CTB Hemoparasitos Farber

Desarrollo de Herramientas
Moleculares para el estudio de

enfermedades transmitidas por
garrapatas
Marisa Farber, PhD

Inst. Biotecnologia
INTA (National Institute for Agricultural Technology)
Buenos Aires, Argentina
Tristeza bovina (Bovine Tick-Borne Diseases)

Babesiosis: Babesia bovis, Babesia bigemina
Anaplasmosis: Anaplasma marginale.
En Argentina:
30S
33S
Boophilus microplus
Babesia enzootic area
A. marginale enzootic area
65W
Ticks & TBD free area
Las prdidas econmicas directas por reduccin de peso o mortalidad, y los

costos para el tratamiento y la prevencin de estas enfermedades, mediante
vacunas vivas en la Argentina, se han estimado en US$ 38.9 millones al ao.
Babesiosis: Babesia bovis,

Babesia bigemina
Anaplasmosis: Anaplasma marginale
Ciclo de vida
RELEVANCIA SOCIAL, ECONOMICA Y

PRODUCTIVA DEL PROBLEMA
Demanda de alimentos en el mundo
Devaluacin del peso en el 2001, la suba del tipo de cambio real,

crecimiento de la economa
Suba de precios internacionales
PRODUCCION DE CARNE VACUNA 2000-2006
Produccin (*) Exportacin (**) Expo/Prod. (%)
Ao
2000
2.489
342
12,6%
2001
2.526
152
6,1%
2002
2.664
351
13,9%
2003
3.024
392
14,7%
2004
3.132
631
20,9%
2005
3.132
771
24,6%
2006
3.030
565
18,6%
(*) miles de toneladas res
Fuente: SAGyPA
(**) miles de toneladas res con hueso
Distribucin de la produccin ganadera en

Argentina
Stock de 49.000.000 bovinos
Pampa hmeda concentra el 60%
NEA posee el 24% del stock
NOA tiene el 8,4%
LABORATORIO DE HEMOPARASITOS
Un poco de historia
Comenz por el Diagnstico
Continu con Vacunas
Se extendi a la Epidemiologa
Aprovechamiento de la informacin
genmica para el desarrollo de
herramientas aplicadas al Estudio de la
Babesiosis y Anaplasmosis Bovinas
GENOMICA FUNCIONAL:
ANTIGENOS
VACUNAS
GENOMAS
EPIDEMIOLOGIA
DIAGNOSTICO
En qu trabajamos?
Produccin de antgenos recombinantes para

determinaciones serolgicas
Desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico
Herramientas para aplicar a estudios epidemiolgicos
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Bsqueda de nuevos antgenos

Sistemas de expresin heterloga
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

La tcnica de Reverse Line Hybridization (RLB) puede ser

utilizada para la deteccin simultnea de diversas especies
cepas de parsitos en muestras de aislamientos.
La introduccin de la sonda general (catch all) permite la
deteccin de parsitos an no descriptos.
Se ha desarrollado este mtodo para parsitos

transmitidos por garrapata tales como Theileria ssp.,
Babesia ssp., Ehrlichia ssp. y Anaplasma ssp.
Permite la caracterizacin de numerosas muestras en un
mismo ensayo partiendo de un producto de PCR.
RLB
Primers:
Anaplasma ssp.
HER-F: AGAGTTGGATCMTGGYTCAG
EHR-R: AGAAGAAGTCCCGGCAAACT
Babesia ssp.
RLB-F2: GACACAGGGAGGTAGTGACAA
RLB-R2: B-CTAAGAATTTCACCTGTGACAGT
Sondas:
A. centrale especfica:
TCGAACGGACCATACGC
A. marginale especifica:
GACCGTATACGCAGCTTG
Anaplasma ssp. catch all:
GGGGGAAAGATTTATCGCTA
B. bovis especfica:
CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG
B. bigemina especfica:
CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG
Babesia ssp. catch all.
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.
Deteccin de polimorfismo en la sonda especfica

para B. bigemina
Observations
Name
Currenly used probe
MEXICO
BgM2P
Pathogenic B. bigemina from Chavarria,

Corrientes, Argentina
BgS1A
BgS1A
BgS2P
BgS2P.clone1
Pathogenic B. bigemina
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
Sequence
C C C T
C C C T
C C C T
BgM2P
Possible options for BgM2P sequences
Attenuated B. Bigemina
C
C
C
BgS2P.clone2
BgS2P.clone3
BgS2P
Attenuated B. Bigemina from Alen-Cue,

BgM1A
Pathogenic B. bigemina from Alen-Cue,

BgM1P
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
B. bigemina from Brasil
Details
T
C
C
G
T
C
T
G
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
G
G
C
T
G
T
C
T
T
T
G
T
T
T
G
T
T
G
T
T
T
T
C
T
C
G
G
G
T
T
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
G
T
T
T
G
G
T
G
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
T
C
C
C
T
T
T
G
T
G
T
T
G
G
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
C
T
T
G
G
G
G
G
G
G
B. bigemina P
B. bigemina A
B. bigemina T
C
C
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
C
G
C
CLONED
Jul-04
PCR
Nov-04
PCR
Nov-04
CLONED
Jul-04
PCR
Sep-II-04
CLONED
Jul-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
PCR
Sep-II-04
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
Secuencias para membrana

B. bigemina M
Reference sample
G
G
G
G
Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

e identificacin de Babesia spp y Anaplasma spp.
Deteccin de B. bigemina por PCR:
Inmunosensor ptico basado en MSP5 para el

diagnstico de A. marginale
Distribucin de Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (F.A.U) de 12 sueros

negativos (barras negras) y 9 sueros de bovinos infectados con A. marginale.
7
Anaplasma spp uninfected cattle

Anaplasma spp infected cattle
Number of sera
6
5
4
Valor de corte: 40 F.A.U

Sensibilidad 95%
Especificidad 83%
3
2
1
>1
01
91
-1
00
81
-9
0
71
-8
0
61
-7
0
51
-6
0
41
-5
0
31
-4
0
21
-3
0
10
-2
0
F.A.U at 670 nm
Comportamiento del inmunosensor en muestras de campo: concordancia con el

ELISAc como gold standard
Negativos
Positivos
Positivos
25
Negativos
IS
Concordancia entre las dos

pruebas: 88%
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

Muestreo NEA y NOA
Diseo del muestreo: Establecer zonas de riesgo en funcin del nmero

de generaciones de garrapatas que nos permite definir 3 regiones de baja,
media y alta transmisibilidad respectivamente, las cuales se asocian
indirectamente las condiciones climticas, uso de garrapaticida, etc.
Hiptesis de trabajo: Definir marcadores moleculares que permitan

asociar los indicadores de riesgo con la variabilidad gentica de los
aislamientos.
Marcadores moleculares
Regiones repetidas en tandem en genes que codifican para
protenas de superficie: A. marginale (MSP1a), B. bovis (Bv80, TRAP,
P200, Antigen 3, Desmoyokin), B bigemina (P200, PLP)
Primer For
MACF
Primer Rev
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PCR amplification of the repeat region from

different isolates of B. bigemina. 1:BgS2P,
2:BgS1A, 3:BgM1P, 4:BgM1A, 5 and 6:BgMx
(Jg29), 7:BgBr, 8:BgM2P, 9:negative control.
Marcadores moleculares
VNTR (Variable number of tandem repeats) : A. marginale (AMTR 15 y
AMTR11). En desarrollo para Babesia sp
MLST (Multilocus Sequence Typing): seleccin de los genes blanco

(housekeeping
genes),
determinacin
de
la
especificidad,
secuenciacin de los fragmentos amplificados, bsqueda de
polimorfismo de nucletidos simples (SNPs), determinacin de la tasa
de sustitucin para verificar que los genes seleccionados respondan a
modelos de evolucin neutra.
DataBase
The ACCESS data base (DB) includes information about
4189 bovine samples from Northeast (1198) and
Northwest (2991) Argentina.
DB fields correspond to information describing sampling
(date, responsible, place of work), the field (region,
province, locality, department, field coordinates), the
cattle (breed, age, tick control strategies), the sample
evaluation (ELISA, PCR, RLBH), molecular
characterization: Polymorphic genes, VNTR, MLST.
Based on the information required, different queries were
designed. These queries enable the DB user to easily
extract information about the 4189 samples.
RLBH detection
NE A
NOA
100
T ota l
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Eo
m
bi
A
B
bo
B
%
bo
A
iA
Eo
Eo
m
bi
Eo
Bb
%
bo
B
B
%
bo
bi
A
Eo
o
iE
Am
%
Bb
%
bi
A
B
bo
Eo
bi
bo
B
%
bo
eg
Eo
%
m
A
i%
Bb
bi
o-
B
Bb
%
%
A+
bo
to
t
%
Eo
to
t
%
bi
%
B
%
bo
to
t
to
t
La proporcin de animales co-infectados con A. marginale y Babesia sp result

significativamente alta (P<0.001). Posteriormente se estudi la asociacin entre el
status de co-infeccion y factores que pudieran influenciar el riesgo de co-infeccin
usando un modelo de regresion lineal multivariado. Los factores que se consideraron
fueron el lugar de origen y la edad de los bovinos.
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

PCR sustractiva
Library phoA
Seleccin de antgenos candidatos
Bibliografa
Bioinformtica
Caracterizacin bioinformtica
Antigeno
Identificacin
Caractersticas
TolC
Library PhoAC
OMP conservada.
Sistema secrecin TipoI.
OMP85
Library PhoAC
OMP conservada.
Antgeno protectivo
OMP 4
Library PhoAC
Familia de antgenos superficie
PhoAc
Library PhoAC
L22
PCR sustractiva
OMP Cluster conservado

patgenos y simbiontes
intracelulares.
Adh
Dominios
transmembrana
Probable adhesina
AM 742
Dominios
transmembrana
Hypotetical protena -
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Los genes que codifican protenas

exportadas pueden identificarse mediante
fusiones traduccionales al gen de la fosfatasa
alcalina (phoA) de Escherichia coli.
La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta
cuando la enzima se encuentra fuera del mbito
citoplasmtico.
El gen reportero phoA utilizado no posee
su promotor ni la regin que codifica
el pptido seal amino terminal.
La actividad PhoA se detecta fcilmente
utilizando BCIP como sustrato.
Actividad de PhoA de acuerdo con la localizacin subcelular
NH2
MEDIO EXTERNO
NH2
Membrana externa
NH2
PERIPLASMA
NH2
NH2
Membrana interna
CITOPLASMA
NH2
NH2
PhoA enzimticamente inactiva

PhoA enzimticamente activa
Segmento hidrofbico
de transmembrana
Bsqueda de protenas exportables
Clonado y expresin de fusiones a

PhoA en Escherichia coli CC118

Western blot
Predicted
ORF
Signal
peptide
TM
Domains
TM Pred
ID
Name
Annotation
Nucleotide
Signal P
AM
1108
PhoAC
Hypothetical
protein
2076
AM
127
L22
Hypothetical
protein
3000
AM
216
Adh
Hypothetical
protein
PhoAC Orf
1
2
1
Ortologos
Conserved
domain
Pentapeptide
repeat
B-Lectin
Blast2GO
Uniprot
Pentapeptide
repeat
Pentapeptide
repeat domain
protein
Acetamidase
formamidase
family protein
Conserved
cluster within
Anaplasmas
and Ehrlichias
2529
+
1
L22
Conserved
cluster within
intracellular
pathogens and
endosymbionts
Adh

Western blot
Confirm la expresin de los

genes candidatos

Western blot

Ensayos con animales naturalmente

infectados (Mercedes, Corrientes)
N ID
Infectados/ no
infectados
Msp5-PCR
Control
No
infectado
282
Infectado
Aguda
285
Infectado
Crnico
99
Infectado
Crnico
Western blot
Confirm la infeccin por pcr diagnostica del gen msp5
Respuesta positiva fuerte para PhoAC ORF y Adh Cterm y
mas dbil para los antgenos L22 N term y Adh Nterm

msp5
PhoAC
Adh-
Adh+
L22 Cterm
Western blot
PhoAc 5
PhoAC
RT qPCR Citokine expression profile
Factorof UP-regulatation
AM1108 PhoAC ORF
AM216 Adh-
4,5
4,5
3,5
3,5
2,5
2,5
1,5
1,5
0,5
0,5
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
Results were presented as ratios calculated with the Relative expression software tool (REST@)
application described by Plaffl et al. The value of PCR efficiency for all transcripts was 2, as
calculated following the formula: E = 10[-1/slope].
Regulation factor of cytokine profile

IL2
IL10
IL12p35
TNF
IFN
Enhanced expression
PhoAC
1,18
1,39
1,49
2,71
1,98
TNF, IFN
Adh- (C-term)
1,41
2,27
1,46
1,63
2,52
IL2, IL10, IL12, TNF,

IFN

Western blot
Identificacin y caracterizacin de nuevos

antgenos candidatos capaces de estimular
una respuesta inmunolgica especfica
Blancos potenciales para ser

estudiados en nuevas
formulaciones vacunales.
Twin arginine translocation pathway: TAT system

Sistema de traslocacin de protenas plegadas a travs de la
membrana interna de bacterias Gram-negativas.
Twin arginine translocation pathway: TAT system
Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y C y su organizacin
en el genoma en las
alphaproteobacterias.
Estudio la transcripcin de los genes y la regulacin .
Funcionalidad de tatABC en sistema heterologo de mutantes de Escherichia

coli.
Identificacin de los componentes del sistema: tatA, B y C y

su organizacin en el genoma
Anaplasma marginale
Brucella abortus
tatAB
Dispersa
Operon
tatBC
tatC-Ser
Funcionalidad de tatABC en sistema heterologo de Escherichia coli

Tat A,B y C
E coli TatA-
Promotor Tat Ecoli

AmaTatA,B,C
pUNIp
E coli TatB-
3404 bp
Anaplasma marginale
E coli TatC-
Brucella abortus
Escherichia coli (Controles)
Viabilidad en SDS 2%
A marginale
B abortus
Tat A
Funcional
TatB
No funcional
Funcional
TatC
No funcional
Funcional
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

Anlisis de la regin que contiene el dominio MACPF
Estudio in silico (colaboracin Natalia Rego y Hugo Naya de la Divisin de

Bioinformtica del Instituto Pasteur de Montevideo)
Prediccin de estructura de los genes con dos gene finders basados en HMM:
Fgenesh entrenado con P. falciparum y Glimmer HMM entrenado con el
cromosoma II y III de B. bovis.
La anotacin pblica de cromosomas de B. bovis y Theileria sp. permiti el estudio de la
ortologa y sintenia entre estos cromosomas y los contigs de B. bigemina
Hasta el momento hemos identificado 6 genes con dominio MACPF y estamos
trabajando en la anotacin y la verificacin de los resultados con estudios in vitro
CDS de 1 Exn:
BbiPLP1 3721 pb; BbiPLP2 3240pb
BbiPLP1
Seal TATA
Pptido seal
BbiPLP2
Regin polimrfica (PLR: perforin like

repeat)
Dominio MACPF (Smart)
BbiPLP1: 623pb y BbiPLP2: 655pb
Sitio Poly A
Verificacin de la expresin de la BbiPLP1

A
RT + RT-
ADNg
B
ADNg RT+ RT-
C
RT+ RT-
ADNg
RT- PCR. A: cDNA Merozotos BbiMx, B: cDNA Merozotos BbiS3 y

C: cDNA Fases sexuales BbiMx
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

Identificacin de potenciales nuevos antgenos de B.

bigemina a partir de un anlisis protemico
Optimizacin de la purificacin de protenas totales de merozotos del aislamiento argentino BbiS2P

-Infeccin experimental con BbiS2P de terneros esplenectomizados
- Purificacin de merozotos (estado intraeritroctico) con gradiente de Percoll
- Preparacin del extracto de protenas solubles totales
- Optimizacin del Isoelectroenfoque
- Optimizacin del SDS- PAGE
- Optimizacin del mtodo de deteccin de las protenas (Coomassie coloidal)
-Transferencia de los perfiles proticos a membranas PVDF
- Inmunoscreening con sueros bovinos
A
Gel en 2D teido. IEF: tiras de 7 cm, rango de pH 4-7 y SDSPAGE 10%. A: protenas de merozotos de BbiS2P. B: protena de
eritrocitos no infectados
Descubrimiento de biomarcadores peptdicos para

diagnstico: aplicacin para el diagnostico de la
babesiosis bovina
-Se utilliz una pipeline bioinformatica (desarrollada por Santiago Carmona y Fernan
Agero- IIB UNSAM) diseada para identificar antigenos peptidicos a partir del genoma
anotado de parasitos patgenos.
-La pipeline define una funcin lineal que permite hacer un ranking de pptidos solapados
de 12 residuos aminoacidicos a partir de los fragmentos virtuales provenientes del
proteoma in silico del parasito (Babesia bovis)
-Se consideraron los siguientes atributos para obtener la puntuacin de los peptidos:
Atributos Positivos
-regiones estructuradas vs. no estructuradas

-repeticiones
-sitios de glicosilacin
-localizacin subcelular
-Medida del sesgo en el uso de codones (CAI)
Atributos Negativos
-Secuenciaas conservadas en el proteoma bovino
-Secuencias conservadas en el proteoma de
Theileria
Diseo del microarray de peptidos
Luego de inspeccionar manualmente los peptidos con mayor puntaje se seleccionaron 83

peptidos, entre lo que se incluyen peptidos de reactividad conocida y los nuevos candidatos.
Se imprimieron los vidrios con los 85 peptidos y otros peptidos utilizados como control (JPT
Peptide Technologies, Alemania)
Durante los proximos periodos se interrogar el array con grupos de sueros de bovinos
infectados y sueros control.
En qu trabajamos?

Estudios bsicos
en Anaplasma

Vectores virales: Capaces de estimular las diferentes vas

del sistema inmune generando proteccin efectiva.
Genticamente atenuados.
Llevar secuencias de inters en posiciones que no sean esenciales para la
replicacin viral.
Fcil produccin (bajo costo) y administracin.
Estables, inocuos.
Poxvirus recombinantes: renen estas caractersticas.

En Poxvirus, el ADN forneo se inserta por recombinacin homloga in vivo y
la expresin se consigue insertando el gen de inters bajo regulacin de
secuencias promotoras tempranas de poxvirus.
Vector de transferencia
pE- X - t
poxvirus
Sitio blanco de insercin
pE: promotor temprano de poxvirus

X: gen de inters.
t: terminador de transcripcin y traduccin
poxvirus recombinante
recombinacin
homloga in vivo
pE- X - t
Teniendo en cuenta que:

La eficiencia de transfeccin es baja en cultivos primarios.
La frecuencia de ocurrencia de doble recombinacin (intercambio allico) no se puede cuantificar.
El virus salvaje replica normalmente.
Screening por actividad de una enzima marcadora

Actividad de la enzima B-glucuronidasa codificada por el
gen bacteriano uidA. Screening con X-Gluc (sustrato de la
enzima GUS)
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
Poxvirus
pE/L-XX - t
Gen no esencial
recombinacin homloga in vivo
Poxvirus recombinante
pH6-GUS- t
pE/L -XX - t
1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.

2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.
4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.
5- Obtencin de un stock
puro.
6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantes
seleccionadas.
Objetivo
Disear, construir y caracterizar un MVA recombinante (MVAr) que exprese un
multiantgeno consistente en epitopes de tipo B y T de tres protenas
inmunognicas de B. bovis.
Epitopes T
Espitopes B
Produccin INF -
Estado donde esta presente
Rap-1
S
S
S
Merozoto
Msa-2c
ND
S
ND
Esporozoto
Hsp20
S
S
S
Espor/Mero
Conservacin entre cepas
Localizacin subcelular
Roptrias
Mem. Plsm.
Citosol y MP
ND: No determinado
Construccin del
Multiantgeno
Extraccin de ADNg o ARN de merozotos y amplificacin de los genes
en cuestin con primers especficos.
Clonado en vector de tipo T por separado e ingeniera gentica para
subclonar y fusionar los genes.
Secuenciacin para verificar correcta orientacin.
1- Subclonar el gen de inters en el vector de transferencia.

2- Infeccin de un cultivo celular con el virus salvaje.
3- Transfeccin del VT con las clulas infectadas.
4- Seleccin de los poxvirus recombinantes.
5- Obtencin de un stock puro.
6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantes

seleccionados.
1) Anlisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados o no para
determinar:
A) Presencia del gen de inters, pero stocks no
puros (no homogneo)
M
WT
22
C
23
24
1.8
B) Pureza de stocks recombinantes

(homogneos)
M
21 22 23
WT C
24
WT M 21
1.8
0.54
0.54
Pasaje 5
Pasaje 9
22
23 24

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Marisa Farber, PhD

Tristeza bovina (Bovine Tick-Borne Diseases)

Ticks & TBD free area

Las prdidas econmicas directas por reduccin de peso o mortalidad, y los

Babesiosis: Babesia bovis,

Anaplasmosis: Anaplasma marginale

RELEVANCIA SOCIAL, ECONOMICA Y

Demanda de alimentos en el mundo

Devaluacin del peso en el 2001, la suba del tipo de cambio real,

(**) miles de toneladas res con hueso

Distribucin de la produccin ganadera en

Produccin de antgenos recombinantes para

Bsqueda de nuevos antgenos

Produccin de antgenos recombinantes para

Bsqueda de nuevos antgenos

La tcnica de Reverse Line Hybridization (RLB) puede ser

Se ha desarrollado este mtodo para parsitos

Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

Deteccin de polimorfismo en la sonda especfica

Currenly used probe

Pathogenic B. bigemina from Chavarria,

Possible options for BgM2P sequences

Attenuated B. Bigemina from Alen-Cue,

Pathogenic B. bigemina from Alen-Cue,

B. bigemina from Brasil

Secuencias para membrana

Reverse Line Blot Hybridization para la deteccin

Deteccin de B. bigemina por PCR:

Inmunosensor ptico basado en MSP5 para el

Distribucin de Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (F.A.U) de 12 sueros

Anaplasma spp uninfected cattle

Valor de corte: 40 F.A.U

Comportamiento del inmunosensor en muestras de campo: concordancia con el

Concordancia entre las dos

Produccin de antgenos recombinantes para

Bsqueda de nuevos antgenos

Muestreo NEA y NOA

Diseo del muestreo: Establecer zonas de riesgo en funcin del nmero

Hiptesis de trabajo: Definir marcadores moleculares que permitan

PCR amplification of the repeat region from

MLST (Multilocus Sequence Typing): seleccin de los genes blanco

La proporcin de animales co-infectados con A. marginale y Babesia sp result

Produccin de antgenos recombinantes para

Bsqueda de nuevos antgenos

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

Seleccin de antgenos candidatos

Familia de antgenos superficie

OMP Cluster conservado

Los genes que codifican protenas

Actividad de PhoA de acuerdo con la localizacin subcelular

PhoA enzimticamente inactiva

Bsqueda de protenas exportables

Clonado y expresin de fusiones a

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

Seleccin de antgenos candidatos

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

Confirm la expresin de los

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin

Ensayos con animales naturalmente

Expresin de protenas recombinantes

Inmunogenicidad de protenas de membrana o exportacin