Vitek 2 106

Figura 51 - SistemaVitek2 Biomrieux ........................................................................ 106
Figura 52 - esquerda, frasco com tampa verde para aerobiose e direita, frasco com
tampa laranja para anaerobiose.................................................................................. 107
Figura 53 - Kit de Pastorex TM STAPH PLUS - ..................................................... 114
Figura 54- Teste CAMP Sinergia em placa em forma de seta. ................................. 117
Figura 55 - Antibiograma em Placa (Mtodo de Difuso Kirby-Bauer) ...................... 119
Figura 56 - Meio Lwenstein Jensen (LJ) ................................................................. 129
Figura 57- Imagem de diplococos Gram negativo no interior do neutrfilo caracterstico
de infeo por Neisseria gonorrhoeae. ......................................................................... 137
Figura 58 - esquerda clula epitelial normal e alguns bacilos de Doderlein. direita
clue cell ..................................................................................................................... 138
Figura 59 - Quistos de Giardia lamblia ........................................................................ 142
Figura 60 - Ovos de Ascaris lumbricoides ................................................................... 142
Figura 61 - Ovos de Trichuris trichiuria ....................................................................... 142
Figura 62 - Ovos de Hymenolepsis nana ...................................................................... 142
Figura 63 - Larvas de Strongyloides stercoralis ........................................................... 142
Figura 64 - Larvas de Enterobius vermicula ................................................................ 142
Figura 65 - Potenciais interaes na difuso dos discos de antibiticos para testar
sinergia bacteriana ........................................................................................................ 144
Abreviaturas
ACTH - Hormona Adrenocorticotrfica
ADC Anemia de doena crnica
ADH - Hormona Antidiurtica
ADP Adenosina Difosfato
AHG - Globulina Anti-humana
ALP - Fosfatase Alcalina
AMA - Anticorpo Anti-mitocndria
ANA - Anticorpo Anti-nuclear
anti- TG - Anticorpos Anti-tiroglobulina
anti-TPO Anticorpos Anti-peroxidase da Tiroide
AP Agregao Plaquetria
APCA - Anticorpo Anti-clulas Parietais
aPTT - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada
AR Artrite Reumatoide
ASMA - Anticorpo Anti-msculo Liso
AT Antitrombina
BLSE - - lactamases de Espectro Alargado
C4bBP - Protena de Ligao C4b
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CHGM - Concentrao de Hemoglobina Globular Mdia
CID - Coagulao Intravascular Disseminada
CLIA Imunoensaio Quimioluminescente
CMV Citomegalovrus
DGS - Direo Geral de Sade
DNA cido Desoxirribonucleico
dNTPs Desoxinucleotdos
EBV - Vrus Epstein-Barr
ECL - Electroquimioluminescncia
ECP - Protena Catinica dos Eosinfilos
EDTA - cido Etilenodiamino Tetra-actico
EIA - Ensaio Imunoenzimtico
VI
ELISA - Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay

ETM - Meio de Transporte Entrico
FAB - Classificao French-American-British
FEIA - Fluoro Enzyme Immuno Assay
FLC - Cadeias Leves Livres
FT4 Tiroxina livre
HAV Vrus da Hepatite A
Hb Hemoglobina
HbA1c - Hemoglobina Glicada
HBC Vrus da Hepatite C
HbF Hemoglobina Fetal
HbsAg Antignio de superfcie do Vrus da Hepatite B
HBV Vrus da Hepatite B
HCG - Gonadotropina Corinica Humana
HDAg Antignio da Hepatite Delta
HDV Vrus da Hepatite Delta
HEV Vrus da Hepatite E
HGB Hemoglobina
hGH - Hormona de Crescimento humano
HGM - Hemoglobina Globular Mdia
HIV Vrus da Imunodeficincia Humana
HPLC - Cromatografia Lquida de Alta Definio
HPV - Papilomavirus humano
HSV Vrus Herpes simplex
Ht - Hematcrito
IFI - Imuno Fluorescncia Indireta
Ig - Imunoglobulina
INH Isoniazida
INR - Ratio Normalizado Internacional
IRMA Ensaio Imunorradiomtrico
ISI - ndice Internacional de Sensibilidade
LA Anticoagulante lpico
LBA - Lquidos Bronco-alveolares
LCR - Lquido Cefalorraquidiano
VII
LES - Lpus Eritematoso Sistmico

LH Hormona Lutenizante
LISS - Low Ionic Strenght Saline
LUC Clulas Grandes no-coradas
MDR-TB Tuberculose Multirresistente
MI Mononucleose Infecciosa
MRAI - Material de Referncia Analtico Interno
MRSA - S. aureus Meticilina Resistentes
MSSA - S. aureus Meticilina Sensvel
OMS Organizao Mundial de Sade
PBP - Protenas de Ligao das Penicilinas
PCR - Reao de Polimerizao em Cadeia
PCR- RT PCR em Tempo Real
Plt Plaquetas
PMT - Tubo Fotomultiplicador
PPP - Plasma Pobre em Plaquetas
PRP - Plasma Rico em Plaquetas
RBC Red Blood Cells
RDW - ndice de disperso eritrocitria
Rh Rhesus
RIA Radio Imuno Assay
RMP Rifampicina
RNA cido Ribonucleico
RP - Ratio de Protrombina
RPR - Rapid Plasma Reagin
SDS - Dodecil Sulfato de Sdio
SHBG - Globulina de Ligao s Hormonas Sexuais
SIDA Sndroma da Imunodeficincia Humana
TBG - Globulina de Ligao Tiroxina
TBPA - Pr-albumina de Ligao Tiroxina
TeBG - Globulina de Ligao ao Estradiol-testosterona
TFPI - Inibidor do Fator Tissular
TP Tempo de Protrombina
TPPA - Treponema pallidum Particle Agglutination Assay
VIII
TSA - Teste de Suscetibilidade aos Antibiticos

TSH - Hormona Estimulante da Tiroide
TSTO Testosterona
TT Tempo de Trombina
UFC Unidades Formadoras de Colnias
ULR - Unidades de Luz Relativa
UTR Regio No Traduzida
VDRL - Venereal Disease Research Laboratory
VGM - Volume Globular Mdio
Vs - Velocidade de Sedimentao
VZV Vrus da Varicela Zoster
IX
Introduo
A concretizao de um desejo de adquirir um maior conhecimento na rea das
Anlises Clnicas levou-me a realizar este Mestrado em Anlises Clnicas da Faculdade
de Farmcia da Universidade de Lisboa. Como profissional de sade, com formao em
Cincias Farmacuticas, pela mesma faculdade, decidi investir nesta rea de
conhecimento para poder dar no futuro o meu contributo.
Apostar na preveno e no diagnstico precoce da doena uma opo que traz
numerosos benefcios, no s, na melhoria da qualidade de vida dos utentes, mas
tambm dos ganhos na Sade. Neste sentido, importante a sensibilizao da populao
do recurso s anlises clnicas como meio de preveno de doenas ou da deteo
destas, numa fase precoce, atravs do seu rpido rastreio, contribuindo para o
diagnstico precoce.
Este relatrio tem por base o estgio efetuado no Laboratrio Dr. Joaquim
Chaves. O laboratrio encontra-se dividido em reas pr-analticas, analticas e psanalticas. A Receo, as Colheitas e a Triagem so reas pr-analticas. O
processamento de dados para envio e entrega de boletins de anlise uma rea psanaltica.
Na Triagem da maior importncia o controlo da fase pr-analtica do
laboratrio, na verificao da identificao e testes pedidos, tratamento e manipulao
das amostras biolgicas. A partir da Triagem as amostras seguem para as reas
Analticas, nas quais so realizadas as anlises que vo ser abordadas neste relatrio de
estgio.
Em relao s reas analticas do laboratrio segue-se uma pequena
caracterizao relacionada com os ensaios efetuados em cada uma.
No CORE Laboratorial realizam-se ensaios hematolgicos, bioqumicos e
imunolgicos. Faz-se o estudo dos elementos figurados do sangue, a hemostase e a
coagulao, o estudo da agregao plaquetria e a fenotipagem sangunea do sistema
AB0 e Rh (Hematologia). Realizam-se determinaes em soro para o estudo bioqumico
dos diversos rgos e determinaes em urina: o estudo fsico-qumico e o exame
microscpico, bem como, o doseamento de diversos analitos (Bioqumica). Realizam-se
imunoensaios para pesquisa e quantificao de marcadores sricos de doenas
infecciosas e marcadores tumorais (Imunologia).
1
Na rea de Radioimunoensaio efetua-se o estudo bioqumico e avaliao

funcional dos eixos endocrinolgicos. O estudo laboratorial da doena alrgica e das
atopias faz-se nesta rea por questes logsticas.
Na Imunologia faz-se a quantificao e confirmao da presena de marcadores
sricos de doena infecciosa; o estudo qualitativo e quantitativo de antignios e
anticorpos; estudo da auto-imunidade atravs da pesquisa e/ou doseamento dos autoanticorpos.
Na Microbiologia faz-se o estudo laboratorial dos agentes etiolgicos de doenas
infecciosas (bacterianas, micolgicas e parasitolgicas) atravs do exame morfolgico
direto, do isolamento, identificao e determinao da resistncia aos agentes
antimicrobianos, presentes nas diferentes amostras biolgicas.
Na rea de Biologia Molecular Infecciosa faz-se o estudo qualitativo e
quantitativo
de
sequncias
genmicas
de
cidos
nucleicos
especficas
de
microrganismos potencialmente patognicos.

Na rea de Qumica Analtica faz-se o estudo laboratorial de metabolitos,
hormonas, vitaminas, elementos trao, neurotransmissores, metais pesados; confirmao
da presena de drogas ilcitas, monitorizao de frmacos e identificao dos seus
metabolitos e anlise espectroscpica do clculo urinrio.
CORE laboratorial
O CORE laboratorial tem um Sistema Modular Advia Labcell para a
centralizao laboratorial numa nica plataforma de Hematologia, Qumica Clnica e
Imunoensaios. constitudo por uma cadeia de automatizao da Siemens. Consiste
numa cadeia de transporte de amostras aos equipamentos acoplados; Sistemas de
colocao e recolha de amostras, os Sample Manager, Robot Racks para os
equipamentos de Hematologia e um sistema de ligao em Rede de Processamento e
Gesto de Dados (LineMaster, Software de Router e CentraLink).
Sample Manager 3
ADVIA Labcell
ADVIA 2120 -1
ADVIA 2400 1
Chemistry System
Siemens ADVIA
Centaur 3
ADVIA 2400 2
Chemistry System
Siemens ADVIA
Centaur 2
Hematologia
ADVIA 2120 -2
Qumica
Clnica
Imunoensaios
Sample Manager 2
ADVIA Labcell
Siemens ADVIA
Centaur 1
Sample Manager 1
ADVIA Labcell
Immulite 2000
Terminal
CentraLink
Figura 1- Plataforma do CORE laboratorial
Entre o CentraLink e os equipamentos existe uma comunicao bidirecional,

isto , os equipamentos recebem as amostras e enviam os resultados. Os tubos de
amostras tm um cdigo de barras que define o processo aberto no software do
Laboratrio, o E-DEIA lab, que tambm tem comunicao bidirecional com o
CentraLink. No processo esto definidos os parmetros de anlises e esta informao
enviada para o CentraLink onde definida a rota a efetuar na cadeia para que os testes
sejam realizados. O CentraLink recebe informao dos parmetros, aps a realizao
dos testes e envia-os para o E-DEIA lab, onde os resultados so validados.
Equipamentos
Entrada de registo
Abertura de processo
CQ
E-DEIA lab
CentraLink
UNITY Real Time
Software do Laboratrio
Validao
Processamento e
envio de resultados
Software de Gesto da
Qualidade
Figura 2- Gesto de Dados
No incio do dia so efetuadas as manutenes necessrias nos equipamentos e

so efetuados os controlos e as calibraes necessrias para cada parmetro. Atravs do
terminal informtico com o software CentraLink possvel ver o estado de cada
parmetro.
Outros dados importantes que o CentraLink recebe dos equipamentos so
relativos ao Controlo de Qualidade que envia de forma unidirecional para o UNITY
Real Time, o software de Gesto da Qualidade.
Este Sistema de automatizao traz numerosas vantagens:

facilidade de operao,
o conceito de cdigo de barras integrado que facilita e aumenta o fluxo de
trabalho,
monitorizao dos analisadores em tempo real,
acesso permanente s amostras, evitando a interrupo de testes de rotina,
garantindo a disponibilizao de resultados to rapidamente quanto possvel,
as amostras de processamento urgente so prioritrias,
controlo de todo o processo a partir de um s terminal, onde possvel, se
necessrio, repetir uma anlise em qualquer ponto da cadeia, sem parar o sistema
e sem ser necessrio o operador intervir para alm de dar uma ordem de
repetio do parmetro, no terminal.
1. Hematologia
1.1. Anemias
As anemias so avaliadas com base nos hemogramas, que se realizam no
Sistema Automatizado de hematologia ADVIA 2120.
Equipamento: ADVIA 2120 Hematology System
Figura 3 - ADVIA 2120 Hematology System esquerda e o mesmo acoplado a ADVIA Autoslide Slide
Maker Stainer direita.
Princpio dos mtodos:

Este Sistema ADVIA 2120 tem uma vlvula de cermica que divide a amostra
em 5 alquotas para os diferentes canais e mtodos para cada cmara de reao.
Os canais do Sistema ADVIA 2120 e os mtodos usados so:
Canal HGB Hemoglobina - Os eritrcitos so lisados libertando Hb, o ferro do heme
da Hb oxidado, passando do estado ferroso para o estado frrico, sendo depois
combinado com o cianeto do reagente para formar o produto da reao, cuja
transmitncia vai ser lida a 546 nm.
Canal RBC/Plt Eritrcitos e Plaquetas -O reagente ADVIA contm dodecil sulfato
de sdio (SDS) e glutaraldedo que provoca a esferificao isovolumtrica do eritrcito,
neste caso o fator de variao da interpretao eliminado. As plaquetas e os eritrcitos
so fixados.
Canal Retic. Reticulcitos - O reagente ADVIA autoRetic contm um detergente
zwitterinico (surfactante) que esferifica isovolumetricamente os eritrcitos. Tambm
contm um corante vital, oxazine 750, que cora as clulas de acordo com o seu
contedo de RNA.
Canal PEROX Peroxidase - Os surfactantes combinados com stress trmico lisam os
eritrcitos. O formaldedo fixa os leuccitos. O meio hipertnico causa alguma
contrao e crenao dos leuccitos incrementando o ndice de refrao das clulas
melhorando a deteo dos linfcitos.No citograma Perox as clulas absorvem a luz
proporcionalmente quantidade de colorao da peroxidase presente (eixo x). As
clulas dispersam a luz proporcionalmente ao seu tamanho (eixo y). Quando os dados
de disperso da luz e de absoro so traados, formam-se clusters distintos. A anlise
de clusters identifica cada populao com base na sua posio, rea e densidade, a
seguir, processado o nmero de clulas de cada populao.
LUC clulas grandes

no coradas, atpicas
Moncitos
Neutrfilos
Linfcitos e Basfilos
Eosinfilos
Eritroblastos
Figura 4- Citograma de Peroxidase.
Canal BASO - O reagente ADVIA BASO contm cido ftlico e um surfactante que
lisam os eritrcitos e as plaquetas. No citograma BASO a disperso da luz relativa
configurao do ncleo traada no eixo x e a disperso da luz relativa ao tamanho da
clula traada no eixo y e formam-se populaes ou clusters diferentes.
1. Rudo
2. Ncleos de clulas blsticas
3. Leuccitos mononucleares
4. Basfilos
5. Suspeita Baso
6. Saturao
7. Leuccitos polimorfonucleares
Figura 5 - Citograma de Baso
Como rotina, depois das manutenes dirias, deve-se passar um sangue como
primer, passar os controlos e s depois dos resultados dos controlos estarem dentro dos
valores das cartas de controlo que se pode iniciar o trabalho das amostras para realizar
os hemogramas.
Hemogramas
Com a determinao da Hemoglobina (Hb), do Hematcrito (Ht) e da contagem
de eritrcitos possvel calcular o Volume Globular Mdio (VGM), a Hemoglobina
Globular Mdia (HGM) e a Concentrao de Hemoglobina Globular Mdia (CHGM),
chamados ndices eritrocitrios. Todos estes parmetros so calculados pelo
equipamento e fazem parte do hemograma.
Microscopia
O Equipamento Autoslide Slide Maker acoplado a um ADVIA 2120, pode
preparar e corar automaticamente um esfregao sanguneo de qualidade elevada numa
lmina para anlise citolgica e frmula leucocitria. Produz lminas para amostras
aspiradas apenas no modo do dispositivo coletor de amostras automtico (Autosampler).
Na observao de lminas de sangue perifrico ao microscpio tico comea-se
por observar um esfregao normal em termos de morfologia, e s depois se observam os
desconhecidos.
Figura 6 - Em cima esfregao sanguneo bem corado, em baixo rea ideal para observao de
esfregaos ao centro (2) e franjas direita (3).
Nas anemias o hemograma pode mostrar microcitose, macrocitose ou algum tipo

especfico de poiquilocitose. A presena de policromatose indica uma resposta
adequada da medula ssea anemia sugerindo que esta possa ter sido causada por
hemlise ou hemorragia.
Quando a etiologia da anemia no esclarecida pela histria clnica e pelo
hemograma so necessrios exames adicionais, como a contagem de reticulcitos, o
doseamento de ferritina srica e ferro srico; doseamento de vitamina B12 srica e
folato srico e eritrocitrio, testes de funo renal, tiroideia e heptica.
A identificao de anemia hemoltica particularmente importante no feto e no
recm-nascido.
Anemia ferropnica
Na anemia por deficincia de ferro, as alteraes morfolgicas no costumam
ser evidentes at queda da hemoglobina abaixo de 10 a 11 g/dL. Nesta altura surgem
os aspetos caractersticos: microcitose, hipocromia, e poiquilocitose.(1)
No hemograma feito no contador eletrnico automatizado, a primeira evidncia
da deficincia em ferro o aumento do RDW (ndice de disperso eritrocitria),
indicativo de anisocitose. A alterao observada em seguida a diminuio de Hb, da
contagem de eritrcitos e do hematcrito, seguida pela diminuio do VGM e da HGM.
Em relao aos exames adicionais, na anemia ferropnica o diagnstico pode ser
confirmado por ferritina srica baixa ou ferro srico baixo. O doseamento isolado do
ferro pouco til uma vez que este est diminudo tanto na deficincia por ferro como
na anemia de doena crnica. (1)
Anemia de doena crnica (ADC)

ADC o termo usado para descrever a anemia que resulta de infeo ou
inflamao crnicas ou de doena oncolgica. Esta caracteriza-se por baixo ferro srico
e incorporao defeituosa na hemoglobina (havendo reservas adequadas na medula
ssea), resposta inadequada da eritropoietina anemia e diminuio moderada da
sobrevida dos eritrcitos. (1)
No hemograma surge hipocromia e microcitose medida que se agrava. Na
inflamao crnica grave, o grau de microcitose pode ser to acentuado quanto na
deficincia em ferro. A contagem absoluta de reticulcitos est diminuda. Podem estar
8
presentes sinais indicativos de inflamao crnica, como neutrofilia, trombocitose e

formao de rouleaux. necessrio diferenciar da anemia ferropnica. (1)
Em relao aos exames adicionais, o ferro srico e a transferrina srica esto
diminudos. A ferritina srica est aumentada devido sntese de apoferritina pelas
clulas inflamatrias ou neoplsicas. Outros sinais que podem ser encontrados so a
velocidade de sedimentao e a protena C reativa aumentadas, bem como, o
fibrinognio, a 2-macroglobulina e as -globulinas. (1)
Anemia megaloblstica
Anemia macroctica que resulta de eritropoiese anormal caracterizada por
aumento do tamanho dos precursores eritrides e maturao citoplasmtica precedendo
a maturao nuclear. (1)
A anemia megaloblstica geralmente resulta de deficincia de vitamina B12 ou
de cido flico ou da administrao de frmacos que interferem na sntese de DNA.
Algumas causas so particularmente importantes na infncia, nomeadamente erros
congnitos do metabolismo de vitamina B12 ou do folato. (1)
Os sinais clnicos nos doentes com falta de vitamina B12 ou de cido flico so
os habituais de anemia, mas tambm pode haver glossite, esplenomegalia e ictercia. (1)
O hemograma mostra baixa contagem de eritrcitos, Hb e Ht. H um aumento
paralelo do VGM e da HGM. A CHGM normal e o RDW aumentada. medida que a
anemia se agrava, pode aparecer poiquilocitose severa acompanhada de fragmentao
eritrocitria, que pode diminuir o VGM e aumentar muito o RDW. (1)
No esfregao sanguneo pode-se observar anemia, macrocitose, anisocitose, e
poiquilocitose
(incluindo
presena
de
macrovalcitos
dacricitos)
hipersegmentao dos neutrfilos. s vezes, a macrocitose est associada a sinais de

hipoesplenismo, particularmente a presena de corpsculos de Pappenheimer e de
corpos de Howell-Jolly. (1)
A hipersegmentao dos neutrfilos (ncleo com mais de 5 lbulos) est
relacionada com o diagnstico de anemia megaloblstica. Pleocaricitos so neutrfilos
de grande tamanho e ncleo hipersegmentado que se observam no sangue perifrico na
anemia megaloblstica.
Figura 7 Neutrfilo hipersegmentado no contexto de anemia megaloblstica.
As caractersticas do esfregao tambm so teis no diagnstico diferencial: na

macrocitose devida hepatopatia ou a abuso crnico do lcool, os macrcitos so
redondos em vez de ovais e no h neutrfilos hipersegmentados. Na anemia hemoltica
crnica a macrocitose pode ser acentuada e a policromasia geralmente evidente. (1)
Os exames teis para estabelecer a distino entre deficincia de vitamina B12 e
deficincia em cido flico so os doseamentos de vitamina B12 srica e de folato
srico e eritrocitrio.
1.2. Hemoglobinopatias e Talassemias

As patologias da hemoglobina so doenas hereditrias com transmisso
autossmica recessiva com 25% de homozigticos (2 genes anormais), 50% de
heterozigtico (1 gene anormal) e 25% de normais. Podem ser anormalidades
quantitativas ou qualitativas.
As anormalidades quantitativas, as talassemias ocorrem por ausncia ou sntese
reduzida de uma ou vrias cadeias de globinas ou aumento de sntese de outras cadeias,
como por exemplo -talassemia, -talassemia e a persistncia hereditria de
hemoglobina fetal (HbF).
As anormalidades qualitativas ocorrem por alterao estrutural, mutao ou
substituio de 1 ou mais aminocidos conduzindo a modificao da carga da molcula
de Hb. As variantes mais frequentes so da -globina. As variantes das cadeias e so
mais raras.
Esto descritas, atualmente, mais de 900 variantes diferentes. A HbS, a HbC, a
HbD-Punjab ou Los Angeles, a HbO-rabe, a HbE e a HbLepore representam, no seu
conjunto, mais de 90% das variantes observadas; so relativamente frequentes, mas so
recessivas e aparecem em populaes especficas.
10
Os portadores so indivduos saudveis e as crianas podem nascer com doena

severa.
Tabela 1 - Percentagens de referncia de Hb A, Hb F e Hb A2 no recm-nascido e no adulto.
Hemoglobina
Recm-nascido
Adulto
Hb A: 22
25%
96 98%
Hb F: 22
75%
<1%
Hb A2: 22
<1%
<3,5%
As hemoglobinas humanas normais so a HbA (22), a HbA2 (22) e a HbF

(22). O padro do adulto (HbA> 95% e HbA2 at 3,5%) atingido por volta dos 6
meses de idade, embora, muitas vezes, a HbF s atinja os valores do adulto normal no
final do segundo ano de vida ( < 1%).(2)
Figura 8 - As diferentes cadeias de globinas ao longo do desenvolvimento.
A hemoglobina fetal nascena representa cerca de 60-80% da Hb total. No

adulto a HbF normalmente <1%. Em alguns indivduos observa-se um nvel de HbF
elevado mesmo na vida adulta, esta caracterstica herdada e denomina-se persistncia
hereditria de HbF. (2)
11
-talassemias
As -talassemias podem ser classificadas em 0 (ausncia da sntese da cadeia)
ou + (reduo da sntese da cadeia). Podem ser classificadas em homozigotia ou
heterozigotia (portador). Em termos clnicos so classificadas em talassemia major
(dependente de transfuses), intermdia ou minor (assintomtica).(1)
-talassemia major
O doente com -talassemia major pode apresentar anemia muito grave,
esplenomegalia,
hepatomegalia
expanso
dos
ossos
que
contm
medula
hematopoitica. Apresentam um grande desequilbrio de sntese de cadeias /globinas, eritropoiese ineficaz e sobrecarga em ferro. A HbA2 pode estar normal ou
ligeiramente aumentada. (1)
A anemia grave com hemoglobina muito baixa. O esfregao sanguneo mostra
anisocitose e poiquilocitose extremas, incluindo eritrcitos em alvo, dacricitos e
eliptcitos. A hipocromia evidente. Pode haver ponteado basfilo e corpsculos de
Pappenheimer. (1)
-talassemia minor
O portador de -talassemia minor ou trao -talassmico em geral clinicamente
assintomtico. O quadro hematolgico tpico apresenta: contagem de eritrcitos
aumentada, microcitose, hipocromia e a HbA2 > 3,5%. (1)
A maioria dos indivduos com -talassemia minor tem Hb dentro dos limites de
referncia. Uma pequena percentagem anmica. A microcitose geralmente acentuada
e pode mostrar hipocromia. A Hb e o Ht so normais ou quase, ao passo que o VGM e a
HGM esto muito diminudos. Em contraste com a deficincia em ferro, o RDW
geralmente normal. (1)
No possvel, apenas com o hemograma, distinguir o trao -talassmico de
outros. Para o diagnstico definitivo so necessrias a eletroforese da hemoglobina para
excluir uma hemoglobina variante, e a determinao de percentagem de HbA2. Esta
deve estar aumentada. (1)
12
-talassemias
Trata-se de um grupo de condies resultantes de uma reduo de sntese das
cadeias -globina. A reduo na quantidade de tetrmero 22 leva anemia. As cadeias
em excesso agregam-se formando homotetrmeros 4. Estes so solveis no havendo
precipitao significativa na medula. Os tetrmeros vo precipitando medida que o
eritrcito vai envelhecendo, dando origem formao de corpos de incluso HbH. Os
eritrcitos vo sendo destrudos no bao. A anemia sobretudo devida reduo do
tempo de vida dos eritrcitos. Esta cursa com microcitose, hipocromia e HbA2
normal.(1)
Variantes da hemoglobina
Drepanocitose ou anemia das clulas falciformes
A anemia das clulas falciformes (ou drepanocitose) a doena causada pela
homozigotia para uma variante da cadeia da hemoglobina, a hemoglobina S (de sickle
= foice). H reduo da solubilidade da HbS e ocorre polimerizao. Formam-se
grandes polmeros que deformam o eritrcito em forma de foice (drepancitos). (1)
O indivduo heterozigtico (AS) praticamente assintomtico (HbS cerca de
40%) e muito raramente ter manifestaes clnicas de vaso-ocluso. O indivduo
homozigtico (SS) apresenta uma anemia hemoltica crnica com manifestaes
clnicas devida a ausncia de HbA e nveis de HbS na ordem dos 80%. (1)
uma anemia hemoltica crnica caracterizada por eventos recorrentes de vasoocluso, hemlise crnica, infees e consequente falha de diversos rgos. (1)
A Hb geralmente da ordem de 7 a 8 g/dL, mas com limites mais amplos, entre
4 e 11 g/dL. O esfregao tpico mostra anisocitose, anisocromia, drepancitos,
eritrcitos em alvo, policromatose, ponteado basfilo e eritroblastos. O hemograma
mostra reduo de eritrcitos, Hb e Ht. O VGM normal ou elevado. Existe aumento na
contagem de reticulcitos e apresenta RDW aumentado. (1).
13
Hemoglobinopatia C
Homozigticos para Hb C, tm hemlise crnica e, em geral, anemia hemoltica.
Pode haver esplenomegalia. Costuma haver anemia leve e moderada. O esfregao
mostra grande nmero de eritrcitos em alvo. H hipocromia e microcitose. A contagem
de eritrcitos, Hb e Ht so normais ou moderadamente reduzidos. Costuma haver
acentuada reduo do VGM e da HGM, com aumento da CHGM, do RDW e da
contagem de reticulcitos. Os eritrcitos podem apresentar cristais tetragonais, visto que
a Hb C tem solubilidade reduzida. Os exames para confirmar so o teste de solubilidade
(que deve ser negativo), HPLC (Cromatografia Lquida de Alta Definio) ou
Eletroforese de Hb, que mostram Hb C e HbA2 (que dificilmente se distinguem) e
pequena quantidade de HbF.
Heterozigticos para Hb C, com Hb C <40% so clinicamente assintomticos,
com fentipo normal ou ligeira microcitose.
Pode existir sndroma drepanoctica composta HbS/HbC com presena de duas
variantes, uma migrando no stio da S e outra no stio da C, na ausncia de HbA.
Rastreio de Hemoglobinopatias
Amostra:
As determinaes analticas devem ser efetuadas a partir de amostras de sangue
(EDTA dipotssico) colhidas recentemente, em particular quando se suspeita da
presena de uma Hb instvel.
O rastreio inicial das hemoglobinopatias e das sndromas talassmicas efetuado

atravs do hemograma (ndices eritrocitrios), da eletroforese das hemoglobinas em pH
alcalino (Eletroforese Capilar de Zona- ECZ) e da determinao quantitativa da HbA2 e
da HbF (HPLC). Os seus resultados devem ser sempre interpretados tendo em
considerao, no s a origem tnica dos doentes, mas tambm a histria clnica de
administrao de transfuso de sangue nos ltimos 4 meses.
14
Equipamento: ADAMSTM A1C HA-8180V
Figura 9- ADAMSTM A1C HA-8180V
Trata-se de um analisador baseado em HPLC (Cromatografia Lquida de Alta

Definio) totalmente automatizado.
Os itens de medio so as seguintes:
HA-8180 no modo rpido mede HbA1c e HbF.
HA-8180 no modo variante, podem ser detetadas HbA1c, HbF, HbS e
HbC.
A hemoglobina glicada (HbA1c) um bom parmetro para a monitorizao de
glicose no sangue, a 3 meses, em doentes que sofrem de Diabetes Mellitus. (ver
Bioqumica Clnica 2.3 Metabolismo dos Hidratos de Carbono).
Para a medio das variantes da Hb, o equipamento HA - 8180V adequado.
Outro equipamento HA 8160 eficaz para o rastreio de -talassmia, com o
modo talassmico ativado, e para detetar HbF, HbA2 e variantes HbS e HbC.
Equipamento: Capillarys 2 Flex Percing Sebia

Utiliza-se este equipamento de Eletroforese Capilar de Zona para quantificar as
variantes da hemoglobina.
Figura 10 - Capillarys 2 Flex Percing Sebia.
15
Princpio do mtodo:
A Eletroforese capilar de zona (ECZ) baseia-se na diferena de mobilidade que
as molculas proteicas tm de acordo com as suas cargas eltricas prprias, assim como
com a sua massa, forma e hidrofobicidade. A separao das hemoglobinas ocorre num
meio liquido tamponado a pH alcalino, no interior de tubos capilares de slica
termostatizados. A velocidade da eletroendosmose leva a uma migrao catdica das
molculas
que,
so
detetadas
semiquantificadas
(%)
diretamente
por
espectrofotometria a 415 nm.
Figura 11 - Padro eletrofortico (ECZ) da amostra do sangue de controlo (AFSC).
16
1.3. Regulao do metabolismo do ferro - Hemosiderose e

Hemocromatose
Hemosiderose
Hemosiderose a deposio de hemossiderina nos tecidos. Nestas condies h
aumento do armazenamento do ferro nos tecidos corporais, particularmente no fgado e
sistema mononuclear fagoctico, sem dano tecidular demonstrvel. O nome refere-se
presena de ferro que pode ser detetado no tecido na forma de hemossiderina.
A hemossiderose um estado em que os depsitos de Fe2+ ainda so reversveis
antes de formar fibrose e necrose. A hemocromatose irreversvel.
Hemocromatose
O ferro acumula-se muito na hemocromatose hereditria (HH), porfiria cutnea
tardia, e nas anemias hemolticas. Nas alteraes primrias, ou genticas, a absoro do
ferro da dieta normal aumenta devido alterao de fatores hereditrios que controlam a
absoro e reteno do ferro.(3)
Nas alteraes secundrias, ou adquiridas, o excesso de ferro pode resultar de
doenas crnicas ou anemias hemolticas, anemia sideroblstica, devido ingesto de
suplementos de ferro, aps mltiplas transfuses, abuso de lcool ou carcinoma
hepatocelular. (3)
No passado, a hemocromatose era identificada com base no excesso de ferro
acompanhado de danos nos rgos, pigmentao da pele, hepatomegalia, Diabetes
mellitus, artropatia e hipogonadismo. Uma hiptese de diagnstico que conduzia a
bipsia do fgado. (3)
Os sintomas mais comuns so: fraqueza, perda de peso, artralgias, dor
abdominal, diminuio da lbido e / ou impotncia, complicaes cardacas mas pode
ser assintomtica. (3)
Ocorre depsito de ferro nos tecidos em virtude do seu excesso no organismo e
alteraes na sua distribuio. Os principais locais de depsito so o fgado, o pncreas,
o corao e a hipfise, que podem perder progressivamente as suas funes. (3)
17
Hemocromatose Hereditria (HH)

A HH um erro gentico do metabolismo que produz aumento inapropriado (2 a
3X maior que o normal) da absoro GI do ferro. uma doena gentica autossmica e
recessiva. Esta definio estabelece uma causa gentica e no requer a presena de
excesso de ferro ou sinais de doena. Os doentes com HH no conseguem impedir a
acumulao em excesso em vrios rgos, provocando problemas cardacos, cirrose,
fibrose e cancro heptico. (3)
Testes de rastreio
O transporte e armazenamento de ferro largamente mediado por 3 protenas: a
transferrina, o recetor da transferrina e a ferritina. No tem grande interesse em pedir a
quantificao da transferrina a no ser para calcular a sua saturao.(2)
Os 2 testes sanguneos representativos do armazenamento de ferro, disponveis
para o rastreio so a % de saturao da transferrina e a concentrao srica de ferritina.
(2)
Significado de diagnstico
O diagnstico de hemocromatose pode ser feito num indivduo que tenha
repetidamente elevada a % de saturao da transferrina, na ausncia de transfuses
prvias. O excesso de ferro pode no estar presente num indivduo que seja
homozigtico para a hemocromatose. (3)
O diagnstico de excesso de ferro feito pela observao de nveis elevados da
concentrao da ferritina srica, que se correlaciona bem com os nveis de ferro
armazenados no fgado. A ferritina o melhor indicador das reservas de ferro. (3)
A ferritina uma protena solvel em gua. Contm mais de 20% do seu peso
em ferro e no visvel ao microscpio. A hemossiderina uma protena insolvel,
variando a sua composio contendo cerca de 37% de ferro. (3)
Na microscopia do sangue perifrico podem-se observar sidercitos, eritrcitos
com pequenas pontuaes de hemossiderina. A ferritina solvel, por isso se doseia
(por quimioluminiscncia). A hemossiderina insolvel, por isso precipita dentro dos
eritrcitos e fica visvel e de cor azul com a colorao de Perls. O ferro tanto na ferritina
como na hemossiderina encontra-se na forma frrica. O excesso de ferro causa um
18
aumento da ferritina e uma baixa de recetor de transferrina, enquanto na deficincia em

ferro a ferritina baixa e o recetor da transferrina aumenta. (2)
O tratamento da hemocromatose consiste em remover o ferro acumulado. No
caso dos doentes em que a eritropoiese seja capaz de responder a flebotomia, a remoo
do sangue geralmente o tratamento de escolha. Quando o doente no responde pela
eritropoiese, como na talassemia major, necessrio empregar agentes quelantes para
remover o ferro, contudo ocasionalmente a flebotomia vai estimular suficientemente a
eritropoiese para tornar a terapia vivel. (3)
A saturao da transferrina e o nvel de ferritina srica devem ser medidas cada
2 a 3 meses. Alguns doentes requerem flebotomia mensal para manter o valor de
ferritina, enquanto outros podem requerer 2 ou 3 flebotomias por ano. (3)
1.4. Alteraes dos leuccitos

Infeo viral Mononucleose infecciosa
A presena de uma linfocitose, com a observao de linfcitos de aspeto reativo
no sangue perifrico deve-se geralmente a infees de etiologia vrica (Vrus EpsteinBarr, Citomegalovrus, Vrus da hepatite C) ou parasitria como a Toxoplasmose. (4)
muito frequente a associao dos linfcitos reativos com o Vrus Epstein-Barr,
responsvel pela Mononucleose infecciosa. Os linfcitos ativados so de maior tamanho
que o linfcito normal, com moderada relao ncleo-citoplasma, um ncleo de perfil
arredondado de cromatina pouco condensada e um citoplasma intensamente basfilo.
Existe um predomnio de basofilia na periferia da clula e o citoplasma mostra
tendncia a aderir s hemcias prximas. (4)
Figura 12 Linfcitos reativos.
19
Eosinofilia reacional
comum em condies alrgicas e em infestaes parasitrias. A eosinofilia
varia de leve a acentuada. Os eosinfilos podem ser citologicamente normais ou mostrar
desgranulao ou vacuolizao varivel. (4)
O primeiro passo na investigao de uma eosinofilia acentuada uma histria
completa, que inclua dados sobre viagens seguida de exame fsico. (4)
Acima de 1,1 de valor absoluto de eosinfilos mandatrio fazer pesquisa de
microfilrias com a objetiva de 10X.
Pseudo-anomalia de Pelger-Hut
Os neutrfilos podem mostrar alteraes congnitas ou adquiridas da lobulao.
Nesta pseudo-anomalia de Pelger-Hut, os neutrfilos so hipolobulados e os lbulos
so arredondados. O perfil nuclear pode chegar a ser completamente redondo. A
cromatina nuclear marcadamente condensada. (4)
Transmite-se como uma caracterstica autossmica dominante. A forma
homozigtica manifesta-se com a ausncia de segmentao na totalidade dos
neutrfilos. A forma heterozigtica no deve confundir-se com um desvio esquerda. A
anomalia morfolgica no se acompanha de alteraes funcionais dos neutrfilos,
excepto para a quimiotaxia. A anomalia tambm pode ser adquirida, o que constitui um
sinal de displasia medular. Pode acompanhar-se da presena de desgranulao dos
neutrfilos ou outros sinais de mielodisplasia. (4)
Figura 13 Pseudo-anomalia de Pelger-Hut
20
Reao leucemide
A reao leucemide uma anormalidade hematolgica que simula e pode ser
confundida com leucemia, mas que, de facto, reacional a outra doena. As causas de
reaes leucemides mielides incluem estmulos graves atividade da medula ssea,
como uma infeo bacteriana sria, tuberculose, algumas viroses, hemorragia e
carcinoma ou outra doena oncolgica (com ou sem metstases na medula ssea). (4)
Leucemias agudas
At recentemente, a classificao mais aceite era a FAB, mas a da OMS est a
ser progressivamente adotada. Nesta o critrio de leucemia aguda de 20% de blastos.
Como a aplicao desta classificao exige o conhecimento das anomalias citogenticas
e moleculares, h um certo atraso no diagnstico definitivo. Portanto persiste um
diagnstico morfolgico preliminar baseado na FAB. (1)
A leucemia mielide aguda (LMA) decorre da proliferao de um clone de
clulas mieloides indiferenciadas que mostram maturao defeituosa ou ausente. A
maioria dos doentes apresenta:
mais de 20% de blastos no sangue perifrico, que podem ser mieloblastos,
monoblastos, megacarioblastos, eritroblastos precursores.
anemia normoctica normocrnica;
neutropenia ou mais frequentemente neutrofilia;
trombocitopenia. (1)
Figura 14 Mieloblasto com corpo de Aer Corpos de fuso de grnulos caracterstico da LMA.
21
A leucemia linfoblstica aguda (LLA) mais frequente em crianas com menos

de 10 anos, mas persiste ocorrendo durante a infncia, adolescncia e vida adulta. Pode
ter linhagem T ou B. Alguns casos apresentam-se com anemia e trombocitopenia.
Outros apresentam nmero varivel de linfoblastos no sangue perifrico, com grande
elevao da contagem de leuccitos. comum existir anemia, neutropenia e
trombocitopenia. (1)
Leucemias crnicas
As vrias leucemias crnicas de origem mielide diferem da LMA por haver
maturao celular, com produo efetiva de granulcitos. A leucemia mielide crnica
(LMC), que se associa a uma translocao especfica que d origem ao cromossoma de
Filadlfia (Ph), usada para designar esta entidade Ph-positiva assim como um modo
mais geral. (1)
A LMC uma doena principalmente de adultos, caracterizada clinicamente por
anemia, esplenomegalia e hepatomegalia. A contagem de leuccitos est elevada, com
os neutrfilos como clula predominante e os mielcitos em segundo lugar. Em doentes
com contagem muito elevada, os blastos podem chegar aos 15%, mas representam
menor percentagem do que os promielcitos e mielcitos. Geralmente, a contagem de
plaquetas normal ou aumentada, e estas so macrocticas. (1)
As leucemias linfides crnicas (LLC) e linfomas so neoplasias linfides. Nas
LLC h linfoblastos circulantes enquanto os linfomas envolvem principalmente os
ndulos linfticos e outros tecidos linfides. Contudo os linfomas podem apresentar
uma fase leucmica inicialmente ou na progresso da doena. (1)
O diagnstico deve basear-se nos aspetos clnicos, no hemograma, na citologia e
no imunofentipo, suplementados, quando necessrio, com anlise citogentica e
molecular. (1)
Na LLC os linfcitos so de tamanho semelhante ao normal, mas com aparncia
mais uniforme. As clulas apresentam uma maior fragilidade mecnica, pelo que
costuma haver sombras nucleares no esfregao.
22
Leucemia a Hairy cell ou Tricoleucemia

uma neoplasia de linfcitos B tpica da idade adulta, mais frequente nos
homens, e que se caracteriza pela presena de uma pancitopenia, esplenomegalia e
ausncia de adenopatias. Constitui 2% das neoplasias linfoproliferativas crnicas com
expresso leucmica. Normalmente acompanhado de anemia normoctica e
monocitopnia. (4)
As clulas linfides caractersticas da tricoleucemia so de maior tamanho que
os linfcitos normais. O ncleo de perfil arredondado ou lobulado, de posio
maioritariamente central e a cromatina pouco condensada ou laxa, a maioria das vezes
com ausncia de nuclolo visvel. O citoplasma mostra uma tonalidade azul-arroxeada,
aspeto hialino e de forma caracterstica apresenta umas vilosidades muito tpicas (largas
e numerosas projees como pelos) que rodeiam o permetro da clula linfide. (4)
Figura 15 Hairy cells.
Sndroma de Szary Linfoma cutneo T

Variante leucmica da micose fungoide, denominada Sndroma de Szary, que
se caracteriza por afeo da pele, gnglios linfticos e sangue perifrico com a presena
de clulas de aspeto cerebriforme, tamanho relativamente pequeno e contorno nuclear
irregular. Nas clulas de Szary o ncleo apresenta sulcos caractersticos da cromatina
que se assemelham a circunvalaes cerebrais. (4)
Figura 16 Clulas de Szary.
23
1.5. Hemostase e Coagulao

Fases da Hemostase
Hemostase primria depende do sistema vascular por constrio do vaso lesado,
e do tempo plaquetrio pela formao do trombo plaquetrio.
Hemostase secundria (coagulao) por formao de fibrina.
Hemostase terciria (fibrinlise) por destruio de fibrina e manuteno da
permeabilidade do vaso.
Coagulao
A coagulao um processo multifatorial e dinmico que culmina na formao
de trombina em quantidades suficientes para converso do fibrinognio em fibrina.
Anticoagulantes Naturais
1. Antitrombina
2. Protena C
3. Protena S
4. Inibidor do Fator Tissular (TFPI)
A Antitrombina uma glicoprotena plasmtica de sntese heptica que inibe a

trombina e os fatores Xa, IXa e XIa. A Heparina existente nas clulas endoteliais ativa a
AT que por sua vez inibe os fatores IIa, IXa, Xa, XIa, XIIa.
A Protena C uma glicoprotena plasmtica de sntese heptica dependente da
Vitamina K. ativada pelo complexo trombomodulina + trombina. responsvel pela
inativao dos fatores Va e VIIa na presena do cofator Protena S, fosfolpidos e
Clcio. Esta reao produz-se na superfcie das plaquetas e no endotlio.
A Protena S uma glicoprotena plasmtica sintetizada no fgado, no endotlio
e megacaricitos. Cofator da Protena C ativada na degradao dos fatores Va e VIIIa.
Circula em forma funcional, livre no plasma (40%) ou unida a uma protena
transportadora da subunidade C4b do complemento (60%).
24
Figura 17- Vias intrnseca, extrnseca e comum da coagulao (a cheio) e vias de anticoagulao (a
tracejado).
Amostra:
Plasma obtido por mistura de 1 parte de soluo de citrato de sdio a 3,2% com
9 partes de sangue. Os tubos com citrato (1:9) levam uma parte de citrato e o tubo de
colheita cheio com sangue, de forma rigorosa, at ao trao.
centrifugado temperatura ambiente, 15 minutos a 1500 g. estvel durante 4
horas temperatura de 15 25 C.
25
Sistema de Coagulao BCS XP
Figura 18 - Sistema de Coagulao BCS XP
O Sistema de Coagulao BCS XP contm as primeiras 4 filas para os

reagentes (1 a 4), que so refrigeradas. E contm as filas 5 a 14 para os controlos e as
amostras.
Faz-se a calibrao e os controlos para os reagentes que so utilizados no dia.
As anlises mais pedidas so o Tempo de Protrombina em segundos (TP seg.),
TP % e TP Inr.
Todos os dias so efetuados os controlos nvel 1 e nvel 3 da coagulao dos
seguintes testes: TP em segundos, TP%, TP Inr, aPTT em segundos, aPTT-R (razo),
Fibrinognio (mg/mL), Antitrombina III, Tempo de Trombina em segundos, DDmeros
(mg/mL), Anticoagulante lpico LA 1 (teste de rastreio). O LA 2 (teste de confirmao)
realiza-se se o LA1 for superior a 45 segundos.
As amostras que no se fazem diariamente, como os fatores de coagulao, so
imediatamente congeladas e s se descongelam num banho-maria a 37C,
imediatamente antes de colocar no equipamento para realizar a anlise. preciso passar
os controlos antes de todas as anlises dos vrios fatores de coagulao.
26
Tempo de Protrombina (TP)

Aplicao:
Serve para determinar o tempo de protrombina (TP) e determinar, juntamente
com os correspondentes plasmas deficitrios, a atividade dos fatores II, V, VII, X.
Princpio do mtodo:
O processo de coagulao desencadeado mediante a incubao do plasma com
quantidades timas de tromboplastina e clcio. Mede-se o tempo que decorre at
formao do cogulo de fibrina.
Significado de diagnstico:
A determinao do TP constitui um teste de triagem rpido e sensvel para
detetar perturbaes da coagulao no mbito da via extrnseca (fatores II, V, VII e X).
adequado para:
Regulao e controlo da terapia por via oral com anticoagulantes cumarnicos
anlogos da Vitamina K (varfarina).
Deteo das deficincias nos fatores de coagulao da via extrnseca.
Controlo da sntese heptica nas doenas do fgado.
Avaliao dos Resultados:

O resultado da medio pode ser expresso em segundos, em % do valor de
referncia, como ratio de protrombina (RP) ou Ratio Normalizado Internacional (INR).
Para o RP divide-se o tempo de reao da amostra pelo tempo de reao da pool de
plasmas normais. Usando o ndice Internacional de Sensibilidade (ISI) pode converterse o RP em valores internacionais comparveis. Desta maneira obtm-se o INR.
INR = RP ISI
Tempo de Tromboplastina parcial ativada (aPTT)

Aplicao:
Determinao do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) em plasmas
humanos citratados. Teste rpido para deteo de transtornos da via intrnseca da
coagulao e que deteta de modo sensvel os fatores VIII e IX, assim como os fatores de
contato XI e XII.
27
Princpio do mtodo:
A incubao do plasma com quantidades timas de fosfolpidos e um ativador de
superfcie leva a uma ativao dos fatores da via intrnseca da coagulao. Mediante a
agregao dos ies clcio desencadeado o processo de coagulao. Mede-se o tempo
at formao de um cogulo de fibrina.
Usado com plasmas deficitrios um instrumento apropriado para a
determinao de fatores singulares da via intrnseca e o diagnstico da hemofilia. Alm
disso pode ser utilizado para o controlo da terapia heparnica. A medio do aPTT est
indicada como teste de triagem de perturbaes da coagulao especialmente antes de
intervenes cirrgicas, e a fim de poder submeter potenciais hemoflicos a um
tratamento preventivo. Um tempo muito aumentado de aPTT por dfice dos fatores VIII
e IX revela as hemofilias A ou B.
Tempo de Trombina (TT)

Aplicao:
Determinao quantitativa do tempo de trombina no plasma humano.
Princpio do mtodo:
A trombina converte o fibrinognio contido na amostra em fibrina, atravs do
qual se produz o cogulo. medido o tempo que decorre at formao do cogulo.
A determinao do TT adequada para:

Monitorizao da terapia fibrinoltica.
Como rastreio das perturbaes da formao de fibrina ou em caso de suspeita
de estados graves de deficincias de fibrinognio.
Diferenciao entre o prolongamento de TT induzido por heparina e as
perturbaes da fibrina. O prolongamento da TT medido tanto nas
perturbaes de polimerizao da fibrina, como em presena de trombina. A
diferenciao consegue-se usando o reagente de batroxobina.
28
Antitrombina
Aplicao:
Para a determinao quantitativa da atividade funcional da antitrombina (AT) no
plasma, para o diagnstico da sntese reduzida de AT, aumento do consumo e
monitorizao da substituio.
Princpio do mtodo:
A AT da amostra convertida num inibidor imediato atravs da heparina e
inativa a trombina presente. O contedo residual de trombina determinado num teste
cintico medindo o aumento da absorvncia a 405 nm. A alterao na absoro est
inversamente relacionada com a atividade de AT na amostra.
A AT o inibidor plasmtico da trombina e do fator X ativado e forma um
complexo inativo, irreversvel com essas enzimas. A inativao dos fatores de
coagulao ativados acelerada, em grande quantidade, pela heparina. Este reagente
serve para a determinao rpida da AT fisiologicamente ativa e permite o diagnstico
da deficincia hereditria e adquirida de AT que representa um risco elevado de
trombose. As deficincias adquiridas de AT ocorrem, frequentemente, como
consequncia do consumo aps operaes de maior dimenso, ou como consequncia
de coagulao intravascular disseminada (CID) nos casos de spsis, nefroses, leses do
parnquima heptico (hepatite, intoxicao por drogas, alcoolismo) e contracetivos
contendo estrognios. O teste permite a deteo precoce dos doentes com elevado risco
de trombose.
29
1.6. Teste de agregao plaquetria

Amostra:
Sangue total Colheita de 1 tubo em EDTA dipotssico e em 6 tubos de citrato
de sdio a 3,2% (1:9),tanto para o doente como para o controlo.
Preparao prvia:
Para a realizao do ensaio necessrio que o doente esteja em jejum e suspenda
durante 1 a 2 semanas, com autorizao mdica, a teraputica anti-inflamatria e antiagregante. Deve reduzir hbitos tabgicos e alcolicos. Os ensaios laboratoriais devem
ser iniciados at 3h aps a colheita. O valor das plaquetas deve ser superior a
100x109/L.
necessrio Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e Plasma Pobre em Plaquetas
(PPP).So preparados por centrifugao de 15 min a 800rpm para o PRP e 20 min a
4500 rpm para o PPP. O PRP deve estar temperatura ambiente e deve-se esperar 30
minutos antes de realizar o teste. O PPP serve como branco.
Princpio do mtodo:
So usados os seguintes reagentes agonistas (indutores de agregao)
ADP
Colagnio
Ristocetina
Epinefrina
Os valores de referncia so de 60 a 100%.
Branco: Plasma Pobre em Plaquetas
A medio da agregao plaquetria (AP) utiliza um mtodo turbidimtrico. A

absorvncia da luz pelo PRP diminui com a AP. A magnitude e a velocidade da
diminuio dependem da reatividade das plaquetas aos agonistas adicionados. A AP
medida como o aumento da passagem da luz (transmitncia) observada durante 5
minutos aps adio do agonista, estando a escala ajustada a 0% de transmitncia com
PRP e a 100% com o PPP.
30
Resultados:
Figura 19- Curvas de agregao plaquetria
Significado clnico:
Este teste tem aplicao em hematologia e de grande valor para o diagnstico
das alteraes funcionais das plaquetas de origem congnita ou adquirida. Estas
alteraes geralmente produzem sangramento das membranas mucosas, o aparecimento
de pequenas equimoses na pele, ou o sangramento anormal de pequenos golpes, feridas
ou durante uma cirurgia. Este teste serve tambm para monitorizar os efeitos
teraputicos de medicamentos (por exemplo da Aspirina) e verificar a funo
plaquetria aps transfuso ou aps teraputica anticoagulante.
31
1.7. Velocidade de sedimentao eritrocitria

A Vs (Velocidade de sedimentao) trata-se de um teste usado normalmente,
mas que no especfico. Mede a velocidade de sedimentao dos eritrcitos no plasma
num perodo de 1h. A velocidade dependente da concentrao plasmtica de protenas
como o fibrinognio e as imunoglobulinas. Valores elevados esto associados com
formao marcada de rouleaux de eritrcitos no sangue perifrico. Valores mais baixos
podem ocorrer na policitmia vera devido elevada concentrao de eritrcitos. Valores
mais elevados que o esperado podem ocorrer em anemia severa devido baixa
concentrao de eritrcitos.(2)
Equipamento: Vesmatic cube 200
Figura 20- Vesmatic cube 200
Significado Clnico
Os valores de referncia no homem so entre 15 mm/h e na mulher 515 mm/h,
mas existe um aumento progressivo na idade mais avanada. A Vs est aumentada na
gravidez e nas doenas inflamatrias sistmicas e neoplsicas. utilizada para
diagnstico e monitorizao temporal de artrite e polimialgia reumtica e para
monitorizao de doentes com doena de Hodgkin. Valores muito elevados tm 90% de
valor preditivo positivo para infees ou doena oncolgica (particularmente no
mieloma). Variaes da Vs podem ser usadas para monitorizar a resposta teraputica.
(2)
32
1.8. Fenotipagem sangunea - Sistema ABO e Rh

Grupos Sanguneos
Foram descritos aproximadamente 400 grupos de antignios dos eritrcitos. Os
diferentes grupos de antignios podem variar bastante, mas no significado clnico os
grupos ABO e Rhesus (Rh) so os mais importantes.(2)
Sistema ABO
O sistema ABO consiste em 3 genes allicos: A, B e O. Os genes A e B
controlam a sntese de enzimas especficas responsveis pela adio de um resduo
nico de hidratos de carbono (N-acetil-galactosamina para o grupo A e D-galactose para
o grupo B) ao antignio bsico, que uma glicoprotena ou glicolpido, com um acar
terminal L-fucose nos eritrcitos, conhecido como substncia H. O gene O amorfo e
no transforma a substncia H. Contudo, h 10 possveis gentipos e 6 fentipos. Os 2
maiores subgrupos de A so A1 e A2. Os anticorpos anti-A e anti-B ocorrem
naturalmente no plasma de indivduos cujos eritrcitos tm falta do correspondente
antignio. (5)
Sistema Rh
O locus do grupo sanguneo Rh composto por 2 genes estruturais relacionados
RhD e RhCE que codificam as protenas da membrana que possuem o antignio D, Cc e
Ee. O gene RhD pode estar presente ou ausente dando o fentipo RhD+ ou RhDrespetivamente. O splicing alternativo do RNA do gene RhCE gera 2 protenas que
codificam os antignios C, c, E, ou e. (5)
Os anticorpos Rh raramente ocorrem naturalmente, a maioria resulta de uma
transfuso ou gravidez prvia. O anti-D responsvel pela maior parte dos problemas
clnicos como a doena hemoltica do recm-nascido. A subdiviso simples dos
indivduos em RhD+ e RhD- usando o anti-D suficiente para os propsitos clnicos de
rotina. O anti-C, anti-c, anti-E e anti-e so ocasionalmente encontrados e podem causar
reaes de transfuso e doena hemoltica do recm-nascido. (5)
33
Outros Sistemas de Grupos Sanguneos

Existem 30 sistemas de grupos sanguneos descritos pela ISBT (International
Society of Blood Transfusion). Estes outros sistemas so menos frequentes na clnica.
Contudo, podem ter imunogenicidade e implicao em reaes transfusionais
hemolticas. Podem ocorrer naturalmente anticorpos dos sistemas P, Lewis e MN. (2)
Os anticorpos destes sistemas so detetados pouco frequentemente. Alguns
exemplos so o sistema Kell, Duffy, Kidd, MNS.(2)
Tcnicas de Serologia de Grupos Sanguneos

As tcnicas mais importantes so baseadas na aglutinao dos eritrcitos
(hemaglutinao). A aglutinao salina com o LISS (low ionic strenght saline)
importante na deteo de anticorpos IgM.
Equipamento: ORTHO AutoVue System
Figura 21 - ORTHO AutoVue System
Foi concebido para automatizar a execuo de testes imunohematolgicos in

vitro de sangue humano, utilizando a tecnologia de cassete e procedimento de imagens
digitais do sistema ORTHO BioVue. Utiliza cassetes com 6 colunas. Cada coluna
contm uma cmara de reao, uma zona de ar, um reagente com esferas de vidro.
34
Leitura das cassetes - Ortho BioVue System

O resultado negativo quando os eritrcitos atravessam a coluna e se depositam no
fundo da coluna.O resultado positivo quando se forma uma aglutinao que fica no
topo do reagente e no atravessa as esferas de vidro.
Figura 22 - Critrio de positividade:

0 corresponde a resultado negativo e 4 corresponde a resultado positivo.
Figura 23 - Exemplo de Cassete do Sistema Ortho BioVue.
Determinao de grupo sanguneo ABO

A tipagem ABO definida pelos antignios presentes nos eritrcitos e pelos
anticorpos naturais presentes no soro ou plasma. Na avaliao imuno-hematolgica, so
realizadas as provas, direta e reversa. Na tipagem direta, pesquisa-se os antignios do
sistema ABO na membrana do eritrcito. Na tipagem reversa, investiga-se a presena de
anticorpos do sistema ABO presentes regularmente no soro ou plasma do indivduo. A
prova direta caracteriza-se pela reao dos eritrcitos da amostra com soros comerciais
35
anti-A, anti-B e anti-AB. A prova reversa baseia-se na reao do soro ou plasma do

doente ou dador com dois reagentes eritrocitrios comerciais (eritrcitos A1 e B). O
resultado da prova direta deve ser concordante com o da prova reversa. (5)
Tipagem RhD
Os eritrcitos do dador so testadas com soro anti-D e com soro controlo RhD.
Com o objetivo de detetar antignios D fracos, recomenda-se a utilizao de, no
mnimo, dois soros anti-D. Importante observar a orientao do fabricante do soro antiD para realizar o teste da antiglobulina humana. Quando a pesquisa do D fraco for
positiva, o concentrado de eritrcitos rotulado como RhD positivo. Quando ambas as
provas resultarem negativas, o sangue deve ser rotulado como RhD negativo. (5)
Teste da antiglobulina humana Teste de Coombs

A utilizao do soro de Coombs (soro antiglobulina humana), na avaliao
imunolgica eritrocitria, pode ser considerada como a mais importante descoberta da
medicina transfusional depois do sistema de grupo sanguneo ABO. Esse soro possui
anticorpos que reagem contra globulinas humanas. Este teste representa a forma mais
importante de aglutinao artificial em imuno-hematologia, permitindo revelar a
presena de anticorpos na membrana do eritrcito. (5)
O teste da antiglobulina pode ser realizado de duas formas:
Direto: Demonstra eritrcitos sensibilizados por anticorpos e/ou fraes do
complemento in vivo. Utilizado na investigao de doena hemoltica do recmnascido e anemia hemoltica autoimune. Um teste positivo ocorre tambm na
anemia hemoltica induzida por drogas e reaes hemolticas de transfuso.
Indireto: Permite detetar eritrcitos sensibilizados in vitro por anticorpos.
Utilizado para a pesquisa de anticorpos antieritrocitrios irregulares (PAI) em
soro ou plasma. Tambm utilizado na prova de compatibilidade, para detetar
anticorpos presentes no soro do recetor, que reconhecem antignios presentes
nos eritrcitos do dador. Este teste usado como parte da rotina do screening de
anticorpos no soro antes de transfuso. (5)
36
2. Bioqumica Clnica
O sistema bioqumico ADVIA 2400 um analisador automatizado de qumica
clnica, que pode processar testes de urina, plasma ou soro humano. Neste sistema so
realizados a maioria dos parmetros da Bioqumica Clnica abordados.
Considera-se parte deste sistema o Exame Sumrio de urina (Urina Tipo II) e a
Anlise de Protenas por Imunofixao e Eletroforese, realizados nos equipamentos
descritos em 2.1 e 2.2.
Equipamento: Analisador ADVIA2400
Figura 24 - ADVIA2400
Princpio dos mtodos:

O Analisador fotomtrico realiza mtodos imunoturbidimtricos e de qumica
clnica. Os ensaios de qumica clnica baseiam-se na alterao de cor resultante da
reao do analito da amostra com os reagentes especficos deste mtodo. Os ensaios
imunoturbidimtricos utilizam a reao de ligao entre um anticorpo e uma protena
para produzir imunocomplexos que aumentam a turvao da mistura. A concentrao do
analito pode ser determinada pela criao de uma curva padro a partir da absorvncia
dos padres.
tambm um analisador de eletrlitos, que mede as concentraes de sdio,
potssio e cloreto nas amostras de soro, plasma ou urina com base num procedimento
potenciomtrico que utiliza eltrodos io-seletivos (ISE).
37
2.1. Exame Sumrio de urina (Urina Tipo II):

Exame fsico-qumico, citomtrico e microscpico
Equipamento: Analisador de urinas Clinitek Atlas
Figura 25 - Clinitek Atlas com manipulador de amostras tipo porta amostras.
Trata-se de um espectrofotmetro de refletncia (disperso) destinado a efetuar o

exame fsico (pH e densidade) e bioqumico em amostras de urina.
Cada embalagem de reagente contm um rolo de tiras de reativas com reas de
reagente para anlise qualitativa ou semi-quantitativa de:
Glicose
Protenas
Bilirrubina
Urobilinognio
Corpos cetnicos
Esterase leucocitria
Hemoglobina
Albumina
Nitritos
Creatinina
38
Cada tira de reagente inclui ainda um tampo para determinao da cor da

amostra, determina a gravidade especfica utilizando o mtodo de ndice de refrao e
determina a clareza medindo a transmisso e disperso da luz que passa atravs da
amostra. O analisador converte os resultados em unidades com significado clnico.
Os tubos que contm amostras para anlise so carregados em porta amostras
com capacidade para 10 tubos cada um. necessrio um mnimo de 2 mL de urina para
anlise. As tiras reativas, em alternativa, so utilizadas isoladamente quando o volume
de urina insuficiente para o equipamento referido.
Princpio dos Mtodos:

Para o exame fsico utilizada a espectrofotometria e o ndice de refrao no
equipamento Clinitek Atlas. O exame bioqumico baseia-se na espectrofotometria de
refletncia no mesmo equipamento.
Para a contagem de elementos figurados, por citometria de fluxo e impedncia,
utiliza-se o Citmetro Sysmex UF-1000i. Este d o resultado de eritrcitos, leuccitos,
clulas epiteliais, bactrias e tambm d informao de cristais, leveduras, pequenas
clulas
redondas
patolgicas
(casts),
cilindros,
amostras
mucosas
com
espermatozoides.
Exame microscpico
Para o estudo das cristalrias e para a pesquisa e caracterizao dos eritrcitos
dismrficos acantcitos - a observao deve ser efetuada at 2h aps a colheita.
O exame microscpico s deve ser efetuado quando: o seu resultado acrescentar
valor clnico evidente face idade (exemplo: crianas) e histria clnica do doente,
assim como determinao da concordncia entre os resultados do exame fsicoqumico e do citmetro de fluxo (exemplos: presena ou ausncia de leucocitria ou de
hematria clinicamente significativas).
39
O exame microscpico permite identificar, caracterizar e semi-quantificar os

elementos figurados, clinicamente significativos:
Clulas epiteliais: tubulares renais e de transio do urotlio assim como
pavimentosas. Normalmente tm origem na uretra feminina e masculina;
Clulas hematopoiticas: leuccitos e eritrcitos;
Cilindros: estruturas proteicas, cuja matriz original constituda pela
protena de Tamm-Horsfall, moldadas nos tbulos contornados distais e
nos tubos coletores, a sua presena est sempre associada a proteinria.
Cristais: a sua presena, na maior parte dos casos, designadamente os de
fosfatos, oxalatos e uratos, que aparecem frequentemente nas urinas
normais, tm pouco significado clnico. So considerados patolgicos os
cristais
que
esto
relacionados
com
alteraes
metablicas,
designadamente os de Tirosina e de Leucina (doenas hepticas graves),

assim como os de Cistina (urinas com pH entre 6,0 e 7,4 cristais
hexagonais amarelo-acastanhados). A presena destes ltimos caracteriza
a cistinria, que uma doena autosmica recessiva.
Figura 26 - Cristais de tirosina ( esquerda), e cristais de cistina ( direita)
O resultado do exame microscpico do sedimento, no que diz respeito

identificao e caracterizao dos elementos figurados referidos, soberano em relao
ao que tiver sido indicado pelo ensaio fsico-qumico, pela citometria de fluxo ou por
ambos.
40
Significado Clnico
O exame da urina sempre o primeiro passo no doente suspeito de ter
deteriorao da funo renal. Verifica-se a aparncia, a colorao plida at presena
de pigmento. Esta indica a hemoglobina e a mioglobina que conferem uma colorao
rosa-vermelha ou castanha, dependendo da concentrao. A turvao na amostra fresca
indica infeo ou pode ser devida a partculas de gordura no doente com sndrome
nefrtico.(6)
A gravidade especfica indica a concentrao de urina. A medio do pH pode
ser til em doentes com acidose tubular renal e formao de clculos. (6)
A proteinria um dos sinais mais comuns em doentes com doena renal. A tira
reativa tem um limite de deteo de cerca de 150 mg/mL; evidente que so
necessrios mtodos mais sensveis para detetar a proteinria incluindo a
microalbuminria (cutoff de 30 mg/dL). (6)
A presena de esterase leucocitria indicativa de piria. A deteo de nitritos
indicativa da presena de bactrias que degradam o nitrato excretado na urina. A
combinao destes 2 testes de valorizar em doentes com infeo do trato urinrio. A
ausncia dos 2 constituintes serve para despistar a infeo urinria, reduzindo o nmero
de amostras enviadas ao laboratrio para mais testes microbiolgicos. (6)
A presena de hemoglobina livre ou eritrcitos na urina indica a presena de
doena renal ou da bexiga. A hematria pode estar presente em vrias doenas renais
incluindo glomerulonefrite, doena poliqustica, doena das clulas falciformes,
vasculites e uma srie de infees, doenas urolgicas da bexiga, da prstata, dos
ureteres, doena oncolgica plvica ou uretral e clculos renais. (6)
41
2.2. Protenas
Imunofixao de Protenas
Amostras:
A maioria das amostras de urina deve ser concentrada 20 a 100 vezes (com um
dispositivo apropriado).
O soro necessrio diluir porque apresenta grande quantidade de protenas.
Estas diluies do soro so efetuadas no equipamento.
Equipamento:
Figura 27 - Sebia Hydraplus pipeta as amostras- esquerda.

Sebia Hydrasys Focusing, onde ocorre a migrao- direita.
No sistema Hydrasys os passos automticos incluem o tratamento dos geles de

agarose segundo as etapas seguintes: aplicao da amostra, migrao eletrofortica,
incubao com os reagentes, secagem, lavagem, colorao, descolorao e secagem
final. Os passos manuais so os seguintes: preparao das amostras e dos geles e
aplicao dos reagentes.
Princpio do mtodo:
Deteo de protenas monoclonais no soro ou urina humanos, por imunofixao.
As protenas so separadas por electroforese em meio alcalino (pH 9,2) e depois
imunoprecipitadas com antisoros de especificidades diferentes: anti-cadeias pesadas e
anti-cadeias leves. Aps imunofixao, as protenas imunoprecipitadas so coradas com
negro de amido ou violeta cido. O excesso de corante eliminado em meio cido.
42
As imunoglobulinas monoclonais, marcadores das gamapatias, so detetadas.

Apresentam-se sob a forma de bandas anormais situadas nas zonas da beta ou gama
globulinas. Para identificar de forma precisa a natureza das bandas monoclonais, as
amostras so testadas simultaneamente em seis pistas. Depois da eletroforese, uma pista
serve como referncia, mostrando o perfil eletrofortico das protenas da amostra. As
restantes cinco pistas permitem a caracterizao das bandas monoclonais graas aos
anticorpos especficos anti-cadeias pesadas e anti-cadeias leves kapa e lambda.
Significado Clnico - Protena de Bence Jones

A protena de Bence Jones (PBJ) formada por dmeros de cadeias leves (kappa
e lambda) de imunoglobulinas monoclonais encontradas na urina. A presena ou a
ausncia da protena de Bence Jones na urina depende da sntese de cadeias leves e do
estado renal do doente.
encontrada em doentes com mieloma mltiplo (60 a 70%), macroglobulinemia
de Waldenstrom (30%), em doenas linfoproliferativas (20%) e em gamopatias
monoclonais benignas (10%). A proteinria de Bence Jones tem um efeito nefrotxico.
A sua presena aumenta o risco de insuficincia renal
Aproximadamente 20% dos mielomas mltiplos secretam apenas cadeias leves
livres (PBJ), e cerca de 50% dos doentes com mieloma tem imunoglobulinas
monoclonais no soro e cadeias leves livres na urina. A monitorizao da PBJ til na
avaliao de recidivas da doena, na transio para uma forma mais agressiva e na
resposta terapia.
A presena e a quantidade de PBJ influenciam no prognstico. Doentes com
mieloma que secretam s protena de Bence Jones tm um prognstico pior. Mieloma
de cadeias lambda tem um prognstico pior do que os de cadeias kappa.
43
Electroforese de Protenas
Amostras:
Utilizar amostras de soro no diludas, conservadas entre 2 e 8 C.
Amostras a evitar:
No utilizar amostras de soro hemolisadas. A hemlise induz a duplicao da zona
alfa-2.
Evitar amostras de soro antigas, indevidamente conservadas, nestas a frao -2 seria
fortemente modificada.
Evite as amostras de plasma. O fibrinognio migra na posio -2 (pico elevado em 2). Quando presente em algumas amostras (plasma, soro no totalmente desfibrinado ou
um doente sujeito a tratamento anticoagulante), o fibrinognio pode interferir na anlise
e reduzir a preciso da interpretao (suspeita de aumento da banda monoclonal ou da
frao -2).
Figura 28 - Capillarys 2 Sebia
Princpio do mtodo:
A eletroforese das protenas uma tcnica para pesquisar modificaes no perfil
das protenas das amostras. O Sistema utiliza o princpio da eletroforese capilar em
soluo livre. Com esta tcnica, as molculas carregadas so separadas pela sua
mobilidade eletrofortica, num tampo alcalino com um pH especfico. A separao
tambm ocorre em funo do pH do electrlito e do fluxo electro-osmtico.
44
O Sistema tem 8 capilares a funcionar em paralelo, permitindo 8 anlises em

simultneo. preparada uma diluio da amostra com tampo e injetada, por aspirao,
na extremidade do nodo do capilar. A separao efetuada aplicando alta voltagem aos
bornes de cada capilar. A deteo direta das protenas efetuada a 200 nm, na
extremidade do ctodo do capilar.
As protenas so detetadas pela seguinte ordem: -globulinas, -2-globulinas, 1-globulinas, -2-globulinas, -1-globulinas e albumina, cada zona contendo uma ou
mais protenas.
Resultados:
Figura 29 - Perfil eletrofortico Zonas de localizao das protenas.
45
Significado Clnico
A figura seguinte apresenta uma esquematizao dos aumentos e diminuies

das fraes do perfil eletrofortico para vrias patologias face a um perfil normal.
Figura 30 Variaes de Protena Total, Albumina, zonas alfa-1 e alfa-2, zona beta e zona gama,
para screening de vrias patologias.
46
2.3. Metabolismo dos Hidratos de Carbono

No estudo do metabolismo dos carbohidratos importante referir os seguintes
parmetros para monitorizao da Diabetes mellitus: a glucose, a prova de tolerncia
oral glicose (PTGO), a hemoglobina glicada (HbA1C) e a frutosamina.
Glicose
A maioria dos diabticos demonstra um aumento dos nveis de glicose no sangue
em jejum. Um nvel de glicose no plasma 126 mg/dL em jejum (8 h no mnimo) e um
nvel 200 mg/dL ps-prandial, aps confirmao, suficiente para o diagnstico de
Diabetes mellitus.(7)
PTGO- Prova de Tolerncia Oral Glicose

A prova deve ser realizada, como descrito pela OMS, usando uma carga de
glucose contendo 75g de glucose anidra dissolvida em gua. A medio de glucose no
plasma realizada s 0 horas, 1 hora e 2 horas aps a ingesto da carga de glucose. (7)
A PTGO raramente necessria para o diagnstico de Diabetes mellitus e no
recomendada para rotina do uso clnico. indicada nas seguintes situaes:
Para testar a Diabetes ou Prdiabetes em doentes assintomticos.
Para deteo e diagnstico de Diabetes mellitus gestacional (DMG) s 24 a 28
semanas de gestao.
Para screening em mulheres com DMG com diabetes persistente, 6 a 12 semanas
ps-parto.
Para detetar tolerncia glucose impaired (IGT) com valores de glucose
plasmtica s 2 horas entre 140 mg/dL e 199 mg/dL.(7)
Para o screening e diagnstico de DMG realiza-se a PTGO de manh depois de
um jejum de 8 horas no mnimo.O diagnstico de DMG feito quando qualquer destes
valores de glucose no plasma exceda:
Em jejum 92 mg/dL
1 h 180 mg/dL
2 h 153 mg/dL (7)
47
Hemoglobina glicada
As protenas glicadas proporcionam um ndice retrospetivo dos valores de
glicose no plasma durante um perodo de tempo e no so sujeitas a grandes flutuaes
observadas nas concentraes sanguneas de glucose. A HbA1C largamente usada em
conjunto com a glucose no sangue, no controlo glicmico. (6)
A glicao uma adio no-enzimtica de um resduo de acar a grupos
amino de protenas. A formao de HbA1C essencialmente irreversvel, e o nvel
sanguneo depende do tempo de vida dos eritrcitos (mdia de 120 dias) e da
concentrao de glucose no sangue. Como a taxa de formao da HbA1C diretamente
proporcional concentrao de glucose no sangue, a concentrao de HbA1C
representa os valores de glicose nas 6 a 8 semanas precedentes. Os valores de HbA1C
esto livres das flutuaes da glucose no dia-a-dia e no so afetados pelo exerccio ou
pela recente ingesto de comida. (6)
A HbA1C deve ser monitorizada rotineiramente em cada 3 meses em indivduos
diabticos tratados com insulina. Em certas condies clnicas como na grvida
diabtica ou numa alterao maior da terapia, a monitorizao mais frequente (cada 4
semanas) pode trazer informao til. (6)
Equipamento: ADAMSTM A1C (HA-8180V)
Frutosamina
Tambm ocorre a ligao no enzimtica de glucose a grupos amina de outras
protenas que no a hemoglobina para formar cetoaminas. A frutosamina o nome para
as protenas cetoaminas plasmticas. O tempo em circulao destas protenas
plasmticas mais curto que o dos eritrcitos. O tempo de semi-vida em circulao para
a albumina cerca de 20 dias. A concentrao de albumina glicada reflete o controlo da
glucose durante um perodo de 2 a 3 semanas. (6)
Alguns estudos sugerem que a frutosamina pode ser til para os idosos e na
gravidez. O papel potencial deste teste a rapidez, a monitorizao tcnica simples do
controlo da glicmia quando requer avaliao. Pode tambm ser til em doentes com
variantes da Hb como HbS ou HbC em que a HbA1C tem pouco valor. Contudo h uma
falta de consenso na sua utilidade clnica. (6)
48
2.4. Funo Renal

As anlises bioqumicas tm um papel importante para averiguar dano renal que
tenha ocorrido, monitorizao do seu progresso e do seu tratamento, mas muito
raramente para estabelecer a causa. (6)
Os rins tm uma grande capacidade de aumentar a sua funo em resposta a
injria. Assim, uma reduo significativa da massa renal funcional (50%-60%) pode
ocorrer antes de qualquer sintoma significativo ou mesmo antes das alteraes
bioqumicas aparecerem. A medida funcional mais sensvel especfica a GFR (taxa de
filtrao glomerular) que pode ser muito reduzida. (6)
Testes de funo renal

Ureia
A ureia o maior produto metablico nitrogenado do catabolismo das protenas
e representa mais de 75% do nitrognio no proteico excretado. Mais de 90% da ureia
excretada atravs dos rins. A ureia no activamente reabsorvida nem secretada pelos
tbulos mas livremente filtrada pelo glomrulo. A produo de ureia demasiado
dependente de variveis no-renais, como a dieta e a sntese heptica, por isso no se
torna til na medida da GFR. (6)
Significado Clnico
A medida da concentrao de ureia no plasma ou no soro observada como teste
da funo renal, contudo os fatores no-renais influenciam a ureia circulante e
consequentemente limitam a sua utilidade como teste de funo renal. A medida da
ureia na urina tem pouco significado no diagnstico clnico contudo, ela demonstra um
ndice do balano de nitrognio total. (6)
49
Creatinina
Como a creatinina produzida endogenamente e libertada nos fluidos biolgicos
a uma taxa constante e os seus nveis no plasma mantm-se dentro de limites, a sua
clearance pode ser medida como um indicador da GFR. (6)
A clearance da creatinina realizada obtendo uma amostra de urina de 4-12h, ou
uma urina de 24h, e tambm uma amostra de sangue colhido no perodo da colheita da
urina. O volume da urina medido, a taxa de fluxo urinrio calculada (em mL/min) e
o ensaio da creatinina realizado no plasma e na urina para obter a concentrao em
mg/dL ou mmoles/L. (6)
A creatinina no soro ou no plasma pode ser medida com mais exatido e
reprodutibilidade e pode ser usada para predizer a clearance da creatinina (GFR) usando
um de vrios algoritmos. O mais conhecido o Algoritmo de Cokroft e Gault. Como a
produo de creatinina est relacionada com a massa muscular, os homens tm nveis de
creatinina no soro mais elevados que as mulheres. A massa muscular e a GFR tambm
se alteram com a idade, ambas tendem a diminuir com o aumento da idade. Estes fatores
esto includos no Algoritmo de Cokroft e Gault:
Clearance creatinina (mL/min/1,73 m2) = (140 idade (anos)) x 2,12 x peso (kg) x K
Creatinina soro x ASC (m2)
Onde:
K=0,85 para mulheres e 1,00 para homens.
ASC= rea de superfcie corporal.
Existem restries para este algoritmo: idade superior a 75 anos, crianas e grvidas. (6)
50
cido rico
O cido rico o produto principal de catabolismo das purinas dos nuclesidos
adenosina e guanosina. As purinas do metabolismo dos cidos nucleicos da dieta so
convertidas a cido rico diretamente. (6)
A sobreproduo de cido rico pode resultar de aumento da sntese dos
percursores das purinas. Aproximadamente 75% do cido rico excretado na urina, a
maior parte do restante secretado no trato gastro-intestinal, onde degradado a
alantona e outros compostos por enzimas bacterianas. A excreo urinria do cido
rico 6 a 12% da quantidade que filtrada. (6)
Significado Clnico
A hiperuricemia assintomtica frequentemente detetada por screening
bioqumico e o seguimento de doentes importante porque muitos esto em risco de
desenvolver doena renal como resultado da hiperuricemia e hiperuricosria. Muitos
destes doentes desenvolvem sndrome clnica de gota. A gota pode estar associada com
cristais nos fluidos sinoviais bem como deposio nos tecidos volta da articulao. (6)
A gota pode ser classificada como primria ou secundria. A gota primria est
associada com a hiperuricemia essencial devido produo excessiva de purinas ou
excreo reduzida de cido rico. A gota secundria resultado de hiperuricemia
atribuda a vrias causas: reteno renal de cido rico, que pode ocorrer na doena
renal crnica de qualquer tipo ou como consequncia de administrao de frmacos (os
diurticos em particular). A acidemia orgnica devido ao aumento do cido acetoactico
na cetoacidose diabtica ou acidose lctica pode interferir com a secreo tubular dos
uratos. (6)
51
Homeostase da gua e formao de urina

O rim tem funes de reabsoro e excreo pelas quais se d a formao de
urina. Tem funes reguladoras da homeostase dos eletrlitos, cido-base e da gua e
ainda funes endcrinas. (6)
Figura 31 Principais processos de transporte no nefrnio.
No tbulo contornado proximal, sais e gua so reabsorvidos com elevadas taxas

nas pores isosmticas. 65 a 70 % do filtrado e virtualmente a completa reabsoro de
glucose, aminocidos, HCO3- ocorrem neste segmento. (6)
Na ansa de Henle, o fludo torna-se hiperosmtico, devido sada de gua e
depois hipoosmtico devido reabsoro de NaCl at ao tbulo contornado distal.
Ocorre reabsoro ativa do Na+ no tbulo contornado distal e tubo coletor cortical. (6)
O ltimo segmento, o ducto coletor impermevel gua na ausncia de ADH.
O ducto coletor permite o equilbrio da gua com o interstcio hiperosmtico quando
ADH est presente. (6)
52
Funes endcrinas do rim

As funes endcrinas do rim podem ser primrias pois o rim um rgo
endcrino, produzindo hormonas, ou secundrias, em que o rim o local de ao de
hormonas produzidas ou ativadas noutro local. O rim o local de degradao de
hormonas como a insulina e aldosterona. Na funo endcrina primria o rim produz
eritropoietina (EPO), prostaglandinas e tromboxanos, renina e 1,25 (OH2)D3. (6)
Doena Renal e Proteinria

A proteinria reflete a anlise quantitativa da permeabilidade glomerular.
Clinicamente, o aparecimento de quantidades significativas de protena na urina sugere
doena renal. Frequentemente a proteinria classificada quer como tubular quer
glomerular.
Na
prtica
para
screening
razo
protena/creatinina
ou
albumina/creatinina, tem sido usada como regra para excluir a necessidade de colheitas
de urinas de 24 horas. (6)
Albumina urinria e screening de microalbuminria

Em geral a proteinria reflete albuminria. A albumina rapidamente medida
por mtodos de imunoensaio quantitativo capazes de detetar, na urina, a albumina em
baixas concentraes. A protena total urinria pode ser substituda por albumina na
urina. Isto demonstra uma medida mais especfica e sensvel da permeabilidade
glomerular. (6)
A microalbuminria definida como um aumento na excreo urinria de
albumina acima do intervalo de referncia de indivduos saudveis no diabticos. Com
a metodologia atual estas pequenas concentraes de albumina podem ser medidas e a
microalbuminria considerada como um importante indicador clnico de deteriorao
da funo renal em indivduos diabticos. O screening para microalbuminria no
indicado em doentes com proteinria estabelecida. (6)
A identificao de doentes diabticos em risco de desenvolver nefropatia deve
ser feito neste estadio de microalbuminria para prevenir o estado de nefropatia
diabtica. (6)
53
2.5. Equilbrio cido-base

Manter o pH do meio interno, dentro de limites estreitos, de vital importncia.
Por isso existem sistemas tampo fisiolgicos e mecanismos de regulao pulmonar e
renal, que so em ltima instncia os responsveis por manter o pH.
O tampo de cido carbnico/bicarbonato de maior importncia na homeostase
do pH porque:
Trata-se de um sistema presente tanto no meio intracelular como extracelular.
um sistema aberto. As concentraes de cada um dos elementos que o
compem so regulveis. O CO2 regulado pelo sistema de trocas de gases a
nvel pulmonar e o bicarbonato mediante um sistema de troca de solutos a nvel
renal.
Por ser um gs, o CO2, vai ser eliminado praticamente na sua totalidade pelos
pulmes sem que se produza uma reteno de cido, pelo que se designa cido voltil.
Figura 32 Reao envolvida no processo do sistema tampo cido carbnico/bicarbonato.

Envolvimento do sistema pulmonar e do renal.
O excesso de H+ removido do corpo:

pelos pulmes num mecanismo que depende da PCO2;
pelos rins num mecanismo que depende de HCO3-;
54
Figura 33 Alteraes do equilbrio cido-base e compensaes renal e respiratria.
Compensao Respiratria
A resposta ventilatria s alteraes de pH uma resposta rpida e mediada
pelos quimiorrecetores dos corpsculos carotdeos e articos e pelo centro respiratrio
bulbar. Numa acidose, baixa o pH, aumenta a concentrao de hidrogenies que
provocam uma hiperventilao, estimulam a eliminao de CO2 diminuindo a PCO2
arterial. Numa alcalose, se o pH se eleva, diminuindo a concentrao de hidrogenies,
inibe os quimiorrecetores provocando hipoventilao, uma reduo da eliminao de
CO2 e portanto um aumento da PCO2 arterial.
Compensao Renal
O rim o principal rgo implicado na regulao do equilbrio cido-base porque
a principal via de eliminao de cidos e dos metabolitos patolgicos. o rgo
responsvel por manter a concentrao plasmtica de bicarbonato num valor constante,
graas sua capacidade para reabsorver e gerar bicarbonato de modo varivel em
funo do pH das clulas tubulares renais.
Portanto, trata-se de uma resposta lenta. Numa situao de acidose produz um
aumento da excreo de cidos e reabsorve mais bicarbonato e numa situao de
alcalose ocorre o contrrio, ou seja, retm mais cido e elimina mais bicarbonato.
55
2.6. Funo Heptica

As doenas que ocorrem no fgado podem ser:
infecciosas (hepatites virais);
txicas (relacionadas com o lcool);
genticas (hemocromatose);
imunes (hepatite auto-imune e cirrose biliar primria);
neoplsicas (carcinoma hepatocelular HCC); (6)
Regenerao
Recuperao
sem sequelas
Carcinoma
Hepatocelular
Dano Agudo
do fgado
Dano Crnico
Fibrose
Cirrose
Morte
Hipertenso Portal
Varizes esofgicas,
ascite, encefalopatia
Falha na
Regenerao
Hepatite
Fulminante
Recuperao
Morte
Figura 34 Histria natural das doenas do fgado.
As enzimas libertadas do tecido heptico lesado que so mais frequentemente

medidas so: a aspartato aminotransferase (AST), a alanina aminotransferase (ALT), a
fosfatase alcalina (ALP) e a gama-glutamiltransferase (GGT).
56
Aminotransferases
Ambas as enzimas AST e ALT esto normalmente presentes no plasma humano,
blis, LCR, saliva, mas no so encontradas na urina a no ser que uma leso no rim
esteja presente. (6)
Significado clnico
Na hepatite viral e noutras formas de doena associada a necrose heptica, os
nveis de AST e de ALT esto elevados mesmo antes dos sinais e sintomas da doena
(como ictercia) aparecerem. (6)
As hepatites alcolicas tm elevaes moderadas. Os nveis de AST so maiores
que os de ALT na doena alcolica do fgado, enquanto os nveis de ALT so
normalmente maiores que os de AST na hepatite aguda. (6)
Nas infees hepticas e outras condies inflamatrias que afetem o fgado, a
ALT est caracteristicamente to ou mais elevada que a AST e a razo ALT/AST, que
normalmente, e noutras condies, inferior a 1, torna-se maior que a unidade. (6)
Na hepatite txica o panorama semelhante s hepatites infecciosas com
atividade da ALT elevada e da AST tambm, em casos graves. Na cirrose os nveis de
aminotransferases variam desde superior ao valor de referncia a 4 a 5 X o limite
superior do intervalo de referncia, com o nvel de atividade da AST superior ao da
ALT, que indicam provavelmente a contnua necrose celular. (6)
Elevaes de ambas as enzimas 5 a 10 X ocorrem em doentes com carcinoma do
fgado primrio ou metstases, com a AST normalmente mais elevada que a ALT.
Apesar de ambas as enzimas se elevarem em doenas que afetam a integridade do
parnquima heptico, a ALT a enzima mais especfica do fgado e as elevaes da sua
atividade persistem por mais tempo do que da atividade da AST. (6)
Fosfatase Alcalina (ALP)

A enzima ALP est presente em praticamente todos os tecidos especialmente nas
membranas celulares e ocorre em nveis elevados no epitlio intestinal, tbulos renais,
osso (nos osteoblastos), no fgado e na placenta. A enzima est associada com o
transporte de lpidos no intestino e com o processo de calcificao no osso. Assim as
57
formas predominantes no soro normal podem ser caracterizadas por variantes do fgado
e do osso. (6)
Significado clnico
Os nveis de ALP no soro tm particular interesse em 2 grupos de condies: na
doena hepatobiliar e na doena ssea associada a aumento da atividade osteoblstica.
A resposta a uma obstruo das vias biliares a sntese de mais ALP devido ao
efeito de induo da enzima. A sntese da enzima ocorre nos hepatcitos adjacentes aos
canalculos biliares. A elevao tende a ser mais marcada (mais de 3 X) na obstruo
extraheptica (por clculos ou por cancro da cabea do pncreas) do que na obstruo
intraheptica e tanto maior quanto mais completa for a obstruo. As atividades das
enzimas podem alcanar 10 a 12 X o limite superior do intervalo de referncia, voltando
ao normal depois da remoo cirrgica da obstruo. (6)
Gama-glutamiltransferase (GGT)
A GGT no soro heterognea no que diz respeito a carga molecular e tamanho.
Estas formas aparecem devido a modificaes ps-traduo de um nico tipo de enzima
molecular, mais do que existncia de verdadeiras isoenzimas. (6)
Significado clnico
A atividade da GGT est elevada em todas as formas de doena heptica. mais
elevada em casos de obstrues biliares intrahepticas e ps-hepticas, atingindo
valores de 5 a 30 X o valor de referncia. mais sensvel que a ALP e que as
transaminases para detetar ictercia obstrutiva, colangite e colecistite. O seu aumento
ocorre antes de outras enzimas e persiste por mais tempo. Elevaes moderadas de 2 a 5
X ocorrem em hepatites infecciosas, mas nesta condio a determinao de GGT no
to til como a determinao das transaminases. So observadas elevaes da GGT em
doentes com neoplasias primrias e secundrias. Os nveis elevados de GGT so
notados no s em doentes com cirrose alcolica mas tambm na maioria de grandes
consumidores de lcool. (6)
A GGT o indicador enzimtico mais sensvel para doenas
hepatobiliares. Contudo, a GGT tem pouco valor para discriminar atempadamente entre
diferentes tipos de doena heptica. Em doentes que recebem frmacos como a fenitona
58
e fenobarbital, so observados nveis elevados de GGT. Este aumento de atividade pode

refletir a induo de nova atividade da enzima por ao de frmacos anticonvulsivantes.
Contudo, na doena oncolgica em geral, o aumento de atividade de GGT deve
primeiro ser suspeita de doena metastsica do fgado. (6)
2.7. Funo Pancretica

Os ensaios sricos da amlase, lpase, quimiotripsina e tripsina so quase
exclusivamente aplicados investigao da pancreatite. (6)
A pancreatite classificada como aguda ou crnica. A pancreatite aguda
habitualmente apresenta-se com dor abdominal e quase sempre com elevao das
enzimas pancreticas no sangue. A doena pode ser caracterizada pela descrio da sua
causa (quando conhecida), da severidade (ligeira ou severa), do local de ocorrncia ou
complicaes sistmicas. (6)
A pancreatite crnica caracterizada por dor abdominal persistente ou recorrente,
evidncia de insuficincia pancretica excrina e endcrina que pode ser resultado da
inflamao ou da destruio do pncreas. (6)
Amilase
As amlases so um grupo de hidrolases que quebram complexos de
carbohidratos compostos por -D-glucose unidas por ligaes entre os tomos de
carbono 1 e 4 localizados nos resduos adjacentes de glucose. As ligaes -1,6 no so
atacadas por esta enzima. As -amilases, tambm so chamadas endoamilases porque
atacam as ligaes -1,4 ao longo da cadeia polissacardea, quebrando-a rapidamente
em pequenas unidades, por exemplo, dextrinas, maltose e algumas unidades de glucose.
A amlase est presente num grande nmero de rgos e tecidos. A maior concentrao
est presente no pncreas (tipo P), onde a enzima sintetizada pelas clulas acinares e
depois secretada no trato gastrointestinal atravs do sistema de ductos pancreticos. As
glndulas salivares tambm secretam amlase (tipo S) para iniciar a hidrlise do amido
enquanto a comida est na boca e no esfago. (6)
59
Significado Clnico
Os ensaios da atividade da amlase no soro e na urina so largamente usados no
diagnstico de doenas do pncreas e na investigao da funo pancretica. A
magnitude da elevao da atividade da enzima no soro no est relacionada com a
severidade da pancreatite, mas quanto maior o aumento, maior a probabilidade de
pancreatite aguda. (6)
Doenas do trato biliar como a colecistite podem provocar aumento 4 X da
atividade da amlase. A peritonite e a apendicite aguda podem tambm produzir uma
ligeira elevao de 2 a 3 X a atividade da amlase srica.(6)
Lipase
As lpases so definidas como enzimas que hidrolisam steres de glicerol e cidos
gordos de cadeia longa. A concentrao de lpase no pncreas cerca de 100 vezes
maior que noutros tecidos. Para a atividade cataltica completa e maior especificidade
requerida a presena de sais biliares e um cofator chamado colipase. (6)
A lpase pode ser ativada por baixas concentraes de NaCl e outros ies. Ambas
lpase e colipase so sintetizadas e secretadas nas clulas acinares do pncreas. (6)
Significado Clnico
Depois de uma crise de pancreatite aguda, a atividade da lpase srica aumenta.
Os nveis permanecem elevados durante mais tempo que a amlase. As elevaes so
entre 2 a 50 X o limite superior de referncia, em paralelo com as da amlase, mas
podem ocorrer mais cedo ou mais tarde que as elevaes da atividade da amlase. (6)
A pancreatite aguda , por vezes, difcil de diagnosticar. Tem sido sugerida,
como alternativa s determinaes individuais da atividade de enzimas pancreticas, a
taxa reduzida de amlase/lpase pancreticas que um indicador til para os estdios da
doena. A obstruo do ducto pancretico por um clculo ou por carcinoma do pncreas
pode causar um aumento na atividade da lpase, dependendo da localizao da
obstruo e da quantidade remanescente de tecido funcional. (6)
60
2.8. Funo cardaca

2.8.1. Marcadores de necrose
Colheita de amostra de sangue: (nos doentes com sintomatologia compatvel com
enfarte agudo do miocrdio)
A colheita de amostras de sangue para efetuar as determinaes analticas dos

marcadores bioqumicos de necrose, deve ser realizada no momento de admisso
hospitalar e 6 a 9 horas mais tarde. Caso os resultados obtidos anteriormente sejam
negativos ou inconclusivos e a suspeita de EM se mantenha, deve ser colhido sangue
novamente 12 a 24 horas aps admisso, para confirmar ou excluir definitivamente o
diagnstico. (8)
Os marcadores bioqumicos de leso do miocrdio so molculas proteicas que

apresentam diferentes ndices de especificidade para o cardiomicito. A sua
concentrao srica/plasmtica e o padro cintico caracterstico em pico com que vo
sendo libertados para o sangue perifrico, depois da perda da integridade das
membranas celulares (leso precoce), esto diretamente relacionadas com o tipo de
clulas em que se encontram, a sua localizao intracelular, o peso molecular e o fluxo
sanguneo e linftico do local em que ocorreu a leso. (8)
Origem e localizao dos marcadores de necrose:
CK Total citoplasma das clulas dos msculos estriado e liso e das clulas do
SNC.
CK-MB massa Isoenzima 100% citoplasmtica do msculo cardaco e
esqueltico (1 a 3% do CK Total).
Mioglobina Protena hmica monomrica presente no citoplasma das clulas
dos msculos estriados.
Troponinas Protenas especficas ligadas s miofibrilas do cardiomicito. (3 a
8% esto livres no citoplasma). (8)
61
Creatina Cinase
CK Total
uma enzima essencialmente citoplasmtica, associada predominantemente s
estruturas miofibrilares das clulas, que se encontra em maior concentrao ao nvel do
SNC e dos tecidos musculares cardaco e esqueltico. A enzima normal tem uma
estrutura dimrica, formada por duas subunidades M, B ou por MB, resultando a
formao de 3 isoenzimas: CK1 ou BB; CK2 ou MB; CK3 ou MM. (8)
No soro/plasma dos indivduos saudveis a concentrao e a atividade da CK
Total devida em mais de 95% dos casos CK3 (isoenzima MM) e, em menos de 5%,
CK2 (isoenzima MB). o marcador clssico de necrose do miocrdio mais
conhecido, mas atualmente, face sua menor especificidade em relao s troponinas e
CK-MB massa, determinado apenas quando estas no esto disponveis. (8)
CK-MB (CK2)
No soro/plasma dos indivduos saudveis constitui menos de 5% da atividade
total de CK. A determinao direta da sua concentrao (CK-MB massa) o mtodo de
eleio para o diagnstico das leses de necrose do miocrdio em particular do enfarte
recorrente. muitas vezes utilizada em associao com a troponina-T e a mioglobina na
documentao e monitorizao, no invasiva, da teraputica da reperfuso do
miocrdio, ocorrida espontaneamente ou aps teraputica mdica ou cirrgica. Tem o
seu valor semiolgico comprometido como marcador de necrose nos doentes que
apresentam leses primrias ou secundrias do tecido muscular esqueltico (por
exemplo, em politraumatizados, aps grandes cirurgias, miopatias, miosites e
rabdomilise). (8)
Mioglobina
uma protena citoplasmtica monomrica presente nas clulas do msculo
estriado (esqueltico e cardaco). Tem elevada afinidade para o oxignio, funcionando
como seu reservatrio e sua transportadora ao nvel dos micitos. Como tem um peso
molecular baixo e se localiza no citoplasma, libertada mais precocemente para a
62
circulao sangunea do que os restantes marcadores de necrose, aps a perda da

integridade das membranas celulares. (8)
o marcador com maior valor preditivo negativo precoce (sensibilidade de 90 a
100%) de leso de necrose do miocrdio. Quando os valores so persistentemente iguais
ou inferiores ao limite superior do intervalo de referncia at ao final das primeiras 6
horas aps o incio da sintomatologia compatvel com leso de necrose do miocrdio,
permite excluir o diagnstico. (8)
utilizada frequentemente associada troponina-T, CK-MB massa ou a
ambas, na avaliao inicial, no invasiva, dos doentes com precordialgias, na
monitorizao da eficcia da reperfuso do miocrdio e no diagnstico laboratorial do
enfarte recorrente. (8)
Figura 35 Marcadores de necrose cardaca aps enfarte agudo do miocrdio.
Sensibilidade dos marcadores de necrose

A mioglobina um dos marcadores com maior sensibilidade nas primeiras 6
horas. Serve para triagem precoce dos doentes. Tem um excelente valor preditivo
negativo precoce: 100% at s 4-5 horas aps o incio da sintomatologia suspeita. (8)
Aps as 6 horas, as troponinas so os marcadores com maior sensibilidade: 65%
s 6h; 86% s 8h e 98% a partir do 5 dia da ocorrncia da leso de necrose do
miocrdio. (8)
63
Troponinas
O complexo proteico das troponinas constitudo por 3 cadeias polipeptdicas
simples, cuja funo regular o mecanismo de contrao muscular (interao entre a
actina e a miosina dependente do Ca2+). (8)
Foram identificadas isoformas da troponina T (cTnT) e da I (cTnI) especficas
do tecido muscular cardaco, que no existem noutras clulas, teis para a determinao
da sua concentrao no estudo dos doentes com patologias cardacas. (8)
As isoformas cardioespecficas das troponinas (cTnT e da cTnI) so os
marcadores bioqumicos de doena cardaca com maior sensibilidade e especificidade
para o estudo dos doentes com leses de necrose do miocrdio, independentemente da
sua etiologia, e para estratificao do risco de morbilidade e de mortalidade, relacionado
com a probabilidade de ocorrncia de episdios cardacos adversos. Para alm do seu
valor de diagnstico e prognstico, permitem identificar os doentes com doena instvel
das artrias coronrias, que podem beneficiar de uma teraputica mdica ou cirurgia
precoce agressiva. (8)
A troponina T (cTnT) considerada o marcador de primeira linha com
especificidade cardaca absoluta e elevado ndice de exatido para detetar, mesmo nos
doentes com insuficincia renal, a presena de leses mnimas de necrose e para fazer a
estratificao do risco. (8)
2.8.2. Marcadores de dislipidmia

A determinao laboratorial destes marcadores tem o seu maior valor na
identificao e caracterizao dos doentes com risco de Doena da Artria Coronria
(DAC), na avaliao da probabilidade de ocorrncia de um episdio cardiovascular
adverso e na monitorizao e orientao teraputica das dislipidmias. (8)
Rastreio laboratorial das dislipidmias

Colheita de amostra de sangue:
Regra geral, a colheita de amostras de sangue para efetuar o perfil lipdico deve
ser efetuada de manh (entre as 8h e as 10h) com o doente em jejum h 9 ou 12 horas.
64
Perfil lipdico:
As determinaes analticas recomendadas para o estudo do perfil lipdico dos
doentes so: Colesterol Total, triglicridos, lipoprotenas LDL, HDL e VLDL colesterol
no HDL, ndice aterognico do plasma e relaes colesterol total /HDL e LDL/HDL.
Tabela 2 Classificao fenotpica das hiperlipidemias (Fredrickson)
Colesterol Total (CT)

Embora uma parte do colesterol tenha origem exgena (da dieta), a maioria
sintetizada no organismo a partir do acetil-CoA ao nvel das glndulas supra-renais, das
gnadas, da pele e principalmente no hepatcito. O colesterol est presente nas
membranas celulares e o percursor dos cidos biliares e das hormonas esteroides. Ao
nvel do plasma encontra-se na forma livre e na esterificada, circulando em complexos
macromoleculares hidrossolveis designados por lipoprotenas. (8)
As lipoprotenas so complexos macromoleculares micelares hidrossolveis
esferides constitudas por triglicridos e steres do colesterol na sua poro central, e
por fosfolpidos e colesterol livre na periferia. Na sua superfcie encontra-se uma ou
mais protenas especficas designadas por apolipoprotenas. (8)
65
Triglicridos (TG)
So steres do glicerol mais abundantes da dieta e os que predominam no
plasma,
cuja
origem
fundamentalmente
exgena.
sua
concentrao
srica/plasmtica est diretamente relacionada com a das lipoprotenas ricas em

triglicridos, que tm origem no intestino (quilomicras) e no fgado (VLDL). (8)
Lipoprotena LDL
A lipoprotena LDL a mais aterognica. S contem uma apolipoprotena
(APO-B) e transporta cerca de 60 a 70 % do colesterol total circulante. O predomnio de
pequenas partculas densas de LDL est diretamente relacionado com o aumento do
ndice de esterificao do colesterol e com o da concentrao dos TG. Estas partculas
so particularmente vulnerveis oxidao e muito aterognicas. (8)
Lipoprotena HDL
Esta lipoprotena transporta cerca de 20 a 30% do colesterol total circulante e
contm apenas apolipoprotena-A. A HDL transporta o colesterol dos tecidos perifricos
para o fgado. As pequenas partculas de HDL, pobres em colesterol, formam-se
primariamente no plasma, a partir da coalescncia dos complexos fosfolpidosapoprotenas. O colesterol livre transfere-se das membranas celulares para a HDL que o
converte em steres de colesterol, para poderem fazer parte do core das HDL. Os nveis
de HDL relacionam-se inversamente com o risco de DAC. (8)
Apolipoprotena - A (APO-A)
A APO-A constitui cerca de 90% do material proteico da lipoprotena HDL.
Apesar das suas concentraes sricas/plasmticas estarem diretamente relacionadas
com as desta lipoprotena no recomendada como marcador de primeira linha para
determinar o risco de DAC. (8)
66
Apolipoprotena B (APO-B)
A
APO-B
um
bom
marcador
de
dislipidmia.
Os
seus
nveis
sricos/plasmticos esto diretamente relacionados com a concentrao de todas as

lipoprotenas aterognicas (VLDL, IDL e LDL), tendo j sido proposto como alternativa
determinao de LDL na estratificao dos doentes de risco. As concentraes da
LDL e da APO-B tm um forte ndice de correlao entre elas nos indivduos com TG
normais. Contudo, nos doentes em que os valores dos TG esto elevados (>199mg/dL),
verifica-se que a concentrao da APO-B aumenta desproporcionalmente mais do que a
da LDL. (8)
2.9. Funo Tiroideia

A funo da tiroide pode ser avaliada com base em vrios parmetros
endocrinolgicos, nomeadamente as hormonas TSH (hormona estimulante da tiroide)
FT4 ou T4 livre (tiroxina livre), a globulina de ligao tiroxina (TBG) e os anticorpos
anti-tiroglobulina (anti- TG), anti-peroxidase da tiroide (anti-TPO) e anti-recetor de
TSH (TRAB).
Ensaio TSH no soro
Indetetvel
Subnormal
Normal
Suspeita de
hipertiroidismo
Estado da
tiroide
borderline
Tiroide sem
disfuno
T4 livre (T3
livre se T4
livre normal
T4 livre
T3 livre
Elevada
Suspeita de
hipotiroidismo
T4 livre
Teste TRH
Figura 36- Estratgia de diagnstico da tiroide usando TSH como passo inicial.
67
TSH
A hormona estimulante da tiroide uma glicoprotena com 2 subunidades no
ligadas por covalncia. A subunidade alfa semelhante s das hormonas FSH, hCG e
LH. A subunidade beta da TSH nica. A TSH sintetizada e segregada pela hipfise
anterior em resposta a um mecanismo de feedback negativo que envolve concentraes
de T3 livre e T4 livre. A TSH exerce 2 funes principais: estimular a reproduo de
clulas e a hipertrofia e estimular a glndula da tiroide a sintetizar e segregar T3 e T4. A
quantificao dos nveis de TSH em circulao til no diagnstico diferencial entre o
hipotiroidismo primrio (tiroide), o secundrio (hipfise) e o tercirio (hipotlamo). No
hipotiroidismo primrio, os nveis de TSH so significativamente elevados, enquanto no
hipotiroidismo secundrio e tercirio so baixos. Os ensaios de TSH com sensibilidade
e especificidade acrescidas proporcionam tambm uma ferramenta de diagnstico
primria para diferenciar os doentes com hipertiroidismo, dos doentes eutiroideus.
T4 livre
Na circulao, 99,95% da T4 est reversivelmente ligada a protenas de
transporte, sobretudo globulina de ligao tiroxina (TBG) e, em menor grau,
albumina e pr-albumina de ligao tiroxina (TBPA). A restante T4 no est ligada a
protenas de transporte, estando livre na circulao. Esta frao no ligada, ou T4 livre,
metabolicamente ativa e um precursor da triiodotironina (T3). Os nveis de T4 livre
esto correlacionados com a secreo e o metabolismo da T4. No hipotiroidismo e no
hipertiroidismo, os nveis T4 livre so paralelos s alteraes nos nveis da T4 total.
Medir a T4 livre til quando ocorrem nveis alterados de T4 total devido a alteraes
nas protenas de ligao T4, sobretudo na TBG. Os nveis de TBG mantm-se
relativamente constantes em indivduos saudveis, mas em determinadas condies, tais
como a gravidez e a terapia com esteroides podem alterar estes nveis. Nestas condies
os nveis de T4 livre permanecem inalterados, enquanto os nveis de T4 total so
paralelos s alteraes da TBG.
68
TBG
A globulina de ligao tiroxina (TBG), embora presente em quantidades
significativamente inferiores que a TBPA e albumina, possui uma afinidade superior
com as hormonas da tiroide, e portanto a principal protena transportadora. A frao
ligada da T4 distribuda entre as protenas transportadoras da seguinte maneira: TBG,
70 75%; TBPA, 15 - 20%; e albumina, 5 a 10%. A concentrao de T4 livre pode ser
esperada em correlao mais prxima que a concentrao total de T4 com o estado
clnico da tiroide, j que um resultado de T4 total anormal pode significar uma
anormalidade na funo da tiroide ou simplesmente uma variao (fisiolgica ou
patolgica) nas protenas transportadoras. Desta forma, por exemplo, as elevaes de
TBG tpicas da gravidez, contracetivos orais e terapia de estrognios causaro o
aumento do nvel de T4 total, frequentemente alm dos limites normais, sem induzir
uma elevao correspondente nos nveis da T4 livre. Portanto, a concentrao da T4
livre refletir tipicamente o estado atual da tiroide do doente com mais preciso que a
T4 total.
Anti- TG
A tiroglobulina produzida unicamente pela glndula tiroide e o componente
maioritrio do coloide folicular da tiroide. As hormonas tiroideias tetraiodotironina
(tiroxina, T4) e triiodotironina (T3) so sintetizadas a partir da tiroglobulina. Os autoanticorpos para a tiroglobulina (anti-TG) esto presentes com grande frequncia em
doentes com doenas autoimunes da tiroide. Aproximadamente 10% dos indivduos
saudveis apresentam auto-anticorpos anti-TG em baixos nveis. Concentraes
superiores so encontradas em 30 85% dos doentes com a doena de Graves e tiroidite
de Hashimoto. Nestas doenas, elevados nveis de anticorpos para a peroxidase da
tiroide (anti-TPO) ocorrem mais frequentemente do que para a TG.
69
Anti-TPO
A peroxidase da tiroide (TPO) uma protena glicosilada com grupo heme
ligado membrana que existe na membrana apical das clulas foliculares da tiroide. A
medio de auto-anticorpos anti-TPO til na identificao de doentes com doena
autoimune da tiroide. Os nveis de anti-TPO aumentam em mais de 90% dos doentes
com tiroidite autoimune ativa. Esto presentes em quase todos os doentes com tiroidite
de Hashimoto e em mais de 70% dos doentes com a doena de Graves. Os nveis de
anti-TPO aumentam nas mulheres com tiroidite ps-parto. Esta condio ocorre em 5 a
9% das mulheres no perodo ps-parto.
TRAb
O TRAb (anticorpo anti-recetor de TSH) especfico para a doena de Graves e
para a tiroidite de Hashimoto em contraste com os anti-TG e os anti-TPO que podem ser
encontrados em outras doenas tiroideias e nos indivduos saudveis.
Sabe-se que existem pelo menos dois tipos de TRAb no soro dos doentes com
doena auto-imune da tiroideia. Um estimulador e detetado na maioria dos doentes
com doena de Graves causando hiperfuno, o outro bloqueador e detectado em
alguns doentes com tiroidite auto-imune crnica causando hipofuno e atrofia. Estes
dois tipos de TRAb podem coexistir no mesmo doente, podendo variar a funo
tiroideia de acordo com a concentrao relativa de cada um deles.
70
3. Imunologia
Neste captulo de Imunologia sero abordadas anlises de 3 reas do laboratrio,
nomeadamente, os imunoensaios (realizados no CORE), os ensaios de RIA e a
Alergologia (realizados na seco de RIA) e os restantes na seco de Imunologia
propriamente dita (IMN).
3.1. Sistemas Automatizados nos Imunoensaios

Na cadeia automatizada do CORE laboratorial esto embutidos equipamentos de
imunoensaios: Siemens ADVIA Centaur 1, 2, e 3 e o IMMULITE 2000.
Figura 37 - Analisadores Automticos de Imunoensaios: esquerda ADVIA Ceutaur e direita

IMMULITE 2000.
O ADVIA Centaur um analisador automtico que mede a quantidade de luz

emitida durante a reao quimioluminescente desencadeada pela alterao de pH devida
adio de um cido e uma base na fase final da reao. Os ensaios utilizam a
tecnologia de ligao competitiva e sandwich, com ster de acridnio como marcador e
partculas paramagnticas como fase slida. No necessria nenhuma etapa de
amplificao do sinal. O sinal gerado pelo marcador suficiente para ser lido pelo
sistema.
O Analisador automtico de Imunoensaio IMMULITE 2000 um instrumento
de acesso aleatrio que efetua imunoensaios de quimioluminiscncia. Este sistema de
automao utiliza amostras de soro, plasma e/ou urina para diagnstico in vitro.
71
Tecnologia de luminescncia
A luminescncia a emisso de luz associada dissipao de energia de um
composto que se encontra num estado eletronicamente excitado ao retornar a um estado
fundamental.
Na quimiluminescncia a excitao causada por uma reao qumica
envolvendo um composto orgnico. Por exemplo, Luminol ou steres de Acridina. Na
electroquimioluminiscncia a excitao causada por uma reao electroqumica
gerada a partir de um composto estvel na superfcie de um eltrodo.
Princpio de funcionamento:
A tecnologia de quimioluminescncia utilizada no IMMULITE 2000 recorre
fosfatase alcalina como catalisador enzimtico e ao dioxetano como substrato. A
fosfatase alcalina catalisa a reao de degradao do substrato num produto
fluorescente.
A luz emitida quando o substrato de quimioluminiscncia reage com a camada
de fosfatase alcalina ligada esfera revestida. A quantidade de luz emitida
proporcional (no caso de um ensaio tipo sandwich) ou inversamente proporcional (no
caso de um ensaio competitivo) quantidade de analito inicialmente contida na amostra.
A emisso de luz detetada pelo tubo fotomultiplicador (PMT) onde a luz gerada pela
reao luminognica medida e os resultados so calculados para cada amostra.
Ao contrrio das reaes quimioluminescentes envolvendo steres de anidrino
(que produzem um claro de luz) a reao amplificada pela enzima no sistema
IMMULITE 2000 produz um brilho prolongado, o que constitui uma vantagem.
Comparando com outros mtodos de deteo, a quimioluminescncia oferece o
mais alto grau de sensibilidade disponvel. Em muitos casos, a sensibilidade melhor
em vrias ordens de grandeza do que aquela obtida com ensaios radioimunolgicos,
sendo mais uma vantagem da quimioluminescncia.
72
Outro equipamento de imunoensaios existente no CORE laboratorial que utiliza

a eletroquimioluminescncia o Analisador cobas e 411.
Figura 38 - Analisador cobas e 411
O sistema de imunoensaio cobas e 411 da Roche Diagnostics um analisador de

mltiplos canais, automatizado, de acesso aleatrio, para anlises imunolgicas. Foi
concebido para efetuar determinaes quantitativas e qualitativas in vitro de uma ampla
variedade
de
substncias
analisadas
atravs
do
recurso
tecnologia
de
electroquimioluminescncia (ECL). A tecnologia de electroquimioluminescncia

utilizada no Cobas, recorre a duas espcies reativas, a Tripropilamina como iniciador
das reaes redox e o Rutnio como marcador quimioluminescente.
73
3.2. Alergologia
Teste de IgE
Podem ser realizadas anlises ao sangue, para medir os nveis de IgE especfica,
qualquer que seja a idade do doente, a condio da pele ou a medicao antihistamnica, mesmo durante a gravidez. Os anticorpos IgE circulam no soro e no plasma
humano como resultado da sensibilizao a um alergnio especfico. A medio destes
anticorpos circulantes proporciona uma medio objetiva e fivel da sensibilizao ao
alergnio.
Existem disponveis no mercado mais de 650 alergnios diferentes e 70
componentes alergnicos para deteo quantitativa sensvel e especfica dos anticorpos
IgE dos alergnios. Embora um diagnstico final se deva basear sempre numa
combinao dos resultados dos testes de doseamento IgE, com o historial clnico do
doente, o princpio emprico geral que quanto maior for a presena de anticorpos IgE,
maior a probabilidade do aparecimento de sintomas.
Ensaios no Analisador de Alergologia ImmunoCAP 250
Figura 39 - Analisador de Alergologia ImmunoCAP 250
Os testes mais comuns so o IgE Total e os IgE Especficos cujos alergnios

podem ser provenientes de plenes de gramneas e rvores, microrganismos, caros,
gatos, ces e outros animais com pelo, insetos, venenos de animais, alimentos, aditivos.
74
Podem ser ainda marcadores celulares de asma e inflamao como o ECP (Protena
catinica dos eosinfilos) e a triptase, um marcador de mastcitos.
O Phadiatop e o Phadiatop Infant (destinado a crianas) so testes de rastreio
que diferenciam atpicos de no atpicos. o primeiro passo quando se suspeita de
uma etiologia perante sintomas tpicos como problemas gastrointestinais, eczema, rinite
ou asma.
ImmunoCAP IgE Total

O ImmunoCAP IgE Total corresponde a um teste in vitro que permite avaliar o
valor de IgE total circulante em amostras de soro ou de plasma humanos. Pretende-se a
sua utilizao para o auxlio no diagnstico de doenas alrgicas IgE-mediadas, em
associao com outros dados clnicos.
Explicao do teste:
A concentrao srica de IgE encontra-se significativamente elevada na maior
parte dos doentes com doenas alrgicas, tais como asma extrnseca, febre dos fenos ou
eczema atpico. O aumento do valor de IgE durante a infncia bastante lento. Os
valores do adulto so atingidos apenas entre os 15 e os 20 anos.
Princpio do mtodo:
Mtodo de FEIA (Fluoro Enzyme Immuno Assay)
As anti-IgE, acopladas por ligao covalente aos ImmunoCAP, reagem com as

IgE totais contidas na amostra de soro do doente. Aps lavagem, os anticorpos anti-IgE
marcados por uma enzima so adicionados para formarem um complexo. Aps
incubao, os enzima-anti-IgE no ligados so eliminados por lavagem e o complexo
ligado colocado em incubao com um substrato. Aps paragem da reao, mede-se a
fluorescncia do eludo. A fluorescncia diretamente proporcional concentrao de
IgE na amostra de soro. Para avaliar os resultados do ensaio, a resposta das amostras
dos doentes convertida em concentraes atravs da utilizao de uma curva de
calibrao.
75
Significado Clnico:
A alergia pode ser entendida como uma deficincia do sistema imunitrio
humano, que causa uma reao violenta a substncias normalmente incuas que esto
presentes no ambiente natural. Neste contexto, essas substncias so denominadas de
"alergnios". No se conhecem todos os fatores de risco da alergia, mas sabe-se que os
fatores genticos e ambientais so importantes. A alergia pode ser mediada por
anticorpos ou por clulas. Na maior parte dos casos, o anticorpo responsvel por uma
reao alrgica pertence ao isotipo IgE, dizendo-se dos indivduos afetados, que sofrem
de uma alergia mediada por IgE.
No caso das alergias atpicas, o efeito da exposio a um alergnio pode ser
imediato. Os sintomas podem ser ligeiros ou graves, indo desde comicho nos olhos a
eczema, passando por rinites, conjuntivites, broncoconstrio, vmitos e diarreia e, mais
raramente, anafilaxia. Podem observar-se reaes crnicas da pele, eczema, e, no caso
da asma brnquica, uma inflamao continuada do tecido pulmonar pode desencadear
um ataque de asma aps a exposio ao alergnio causador. Os ataques de asma
tambm podem ser desencadeados por eventos diferentes das reaes mediadas por IgE.
As manifestaes de doena atpica variam consideravelmente consoante o alergnio
envolvido e a idade dos doentes alrgicos. Durante a primeira infncia, so mais
comuns as alergias a alimentos, especialmente ovos e leite. Depois dos 3 anos de idade,
a maior parte das crianas tolera estes alimentos, passando a predominar a alergia a
inalantes. Os anticorpos IgE especficos antecedem frequentemente os sintomas de
alergia, mas os sintomas clnicos revelam-se com o passar do tempo. Nas fases iniciais,
a alergia pode revelar-se como uma condio aparentemente benigna, como, por
exemplo, a febre-dos-fenos durante a estao polnica.
Algumas pessoas desenvolvem uma condio alrgica gradualmente, ao longo
dos anos, antes de sentirem quaisquer sintomas. Outras sofrem um choque anafiltico
sbito que pode ser fatal aps a ingesto de determinado alimento ou frmaco, ou aps
uma picada de inseto. Alm disso, algumas alergias que comeam como um eczema ou
problemas gastrointestinais podem evoluir para asma, envolvendo muitas vezes
sintomas respiratrios como a hiperatividade e a obstruo das vias respiratrias.
76
3.3. Endocrinologia
A figura seguinte ilustra vrias glndulas e os eixos endocrinolgicos da
hipfise, dos quais sero abordados alguns exemplos.
Figura 40 - Eixos endocrinolgicos da hipfise
Hormona de Crescimento
Amostra: Soro ou plasma.
Significado Clnico:
A hormona de crescimento humano (hGH) polipeptdo originrio da hipfise
anterior. Os seus efeitos so principalmente anablicos. Promove a conservao da
protena, aumenta o transporte de glucose e facilita o armazenamento de glicognio.
As desordens clnicas de hipossecreo incluem nanismo e no obteno de
crescimento potencial. A hipersecreo associada ao gigantismo e a acromeglia
77
Deve-se ter cuidado na interpretao clnica de nveis de hormona de

crescimento. Esta varia durante todo o dia, dificultando a definio de uma faixa de
referncia ou a avaliao do estado de um indivduo baseado numa nica determinao.
Muitos factores so conhecidos na influncia da taxa de secreo da hormona de
crescimento, incluindo perodos de sono e estado de alerta, exerccio, stress,
hipoglicmia, estrognios, corticosteroides e outros.
ACTH- Hormona Adrenocorticotrfica

Amostra: Plasma em EDTA.
Preparao e conservao da amostra:
Os nveis de plasma de ACTH exibem uma variao diurna significativa.
Portanto, importante uniformizar a hora de colheita: os valores de referncia tpicos
foram estabelecidos para as 9 horas da manh, aproximadamente.
Deve-se recolher o sangue em tubos de EDTA em gelo anotando a hora da
colheita. Os tubos devem ser imersos num banho de gelo aps a colheita. Separa-se o
plasma por centrifugao numa centrfuga refrigerada, separa-se por alquotas e
congela-se imediatamente em tubos de vidro de silano ou plstico.
Significado Clnico:
As determinaes de ACTH so valiosas no diagnstico diferencial de
insuficincia adrenal e hipersecreo. Na doena de Addison (insuficincia adrenal
primria) nveis elevados so tpicos, enquanto se verificam nveis reduzidos quando a
insuficincia adrenal secundria, deficincia pituitria. As determinaes de ACTH
tambm podem auxiliar a identificar a causa da hipersecreo de hidrocortisona no
Sndrome de Cushing.
78
Fertilidade e desordens do Sistema Reprodutor

-hCG livre
Medio quantitativa da sub-unidade -hCG livre no soro.
A gonadotropina corinica humana (HCG) uma hormona glicoprotena

normalmente presente no sangue e na urina apenas durante a gravidez. segregada pelo
tecido placentrio comeando com o trofoblasto primitivo, quase a partir do tempo da
sua implantao e serve para apoiar o corpo lteo durante as primeiras semanas de
gravidez. A HCG tambm produzida por uma variedade de neoplasias trofoblsticas e
no trofoblsticas. A HCG intacta composta de 2 subunidades no idnticas, e , que
so ligadas entre si de uma forma no covalente. Podem ocorrer numa forma livre ou
no ligada. A subunidade semelhante da LH, FSH, TSH. A subunidade
especfica para cada uma dessas hormonas e confere-lhes as atividades biolgicas
diferentes.
As medidas dos nveis de -hCG livre tm sido comprovadas como auxiliar no
diagnstico e monitorizao de doenas trofoblsticas, coriocarcinomas e em
determinados tumores testiculares onde as propores de subunidade beta-livre para a
HCG intacta podem ser bastante altas. As medidas dos nveis de -hCG livre podem
tambm ter valor na monitorizao precoce dos resultados dos procedimentos de
fertilizao in vitro. A determinao no soro materno de -hCG livre tem sido
referenciado como tendo utilidade significativa na deteo do risco pr-natal no 1 e 2
trimestres para a Sndroma de Down e outras anomalias cromossmicas.
Testosterona (TSTO)
A testosterona o andrognio principal dos homens, sendo controlada pela LH.
Uma avaliao clnica da testosterona no soro, em conjunto com a LH no soro, auxilia
na avaliao dos homens hipogonadais. As principais causas de reduo de testosterona
nos homens incluem: hipogonadismo hipogonadotrfico, insuficincia testicular,
hiperprolactinmia, hipopituitarismo e alguns tipos de doenas hepticas e renais.
Os nveis so muito inferiores nas mulheres em comparao com os homens. As
principais fontes de testosterona nas mulheres so os ovrios, a glndula suprarrenal e a
79
converso perifrica de percursores, especificamente a converso de androstenodiona

em testosterona. Nas mulheres, nveis normais de androgneos podem proporcionar
substrato para a produo de estrognios. Nveis acrescidos de testosterona no soro das
mulheres pode ser indicativo de Sndroma de ovrios poliqusticos e hiperplasia
suprarrenal. As manifestaes clnicas de excesso incluem infertilidade, hirsutismo,
amenorreia e obesidade.
A testosterona liga-se fortemente a protenas do plasma, como a globulina de
ligao s hormonas sexuais (SHBG) ou a globulina de ligao ao estradiol-testosterona
(TeBG). Menos de 2,5% da testosterona circula desligada das protenas do plasma.
SHBG - Globulina de Ligao s Hormonas Sexuais

A globulina de transporte das hormonas sexuais uma glicoprotena sintetizada
no fgado, que liga a testosterona e a 5-dihidrotestosterona com elevada afinidade, assim
como o estradiol mas com afinidade algo menor.
A SHBG circula normalmente em maiores concentraes na mulher do que no
homem, devido maior proporo de estrognios que andrognios na mulher. Pela
mesma razo os nveis de SHBG na gravidez avanada ou aps administrao de
estrognios podero ser especialmente elevados. A administrao de andrognios tende
a estar associada a nveis de SHBG diminudos.
Valores baixos de SHBG so normalmente encontrados no hirsutismo, acne
vulgaris, e na Sndroma do ovrio poliqustico. Os nveis de SHBG podero ser
reduzidos no hipotiroidismo, acromeglia, doena de Cushing e hiperprolactinmia. Os
glucocorticoides e a hormona de crescimento tm sido igualmente associados a nveis
decrescidos de SHBG.
Podero ser encontrados nveis elevados de SHBG no hipertiroidismo e cirroses
hepticas e tambm em outras condies como a gravidez. Os aumentos podero por
vezes ser vistos aps administrao de estrognios como, por exemplo, sob a forma de
contraceptivos orais, ou como consequncia da induo heptica.
80
Radioimunoensaio (RIA )
O RIA um mtodo de elevada especificidade que pode ser utilizado para
quantificar hormonas (como os exemplos aqui apresentados), drogas, marcadores
tumorais, entre outros.
O RIA baseia-se na competio de um antignio presente na amostra em anlise
com um antignio marcado com istopo radioativo pelo mesmo anticorpo. A
concentrao do antignio em anlise ser inversamente proporcional radiao
emitida. Trata-se de uma tcnica com alta especificidade e sensibilidade, porm com
elevado custo e risco operacional por manipular material radioativo.
H muitas variaes, mas o princpio o mesmo: a quantidade de reagente
marcado (antignio ou anticorpo) quantifica o antignio ou anticorpo no-marcado na
amostra. Este mtodo tem como princpio geral uma reao de competio por um
recetor comum entre uma substncia a ser determinada e a mesma substncia marcada
radioisotopicamente.
Nos ensaios de RIA existem dois tipos:

Ensaio competitivo, indireto ou no imunognico (RIA)
Ensaio no-competitivo, direto ou imunognico (IRMA).
Desvantagens das tcnicas de RIA:

Morosidade
Trabalho manual
Necessidade de licena da DGS (Direo Geral de Sade)
Validade curta
Rentabilidade baixa
Custos adicionais da dosimetria
Monitorizao da radiao
Contudo, apesar das desvantagens, o RIA no est em desuso, pois necessrio

fazer por estas tcnicas os ensaios para os quais no haja alternativa.
81
Tcnica de RIA - Ensaio competitivo, indireto ou no- imunomtrico

Antignio marcado 125I
Nesta tcnica os tubos podem ter o anticorpo impregnado no tubo ou formar-se
um precipitado no fundo do tubo.
Exemplo: A Aldosterona marcada com
125
I compete durante um perodo de
tempo fixo com a Aldosterona por locais de fixao de anticorpo na amostra do doente.
Figura 41- Radioimunoensaio competitivo ou indirecto
Tcnica de IRMA - Ensaio no-competitivo, direto, imunomtrico

Anticorpo marcado 125I
Figura 42-Radioimunoensaio no competitivo, direto ou imunomtrico
82
Doseamento de Renina pelo mtodo de IRMA
Amostra:
Plasma em EDTA.
Princpio do mtodo:
Trata-se de um ensaio imunorradiomtrico baseado num tubo coberto. O
anticorpo de captura, cobre a parte interna inferior do tubo de plstico. Os calibradores
ou amostras agregadas aos tubos manifestam ao princpio uma baixa afinidade para o
anticorpo de captura. A adio de um anticorpo de sinal marcado com
125
I, completa o
sistema e desencadeia a reao imunolgica. Depois de lavar, a radioatividade

remanescente no tubo reflete a concentrao do antignio.
Significado clnico:
A renina uma protase circulante secretada pelas clulas justaglomerulares no
aparelho justaglomerular dos rins como resposta a uma baixa da volmia ou baixa
concentrao de NaCl no organismo. A renina ativa o sistema renina-angiotensina
dividindo o angiotensinogneo produzido no fgado em angiotensina I (inativa) que por
sua vez convertida em angiotensina II (ativa) no epitlio vascular do pulmo. A
angiotensina II pode provocar vasoconstrio, estimula a secreo de ADH e a secreo
de aldosterona na glndula suprarrenal. A regulao da presso sangunea e o controlo
da filtrao glomerular so as funes mais importantes do sistema renina-angiotensina.
A determinao dos nveis plasmticos de renina til no diagnstico de hipertenso e
no seguimento teraputico dos doentes hipertensos. A concentrao plasmtica de
renina diminui nos doentes hipertensos devido a hiperaldosteronismo primrio. Pelo
contrrio na hipertenso renovascular tanto a concentrao de renina como a de
aldosterona esto aumentadas.
83
3.4. Serologia infeciosa Reaes de aglutinao

Nas reaes de aglutinao formam-se imunocomplexos devido interao de
anticorpo e de antignio sob a forma de partculas. Faz-se a distino entre testes de
aglutinao direta (prova de hemaglutinao para determinao do tipo de sangue e
prova de aglutinao bacteriana de Widal) e testes de aglutinao indireta (prova de
aglutinao do ltex e prova de hemaglutinao passiva). (9)
Serodiagnstico Febril
Existem vrias reaes:
Reao de Hudlesson (para Brucella spp.) - esta reao consta de uma
aglutinao em placa e deteta quer imunoglobulinas da classe IgM, quer da
classe IgG
Reao de Rosa Bengala (para Brucella abortus)
Reao de Widal (para Salmonella typhi e Salmonella paratyphi)
Reao Weil Flix (para Rickettsia spp.)
Estas reaes fazem-se em lmina e os positivos tm de ser feitos em tubo para

confirmar.
Amostra:
Soro (no utilizar amostras hemolisadas nem lipmicas).
Princpio do mtodo:
Os antignios febris so suspenses normalizadas de bactrias tingidas que so
utilizadas para identificar e quantificar anticorpos especficos que se desenvolvem
durante algumas infees febris tais como a brucelose, salmonelose e certas
rickettsioses. O antignio na suspenso aglutina na presena do anticorpo homlogo nas
amostras ensaiadas.
84
Leitura de Resultados:
Examina-se a presena de aglutinao no minuto seguinte paragem do agitador
mecnico rotatrio de velocidade regulvel a 100 rpm. necessrio ter em ateno que
os atrasos nas leituras podem ocasionar falsos resultados positivos.
Resultados positivos: Presena de aglutinao. Os soros positivos devem ser
quantificados por meio da prova em tubo. Define-se o ttulo na prova em tubo como a
diluio maior que d resultado positivo.
Resultados negativos: ausncia de aglutinao visvel.
Significado Clnico:
Ttulos superiores a 1/80 para os antignios de Salmonella ou Brucella so
geralmente indicativos de infeo recente. Um ttulo inferior a 1/160 no deve ser
considerado significativo.
Serodiagnstico da Sfilis
Teste rpido de floculao IMMUTREP RPR Amostra:

Soro ou plasma.
Princpio do teste:
Trata-se de um teste de floculao no especfico para o diagnstico da Sfilis
atravs da pesquisa de anticorpos (reaginas) do Treponema pallidum. O RPR uma
forma modificada do clssico Antignio VDRL contendo partculas de carvo o que
evita a necessidade de utilizao do microscpio. Quando existe ligao entre
colesterol/ cardiolipina/ lecitina no reagente e os anticorpos reagina na amostra, os
resultados podem ser observados em forma de manchas pretas. Quando h aglutinao
apresenta flocos negros. O teste pode ser utilizado no soro ou plasma, inativados ou no,
sendo assim bastante verstil. Pode ser utilizado no teste manual ou em aparelhos auto85
analisadores que so utilizados em bancos de sangue para o despiste, em grandes

quantidades, de Sfilis, em doaes de sangue de rotina.
O mtodo RPR semi-quantitativo, no necessita de confirmao mas faz-se
diluio em lmina para dar o resultado da diluio. O ttulo o inverso da ltima
diluio a apresentar um resultado positivo. Foram detetados ttulos 1/128 com o RPR
sem efeito prozona (efeito Hook). A ausncia de aglutinao em altas concentraes de
anticorpos chamada de efeito prozona. A ausncia de aglutinao no efeito prozona
devida ao excesso de anticorpos resultando em complexos muito pequenos que no se
aglomeram para produzir aglutinao.
Aglutinao passiva
TP-PA - Teste de aglutinao passiva para deteo de anticorpos de
Treponema pallidum
Amostra:
Soro ou plasma.
Princpio do mtodo:
O kit fabricado atravs da utilizao de portadores de partculas de gelatina
sensibilizadas com patogneo purificado de Treponema pallidum. O teste baseia-se no
princpio de que as partculas sensibilizadas so aglutinadas pela presena de anticorpos
de Treponema pallidum no soro ou plasma humano. Trata-se de um teste semiquantitativo baseado numa srie de diluies duplas em placa.
Figura 43- Placa do teste TP-PA
86
Resultados:
Partculas concentradas em boto no centro da cavidade com uma margem
externa circular lisa um resultado negativo (-).
Partculas concentradas em anel compacto com margem externa circular lisa
um resultado indeterminado ().
Anel grande bem definido com uma margem externa irregular multiforme e
aglutinao perifrica um resultado positivo (+).
Partculas aglutinadas dispersas a cobrir o fundo da cavidade de modo uniforme
um resultado positivo (++).
Significado Clnico:
A sfilis uma doena infecciosa crnica causada por transmisso sexual, ou
congnita, do Treponema pallidum. Esta doena continua a ser um problema global,
com uma estimativa de 12 milhes de pessoas infetadas a cada ano, apesar da existncia
de medidas eficazes de preveno e opes de tratamento eficazes e de relativamente
baixo custo. Deste modo, a serologia essencial na deteo e controlo de infeo da
sfilis.(10)
As recomendaes europeias da OMS sugerem o ensaio imunoenzimtico (EIA)
ou imunoensaio quimioluminescente (CLIA) ou TPPA, conforme o caso, como um
nico teste de triagem. O RPR/VDRL no recomendado como um teste de triagem
primria. O ensaio de confirmao realiza-se se qualquer outro ensaio de rastreio
primrio for positivo. (10)
O CDC, por outro lado, argumenta que a utilizao de apenas um tipo de teste
serolgico, insuficiente para o diagnstico. O CDC recomenda o teste reflexo de todos
os soros que do resultados EIA/CLIA reativos com um teste no-treponmico
quantitativo, e o teste reflexo de soros que do resultados discordante (ou seja, teste
EIA/CLIA reativo e teste RPR/VDRL no reativo) com confirmao com o teste TPPA.
(10)
87
3.5. Immunodifuso radial
Amostras:
Amostras de soro frescas ou congeladas. O sangue deve ser colhido por via
venosa e coagulado temperatura ambiente. O soro pode ser guardado entre 2 e 8 C at
48 horas, antes de ser utilizado.
Princpio do mtodo:
Na Imunodifuso radial simples (mtodo de Mancini), uma placa de agarose
homogeneamente revestida com um gel que contm o anticorpo apropriado. A amostra
de antignio colocada nos poos da placa. O anticorpo difunde-se radialmente para o
gel, diluindo-se deste modo. Formam-se imunocomplexos que do origem ao
aparecimento de um halo de precipitao. O tamanho deste halo aumentar at se
alcanar o equilbrio entre a formao e o esgotamento destes complexos, sendo este
ponto designado por concluso. Os imunocomplexos formam precipitados na regio
de equivalncia. Neste estado de equivalncia existe uma correlao linear entre o
quadrado do dimetro do halo e a concentrao de antignio. No mtodo de Mancini
considera-se que a concentrao do antignio proporcional ao quadrado do dimetro
(d2) do halo de precipitao. A partir da medio do dimetro dos halos de um nmero
de calibradores com concentraes conhecidas, poder construir-se uma curva de
calibrao. A concentrao do antignio numa amostra desconhecida pode ento ser
determinada pelo valor da medio do dimetro do halo produzido por esta amostra,
numa curva de calibrao.
Existem vrios procedimentos para determinar a concentrao do antignio.
Pode-se usar uma tabela de valores de imunodifuso radial, que no requer a elaborao
de uma curva de calibrao. Pode usar-se uma curva de calibrao de difuso completa
ou de difuso incompleta.
88
Significado Clnico:
Em adultos normais as IgG representam aproximadamente 75% das
imunoglobulinas totais no soro. A maioria das IgG sintetizada nas clulas plasmticas
e a sua capacidade para penetrar na placenta confere-lhe um papel protetor fundamental
nas primeiras semanas de vida, quando o sistema imunitrio neonatal no est ainda
totalmente desenvolvido. As IgG esto divididas em 4 subclasses, IgG1, 2, 3 e 4, as
quais revelam considerveis diferenas nas suas propriedades, incluindo a capacidade
de fixao do complemento para a ligao aos macrfagos e de penetrao na placenta.
Nveis sricos aumentados esto associados a doenas hepticas crnicas e a mielomas.
Nveis sricos diminudos podero estar associados a distrbios e outras condies
severas de diminuio da sntese proteica.
As IgA so a maior classe de imunoglobulinas secretoras. So parte do sistema
de defesa contra os agentes exteriores de superfcie. A forma monomrica composta
por duas cadeias pesadas alfa e duas cadeias leves, mas a forma dimrica, IgA secretora
(IgA1) contm a componente secretora e a cadeia J liga as duas molculas de IgA. Esta
tambm aparece em secrees e no colostro. Aumentos dos nveis sricos das IgA esto
associados a aleitao, mas tambm a infees crnicas, doenas hepticas e mielomas.
Nveis sricos diminudos podero estar associados a certas condies de diminuio de
sntese proteica.
As IgM so imunoglobulinas sintetizadas como resposta aos ataques de
particulares antignios. Cada unidade consiste em duas cadeias pesadas e duas leves,
cinco unidades associadas com a cadeia J correspondem a uma molcula de IgM. A IgM
por esta razo, multivalente e reage mais eficazmente com antignios polivalentes tais
como bactrias e vrus. Elas tambm activam o complemento. Uma imunizao ativa a
IgM aparece rapidamente no soro, mas os nveis normalmente decrescem aps uma
semana, usualmente em paralelo com um aumento das IgG. Nveis sricos aumentados
esto associados com hepatites, mielomas, macroglobulinemias de Waldenstrm e
outras infees. Nveis diminudos podem ocorrer em sndromas de deficincia de
produo de anticorpos.
89
3.6. Nefelometria
Dentro das reaes de precipitao em fase lquida, temos a turbidimetria e a
nefelometria. Na turbidimetria, depois de fazer reagir a amostra de antignio com um
excesso de anti-soro contendo o respetivo anticorpo, formam-se complexos solveis. A
mudana de turvao no tubo de ensaio medida por fotometria. Para determinar o
ponto final, usa-se o aumento de absoro num determinado espao de tempo como
medida da concentrao do antignio. A nefelometria tambm se baseia no princpio da
reao de formao de imunocomlexos pela interao antignio-anticorpo. O tubo
irradiado por luz laser, que se dispersa dos imunocomplexos. Usam-se lentes para focar
a luz dispersa sobre um fotmetro. Usando os sinais medidos, a concentrao
desconhecida de antignio pode ento ser determinada a partir de uma curva padro. (9)
Imunonefelometria nos Sistemas BN ProSpec
Figura 44 - Sistemas BN ProSpec
Amostra:
Soro ou plasma heparinizado.
Princpio do mtodo:
As protenas contidas nos fluidos corporais humanos formam complexos
imunitrios numa reao imunoqumica com anticorpos especficos. Estes complexos
difratam um feixe de luz que atravessa a amostra. A intensidade da luz difratada
proporcional concentrao da protena relevante na amostra. O resultado avaliado
por comparao com um padro de concentrao conhecida.
90
Significado clnico:
A imunonefelometria utilizada para quantificao de protenas como: 1
glicoprotena cida, 2macroglobulina; apolipoprotena A-II e apolipoprotena E
humanas; fatores de coagulao e inibidores C1 humanos: fibrinognio, antitrombina III
e plasminognio e inibidor C1 esterase; ceruloplasmina (protena com funo de
transporte de cobre no soro) e hemopexina humanas. A hemopexina liga-se ao heme da
hemoglobina e liberta-se durante a lise dos eritrcitos. No uma protena de fase
aguda. Tem um papel semelhante haptoglobulina. Em casos de hemlise grave aps o
consumo de haptoglobulina, leva a reduo dos nveis sricos e plasmticos de
hemopexina.
Imunonefelometria potenciada por partculas

Amostra:
Soro ou urina.
Princpio do mtodo:
As partculas de poliestireno revestidas com anticorpos para cadeias humanas leves
livres tipos kappa ou lambda so aglutinadas quando misturadas com amostras que
contm FLC (Cadeias Leves Livres). Estes agregados so atravessados por um raio de
luz que passa atravs da amostra. A intensidade da luz dispersa proporcional
concentrao da respetiva protena na amostra. O resultado avaliado por comparao
com um padro de concentrao conhecida.
Significado Clnico:
Determinao de imunoglobulinas / cadeias leves livres kappa e lambda em
gamapatias monoclonais. Trata-se de um mtodo auxiliar de diagnstico e
monitorizao de mieloma mltiplo, macroglobulinemia de Walderstrm, amiloidose,
perturbaes de deposio de cadeias leves livres e neoplasia linfocitria.
91
3.7. Tcnicas cromatogrficas

Mononucleose infecciosa - Kit Clearview IM
Amostras:
Para amostras de soro ou plasma adicionam-se 4 gotas e espera-se 5 minutos.
Para amostras de sangue total adicionam-se 2 gotas e 2 gotas de diluente de amostra e
espera-se 15 minutos.
Indicao:
O teste usado para o diagnstico da mononucleose infeciosa. Na febre
glandular e a mononucleose infeciosa (MI) comum haver troca de diagnstico. A MI
sintomaticamente, a doena do beijo, pode ser uma infeo sria que necessita de
tratamento urgente. possvel uma rpida identificao ou eliminao da MI com o
Clearview IM. Sabe-se que a MI uma infeo aguda por vrus herpes causada pelo
Vrus Epstein-Barr (EBV). A infeo induz a produo de vrios anticorpos.
Princpio do teste:
um teste cromatogrfico que utiliza o mtodo de Paul Bunnell. O mtodo de
Paul Bunnell baseado na aglutinao de eritrcitos por anticorpos heteroflicos da MI.
Contudo a MI no a nica que produz anticorpos heteroflicos. Uma glicoprotena
altamente purificada de eritrcitos de bovino combinado com o Clearview numa
tecnologia de um nico passo produz um resultado que no ambguo.
A amostra colocada na janela da amostra, hidrata os reagentes e migra atravs
de uma membrana cromatograficamente. Se o anticorpo heteroflico estiver presente vai
ligar-se ao ltex marcado com a glicoprotena formando um complexo. Este complexo
imobilizado por uma banda de glicoprotena na janela do resultado produz uma linha
azul slida. Se no houver linha azul na janela do resultado indica que os anticorpos
heteroflicos no esto presentes.
Como garantia, o controlo formado por ltex marcado com anticorpo de rato na
janela do controlo quando capturado forma uma linha confirmando que o teste correu
corretamente.
92
3.8. Marcadores sricos de doenas infeciosas

Na serologia infeciosa muito importante a especificidade dos testes devido s
interferncias das reaes cruzadas, nomeadamente a presena de anticorpos heterfilos.
3.8.1. Vrus da Hepatite C

Teste Anti- HCV II
Trata-se de um 2 teste em relao ao HCV realizado no ADVIA Centaur para
diagnstico e screening para doaes de sangue.
Amostra:
Soro ou plasma.
Especificidade analtica:
Amostras contendo substncias potencialmente interferentes de grupos de alto risco
foram testadas contendo:
anticorpos contra HBV, HAV, HEV, EBV, CMV, HSV, HIV, VZV,
Parvovrus, Dengue, Rubola, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum,
anticorpos e elevados ttulos de factor reumatide IgG, IgM ou IgA,
positivo para HbsAg e Escherichia coli,
aps vacinao contra HBV e Influenza,
doenas do fgado (no virais),
doena alcolica do fgado,
grupos de alto risco: hemoflicos, e abusadores de drogas intravenosas.
Significado Clnico:
O HCV um membro da famlia Flaviridae e tem genoma RNA cadeia simples
e polaridade +. Existem 50 subtipos classificados em 6 gentipos. Devido taxa elevada
de infees assintomticas o diagnstico clnico difcil e os ensaios de screening so
93
da maior importncia. Os testes de anticorpos anti-HCV so usados s ou em

combinao com outros (HCV-RNA) para detetar indivduos infetados com HCV. Este
teste usa pptidos, antignios recombinantes e protenas NS3 e NS4 para a determinao
dos anticorpos anti-HCV.
Confirmao
Imunoblot para a deteo de anticorpos Anti-HCV - DeciscanTM HCV PLUS
Amostra: Soro ou plasma.
Princpio do teste:
O teste utiliza como suporte slido uma membrana fixa sobre uma tira de
plstico com o seguinte esquema de revestimento sequencial:
Controlo de IgG anti-humano, que permite a validao da dispensa da amostra, o
controlo dos reagentes (conjugado e substrato) e a leitura dos resultados de
acordo com a intensidade do sinal do controlo.
Protena de fuso GST (os genes que codificam para as protenas NS3 e NS4
sofrem fuso com o gene da Glutationa S transferase).
Antignios do HCV: Pptidos selecionados pela sua imunogenicidade na rea
estrutural: C1 e C2 e protenas recombinantes produzidas por Escherichia coli a
partir de clones selecionados na rea no estrutural NS3 e NS4.
O ensaio inclui os seguintes passos reacionais:

1. Incubao do soro a testar com a tira. Os anticorpos do HCV, se existirem,
ligam-se aos antignios fixados na fase slida.
2. A fosfatase alcalina, marcada com anticorpos anti-humanos, adicionada depois
da lavagem, liga-se aos anticorpos especficos capturados na fase slida.
3. O conjugado no ligado removido por lavagem, e o complexo
antignio/anticorpo revelado pela adio do substrato.
4. Depois de parar a reao, as bandas coradas so lidas e interpretados os
resultados.
94
3.8.2. Vrus da Imunodeficincia Humana

RETROSCREEN HIV
Amostra:
Soro.
Adiciona-se 1 gota de soro no poo da amostra.
Adicionam-se 2 gotas de tampo de corrida no mesmo poo.
Lem-se os resultados aps 15 min e no se pode considerar um resultado aps
30 minutos.
Princpio do teste:
Trata-se de um mtodo imunocromatogrfico para deteo diferencial e
simultnea de anticorpos para o HIV-1 e HIV-2 no soro humano. Utiliza antignios
altamente purificados gp41, gp120 e o polipptido de fuso. O gp24 que representa o
HIV-1 e o pptido sinttico gp-36 que representa o HIV-2. Estes antignios esto
inseridos numa membrana em duas bandas teste separadas. Existe ainda um ensaio
controlo que forma a terceira banda.
Na membrana do teste esto marcados separadamente os antignios especficos
do HIV-1, HIV-2 e controlo. A amostra adicionada e move-se ao longo da membrana.
Qualquer anticorpo de HIV, se existir, liga-se ao seu respetivo antignio, revestido de
ouro coloidal, formando o complexo anticorpo-antignio-ouro. Este complexo move-se
ao longo da membrana e capturado pelos antignios especficos do HIV revestidos na
membrana formando uma banda colorida vermelha ou roxa. O material no ligado
move-se para o final da membrana onde anti-IgG de coelho forma a banda de controlo.
95
Confirmao de HIV-1
VIDAS HIV P24 II Confirmation
Princpio do teste:
Este teste permite confirmar a presena do Agp24 do HIV-1 numa amostra
considerada positiva. O princpio do teste baseia-se na neutralizao do Agp24
potencialmente presente na amostra atravs de um soro de cabra anti-p24. A amostra
colocada em contacto com este soro de cabra analisada pelo reagente VIDAS HIV P24
II por comparao com a mesma amostra incubada com um soro de cabra desprovido de
anticorpos anti-p24. Uma frmula de clculo permite definir a percentagem de
neutralizao.
Figura 45- Sistema VIDAS
96
3.8.3. Citomegalovrus
IgM do Citomegalovrus
Auxiliar na determinao de uma infeo aguda por CMV.
Amostra: Soro ou plasma com EDTA ou heparina.

Significado Clnico:
O Citomegalovrus (CMV), um membro da famlia dos Herpes Vrus, est
presente em todo o mundo. Seres humanos de todas as idades so suscetveis e a infeo
propaga-se atravs de contacto sexual, exposio direta a fludos corporais infetados,
transfuses sanguneas e transplante de rgos. A maioria das infees assintomtica,
contudo as infees por CMV podem ser graves em recm-nascidos e indivduos
imunocomprometidos. A infeo pode tambm ser grave em doentes com defeitos de
imunidade celular congnita ou adquirida, incluindo doentes com carcinomas, recetores
de rgos e doentes com SIDA.
Interpretao de Resultados:
A presena de IgM indicadora de uma infeo ativa. Um resultado reativo
(razo 1,1) indica que foram detetados na amostra do doente anticorpos IgM antiCMV. Um resultado no reativo (razo <0,9) indica que no foram detetados na
amostra do doente anticorpos IgM anti-CMV. Qualquer razo entre 0,9 e 1,1 deve ser
testada novamente. Amostras que voltem a apresentar um resultado indeterminado
devem ser examinadas por um mtodo alternativo ou ser pedida uma 2 amostra,
colhida, se possvel, dentro de um perodo razovel de tempo (por exemplo: uma
semana).
97
Limitaes:
As amostras que contm anticorpos anti-nucleares ou outros anticorpos anticelulares podem ter resultado falso reativo. Um aumento no nvel de anticorpos de
CMV pode ocorrer em doentes com sarampo, VZV, HSV devido reatividade cruzada
antignica dentro da famlia herpes vrus. Doentes com infeo EBV aguda podem
mostrar maior reatividade a outros vrus, incluindo o CMV.
Os anticorpos heteroflicos no soro humano podem reagir com as Ig presentes no
ensaio causando interferncia com os imunoensaios in vitro.
So adicionados aos reagentes anticorpos para as IgG para remover IgG
especfico a fatores reumatoides que podem causar respostas falsamente reativas.
Avidez de IgG anti-CMV

O teste IgM e a avidez das IgG conseguem identificar todas as mulheres com
risco de transmitir CMV. Estas infees podem ser nocivas para o feto quando ocorre a
primoinfeo no primeiro trimestre da gravidez. A medio da avidez das IgG
correntemente o melhor mtodo para datar as infees por CMV neste perodo da
gravidez. Mais ainda, um elevado DNA de CMV no lquido amnitico pode ser
indicador de infeco congnita sintomtica num estadio relativamente cedo da
gravidez. A deteo de anticorpos IgM especficos no sangue do feto est
correlacionada com a severidade da doena para o feto ou o recm-nascido.
Equipamento: EUROIMMUN Analyzer I
Figura 46 - Equipamento EUROIMMUN Analyzer I, racks dos reagentes esquerda e placas de

diluio de amostra direita.
98
3.8.4. Toxoplasma gondii

Avidez de IgG anti-Toxoplasma
Amostra:
Soro ou plasma.
Antes de efetuar a avidez necessrio determinar a IgG do toxoplasma no

ADVIA Centaur. Se o valor da IgG especfica revelar que no imune no se faz a
avidez. Se a amostra for reativa necessrio pr-diluir manualmente.
Princpio do teste:
O analisador cobas e 411 utiliza ensaios de electroquimioluminescncia.
O princpio do teste baseia-se em duas medies paralelas. Uma alquota da
amostra diluda com o diluente universal e esta mistura serve de referncia. Uma
segunda alquota da amostra diluda com o diluente da avidez de toxoplasmose. A
avidez avaliada determinando a razo entre o resultado obtido a partir desta alquota e
o resultado da alquota de referncia.
Significado Clnico:
A toxoplasmose uma infeo comum provocada pelo parasita Toxoplasma
gondii. A infeo adquirida principalmente por ingesto de alimentos ou de gua
contaminados por fezes de gatos (e que contenham ocitos maduros de T.gondii), ou
pela ingesto de carne mal cozinhada proveniente de animais infetados. A infeo aguda
primria, que principalmente ligeira ou at assintomtica nos indivduos saudveis,
seguida de uma infeo latente que normalmente persiste por toda a vida. No entanto, a
reativao de uma infeo por toxoplasma latente pode ser resultado de uma
imunossupresso.
A infeo primria materna por Toxoplasma durante a gravidez pode ter como
resultado leses graves no feto, uma vez que, o parasita pode ser transmitido atravs da
placenta. A maioria dos bebs com infeo congnita no apresenta sintomas clnicos ao
nascer, mas pode desenvolver sequelas graves mais tarde na vida, como, por exemplo,
atraso mental e psicomotor, coriorretinite e perda de audio.
99
O risco de ocorrerem manifestaes clnicas graves mais elevado quando a

infeo materna ocorre no incio da gravidez, no primeiro trimestre. Na ausncia de
sintomas clnicos agudos, o diagnstico da infeo por toxoplasma baseia-se em testes
com marcadores serolgicos, nomeadamente IgG e IgM direcionadas contra o T.gondii.
A IgM um marcador de fase aguda, mas pode em alguns casos persistir meses ou
anos. Devido a este facto necessrio uma tcnica complementar para ajudar a datar a
infeo e, dessa forma, possibilitar um aconselhamento e um controlo apropriados da
gravidez. Os ensaios de avidez de IgG de Toxoplasma so atualmente o mtodo mais
fivel de excluso de infees ocorridas nos ltimos 4 meses.
A avidez mede a afinidade de ligao funcional das IgG anti-T.gondii em
resposta infeo. Os anticorpos produzidos durante uma resposta recorrente ou na fase
remota da infeo tm uma avidez de antignios mais alta do que os anticorpos
produzidos durante a resposta primria. No pode ser deduzida nenhuma interpretao
clnica de um resultado de avidez baixa ou na zona cinzenta. O teste de avidez deve ser
realizado durante o primeiro trimestre da gestao. Um resultado de avidez alta aps o
quarto ms de gestao no permite excluir uma infeo primria numa fase precoce da
gestao. A deteo de uma avidez de IgG alta durante o primeiro trimestre de gravidez
pode ser considerada um bom indicador de infeo antiga.
100
3.9. ELISA
Princpio do mtodo:
O ensaio de ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) um tipo de ensaio
imunoenzimtico EIA. O mtodo ELISA baseado na reao de anticorpos da amostra
testada com os antignios adsorvidos na superfcie de poliestireno. As imunoglobulinas
no ligadas so lavadas. Uma anti-globulina humana marcada enzimaticamente liga-se
ao complexo antignio-anticorpo num segundo passo. Aps uma nova lavagem, o
conjugado marcado desenvolve-se com a aguda da soluo de substrato produzindo um
produto solvel de colorao azul que vira para amarelo depois da adio de uma
soluo de paragem cida.
Figura 47 - Placa de ELISA aplicao de branco, controlos e amostras.
Resultados:
O isotipo IgG quantitativo, com um valor de referncia inferior a 20 unidades
arbitrrias por mililitro (<20 UA/mL). Para IgM e / ou IgA o valor de 20 UA / mL o
cut-off.
Os valores podem ser reportados como:
< ao calibrador mnimo ou
< ao limite de deteo ou
> ao calibrador mximo e, se for clinicamente revelante, fazer uma diluio para
valores que se integrem na curva de calibrao, sendo o valor depois corrigido
(multiplicando pelo inverso do fator de de diluio).
101
3.10. Imuno Fluorescncia Indireta (IFI)
Princpio do teste:
Os substratos so incubados com a amostra do doente diluda. Se a reao
positiva para os anticorpos especficos das classes IgA, IgG e IgM ligam-se aos
antignios. Num segundo passo, os anticorpos ligados so marcados com antianticorpos humanos marcados com fluorescena e so visveis no microscpio de
fluorescncia.
Amostras:
- Soro humano ou plasma (EDTA, Heparina ou Citratos)
Resultados:
- Resultado no reativo: Quando no existe fluorescncia especfica na diluio de
partida (screening)
- Resultados reativos
O resultado reativo adotado reportado como o inverso da diluio at qual existe
reatividade ou como maior (>) que a ltima diluio efetuada, sempre que clinicamente
no seja relevante determinar a titulao final. Apesar disso, sempre que solicitado pelo
clnico, poder fazer-se a titulao final.
- Amostra fracamente reativas / reativas na diluio de screening e claramente
no reativas na 2 diluio Ttulo da diluio de screening
- Amostra fortemente reativa da diluio de screening e claramente no reativa
na 2 diluio Ttulo da diluio intermdia
- Amostra fortemente reativa na diluio de screening e fracamente reativas /
reativas na 2 diluio Ttulo da 2 diluio
- Amostra fortemente reativas na diluio de screening e fortemente reativas na
2 diluio Ttulo maior (>) que a 2 diluio
102
3.11. Auto-imunidade
A utilizao da imunofluorescncia indireta para o rastreio e titulao de autoanticorpos circulantes no soro tem sido feita utilizando vrios substratos de antignios,
incluindo seces de criostato de tecidos humanos e animais, preparaes de clulas e
extratos de tecidos.
Princpio do teste:
Os sistemas de teste baseiam-se na tcnica do anticorpo fluorescente indireto. As
amostras de soro dos doentes so diludas em tampo fosfato salino e sobrepostas em
seces de criostato de tecidos, fixas numa lmina microscpica. Se houver anticorpos
especficos no soro do doente, formam-se complexos antgeno-anticorpo estveis. Os
complexos formados ligam a imunoglobulina anti-humana marcada com fluorescena. A
reao positiva resultante traduz-se numa fluorescncia verde-ma dos organitos de
tecidos especficos quando se visualiza o tecido com um microscpio de fluorescncia
devidamente equipado.
Resultados:
O resultado do teste expresso como positivo ou negativo e inclui a descrio
dos padres de marcao fluorescente dos compartimentos ou organelos celulares:
padro nuclear (homogneo, granular), nucleolar, centromrico e citoplasmtico
(citoesqueleto, microssoma, mitocndria).
Figura 48 - Padres ANA por imunofluorescncia indireta em clulas HEp2.

Padro nuclear homogneo (A), nuclear granular grosso (B), centromrico (C), nucleolar (D),
citoplasmtico (E), misto citoplasmtico granular fino e nucleolar (F), fuso mittico (G).
103
Significado Clnico:
Os quatro principais auto-anticorpos: anticorpo anti-nuclear (ANA), anticorpo
anti-mitocndria (AMA), anticorpo anti-msculo liso (ASMA) e anticorpo anti-clulas
parietais (APCA), so facilmente detetveis em clulas HEp-2 (os ANA) ou em vrias
seces de tecido. Existem alguns auto-anticorpos menos comuns, tais como o anticorpo
anti-canaliculo biliar, anticorpo anti-ribossomal e anticorpo anti-LKM (liver kidney
microssoma).
Os auto-anticorpos individuais podem ser vistos em vrias doenas. Os ANA so
vistos com mais frequncia nos pacientes com Lpus Eritematoso Sistmico (LES), mas
podem ser detetados em doentes com Artrite Reumatide e Sndrome de Sjogren; da
mesma forma, os AMA so vistos com mais frequncia nos doentes com cirrose biliar
primria, mas tambm podem ser detetados em doentes com hepatite crnica. Os
ASMA so vistos na hepatite crnica ativa e na cirrose biliar primria. Os APCA
encontram-se predominantemente em casos de anemia perniciosa. Os anticorpos anticanaliculo biliar ocorrem com mais frequncia nos doentes com doena heptica crnica
ativa. Os anticorpos anti-ribossomais so bastante raros, mas j tm sido detetados em
alguns pacientes de LES com envolvimento renal.
Tabela 3 - Principais auto-anticorpos, patologias associadas e percentagem da ocorrncia.
Diagnstico Clnico
ANA
AMA
ASMA
APCA
Anticorpos antiribossomais
Anticorpo anticanaliculo biliar
LES
AR juvenil
Hepatite crnica ativa
Sndrome de Sjogren
Esclerose sistmica progressiva
Cirrose biliar primria
Hepatite crnica
Hepatite crnica
Cirrose biliar primria
Anemia perniciosa
LES com envolvimento renal
Doena heptica crnica ativa
LES
Percentagem da
ocorrncia
99
76
75
68
64
60 94
25 60
40 90
30 70
90 - 100
<1
66
8
104
4. Microbiologia
A seco de Microbiologia est organizada em termos de equipamento e espao
fsico de uma forma isolada, o que importante por causa das contaminaes e da
segurana. O fluxo de trabalho organiza-se recorrendo a cmaras de fluxo laminar para
semear as amostras nos meios de cultura e a estufas para os diferentes tempos de
incubao, a certas temperaturas, que favorecem o crescimento de determinados
microrganismos, que sero abordados.
Outra seco relacionada a Biologia Molecular Infecciosa, onde se realizam
ensaios em microrganismos no abordados aqui, apesar da sua importncia
complementar para o diagnstico.
4.1. Equipamentos em Microbiologia

Citmetro de fluxo para Exame citobacteriolgico de urina asstica
Figura 49 - Analisador automtico de partculas de urina citmetro de fluxo Sysmex UF 1000i
Aps a anlise das amostras de urina no citmetro de fluxo, imprimem-se os

respetivos resultados, nomeadamente: n de eritrcitos, de leuccitos, de clulas
epiteliais e de bactrias. Alm destes parmetros o citmetro poder indicar a presena
de cristais, clulas epiteliais tubulares, leveduras e espermatozoides. Devero ser
semeadas em meio CLED as amostras de urina que tenham resultados de leuccitos >
20 WBC/ L bem como todas as amostras de urina com bactrias > 500 BACT/ L,
urinas de bebs colhidas em saquinho e de todas as amostras processadas em regime de
urgncia.
105
Para analisar uma urina de criana deve-se semear sempre em meio CLED, uma
vez que, os valores de referncia para crianas so diferentes dos referidos para os
adultos.
SistemaVitek 2 Biomrieux
Figura 50 - Estao de Trabalho ( esquerda) e Cartas ( direita) do Sistema Vitek 2
Um exemplo de carta para antibiograma Gram positivo a carta Vitek 2 (ASTP619) que se destina determinao da sensibilidade de: Staphylococcus spp.
A carta Vitek 2 (AST-N215) para antibiograma Gram negativo destina-se
determinao da sensibilidade de bacilos Gram negativos aerbios com significado
clnico. Na urina asstica, por exemplo, para o caso da Escherichia coli.
Figura 51 - SistemaVitek2 Biomrieux
O Sistema Vitek 2 utiliza a tecnologia colorimtrica avanada, utilizando

cdigos de barras para a rastreabilidade completa e qualidade desde a amostra at ao
resultado. O sistema Vitek 2 responde s necessidades dos testes laboratoriais de
controlo de qualidade para identificao microbiana rpida e segura. A tecnologia inclui
uma grande base de dados de identificao, a disponibilidade de uma plataforma mais
automatizada, resultados rpidos, maior confiana e requer pouco tempo de formao.
106
Sistemas de Hemocultura Automatizados e Computorizados
Equipamento Bact/Alert da Biomerieux

O Sistema Bact/Alert contm um pequeno contentor, refrigerador que serve de
incubador, misturador e detetor. Cada frasco colocado voltado para baixo no poo
identificado por cdigo de barras e integrado no computador ligado identificao do
doente. Em intervalos de 10 minutos, o feixe de luz emitido dos dodos (1 para cada
poo) projetado atravs de um filtro de excitao para refletir o sensor sensvel ao CO2
no topo de cada frasco. A luz refletida direcionada atravs de um filtro de emisso
para um detetor fotossensvel que por sua vez est conectado com o computador.(11)
Cada frasco de hemocultura tem a capacidade de receber 10 mL de sangue.
Enquanto os microrganismos crescem na mistura, o CO2 libertado. Ligado ao topo de
cada frasco est um sensor qumico sensvel ao CO2. Na presena de CO2 o sensor altera
de verde para amarelo, apesar do detetor ser sensvel luz reage antes que a mudana de
cor seja aparente. Assim que a acumulao de CO2 suficiente no frasco para alterar o
sensor, gerado um alerta audvel ou visvel e a posio do frasco positivo marcado
pelo computador. Os frascos positivos podem ser removidos e processados. (11)
Meios de hemocultura
Figura 52 - esquerda, frasco com tampa verde para aerobiose e direita, frasco com tampa laranja
para anaerobiose.
107
4.2. Meios de cultura e suas caractersticas

Meios
Composio
Caractersticas
Meio no-seletivo para diferenciao
Lact + Colnias
de microrganismos urinrios que
amarelas plidas e
fermentam a lactose dos no
amarelas.
fermentativos. Limita a invaso por
Lact Colnias verdes,
Proteus spp.
azuis ou incolores.
Meio seletivo para Gram negativo.
Com cristal violeta
Isolamento seletivo e de
permite evidenciar a
diferenciao para a pesquisa de
fermentao da lactose
Enterobacterias. A seletividade em
pela viragem do
Meio MacConkey
relao s bactrias Gram positivo
vermelho neutro.
(MCK)
conseguida pelos cidos biliares e o
Lact + Colnias rosas
cristal violeta.
ou vermelhas.
Meio CLED gelose
Lact Colnias
incolores ou
ligeiramente bege.
Colnias rosa a
Meio comercial
chromID
TM
CPS3
Isolamento, quantificao e
bordeaux so -
identificao direta de Escherichia
glucoronidase + e
coli.
identifica Escherichia
coli.
Meio de isolamento seletivo que
A presena de sangue
Gelose Columbia
permite o desenvolvimento das
de carneiro permite a
ANC + 5% de
bactrias Gram positivo. A presena
expresso de hemlise,
sangue de carneiro
de cido nalidxico e de colimicina
que um critrio de
(CNA)
permite inibir a maioria das bactrias
base para a orientao
Gram negativo bem como Bacillus.
da identificao
bacteriana.
108
Meios
Composio
Caractersticas
Destina-se realizao de
Permite o crescimento
antibiogramas por difuso.
das bactrias no
Gelose Muller
Garante um mnimo de interferncia
exigentes
Hinton 2
dos componentes da frmula no
(enterobactrias, bacilos
(MH2)
resultado do antibiograma.
Gram negativo no
fermentadores,
estafilococos e
enterecocos).
Destina-se realizao de
Permite o crescimento
Gelose Muller
antibiogramas por difuso.
de bactrias como os
Hinton + 5% de
Garante um mnimo de interferncia
enterecocos e outros
sangue de carneiro
dos componentes da frmula no
estreptococos.
resultado do antibiograma.
Meio de isolamento que se destina a
A presena de sangue
facilitar o crescimento de
de carneiro permite a
microrganismos exigentes. Tambm
expresso de hemlise
Gelose Columbia +
adequada para o isolamento dos
da identificao
5% de sangue de
microrganismos anaerbios. A
bacteriana
Carneiro (COS)
gelose contm uma mistura de
(Streptococcus spp.,
peptonas especialmente adaptada
Listeria spp.).
cultura dos microrganismos

exigentes.
Destinado ao isolamento e
Microrganismos que
diferenciao dos estafilococos.
fermentam o manitol
O teor elevado de NaCl limita o
(+) do colnias
Meio Chapman
desenvolvimento de outros
amarelas por
(MSA2)
microrganismos.
acidificao do meio.
D orientao para
Staphylococcus aureus.
109
Meios
Composio
Caractersticas
Meio seletivo para isolamento de
A presena de peptonas
leveduras e fungos filamentosos a
e glucose favorece o
partir de amostras polimicrobianas.
desenvolvimento de
Gelose Sabouraud
A presena de Gentamicina permite
estirpes fngicas.
Gentamicina
inibir a maioria das bactrias Gram
Cloranfenicol
negatio e Gram positivo. O
(SGC)
Cloranfenicol melhora a seletividade

em relao a algumas espcies, por
vezes resistentes Gentamicina
(Streptococcus spp., Proteus spp.)
Trs substratos cromogneos
Colnias caractersticas
Meio comercial
optimizam a identificao de
de rosa plido a
STREPTO B ID
Streptococcus tipo B (Streptococcus
vermelho, aps
(STRB)
agalactiae).
incubao em estufa
com mais 5% de CO2.
Meio seletivo para o isolamento das
Contm uma base
diferentes espcies de Haemophilus
nutritiva enriquecida
Gelose Chocolate
spp. A seletividade obtida pela
em fatores X (Hemina)
Haemophilus
associao de antibiticos e
e V (NAD).
(HAEM)
antifngicos que permitem inibir

bactrias Gram positivo e leveduras.
Meio indicado para o crescimento
Contm uma base
Gelose Chocolate +
das estirpes exigentes pertencentes
nutritiva enriquecida
Polivitex (PVX)
ao gnero Neisseria, Haemophilus e
em fatores X (Hemina)
Streptococcus (S.pneumoniae)
e V (NAD).
110
Meios
Composio
Caractersticas
Meio que se destina ao isolamento
Os antimicrobianos
seletivo de Neisseria gonorrhoeae e
permitem inibir a maior
Gelose
Neisseria meningitidis a partir de
parte das bactrias e
Chocolate +
colheitas polimicrobianas. A
leveduras para alm das
Polivitex VCAT
seletividade obtida pela associao
espcies pesquisadas.
(VCA3)
de antibiticos e antifngicos:
Vancomicina, Colistina,
Anfotericina B e Trimetoprim.
Meio de isolamento seletivo
A presena de sangue
destinado deteo de Gardnerella
humano facilita o
Gelose
vaginalis a partir de colheitas
crescimento da espcie
Gardnerella
genitais. Os antibiticos cido
procurada e permite a
(GAR)
Nalidxico e Colistina inibem a
obteno de uma -
maioria dos contaminantes Gram
hemlise volta das
negativo bem como das leveduras.
colnias.
Meio de isolamento seletivo e de
Microrganismos que
diferenciao destinado pesquisa
produzem H2S originam
das Salmonella spp. e Shigella spp. a
colnias com centro negro.
Gelose Hektoen
partir de colheitas clnicas (fezes). A
As colnias verdes ou
(HEKT)
inibio dos Gram positivo obtm-se
azuis esverdiadas com
com uma mistura de sais biliares e de centro negro representam

corantes (azul de bromotimol e
uma forte presuno de
fuscina cida).
Salmonella spp. ou
Shigella spp.
111
Meios
Composio
Caractersticas
Meio seletivo para o isolamento dos
As colnias caractersticas
Campylobacter intestinais (C. jejuni
de Campylobacter spp. so
Gelose
e C. coli) principalmente a partir de
colnias pequenas e
Campilosel
fezes. A presena de sangue de
brilhantes e crescem depois
(CAM)
carneiro facilita o crescimento. Os
de incubar em atmosfera
antibiticos e antifngicos inibem a
microaerfila a 42C.
maior parte dos contaminantes.

Meio de isolamento seletivo
O manitol e o vermelho
destinado deteo e diferenciao
neutro permitem uma
de diferentes espcies de Yersnia
diferenciao das
Gelose Yersnia
em colheitas diversas. A presena de
Yersnias.
CIN (YER)
colato, desoxicolato, cristal violeta
Colnias de colorao rosa
antibiticos inibe o desenvolvimento
escuro a vermelho, ao fim
das bactrias Gram positivo e a
de 48h, so caractersticas
maioria das Gram negativo.
de Yersnia spp.
Destina-se cultura de micobactrias Existe em tubo inclinado e

Mycobacterium tuberculosis e outras
semeado por inundao
Meio
micobactrias.
aps descontaminao das
Lwenstein
Este meio enriquecido com a
amostras de expetorao
Jensen (LJ)
presena de ovo, de asparagina e de
pelo mtodo do NaOH.
fcula, favorece o crescimento das

micobactrias.
112
4.3. Procedimentos em microbiologia

Segue-se uma breve descrio dos procedimentos utilizados na identificao de
microrganismos no laboratrio clnico, na rea da microbiologia.
Colorao de Gram
Os esfregaos podem ser preparados a partir das amostras biolgicas ou de
colnias em meio de cultura. As lminas com esfregao so fixadas chama do Bico de
Bunsen. A colorao de Gram realizada em vrios passos, que podem ser
automatizados num equipamento:
1. Soluo de Cristal Violeta (90s)

2. Lavagem com gua (45s)
3. Soluo de Lugol (90s)
4. Descolorao com soluo lcool/acetona (30s)
5. Lavagem com gua (45s)
6. Soluo de Safrarina (30s)
7. Secagem das lminas (4min)
Resultados:
As bactrias so classificadas de Gram negativo e Gram positivo. Nas amostras
biolgicas podemos tambm observar leuccitos, clulas, formas parasitrias e
leveduriformes. Todos estes elementos devem ser referenciados no resultado final da
anlise. A observao do Gram serve de diagnstico presuntivo do agente infeccioso e
tambm para avaliar a qualidade da amostra e para orientar a identificao definitiva.
113
Colorao lcool-cido resistente de Ziehl-Neelsen

1. Fixa-se o esfregao com calor.
2. Cobre-se com carbofucsina, seca-se com chama direta durante 5 minutos
utilizando a emisso de vapores (ou em alternativa 20 minutos em banho-maria).
3. Lava-se com gua.
4. Descora-se em cido-lcool at permanecer apenas uma colorao rosada plida.
5. Lava-se com gua.
6. Realiza-se a contracolorao durante 10 a 30 segundos com azul de metileno.
7. Lava-se com gua e seca-se.
Teste de Catalase
A enzima catalase hidrolisa o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e
oxignio.
2H2O2 2H2O + O2
Catalase positiva: h libertao de oxignio.
Catalase negativa: ausncia de libertao de oxignio.
Este teste permite a distino entre Staphylococcus spp. (catalase +) e os Streptococcus

spp. (catalase - ).
Teste de identificao de Staphylococcus aureus

Pastorex TM STAPH PLUS
Figura 53 - Kit de Pastorex TM STAPH PLUS O kit inclui o controlo, cartes descartveis e paus.
114
Trata-se de um teste de aglutinao rpida para a deteo simultnea da

afinidade para o antignio do fibrinognio (fator de aglutinao), protena A, e os
polissacridos capsulares de Staphylococcus aureus.
O teste de anticorpos monoclonais que ligam a polissacridos capsulares, bem
como aos antignios na parede celular, reduz assim o risco de resultados falsos
negativos.
Neste teste, para validar o resultado, para alm de aglutinar o Staphylococcus
aureus com o reagente, necessrio que o controlo negativo, nos cartes descartveis,
no aglutine. S assim se pode validar o resultado.
Teste da Oxidase
O teste da oxidase baseia-se na produo intracelular da enzima citocromo
oxidase pela bactria. Utilizam-se discos no impregnados e um reagente.
Resultados:
Oxidase +: cor de violeta a prpura ao fim de 10 a 30 segundos.
Oxidase - : reao tardia ou ausncia de colorao.
O teste da oxidase utiliza-se principalmente para separar as Pseudomoneceae

(oxidase +) das Enterobacteriacea (oxidase -).
As Neisseriaceae so tambm oxidase +.
Teste da Bacitracina
Os Streptococcus hemolticos do Grupo A de Lancefield so geralmente
sensveis a pequenas quantidades de Bacitracina, o seu crescimento inibido pela
Bacitracina, verifica-se uma zona de inibio volta do disco que deve ser> 15 mm.
Os Streptococcus hemolticos dos outros Grupos so geralmente resistentes
Bacitracina e crescem volta do disco.
115
Teste da Optoquina
Permite testar a sensibilidade do Streptococcus optoquina. A espcie
Streptococcus pneumoniae geralmente sensvel optoquina ao contrrio das outras.
Resultados:
Um halo de inibio superior ou igual a 19 mm significa uma presena eventual
de Streptococcus pneumoniae.
Testes de grupagem para identificao de Streptococcus hemolticos
Os Grupos A, B, C, D, F, G, possuem antignios especficos de grupo que

podem ser extrados e identificados com anti-soros. Assim reagentes constitudos por
partculas de ltex sensibilizadas por anticorpos, dirigidas contra os antignios, ligam-se
aos antignios correspondentes formando aglutinao visvel das partculas de ltex.
Resultados:
Positivo: se houver aglutinao em menos de 2 min
Negativo: ausncia de aglutinao
Utiliza-se um Kit que contm uma enzima de extrao, junta-se nos cartes
descartveis algumas colnias a testar e fica durante 15 minutos na estufa. Depois
averigua-se se houve aglutinao para confirmar se do Grupo A. Se for negativa para
o grupo A deve-se fazer a Serologia para o Grupo C e para o Grupo G.
A Serologia B s tem interesse no exsudado vaginal mas existe o meio STREP B
para averiguar a sua presena.
A Serologia D identifica o Enterococcus.
116
Teste da Urease
A urease uma enzima que hidrolisa a ureia com libertao de CO2, H2O e NH3.
A amnia em soluo resulta numa alcalizao do meio pois forma carbonato de
amnio.Uma soluo contendo fenolftalena a pH <8,1 (incolor) com a adio de
amnia fica rosa avermelhada devido a fenolftalena mudar de cor a pH> 8,1.
Proteus spp. (urease +) funciona como controlo positivo
Klebsiella spp. (urease + fraco)
Escherichia coli (urease - ) funciona como controlo negativo
A urease negativa suspeito de Salmonella spp. na coprocultura, o que a
distingue do Proteus spp.
Teste CAMP
O teste CAMP (Christie, Atkins, Munch-Peterson) um teste para identificao
presuntiva de Streptococcus do Grupo B. usada uma estria de Staphylococcus aureus
produtor de -hemolisina. O Streptococcus do Grupo B secreta uma protena chamada
fator CAMP que interage com a -hemolisina produzida e secretada pelo
Staphylococcus aureus e causa sinergia aumentada da hemlise. Esta sinergia aparece
em forma de seta com uma rea aumentada de hemlise na rea de crescimento onde as
duas estrias esto mais prximas, sem contudo se tocarem.
Numa placa de Gelose de Sangue, faz-se uma estria com a bactria de referncia
(S. aureus) e depois com os possveis Streptococcus do Grupo B fazem-se estrias em
ngulo reto com a primeira, sem as estrias se tocarem. Depois da incubao overnight,
pode surgir uma rea de sinergia da hemlise em forma de seta pela interao do fator
CAMP e a -hemolisina que difundiram no meio. (11)
Figura 54- Teste CAMP Sinergia em placa em forma de seta.
117
4.4. Teste de Suscetibilidade aos Antibiticos (TSA)
Antibiograma em Placa (Mtodo de Difuso Kirby-Bauer)

O teste de suscetibilidade aos antimicrobianos pode ser efetuado em placa.
Amostra
4 a 5 colnias iguais retiradas de um meio com 18 a 24 horas de incubao.
Procedimento:
1. Colocam-se os discos de papel impregnados com o agente antimicrobiano e as
placas MH2, MHS ou PVX (escolhida conforme o microrganismo)
temperatura ambiente.
2. Prepara-se um inculo num tubo de poliestireno, suspendendo 4 ou 5 colnias
iguais na ampola de soro fisiolgico estril, agita-se no vrtex e ajusta-se a
turvao a 0,5 da escala de McFarland por comparao visual.
3. Inocula-se as placas com uma zaragatoa, espremendo o excesso contra as
paredes do tubo, passando-a em 3 sentidos diferentes pela totalidade da placa.
4. Seleccionam-se os antibiticos a usar de acordo com o produto e o organismo
em estudo.
5. Aplicam-se os discos com o auxlio de uma pina, fazendo uma ligeira presso
no agr. Coloca-se no mximo 5 discos por placa de 10 cm, afastados no
mnimo 2,5 cm cada disco, centro a centro. No se deve recolocar um disco
depois deste ter entrado em contacto com o agr.
6. Coloca-se a incubar 18 a 24 horas na estufa de 352C com ar ambiente ou com
5% de CO2 no caso do Haemophilus spp e da N. gonorrhoeae.
7. Faz-se a leitura dos halos de inibio com o auxlio de uma rgua medindo o
dimetro dos halos em mm.
118
Figura 55 - Antibiograma em Placa (Mtodo de Difuso Kirby-Bauer)
Resultados:
Interpreta-se os resultados como Sensveis (S), Intermdios (I) ou Resistentes
(R) de acordo com as Normas em vigor.
Antibiograma em Galeria para Haemophilus (e Branhamella)

KIT ATB HAEMO
Amostra: algumas colnias de uma cultura pura com 18 a 24 horas de incubao.

Interpretao dos resultados:
A primeira cpula sem antibitico serve de controlo de crescimento e as
seguintes 10 contm os antibiticos: ampicilina, amoxicilina/cido clavulnico,
cefalotina,
tetraciclina,
ofloxacina,
clotrimoxazol,
rifampicina,
cloranfenicol,
cefuroxima, cefotaxima.
A leitura visvel de cada cpula feita com base em:
Aspeto
Interpretao
Nos antibiticos com 2 concentraes, se se obtiver uma
Claro
Sensvel
cpula turva e outra clara para interpretar como
Turvo
Resistente
resistente.
O ATB HAEMO efetuado para determinar a sensibilidade a Haemophilus e

Branhamella (Moraxella) em meio semi-slido em condies muito prximas das
tcnicas de referncia de diluio em gelose ou de microdiluio.
119
4.5.
Produtos Biolgicos
Exame direto
O exame direto (a fresco) realizado para as seguintes amostras de vrios
produtos biolgicos:
Exsudado vaginal / vulvar
Exsudado uretral
Esperma
Exame direto com Gram

Tambm se realiza o exame direto com a colorao de Gram para:
Exsudado auricular/ocular
Expetorao
Exsudado vaginal / vulvar
Exsudado uretral
Esperma
Exame Cultural
Resultados:
No caso do exame cultural ser positivo (desenvolvimento de bactrias
patognicas) deve ser identificado o microrganismo e tambm deve ser efetuado o teste
de suscetibilidade aos antimicrobianos. O microrganismo identificado e o respetivo
TSA devem ser referidos no resultado final do exame bacteriolgico. Isto vlido para
todos os produtos biolgicos.
120
4.5.1. Hemoculturas
Colheita:
Para a colheita de sangue para a hemocultura, desinfeta-se a zona com soluo
de iodopovidona, em crculo, do centro para o exterior, deixa-se secar sem soprar,
limpa-se com lcool a 70% e deixa-se secar.
Geralmente necessrio sangue para 2 frascos de hemocultura de cada puno
venosa, uma para ser incubada em anaerobiose e outra em aerobiose. A maioria de
hemoculturas em frascos de vcuo tm 5% a 10% de concentrao de CO2 para permitir
o crescimento de microrganismos mais exigentes, que requeiram CO2 para sobreviver.
O volume necessrio no adulto de 10 a 30 mL de sangue. Em crianas 1 a 5
mL de sangue geralmente suficiente para cada cultura. A diluio 1:50 ou 1:10 serve
para diluir antibiticos ou outras substncias antibacterianas. (11)
Hemocultura em aerobiose (Exame cultural)

A hemocultura serve de auxiliar para o diagnstico de infees sistmicas. A
valorizao e interpretao clnica so baseadas no Cumitech 1 C (Blood cultures IV) da
Sociedade Americana de Microbiologia.
Os microrganismos frequentemente isolados so:
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Enterobactereaceae
Hemocultura em anaerobiose (Exame cultural)

As spsis a anaerbios so situaes clnicas muito pouco frequentes. A
positividade dos frascos de hemocultura em anaerobiose so na maior parte dos casos da
responsabilidade de bactrias anaerbias facultativas, como por exemplo, os
Staphylococcus spp.
121
Significado Clnico:
A septicmia uma sndrome clnica caracterizada por febre, perda de peso,
fadiga, taquicardia, hiperventilao, prostrao, que resulta da multiplicao de
bactrias circulantes numa taxa que excede a sua remoo pelos macrfagos. (11)
A bacteriemia pode ser transiente, intermitente ou contnua, refletindo vrios
mecanismos de entrada da bactria na corrente sangunea. A bacteriemia transiente pode
ocorrer quando organismos da flora normal so introduzidos no sangue. A bacteriemia
intermitente ocorre quando bactrias de um local infetado so espasmodicamente
libertadas no sangue a partir de abcessos extravasculares, ou infees difusas, (celulite,
peritonite, artrite sptica). A bacteriemia contnua ocorre em casos onde os organismos
tm acesso direto corrente sangunea como, endocardite subaguda, fstulas
arteriovenosas infetadas, cateteres intra-arteriais. (11)
Existem vrios mecanismos que tm um papel importante para remover
microrganismos da corrente sangunea. Em indivduos saudveis e imunocompetentes
um sbito influxo de bactrias removido do sangue em 30 a 45 minutos. O fgado e o
bao tm o papel principal em remover a bactria, os neutrfilos intravasculares tm um
papel menor. Os doentes debilitados e com doenas imunodeficientes tm um maior
risco porque as bactrias no so removidas durante horas. (11)
Devido taxa de mortalidade da septicmia, que pode ser de 40% ou maior, em
certas populaes de doentes hospitalizados, o tempo de remoo da bactria do sangue
do doente pode ser de grande importncia no diagnstico e prognstico. (11)
4.5.2. Lquido Cefalorraquidiano LCR

O LCR tal como outros fludos, para concentrar qualquer bactria presente
recomendado centrifugar e usar o sedimento.
Colheita:
O LCR mais comum quando obtido por puno na espinal medula.
Na Microbiologia centrifuga-se e usa-se o sedimento para contagem de clulas, Gram e

cultura.
122
Potenciais Patognicos
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Escherichia coli
Mycobacterium spp.
Exame cultural
Meios de cultura
Caldo Crebro Corao (BHI)
Condies de incubao
Adaptado
ao
crescimento
de
microrganismos
exigentes.
Gelose Columbia + 5% de Streptococcus spp Crescimento aps 24h a 352C
sangue de carneiro (COS)
Meio MacConkey (MCK)
Crescimento aps 24 horas a 352C
Gelose Chocolate
Haemophilus spp. Crescimento aps 24 horas a
Haemophilus (HAEM)
352C
Gelose Chocolate + Polivitex
Neisseria spp. e Haemophilus spp. Crescimento
(PVX)
aps 24 horas a 352C
Significado Clnico: Infees do Sistema Nervoso Central

A meningite mais prevalente em certos grupos etrios ou em doentes com
vrias doenas. A meningite neonatal mais comum envolve invaso direta da flora da
me durante o parto. O Streptococcus do Grupo B e a Escherichia coli so os
microrganismos mais comuns. A Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae,
Serratia spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus e bactrias anaerbias so
menos frequentes. (11)
O Haemophilus influenzae a causa mais comum de meningite bacteriana aguda
em crianas entre os 6 meses e os 5 anos de idade. A Neisseria meningitidis e o
Streptococcus pneumoniae so as seguintes causas mais comuns. Estes casos so
frequentemente associados a bacteriemia e extenso da infeo dos seios adjacentes e
ouvido mdio seguido de trauma, neurocirurgia ou anestesia espinal. (11)
123
Nos adultos o Streptococcus pneumoniae a causa mais comum de meningite

bacteriana. Em jovens adultos a Neisseria meningitidis tambm comum, bem como a
Escherichia coli e outros bacilos Gram negativos. (11)
O fungo Cryptococcus neoformans, a Listeria monocytogenes e Mycobacterium
tuberculosis prevalecem em doentes imunocomprometidos e a Escherichia coli, a
Klebsiella pneumoniae e os Staphyilococci prevalecem em doentes ps-traumatizados e
ps-cirrgicos. (11)
4.5.3. Exsudado ocular e auricular

Colheita:
O exsudado auricular realizado com uma zaragatoa no canal auditivo externo.
As culturas do canal auditivo externo geralmente no refletem a causa bacteriana da
otite mdia, a no ser que a membrana do tmpano estivesse recentemente rompida. (11)
As culturas da faringe posterior podem revelar os microrganismos causadores de
otite mdia. As culturas a partir dos seios do maxilar, frontal ou outros seios devem ser
colhidas por aspirao e as culturas devem ser incubadas em ambas aerobiose e
anaerobiose. Nas infees polimicrobianas, geralmente vrias espcies de bactrias
anaerbias so comuns em casos de sinusite crnica. (11)
Exame cultural
Meios de cultura
Condies de incubao
Gelose Columbia + 5% de Streptococcus spp Crescimento aps 24h a

352C
Gelose Chocolate Haemophilus
Haemophilus spp. Crescimento aps 24 horas a
(HAEM)
352C
Gelose Chocolate + Polivitex
Neisseria spp. e Haemophilus spp. Crescimento
(PVX)
aps 24 horas a 352C
Gelose Chapman (MSA)
Staphylococcus aureus Crescimento de colnias

amarelas aps 24h a 352C
124
Significado Clnico:
O Haemophilus influenzae e outros Haemophilus spp. causam frequentemente
conjuntivites por isso devem ser usados meios Chocolate Polivitex (PVX) e
Haemophilus (HAEM).
O meio PVX serve tambm para outros microrganismos relativamente exigentes
como a Moraxella spp. e N. gonorrhoeae que ocasionalmente causam infees,
particularmente nos recm nascidos e crianas pequenas. Deve ser dada particular
ateno identificao de Pseudomonas aeruginosa a partir da cultura ocular porque
este microrganismo pode ser altamente virulento e conduzir a progresso rpida de
cegueira. (11)
Os fungos, particularmente Aspergillus niger e Fusarium spp. do ouvido e do
olho respetivamente, podem indicar casos de otite mdia mictica e ceratite mictica.
Deve ser usado um meio de isolamento de fungos nestes casos suspeitos, como o meio
Sabouraud (SGC). (11)
Para confirmar a presena do Haemophilus influenzae pode-se fazer o teste dos
fatores X (Hemina) e V (NAD) que funciona como um antibiograma em placa. Utilizase o meio MH2 e colocam-se 3 discos com o fator X, o fator V e ambos em conjunto
XV, em forma de tringulo. Se houver crescimento volta do disco que contm os dois
fatores X e V em conjunto trata-se do Haemophilus influenzae pois este necessita destes
dois fatores para se desenvolver.
Nestes casos faz-se o antibiograma em Galeria para Haemophilus para obter
resultados sobre quais os antibiticos a que o microrganismo sensvel ou resistente.
4.5.4. Exsudado nasal, farngeo e amigdalino

Servem de auxiliar de diagnstico nas infees do trato respiratrio superior.
Colheita:
Para realizar o exsudado farngeo e amigdalino, utiliza-se uma zaragatoa na
parte superior da faringe, faringe posterior, por detrs da vula, ou respetivamente nas
amgdalas, evitando tocar nas mucosas da parede oral.
125
No exsudado nasal a pesquisa orientada para:

Staphylococcus aureus
Streptococcus hemoltico do Grupo A de Lancefield
No exsudado nasal para o Staphylococcus aureus testa-se a sensibilidade

Cefoxitina (FOX) fazendo o TSA em meio MH2. Usa-se uma colnia em frasco de soro
e cobre-se a placa por espalhamento.
No exsudado farngeo a pesquisa orientada para:

Streptococcus hemoltico do Grupo A, C e G de Lancefield
Na cultura da nasofaringe a pesquisa orientada para:

Streptococcus pyogenes
Neisseria meningitidis
Exame cultural
Meios de cultura
Condies de incubao
Gelose Columbia + 5% de Streptococcus spp Crescimento aps 24h a 352C

sangue de carneiro (COS).
Gelose Columbia ANC + 5% Streptococcus spp Crescimento aps 24h a 352C
de sangue de carneiro (CNA).

amarelas aps 24h a 352C
Para o exsudado farngeo e amigdalino utiliza-se o meio Todd com sangue, que
um meio de enriquecimento. Semeia-se aps 24 horas no meio seletivo para Gram
positivo: Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro (CNA).
No exsudado farngeo, no meio Columbia (COS) pesquisa-se a existncia de
hemlise, no meio Chapman (MSA) pesquisa-se o Staphylococcus aureus que manitol
+ e no meio CNA isolam-se os microrganismos Gram +. Se crescerem colnias
pequenas com hemlise (hemlise total) faz-se a Serologia A.
126
Para o exsudado nasal e farngeo semeia-se o meio de Chapman (MSA) para

pesquisa de Staphylococcus aureus que forma colnias amarelas (manitol +) com hemlise. Se for identificado o Staphylococcus aureus faz-se o TSA. Para averiguar se
sensvel ou resistente meticilina, utiliza-se um disco impregnado de Cefoxitina (FOX)
em Gelose Muller Hinton 2 (MH2).
A Faringite aguda pode ter como etiologia o Streptococcus spp., vrus (que so
mais comuns) ou difteria, sobretudo em crianas. (11)
O Streptococcus Grupo Viridans produz uma -hemlise.
O teste da Serologia do Grupo A faz-se a partir do meio CNA, onde crescem os
Gram+ como o Streptococcus spp. por exemplo da nasofaringe. Para o estudo da cultura
do Streptococcus pyogenes (-hemoltico do grupo A) utiliza-se o meio de
enriquecimento lquido (Meio Todd com Sangue) para o exsudado farngeo. Os meios
inoculados crescem em 18 a 24 horas. Formam uma hemlise ou hemlise total e tm
outra caracterstica que ser catalase negativa. O antibiograma faz-se em meio MHS
com sangue durante 18 a 24 horas na estufa.
4.5.5. Expetorao
Colheita:
A expetorao deve ser obtida pela manh, em jejum, porque contm um
conjunto de secrees, acumuladas durante a noite, em que as bactrias patognicas
esto mais concentradas.A incapacidade de prevenir adequadamente a contaminao por
secrees orais dificulta a obteno de secrees representativas do trato respiratrio
inferior e compromete a utilidade do diagnstico. (11)
Exame direto e cultural

Fazem-se 2 lminas para colorao Gram por estiramento.
Os microrganismos mais frequentemente valorizados so:
Haemophilus influenzae
Moraxella ( Branhamella) catarrhalis
Klebsiella pneumoneae. e eventualmente outros Gram negativos
127
Meios de cultura
Condies de incubao
Gelose Columbia + 5% de sangue de Streptococcus spp Crescimento aps 24h

carneiro (COS)
a 352C
Gelose Chocolate Haemophilus (HAEM)
Significado Clnico:
No diagnstico laboratorial da pneumonia bacteriana, o Streptococcus
pneumoniae, a Klebsiella pneumoniae, o Haemophilus influenza e Moraxella
(Branhamella) catarrharis so os microrganismos predominantes das secrees
respiratrias, particularmente quando obtidas concomitantemente com hemocultura, que
suporta o seu papel no desenvolvimento da pneumonia aguda. (11)
Pesquisa de BK Bacilo de Koch

Exame direto
Fazem-se 2 lminas por tcnica de estiramento, uma para avaliar a qualidade da
amostra, outra para colorao lcool-cido resistente de Ziehl-Neelsen.
Para avaliar a qualidade da amostra a partir do exame direto, observam-se ao
microscpio, com objetiva de 10 x, alguns campos, tendo em conta a presena de
clulas epiteliais e leuccitos.
Tabela 4 - Classificao de amostras segundo o critrio de Murray e Washington
Clulas epiteliais
Leuccitos
GRUPO
(Ampliao 10 x)
(Ampliao 10 x)
25
10
25
10 25
25
25
10 - 25
25
<10
25
So adequados para fazer a cultura os grupos 4 e 5 da tabela, segundo a

distribuio do nmero de clulas e de leuccitos por campo.
128
Colorao lcool-cido resistente de Ziehl-Neelsen:

As Mycobacteria esto revestidas com uma fina camada de material que resiste
colorao, contudo, uma vez coradas as clulas bacterianas resistem descolorao por
solventes orgnicos fortes como lcool-cido. Consequentemente, estas bactrias so
conhecidas como acid-fast. Requerem um tratamento especial para a primeira
colorao com carbofuscina para penetrar no material dos bacilos acid-fast. Estes
apresentam-se vermelhos contra um fundo verde ou azul, dependendo do contracorante
usado. (11)
Exame cultural
O tratamento da amostra de expetorao necessita de um procedimento de
descontaminao digesto com NaOH para concentrar qualquer clula de
micobactria que possa estar presente.
1. Junta-se igual quantidade de expetorao e de NaOH.
2. Adiciona-se uma gota de indicador fenolftalena.
3. Neutraliza-se com HCl 2N at viragem da cor da soluo (at desaparecer a cor
vermelha).
Semeia-se por inundao no Meio Lwenstein Jensen (LJ).
Figura 56 - Meio Lwenstein Jensen (LJ)
Resultados:
Fica at 60 dias na estufa. D-se resultado ao fim de 30 e 60 dias caso seja
negativo. Se for positivo pode-se dar o resultado quando se revelar positivo.
129
4.5.6. Urina asstica

Amostra:
A amostra para urina asstica uma urina denominada jacto intermdio. Pode
conservar-se refrigerada at 24 horas. Em bebs e crianas a urina colhida com saco
coletor. Em doentes algaliados colhida a urina por puno do cateter urinrio.
A urina depois colocada num tubo com cido brico, que bacteriosttico, ou
seja, inibe o crescimento de bactrias. Assim no tubo com cido brico conservam-se as
bactrias iniciais do jacto intermdio de urina.
Exame do sedimento urinrio

Deve-se efetuar o exame do sedimento urinrio quando aparecem, no citmetro
de fluxo, sinais de alerta de:
Muitas clulas epiteliais
Muitos leuccitos
Clulas epiteliais tubulares
Cristais
Presena de eritrcitos
Leveduras
Procedimento:
1. Enche-se um tudo de centrfuga com 10 mL de urina a partir do balo inicial.
2. Centrifuga-se 5 min a cerca de 1500 rpm.
3. Decanta-se o sobrenadante e monta-se o sedimento entre lmina e lamela aps
homogeneizao da amostra.
4. Observa-se ao microscpio ptico com ampliao 400X e faz-se a quantificao
por campo. Multiplica-se por um factor 5 para obter o resultado em L. Avaliase tambm as possveis interferncias com cristais ou granulaes.
130
Na mulher, um valor de leuccitos >20/L considerado suspeita de infeo. No

homem, um valor de leuccitos >10/L reflete algum problema. Pode no ser uma
infeo urinria, mas pode ser gnito-urinrio, por exemplo, um problema na prstata.
Exame cultural:
1. Selecionar o meio de cultura, para urina utiliza-se o Meio CLED gelose.
2. Com a ansa descartvel, calibrada de 10 L, semear a urina, descarregar a ansa
no meio fazendo um inculo vertical e espalh-lo em estrias perpendicularmente
a este.
3. Incubar na estufa (352C) durante 18 48 h.
4. Observar as placas e efetuar a valorizao clnica das amostras de acordo com o
n de clulas epiteliais, de leuccitos e com a contagem de colnias:
10 colnias = 1000 UFC/mL (103)
100 colnias = 10 000 UFC/mL (104)
1000 colnias =100 000 UFC/mL (105)
Habitualmente, os exames culturais so valorizados com contagens de colnias

superiores a 105 UFC/mL. Em condies particulares, nomeadamente, nas crianas, nos
diabticos e sempre que a informao clnica disponvel o justifique, valoriza-se
contagens de 104 ou 103 UFC/mL.
As caixas semeadas vo para a estufa (352C) a incubar durante 18 a 48h.
No meio CLED crescem microrganismos fermentadores e no fermentadores de
lactose. Se se verificar crescimento de colnias amarelas (lactose +), com morfologia de
Escherichia coli, semeia-se no meio comercial CPS3 para identificar. Este meio serve
para efetuar uma identificao presuntiva, atravs da produo de -glucoronidase.
Aps incubao de 18-48h a 352C, se crescerem colnias rosa a bordeaux, faz-se a
identificao direta de cerca de 90% das Escherichia coli.
Quando se suspeita de um microrganismo Gram + faz-se o teste da catalase. Este
teste permite a distino entre Staphylococcus spp. (Catalase +) e os Streptococcus spp.
(Catalase - ).
131
Significado Clnico:
Os microrganismos que mais frequentemente so responsveis por infees
urinrias so:
Escherichia coli,
Proteus spp.,
Klebsiella spp.,
Staphylococcus saprophyticus
Aps identificao do microrganismo faz-se o respetivo teste de suscetibilidade

aos antibiticos (TSA), feito em placa ou com as respetivas cartas no sistema Vitek 2
para dar indicao de antibiticos para os quais o microrganismo sensvel e se for o
caso as resistncias.
Escolhem-se os antibiticos de 1 linha teraputica de acordo com as Normas em
vigor.(12)
A eficcia do tratamento depender do rigor do diagnstico e de uma teraputica
antimicrobiana apropriada. A teraputica definitiva poder diferir da teraputica
inicialmente instituda e dever ser iniciada logo que os resultados laboratoriais estejam
disponveis.
4.5.7. Exsudado Vaginal /Vulvar

Colheita na mulher:
O exsudado cervical obtm-se com a ajuda do espculo. Uma zaragatoa inserida
alguns milmetros passando o canal cervical, rodada firmemente para obter o
exsudado e clulas cervicais. (11)
Exame citolgico (Exame direto a fresco)

Retira-se a zaragatoa do meio de Stuart. Coloca-se uma pequena quantidade de
exsudado numa lmina cobrindo com uma lamela.
Pesquisa-se ao microscpio a presena de:
132
Clulas
Leuccitos
Eritrcitos
Parasitas (Trichomonas vaginalis)
Formas leveduriformes e filamentosas de fungos
Faz-se a sua semi-quantificao com os seguintes critrios:
0-5 / campo com ampliao 400X Raros
6-14 / campo com ampliao 400X Alguns
> 15 / campo com ampliao 400X Muitos
Exame direto com Gram

Pesquisa-se ao microscpio tico a presena de bactrias Gram+ e Gram , as suas
caratersticas morfolgicas assim como a presena de formas leveduriformes e
filamentosas de fungos. Efetua-se a sua semi - quantificao de acordo com os seguintes
critrios:
0-5 / campo com ampliao 1000X Raros
6-29/ campo com ampliao 1000X Alguns
> 30 / campo com ampliao 1000X Muitos
Exame cultural
Meios de cultura
Condies de incubao
Columbia (COS)
Streptococcus spp Crescimento aps 24h a 352C
Sabouraud (SGC)
Candida spp.- Crescimento em 3 dias a 20 -25 C
Chocolate
(VCAT)
Gelose
(GAR)
Polivitex Neisseria gonorrhoeae Crescimento aps 48h a 352C em

estufa com + 5% de CO2
Gardnerella Gardnerella vaginalis Cresce formando -hemlise aps 48
horas a 352C
Deve-se observar as placas s 48 horas e procurar colnias sugestivas.

Na observao do meio Gelose de Sangue Columbia no se valorizam Gram
negativo, nem flora mista com colnias variadas, pois pode apresentar uma flora
comensal variada, que dada como resultado negativo. S se valorizam culturas puras.
133
O exame do exsudado vaginal serve de auxiliar de diagnstico nas infees

genitais. Na grvida, efetua-se o despiste da colonizao por Streptococcus do grupo B
para preveno da spsis neonatal precoce. Uma placa de meio comercial STREPTO ID
(STRE) realizada em grvidas a partir das 34-35 semanas de gestao. No meio STRE
valorizam-se as colnias rosa a vermelho e faz-se a repicagem para meio ANC, seletivo
para Gram+. O objetivo isolar as colnias, por isso faz-se um inculo e estrias para
isolar os microrganismos Gram+. Muitas grvidas so portadoras de Streptococcus do
grupo B, mas s tem interesse em averiguar a partir das 34-35 semanas.
Flora comensal do trato genital (contaminantes)

Escherichia coli e outros coliformes
Streptococcus Grupo D
Lactobacillus spp.
Staphylococcus coagulase negativa
Flora Potencialmente Patognicas no trato genital

Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus Grupo A
Gardnerella vaginalis
Candida spp.
Trichomonas vaginalis
de valorizar a presena de microrganismos em elevada concentrao e em
cultura pura.
134
4.5.8. Exsudado uretral

Colheita no homem:
Deve-se colher o exsudado uretral antes da primeira urina da manh, inserir o
cotonete no orifcio uretral, 3 a 4 cm na uretra anterior, e rodar 360 graus para colher
algumas clulas epiteliais. (11)
Exame citolgico (Exame direto a fresco)

O exame direto a fresco do exsudado uretral semelhante ao que se realiza para
o exsudado vaginal.
Exame bacteriolgico direto Gram

O exame direto do Gram serve para semi-quantificar de acordo com os critrios
do exame direto, referindo os elementos leveduriformes, os bacilos Gram negativo, os
cocos Gram + ou a presena de flora mista sem predomnio.
Exame cultural
Meios de cultura
Condies de incubao
Columbia (COS)
Sabouraud (SGC)
Chocolate
(VCAT)
O exame do exsudado uretral serve de auxiliar de diagnstico nas infees

genitais. A pesquisa orientada para a deteo de:
Neisseria gonorrhaeae
Candida spp.
Trichomonas vaginalis
de valorizar a presena de microrganismos em elevada concentrao e em
cultura pura.
135
4.5.9. Esperma
Exame direto e cultural
A espermocultura serve de auxiliar de diagnstico nas infees do trato genital
masculino. Os microrganismos mais frequentemente valorizados so:
Neisseria gonorrhaeae
Enterococcus spp.
Enterobacteriaceae
de valorizar a presena de microrganismos em elevada concentrao e
em cultura pura.
Meios de cultura
Condies de incubao
Columbia (COS)
Sabouraud (SGC)
Chocolate
(VCAT)
Significado Clnico:
Infees do trato Genital
No homem uma descarga uretral purulenta um clssico sintoma de gonorreia
genital. Na mulher as manifestaes clnicas so normalmente mais complexas e
variam, podem estar presentes: vaginites, salpingites e inflamao plvica. A
observao do exsudado uretral na mulher no suficiente para estabelecer o
diagnstico porque a morfologia e colorao caractersticas de outras espcies
bacterianas mimetizam os gonococos. necessria a cultura, com incubao com nveis
aumentados de CO2. No homem podem estar presentes vrios graus de epididimites e
prostatites. (11)
136
O diagnstico tradicional de Neisseria gonorrhoeae feito ao examinar na

preparao de Gram a presena de diplococos Gram negativos intracelulares, contudo o
exame cultural necessrio. (11)
Figura 57- Imagem de diplococos Gram negativo no interior do neutrfilo caracterstico de infeo por
Neisseria gonorrhoeae.
A Neisseria gonorrhoeae cresce em meio Gelose Chocolate VCAT que

incorpora 4 antibiticos: vancomicina, colistina, nistatina e trimetoprim e/ou agentes
antifngicos. A Neisseria gonorrhoeae uma bactria exigente que no tolera meio
seco, variaes bruscas de temperatura nem atmosfera baixa em CO2. Como tal, as
colheitas vaginais e uretrais so depois incubadas com aumento de CO2.
O transporte feito em meio de Stuart modificado e transferido para cultura,
assim que possvel, (antes de 6 horas) e a incubao deve ser de 24 a 48 horas a 352C
em atmosfera de 5% de CO2.
Em casos de infeo gonoccica urogenital o teste de oxidase positivo e os
diplococos Gram negativo no Gram so geralmente suficientes para estabelecer um
diagnstico presuntivo.
Cerca de 20% dos homens e 40% das mulheres com gonorreia esto co-infetados
com Clamydia trachomatis. Quando esta o agente infetante, muitas vezes a infeo
assintomtica e necessrio fazer exame cultural do parceiro sexual para estabelecer o
diagnstico. A Clamydia trachomatis estritamente intracelular. (11)
A Gardnerella vaginalis est associada vaginose bacteriana em associao
com bactrias anaerbias que pertencem aos Bacteroides e Peptococcus que produzem
um cheiro de mau odor caracterstico. (11)
137
Ao microscpio tico, a observao do Gram apresenta densos agregados de

bacilos Gram negativo ou Gram varivel, em clulas epiteliais e volta delas. Estas
clulas so designadas clue cells.
Figura 58 - esquerda clula epitelial normal e alguns bacilos de Doderlein. direita clue cell
clula epitelial, ausncia de Bacilos de Doderlein, muitos cocobacilos Gram varivel, caractersticas de
Gardnerella vaginalis.
Quando a observao de clue cells no Gram existe em combinao com o teste

de produo de amina, em que se usa igual volume de fluido genital e KOH a 10%, a
perceo de um odor a peixe um resultado positivo para Gardnerella vaginalis. (11)
A Gardnerella vaginalis hemolisa o sangue humano, mas no o de carneiro,
coelho ou cavalo, por isso sugerido que o meio de cultura inclua sangue humano e
protease peptona 3. Contudo, o diagnstico da vaginose bacteriana baseado, em
primeiro lugar, na correlao dos sinais clnicos e sintomas com o Gram das secrees
vaginais. (11)
Mobiluncus curtisii e Mobiluncus mulieris esto tambm associados com
vaginose bacteriana. So microrganismos Gram negativo curvos. (11)
138
4.5.10.
Fezes
As fezes chegam em meio de transporte entrico (ETM) ou em recipiente estril.
Flora Comensal
Escherichia coli (no patognicas)
Pseudomonas spp. e no fermentativas
Enterococcus spp.
Microrganismos patognicos
Campylobacter jejuni e Campylobacter spp.
Salmonella spp.
Shigella spp.
Escherichia coli (enteropatognica e enterotoxinognica)
Yersinia enterocolitica
Coprocultura
Meios de cultura
Condies de incubao
Caldo Selenito
Enriquecimento para Salmonella spp. (18 a 24h)
Gelose Hektoen (HEKT)
Salmonella typhimurium Colnias verdes com

centro negro - Crescimento aps 24 h a 352C.
Gelose Campylosel (CAM)
Campylobacter spp. - colnias pequenas e brilhantes

- microaerofilia a 42C durante mais de 24 horas.
Gelose Yersnia CIN (YER)
Yersnia
enterocoltica
Colnias
rosa
Crescimento temperatura ambiente (20 a 25C)

durante 48 horas.
Gelose Sabouraud Gentamicina
Deixar temperatura ambiente (20 a 25C) durante
Cloranfenicol (SGC)
48 a 72 horas.
Candida albicans Crescimento em 3 dias.
139
Infees do Trato Gastrointestinal Inferior

O intestino grosso apresenta uma microbiota normal extraordinariamente grande.
Qualquer tentativa no sentido de isolar bactrias patognicas das fezes requer a
separao dos microrganismos patognicos da microbiota normal, geralmente atravs do
uso de meios seletivos diferenciais e de culturas de enriquecimento. (11)
O meio Selenito um meio de enriquecimento para a Salmonella spp. Depois

semeia-se em meio Hektoen. A pesquisa de Salmonella spp. e Shigella spp. faz-se em
meio Hektoen e a pesquisa de Campylobacter spp. no meio Campylosel (CAM) que
tem condies de incubao especiais, em ambiente de microaerofila e a uma
temperatura de 42C durante mais de 24 horas.
No meio Hektoen colnias amarelas e meio vermelho caracterstico da
Escherichia coli, que no se valoriza na coprocultura por ser um comensal, logo o
resultado negativo. Se existirem colnias verdes com um ponto negro deve-se fazer o
teste da urease para despistar Salmonella spp. O teste urease proveniente do meio
Hektoen, quando negativo suspeito de Salmonella spp. e distingue do Proteus spp.
que urease +. Portanto, se for negativo, deve-se repicar em meio MacConkey.
O Campylobacter spp. forma colnias pequenas e brilhantes no meio
Campylosel e tambm tem como caractersticas ser oxidase + e catalase +, testes que se
fazem para confirmar se so colnias de Campylobacter spp. As colnias suspeitas de
Yersnia spp. so cor de rosa no meio Gelose Yersnia CIN (YER). Quando no meio
Sabouraud com Gentamicina e Cloranfenicol (SGC) cresce Candida faz-se uma
repicagem para o meio cromogneo Gelose Candida ID (CAND), onde a Candida
albicans forma colnias azuis e se diferencia de um conjunto de outras espcies (C.
tropicalis, C. lusitaniae e C.kefir) que formam colnias pigmentadas de rosa.
140
Pesquisa de ovos, quistos e parasitas
Princpio:
utilizada uma tcnica de concentrao pelo Formol Etil-Acetato que se baseia
na diferena de solubilidade dos diferentes componentes das fezes. O meio A (soluo
de formaldedo) simultaneamente conserva os parasitas e solubiliza os componentes
hidrfilos; o meio B (soluo de acetato de etilo) solubiliza os componentes lipfilos
como as gorduras; o meio C (soluo de iodo) cora diferencialmente as estruturas. Estes
meios, quando misturados, criam uma suspenso imiscvel que aps filtrao
centrifugada e exibe 3 camadas distintas: uma superficial de componentes lipfilos, uma
intermdia formada por detritos de densidade intermdia, uma camada profunda
composta por elementos hidrfilos e no fundo do tubo um sedimento de compostos de
alta densidade que inclui os ovos, os quistos e as larvas de parasitas.
Resultados:
Positivo: observao de ovos, quistos ou larvas de parasitas corados pelo iodo. A
visualizao de um nico elemento parasitrio por lamela suficiente para afirmar o
diagnstico. Se se observarem quistos, a quantificao por campo 400X (com a
objetiva de 40X). Se se observarem ovos, a quantificao por lmina.
Negativo: Ausncia de estruturas parasitrias. Os detritos fecais devem estar

sempre presentes.
141
Observao do Material de Referncia Analtico Interno (MRAI) de parasitas mais

frequentes:
Figura 59 - Quistos de Giardia lamblia
Figura 60 - Ovos de Ascaris lumbricoides
Figura 61 - Ovos de Trichuris trichiuria
Figura 62 - Ovos de Hymenolepsis nana
Figura 63 - Larvas de Strongyloides

stercoralis
Figura 64 - Larvas de Enterobius vermicula
142
4.5.11.
Feridas e fludos purulentos
Colheita:
A colheita feita por aspirao do fluido ou ps com agulha e seringa estreis,
aps descontaminao com lcool etlico a 70% ou lcool isoproplico.
Flora comensal (Contaminantes)

Corynebacterium spp.
Streptococcus -hemolticos
Propionibacterium spp.
Bacillus spp.
Potenciais Patognicos
Streptococcus -hemolticos
Pseudomonas aeruginosa
Exame cultural
Meios de cultura
Condies de incubao
Gelose Columbia + 5% de Streptococcus spp Crescimento aps 24h a

352C

amarelas aps 24 horas a 352C
143
4.6. Resistncias a Antibiticos

4.6.1. Beta-lactamase de espectro alargado (BLSE)
H que ter em conta que existem resistncias naturais ou intrnsecas de certos
microrganismos para certos antibiticos. importante referir as multiresistncias graves
como as - lactamases de espectro alargado (BLSE). Pode ser testado em Placa, TSA
em meio MH2 que tenha sido inoculado com a bactria isolada formando colnias puras
confluentes.
Entre os vrios mtodos sugeridos para a deteo de resistncia, um mtodo de

sinergia de duplo disco pode ser utilizado e pode ser eficaz para detetar esta resistncia
de tipo de enzimas BLSE. Colocam-se 2 discos de AMC (Amoxicilina com cido
Clavulnico) e ATM (Aztreonan) com uma distncia de 20 mm entre os centros para
observar se h sinergia. Quando h um BLSE verifica-se um fenmeno de sinergia entre
os dois discos de AMC e ATM, colocados distncia de 20 mm. Num teste com AMC
no centro e rodeado de discos de Aztreonam e discos de cefalosporinas de 3 gerao
pode verificar-se distoro das zonas do halo formando uma sinergia. (11)
Figura 65 - Potenciais interaes na difuso dos discos de antibiticos para testar sinergia bacteriana
(AMC Amoxicilina com cido Clavulnico; ATM Aztreonan; CRO Ceftriaxona; CTX
Cefotaxima; CAZ Ceftazidima)
144
4.6.2. Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)

O Staphylococcus aureus uma bactria responsvel por uma ampla variedade
de enfermidades infecciosas. responsvel por uma grande variedade de infees,
como infees na pele e no subcutneo, infees ps-cirrgicas, osteomielites,
pneumonias, abscessos, endocardites e bacteriemia. umas das causas mais comuns de
infees nosocomiais, bem como de infees comunitrias que podem apresentar altos
ndices de morbidade e mortalidade. (14)
Mecanismos como a diminuio da permeabilidade da clula bacteriana,
alteraes de molculas onde se aderem os antibacterianos, e expulso do antibacteriano
do interior da clula tambm conferem resistncia a frmacos antimicrobianos. (13)
As bactrias geralmente tornam-se resistentes aos antibiticos betalactmicos
atravs da produo de betalactamases, enzimas capazes de hidrolisar o anel
betalactmico transformando os antibiticos em produtos inativos. (13)
Com uma menor frequncia, as bactrias podem tornar-se resistentes aos
antibiticos betalactmicos, por alterao de permeabilidade e modificaes nas suas
protenas de ligao das penicilinas (PBP). As PBPs so enzimas responsveis pelas
ligaes cruzadas (cross-link) entre as molculas de peptidoglicano para a sntese da
parede das bactrias e so locais de ao dos antibiticos betalactmicos. O aumento do
nmero de infees causadas por S. aureus meticilina resistentes (MRSA), nas quais
muito frequente a ocorrncia de resistncia mltipla, constitui um srio problema para o
incio de uma terapia. (13)
O S.aureus meticilina-resistente desencadeia infees invasivas como, por
exemplo, as infees em feridas, queimaduras e lceras. A frequncia de infees
ocasionadas por MRSA tem apresentado crescimento contnuo em instituies
hospitalares a nvel mundial. (13)
Tradicionalmente, as infees causadas pelo MRSA estavam limitadas aos
hospitais, mas, nos ltimos anos, as infees associadas ou adquiridas na comunidade
tm sido documentadas de forma crescente em todo o mundo. (14)
145
Bibliografia
1. Bain, B.J., Clulas Sangneas, Um Guia Prtico, 4 Edio; Artmed, London,
2007
2. Hoffbrand, A.V., Pettit, J.E., Moss, P.A.H., Essential Haematology, Fourth
Edition, Blacknell Science, United Kingdom, 2001
3. Turgeon, M.L., Clinical Hematology, Theory and Procedures, 5th Edition,
Wolters Kluwer Lippincott Williams and Wilkins, USA, 2012
4. Merino, A., Manual de Citologia de Sangre Perifrico, Accin Mdica, Madrid,
2005
5. Christfaro, M.A., Carvalho, M.S., Sales, M.J., Tcnico em Hemoterapia: Livro
de Texto, Ministrio da Sade, Braslia, 2013
6. Burtis, C.A., Ashwood, E.R., Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Third
Edition, W.B. Saunders Company, USA, 1999
7. American Diabetes Association, Diabetes Care, Volume 36, Supplement 1,
USA, January 2013
8. Pimentel, R.A., Marcadores Bioqumicos de Doena Cardiovascular, Clnica
Mdica e Diagnstico Dr. Joaquim Chaves, Lisboa, 2005
9. Burmester, G.R., Pezzutto, A., Imunologia, Texto e Atlas, Lidel, Edies
Tcnicas, Lda, Lisboa, 2005
10. Center for Disease Control and Prevention, disponvel em:
www.cdc.gov/std/syphilis/syphilis-fact-sheet-press.pdf
11. Koneman, E. W. et al, Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology,
Fifth Edition, Lippincott-Raven Publishers, 1997
12. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First
Informational Supplement; Clinical and Laboratory Standards, January 2011
13. Ratti, R.P.; Sousa, C.P. Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) e
infeces nosocomiais, Rev. Cinc. Farm. Bsica Apl., 2009; 30(2): 137-143
14. Gelatti, L.C. et al, Staphylococcus aureus resistentes meticilina: disseminao
emergente na comunidade, An. Bras. Dermatol., 2009; 84(5):501-6
146

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

RELATRIO FINAL DE ESTGIO

Ana Paula Silvrio da Silva

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS

Relatrio de Estgio no Laboratrio Dr. Joaquim Chaves

Ana Paula Silvrio da Silva

Relatrio de Estgio orientado pelo Dr. Carlos Oliveira

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS Ana Paula Silvrio da Silva

Hemoglobinopatias e Talassemias .................................................................... 10

Regulao do metabolismo do ferro - Hemosiderose e Hemocromatose ......... 17

Alteraes dos leuccitos .................................................................................. 19

Hemostase e Coagulao .................................................................................. 24

Teste de agregao plaquetria ......................................................................... 30

Velocidade de sedimentao eritrocitria ......................................................... 32

Fenotipagem sangunea - Sistema ABO e Rh ................................................... 33

Bioqumica Clnica ........................................................................................... 37

Exame Sumrio de urina (Urina Tipo II): ......................................................... 38

Metabolismo dos Hidratos de Carbono............................................................. 47

Funo Renal .................................................................................................... 49

Equilbrio cido-base ........................................................................................ 54

Funo Pancretica ........................................................................................... 59

Funo cardaca ................................................................................................ 61

Marcadores de necrose ...................................................................................... 61

Marcadores de dislipidmia .............................................................................. 64

Funo Tiroideia ............................................................................................... 67

Sistemas Automatizados nos Imunoensaios ..................................................... 71

Serologia infeciosa Reaes de aglutinao .................................................. 84

Immunodifuso radial ....................................................................................... 88

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS Ana Paula Silvrio da Silva

Marcadores sricos de doenas infeciosas ........................................................ 93

Vrus da Hepatite C ........................................................................................... 93

Vrus da Imunodeficincia Humana ................................................................. 95

ELISA ............................................................................................................. 101

Imuno Fluorescncia Indireta ......................................................................... 102

Auto-imunidade .............................................................................................. 103

Microbiologia .................................................................................................. 105

Equipamentos em Microbiologia .................................................................... 105

Meios de cultura e suas caractersticas ........................................................... 108

Procedimentos em microbiologia ................................................................... 113

Teste de Suscetibilidade aos Antibiticos....................................................... 118

Produtos Biolgicos ........................................................................................ 120

Hemoculturas .................................................................................................. 121

Lquido Cefalorraquidiano .............................................................................. 122

Exsudado ocular e auricular ............................................................................ 124

Exsudado nasal, farngeo e amigdalino .......................................................... 125

Urina asstica .................................................................................................. 130

Exsudado Vaginal /Vulvar .............................................................................. 132

Exsudado uretral ............................................................................................. 135

Fezes ........................................................................................................... 139

Feridas e fludos purulentos ....................................................................... 143

Resistncias a Antibiticos ............................................................................. 144

Beta-lactamase de espectro alargado .............................................................. 144

Staphylococcus aureus meticilina resistente ................................................... 145

Bibliografia ................................................................................................................... 146

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ndice de tabelas e figuras

Figura 1- Plataforma do CORE laboratorial ..................................................................... 3

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Figura 21 - ORTHO AutoVue System ........................................................................ 34

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS Ana Paula Silvrio da Silva

Figura 50 - Estao de Trabalho ( esquerda) e Cartas ( direita) do Sistema Vitek 2 106

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