UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Campus Recife

CURSO DE MEDICINA
BIOQUMICA
1 PERODO - TURMA 139

ISABELLA BENIGNO NINO SILVA

RELATRIO DE AULA PRTICA DE PROTENAS

RECIFE
2015

1. INTRODUO
PROTENAS
As protenas so macromolculas muito abundantes na natureza, ocorrem em todas as
clulas e em grande variedade de tipos, desde peptdeos pequenos at grandes polmeros, com
elevado peso molecular e diferentes funes biolgicas. So polmeros formados por
aminocidos, unidades monomricas relativamente simples que se ligam umas as outras por
meio de ligaes peptdicas. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH 2 ) de um
aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de uma
amida.
Os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminocidos influenciam na estrutura, na
funcionalidade e nas propriedades das protenas individuais, dessa forma, podemos classificar
os aminocidos quanto ao seu grupo funcional como no polares (alifticos), polares no
carregados, polares positivamente carregados, polares negativamente carregados e aromticos.
As protenas, mesmo tendo variadas funes e propriedades, so constitudas por um grupo de
20 aminocidos, chamados aminocidos padro, que se arranjam em variadas sequncias a fim
de conferir conformao e funo de uma determinada protena. Os aminocidos possuem
propriedades pticas, apresentando estereoismeros D e L, uma vez que todos os aminocidos,
exceto a glicina, possuem quatro ligantes diferentes ligados ao carbono . A maioria das
protenas encontradas nos seres vivos so formadas por L-aminocidos. Os D-aminocidos
aparecem somente em certos antibiticos peptdicos e em peptdeos componentes da parede de
algumas bactrias.
As protenas podem se apresentar em conformao primria (linear), secundria (formando
-hlices e folhas ), terciria (enovelamento por interao entre sequncias polipeptdicas de
uma protena com estrutura secundria) e quaternria (arranjo de mais de uma subunidade
protica), como pode ser visto na Figura 1. As protenas que apresentam uma ou mais cadeias
polipeptdicas formando estruturas compactas, mais ou menos esfricas e que geralmente so
solveis denominam-se protenas globulares. As protenas fibrosas possuem forma alongada,
geralmente insolveis, que em meio aquoso e desempenham um papel basicamente estrutural
nos sistemas biolgicos. Ao contrrio das globulares, as fibrosas so formadas pela repetio de
mdulos, o que possibilita a construo de grandes estruturas, com organizao que origina
fibras.

Figura 1 Formao estrutural das protenas. Esquema mostra o enovelamento da sequncia

de aminocidos para a formao de protenas nas conformaes primria, secundria, terciria e
quaternria.
Uma perda da estrutura tridimensional suficiente para causar perda de funo denominada
desnaturao. O estado desnaturado no necessariamente corresponde a um desenovelamento
completo da protena, mas sob a maioria das condies, as protenas desnaturadas consistem
num estado parcialmente enovelado. As protenas podem ser desnaturadas pelo calor, que afeta
principalmente as ligaes de hidrognio; por extremos de pH, que alteram a carga lquida da
protena; por solventes orgnicos miscveis com gua, que promovem rompimento de interaes
hidrofbicas; etc.
PRECIPITAO DE PROTENAS COM DESNATURAO
Uma perda da estrutura tridimensional suficiente para causar perda de funo denominada
desnaturao. O estado desnaturado no necessariamente corresponde a um desenovelamento
completo da protena, mas sob a maioria das condies, as protenas desnaturadas consistem
num estado parcialmente enovelado. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas
quaternria, terciria e secundria de protenas, mas no da primria.
As protenas podem ser desnaturadas pelo calor, que afeta principalmente as ligaes de
hidrognio; por extremos de pH com adio de cidos ou lcalis, que alteram a carga lquida da
protena; por solventes orgnicos miscveis com gua, que promovem rompimento de interaes
hidrofbicas; solues concentradas de uria e guanidina; detergentes; sais de metais pesados,
etc. Entre as alteraes que se observam em decorrncia da desnaturao protica, pode-se
citar: diminuio da solubilidade, perda de atividade biolgica (por exemplo, da ao
enzimtica, da ao hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptdica,
alteraes na viscosidade e coeficiente de sedimentao, etc.

A desnaturao, usualmente decresce a solubilidade das protenas. A diminuio da

solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais hidrofbicos e outros que
prejudiquem a interao da protena com a gua e favoream a interao entre protenas. A
desnaturao o evento primrio e importante. A floculao e a coagulao, que muitas vezes
so confundidos com desnaturao de protenas, so simplesmente manifestaes visveis das
alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.
As reaes de precipitao com desnaturao, alm de serem utilizadas para caracterizar a
presena de protenas em soluo, tambm so teis para proceder a desprotenizao de lquidos
biolgicos para anlise de componentes no proticos.
PRINCPIOS TERICOS
- Precipitao pelo cido Tricloroactico: A solubilidade de uma molcula depende da
interao entre os grupos polares dos radicais R e as molculas de gua atravs de pontes de
hidrognio. Grandes variaes de pH modificam a ionizao destes grupos e, portanto, a
interao da protena com o meio. Nos seres vivos, as protenas esto em contnua modificao
de sua conformao, uma vez que as concentraes locais de ons, o pH e o poder redutor
sofrem pequenas variaes, alterando a interao dos vrios grupos reativos das protenas entre
si e com o meio. Valores extremos de pH afetam bruscamente estas interaes, causando uma
desnaturao. nions de cidos complexos, como o tricloroactico, o tngsnico e o pcrino,
formam sais insolveis onde a protena funciona como ction.
- Precipitao com sais de metais pesados: A adio de sais de metais pesados, tais como
mercrio, chumbo, cobre e zinco, levam formao de sais chamados "quelatos", so
denominados de acordo com o elemento formador entre os aminocidos cidos e estes metais,
como por exemplo, o proteinato de mercrio e o proteinato de chumbo A protena precipita
porque estes sais so insolveis em gua e tambm porque, com a quebra das ligaes inicas,
os aminocidos hidrofbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Essa precipitao mais
intensa quando o pH est acima do ponto isoeltrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga
lquida sobre a protena negativa, favorecendo a interao com os ctions provenientes do sal.
- Precipitao por saturao salina e com solvente orgnico: A solubilidade de uma protena
pode variar de acordo com a concentrao de sal a que ela submetida. Em baixa concentrao
de sal, observamos um aumento na solubilidade das protenas com a presena de ons. Este
fenmeno chamado de salting in, onde ocorre uma interao entre os ons salinos e os
grupamentos carregados das protenas diminuindo as interaes eletrostticas intermoleculares
protena-protena (responsveis pela diminuio da solubilidade protica). Por outro lado, em
elevada concentrao salina, observamos uma reduo na solubilidade das protenas. Este

processo chamado de salting out, aonde alguns sais, ao interagir com a gua, removem a
camada de solvatao das protenas, o que facilita a formao de agregados e leva sua
precipitao. A solubilidade das protenas em solventes orgnicos menor do que em gua. Isso
acontece porque a capacidade de interao com as partculas de soluto diferente para cada
solvente. Numa soluo contendo, exclusivamente, gua e molculas proticas temos: interao
gua - protena e interao protena-protena. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o
primeiro tipo de interao prevalecer sobre o segundo porque a gua possui grande capacidade
de separao das partculas do soluto (constante dieltrica elevada). O solvente orgnico
apresenta valor de constante dieltrica bem inferior da gua, o que leva a interao protenaprotena a ser superior, em competio com o poder de solvatao da gua (interao guaprotena). A protena precipita. Essa precipitao reversvel pela adio de mais gua. A
precipitao por solventes orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos,
quando utilizados a temperaturas baixas, so bastante teis na separao de misturas de
protenas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar desnaturao por
rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de interaes apolares, importantes na
manuteno da conformao protica.
- Precipitao isoeltrica: As protenas so muito sensveis variao de pH, podendo adquirir
uma forma aninica, catinica ou zwitterinica, o que altera propriedades como sua solubililade
e atividade cataltica. Quanto maior o grau de ionizao de uma protena, maior ser sua
tendncia solvatao. No ponto isoeltrico (pI), a protena tem carga lquida igual a zero, o
que diminui a repulso entre as molculas proticas e o grau de solvatao provocando a
agregao e floculao das molculas. Esse fenmeno chamado de precipitao isoeltrica.
As cadeias laterais de alguns aminocidos possuem a capacidade de se ionizar em condio
cida ou bsica. Desta forma, protenas com composio de aminocidos diferentes podero ter
cargas distintas de acordo com a condio a que forem submetidas. Os aminocidos apresentam
propriedades caractersticas quando isolados, mas formando um polipeptdeo eles podem
interferir uns nos outros e consequentemente no comportamento total da protena. As protenas,
assim como os peptdeos e aminocidos, possuem pontos isoeltricos caractersticos, nos quais
elas possuem carga lquida (soma das cargas positivas e negativas) igual zero. O ponto
isoeltrico de cada protena especfico e pode servir como mtodo de separao de protenas
em soluo, por exemplo, ao submeter uma soluo com vrias protenas a um pH tal que seja
equivalente ao ponto isoeltrico de uma delas, s esta precipitar, podendo ser separada das
demais.

2. MTODOS EXPERIMENTAIS
PRECIPITAO PELO CIDO ACTICO
Foram utilizados trs tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles
foram colocados 2 mL de ovoalbumina com a utilizao de uma pipeta graduada e um
auxiliador de pipetagem (pra). Posteriormente foi adicionado 1 mL de soluo de cido actico
20% no primeiro tubo, 1 mL de soluo de cido clordrico 20% no segundo tubo e 1 mL de
soluo de cido tricloroactico no terceiro; os trs tubos foram agitados para misturar bem os
reagentes.
PRECIPITAO COM SAIS DE METAIS PESADOS
Foram utilizados trs tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles
foram colocados 2 gotas de NaOH com a utilizao de uma pipeta graduada de 5 mL.
Posteriormente foi adicionado 1 mL de ovoalbumina no primeiro tubo, 1 mL de ovoalbumina e
5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10% no segundo tubo e 1 mL de gua e 5 gotas de
soluo de acetato de chumbo 10% no terceiro; os trs tubos foram agitados levemente para
misturar bem os reagentes e aps 10 minutos foram observados os resultados.
PRECIPITAO POR SATURAO SALINA E COM SOLVENTE ORGNICO
Foram utilizados dois tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles foi
colocado 1 mL de ovoalbumina com a utilizao de uma pipeta graduada e um auxiliador de
pipetagem (pra). Posteriormente foram adicionados 3 mL de soluo saturada de sulfato de
amnio no primeiro tubo e 3 mL lcool no segundo tubo; os dois tubos foram agitados para
misturar bem os reagentes e deixados em repouso para que os resultados fossem anotados.
Depois de 5 minutos, adicionou-se 5 mL a cada um dos tubos, que foram agitados e
posteriormente deixados em repouso afim de perceber os resultados.
PRECIPITAO ISOELTRICA
Foram utilizados trs tubos de ensaio devidamente identificados e em cada um deles foram
colocados 2 mL de solues tampo; no primeiro, tubo foi colocada uma soluo tampo de pH
6; no segundo, uma de pH 4,7 e , no terceiro, uma de pH 3. Posteriormente foi adicionado 1 mL
de ovoalbumina e 4 mL de lcool em todos os tubos, os trs tubos foram agitados para misturar
bem os reagentes.

3. RESULTADOS E DISCUSSES
PRECIPITAO PELO CIDO TRICLOROACTICO
TUBO
1
2
3

RESULTADO
++
++++

QUESTES:
Explique a eficincia dos diferentes cidos para precipitar a protena.
Existe relao entre a molaridade do cido e o seu efeito sobre a ovoalbumina?
RESPOSTAS:
Observa-se, portanto, que quanto mais forte um cido, mais eficiente a precipitao
da protena quando reage com ele. A fora de um cido medida a partir do seu grau de
ionizao, dessa forma, possvel explicar por que o cido actico no foi capaz de provocar
precipitao da protena, isso porque seu grau de ionizao baixo e ele classificado como um
cido fraco, enquanto o acido actico considerado forte e tem alto grau de ionizao, sendo
capaz de provocar precipitao. O cido tricloroactico capaz de promover maior precipitao
porque, alm de ter alto grau de ionizao, capaz de atacar os centros hidrofbicos das
protenas, sendo um agente de precipitao mais eficiente.
A molaridade dos cidos utilizados na aula prtica em questo no tem relao direta
com o efeito deles sobre a ovoalbumina, visto que os cidos com maior molaridade no so os
que provocam maior precipitao da protena. Calculando a molaridade dos cidos usados a
partir da seguinte frmula:

Molaridade=

x 10
Massa Molar do cido

Obteremos as molaridades:

Molaridade do c . Actico 20 =3,33 molar

Molaridade do c . clordrico 20 =5,48 molar

Molaridade do c . Tricloroactico 20 =1,22molar

PRECIPITAO COM SAIS DE METAIS PESADOS

TUBO
1
2
3

RESULTADO
++++
++

QUESTES:
Explique a natureza do precipitado no tubo n 2.
Qual a influncia do pH do meio (alcalino ou cido) neste processo de precipitao de
protenas?
RESPOSTAS:
O primeiro tubo no apresentou precipitado porque a base forte adicionada no capaz
de formar um precipitado sozinha. No segundo tubo, observa-se intensa formao de
precipitado, o proteinato de chumbo. O grupo hidroxila da gua reage com o sal de metal
pesado formando um hidrxido de chumbo, sal insolvel constituinte do precipitado observado
no terceiro tubo.
O pH importante para esse tipo de reao porque essa precipitao mais intensa
quando o pH est acima do ponto isoeltrico. Isso porque, acima do pI, a carga lquida sobre a
protena negativa favorecendo a interao com os ctions provenientes do sal. Em pH abaixo
do ponto isoeltrico, no possvel provocar precipitao com sais, mas com cidos fortes.
PRECIPITAO POR SATURAO SALINA E COM SOLVENTE ORGNICO
TUBO
1
2

1 PRECIPITAO
++++
++++

2 PRECIPITAO
++

QUESTES:
Explique a reversibilidade das precipitaes nos tubos 1 e 2?
Como se d a relao das molculas de gua com o sal e com o solvente orgnico?
RESPOSTAS:
A camada de solvatao retirada pela soluo saturada de (NH 4)2SO4 e pelo lcool,
fazendo a protena se associar e precipitar.

As molculas de gua presente na soluo de ovoalbumina apresentam maior tendncia

de solvatao de partculas menores (nesse caso, os ons do sulfato de amnio). As molculas de
gua, ocupadas em sua interao com os ons, "abandonam" a estrutura protica. Dessa forma,
h maior interao protena-protena, diminuio da solubilidade em meio aquoso e,
consequentemente, precipitao da protena. A esse fenmeno de precipitao da protena em
decorrncia de um considervel aumento da fora inica do meio d-se o nome de salting out. A
adio de mais gua soluo possibilita a reversibilidade da precipitao porque, como h
mais molculas de gua para interagir com as protenas, a competio entre a solvatao dos
ons e da protena diminui, uma vez que existem molculas de gua suficientes para solvatar
esses dois elementos e relao gua-protena favorecida.
Os solventes orgnicos que tm uma poro hidrofbica e uma poro polar so capazes
de precipitar protenas porque os grupos polares interagem com os grupos polares da protena,
competindo com as molculas de gua, e os grupos hidrofbicos alteram as interaes
hidrofbicas dentro da estrutura proteica. O volume de solvente orgnico reduz a concentrao
efetiva da gua, havendo menos molculas para a relao gua-protena, favorecendo a relao
protena-protena, fazendo com que haja precipitao. A protena no volta a se solubilizar
completamente com adio de mais gua porque as interaes apolares da molcula da protena
so atingidas pelo solvente orgnico, novas interaes so estabelecidas e algumas partes da
protena no so capazes de voltar conformao inicial. Consequentemente, a precipitao
apenas reduzida com a adio de gua, uma vez que a competio entre solvente e protena
eliminada pelo aumento da concentrao efetiva de gua, mas ainda resta precipitado por causa
da desnaturao protica causada pelo solvente orgnico.
PRECIPITAO ISOELTRICA
TUBO
1
2
3

RESULTADO
+++
-

QUESTES:
Qual o ponto isoeltrico (aproximao) da ovoalbumina?
Quais aminocidos ionizveis so mais abundantes nesta protena?
Faa uma curva de ionizao (aproximada) para a lisina:
RESPOSTAS:

Quando uma protena se encontra em meio com pH igual a seu ponto isoeltrico, ou
seja, quando apresenta carga lquida nula, a repulso eletrosttica entre partculas diminui,
possibilitando interaes protena-protena, gerando uma condio favorvel para que as
molculas de protena se aproximem, agreguem e precipitem. O ponto isoeltrico aproximado
da ovoalbumina no pH 4,7, pois nesse pH em que h precipitao da protena.
A ovolbumina de galinha composta por 385 aminocidos, possui os 20 aminocidos
padro, e sua massa molecular relativa 45 kDa. A ovoalbumina tambm tem vrias
modificaes, como a acetilao N-terminal (G1), fosforilao (S68, S344), e glicosilao
(N292). rica em aminocidos com enxofre como a cistena e metionina, apresenta 4 sulfidrilas
e forma duas pontes dissulfeto; estas pontes aumentam quando se armazena a protena. Como
contm fsforo e glicdios unidos uma fosfoglicoprotena, que composta por trs fraces
(A1, A2 e A3 na proporo 85: 12: 3) com diferente teor de fsforo. Os aminocidos ionizveis
mais abundantes so cistena, metionina, histidina, cido glutmico, arginina e lisina.

A curva de ionizao da lisina pode ser observada na Figura 2.

Figura 2 Curva de ionizao para a lisina.

4. CONCLUSES
Diante do observado com a realizao da prtica, possvel perceber experimentalmente as
propriedades das protenas atravs de suas reaes de precipitao. As reaes de precipitao
podem ser provocadas por diversos tipos de agentes precipitantes, so teis para a separao
das protenas e podem ser tambm agentes desnaturantes, alterando a funo original de uma
determinada protena.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
CARREIRA,

R.

L.

et

al.

EFEITO

DA

PRECIPITAO

PELO

CIDO

TRICLOROACTICO (TCA) E DA ULTRAFILTRAO SOBRE O PERFIL

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Experimentos

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<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipitacao_proteinas.htm
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MORAES, C.S. et al. SRIE EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR - MTODOS
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NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninguer Princpios da Bioqumica. Editora Sarvier, So
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