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LABORATORIO DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD

CATLICA DE LA SANTSIMA CONCEPCIN

DETERMINACION DE LA CARGA VIRAL DE VIRUS DE HEPATITIS B


MEDIANTE COBAS Taqman HBV Test

La prueba COBAS Taqman HBV Test (P/N: 03500756 190, ROCHE MOLECULAR DIAGNOSTIC) es
una prueba de diagnstico in Vitro (IVD) para la determinacin cuantitativa del ADN del virus de la
Hepatitis (HBV) en la matriz de plasma o suero humano.
El sistema High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001, ROCHE MOLECULAR
DIAGNOSTIC), permite la preparacin manual de las muestras en gabinetes especialmente
acondicionados para la manipulacin de cidos nucleicos, y su posterior amplificacin y deteccin
en el analizador COBAS Taqman 48.
El virus de la hepatitis B (HBV) es uno de los virus causantes de la hepatitis vrica. El indicador ms
comn de la infeccin por HBV es la presencia del antgeno de superficie (HBsAg) del HBV. Aunque
los portadores pueden eliminar el HBsAg y desarrollar anticuerpos contra l, parece que todava
existe el riesgo de complicaciones hepticas graves en aos posteriores.
Se ha descubierto que la capacidad para detectar el ADN del HBV es suero tiene un valor
pronstico para el resultado de infecciones de HBV agudas y crnicas. La metodologa permite
detectar el ADN del HBV despus de eliminar el HBsAg o detectar el HBV sin la presencia de
indicadores serolgicos.
La eficacia de la terapia antivrica utilizada para tratar pacientes con HBV puede evaluarse
mediante indicadores sexolgicos o la medicin de la funcin de las enzimas hepticas, sin
embargo, la medicin ms directa y fiable de la replicacin vrica es la cuantificacin del HBV en
pacientes que reciben tratamiento. Del mismo modo, el seguimiento de los niveles de ADN del
HBV permite predecir el desarrollo de la resistencia a algunos antivirales.
La deteccin del HBV se realiza mediante sondas marcadas con colorantes fluorescentes que
permiten la cuantificacin del producto amplificado de la muestra con HBV (amplicn) y del ADN
patrn de terminacin cuantitativa del HBV que se procesa, amplifica y detecta simultneamente.
Este patrn es una plsmido linealizado no infeccioso que contiene regiones de unin a los
partidores idnticas a las del objetivo del ADN del HBV, y una regin exclusiva de unin a la sonda
que permite distinguir el amplicn del patrn de determinacin cuantitativa del HBV del amplicn
del objetivo. El patrn es aadido a cada una de las muestras y controles en un nmero de copias
conocido y es procesado en conjunto. El analizador COBAS Taqman 48 calcula la concentracin
del ADN del HBV comparando la seal con el plsmido patrn compensando los efectos de
inhibicin y controlando los procesos de preparacin y amplificaron para permitir la cuantificacin
exacta del ADN del HBV en cada una de las muestras.
Una vez completadas y superadas todas las comprobaciones, se utilizan constantes de calibracin
especficas del lote incluidas en la prueba COBAS Taqman HBV para calcular el ttulo de las
muestras y controles. La prueba COBAS Taqman HBV ha sido estandarizada utilizando la Norma

Internacional de la OMS para el HBV para pruebas NAT 97/746 y los resultados de la concentracin
se expresan en unidades internacionales (UI/mL).

Lmite de deteccin
Los estudios indican que la prueba COBAS Taqman HBV puede detectar ADN del HBV en plasma
con EDTA y suero en concentraciones tan bajas como 6.0 UI/mL con un ndice de positividad
superior al 95% hasta 110.000.000 UI/mL (35 640.000.000 copias/mL)
El factor de conversin entre copias/mL de HBV y unidades internacionales UI/mL es 5.82
copias/UI, utilizando el estndar internacional de la OMS para el HBV en pruebas NAT 97/746.

Reactivos incluidos en el Kit COBAS Taqman HBV Test


HBV QS
Patrn
determinacin
cuantitativa del
COBAS Taqman

de

HBV

HBV H(+)C
Control (+) alto del HBV

HBV L(+)C
Control (+) bajo del HBV

CTM (-) C
Control
negativo
Taqman
humano)

humano
COBAS
(plasma
-

Tampn fosfato de sodio


EDTA
< 0.001% de ADN plsmido bicatenario, linealizado que
contiene un inserto. El inserto de ADN contiene secuencias
de unin al indicador del HBV y una regin de unin
exclusiva a la sonda.
Marcador de amaranto
< 0.005% ARN Poli rA (sinttico)
0.05% de azida sdica
< 0.001% de ADN plsmido bicatenario, linealizado que
contiene secuencias del HBV
Plasma humano negativo, no reactivo segn pruebas
aprobadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos a HCV,
anticuerpos a HIV-1/2, antgeno p24 y antgeno HBsAg. El
ARN del HIV-1/, ARN del HCV y ADN del HBV no pueden
detectarse mediante mtodos de la PCR.
0.1% de conservante Proclin 300
< 0.001% de ADN plsmido bicatenario, linealizado que
contiene secuencias del HBV
Plasma humano negativo, no reactivo segn pruebas
aprobadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos a HCV,
anticuerpos a HIV-1/2, antgeno p24 y antgeno HBsAg. El
ARN del HIV-1/, ARN del HCV y ADN del HBV no pueden
detectarse mediante mtodos de la PCR.
0.1% de conservante Proclin 300
Plasma humano negativo, no reactivo segn pruebas
aprobadas por la FDA de EE.UU. para anticuerpos a HCV,
anticuerpos a HIV-1/2, antgeno p24 y antgeno HBsAg. El
ARN del HIV-1/, ARN del HCV y ADN del HBV no pueden
detectarse mediante mtodos de la PCR.
0.1% de conservante Proclin 300

Recoleccin de las muestras


La prueba COBAS Taqman HBV debe utilizarse nicamente con muestras de suero o plasma. La
sangre debe recogerse en tubos de separacin de suero o en tubos estriles con anticoagulante
EDTA (tapa de color lavanda).
La sangre entera debe conservarse a 2-25C no ms de 1 da. Siga las instrucciones del fabricante
de los tubos para separar el suero o el plasma de la sangre entera. Separe el suero o el plasma de
la sangre total mediante centrifugacin a 800-1600 x g durante 20 minutos a temperatura
ambiente. Transfiera el suero o el plasma a un tubo de polipropileno estril con tapa en
condiciones adecuadas.

Transporte de la muestra
El transporte de sangre entera, suero o plasma debe cumplir las reglamentaciones locales
regionales y nacionales para el transporte de agentes etiolgicos. La sangre entera debe
transportarse a una temperatura comprendida entre 2 y 25C y procesarse dentro del da de su
recogida. El plasma o suero pueden transportarse a una temperatura comprendida entre 2 y 8C o
congelarse a una temperatura entre -20C y -80C.

Almacenamiento de las muestras


Las muestra de suero o plasma pueden almacenarse a una temperatura comprendida entre 2 y
8C durante un periodo mximo de 7 das o congelarse a una temperatura de -20 a -80C. Se
recomienda almacenar las muestras en alcuotas de un volumen entre 800 y 900 uL en tubos de
polipropileno estriles de 2.0 mL con tapa rosca.

Control de Calidad
En cada serie analtica se deben incluir: una rplica de cada control negativo de COBAS Taqman,
el control bajo (+) del HBV de COBAS Taqman HBV y el control alto (+) del HBV de COBAS
Taqman HBV.
Control negativo
El control CTM (-) C debe arrojar una resultado Target not detected, es decir, el valor de
amplificacin para el ADN del HBV estuvo por encima del lmite del ensayo o no se obtuvo ningn
valor para el ADN del HBV, aunque se obtuvo un valor vlido para el ADN del patrn de
determinacin cuantitativa del HBV. Si CTM (-) C no cumple con estos criterios, se debe repetir
todo el proceso (preparacin de la muestra y controles, amplificacin y deteccin).
Controles positivos
Los intervalos asignados para los controles HBV L(+)C y HBV H(+)C, se indican en la tarjeta de
valores del ensayo de la prueba COBAS Taqman HBV que se suministra con cada kit. Si uno o los
dos controles no renen estos criterios, se debe repetir todo el proceso (preparacin de la
muestra y controles, amplificacin y deteccin).

Sustancias interferentes
Los niveles elevados de lpidos, bilirrubina, albmina y hemoglobina en las muestras NO
INTERFIEREN en la cuantificacin del ADN del HBV en esta prueba.
Anlogos nucletidos inhibidores de la ADN Anlogos nuclesidos inhibidores de
polimerasa
transcriptasa reversa y la ADN polimerasa
Adefovir dipivoxil
Tenofovir disoproxil fumarato

Inhibidor de la proteasa del HIV


Indinavir
Ritonavir
Nelfinavir
Saquinavir
Amprenavir
Lopinavir/Ritonavir
Moduladores del sistema inmunolgico
Interfern alfa-2b
Interfern alfa-2a
Compuestos de tratamiento para CMV

la

Lamivudina
Zidovudina
Zalcitabina
Estavudina
Abacavir
Anlogos no nuclesidos inhibidores de la
transcriptasa reversa del HIV
Nevirapina
Efavirenz

Inhibidor de fusin del HIV


Enfuvirtide

Ganciclovir
Hidrocloruro de valganciclovir
Aciclovir
Hidrocloruro de valaciclovir

Especificidad analtica
La especificidad analtica de la pruebas COBAS Taqman HBV se evalu aadiendo virus
cultivado en plasma con EDTA humano sin HBV o analizando muestras de pacientes infectados.
Ninguno de los virus ARN o ADN diferentes del HBV analizados obtuvo resultados positivos para la
presencia de ADN del HBV.
Virus aadidos al plasma
Adenovirus tipo 7
Herpes simple tipo 2, MS
Citomegalovirus AD-169
Clulas HTLV-1
Virus Epstein-Barr (clulas con linfoma de RAJI Virus A de la gripe A/Hong Kong/8/68
Burkitt)
Virus de la Hepatitis A PA 21
Virus A de la gripe B/R75
Herpes simple tipo 1, MacIntyre
Varicela-Zoster Ellen
Virus del Nilo Occidental

Informes de exmenes
Las determinaciones de la cuantificacin del ADN del virus HBV sern informadas en un plazo
mximo de 15 das hbiles.
Se sugiere indicar en la solicitud de examen la hora de toma de muestra.
Para sus consultas dirigirse a:
Laboratorio de Diagnstico Molecular (L.D.M.)
Faculta de Medicina
Universidad Catlica de la SSMA. Concepcin
Alonso de Ribera #2850
Fono/FAX: (56) 41-234 5435
Email: ldm@ucsc.cl
BQ. Marcelo Bustamante Carrasco. PhD (Director de Laboratorio)
BQ. Hctor Contreras Moraga. M.Sc
Secretaria: Carolina Morales Seplveda.

Concepcin, XX de XXXXXXXXXXX de 20XX


INF: XXX/20XX

INFORME DIAGNSTICO MOLECULAR

PACIENTE

PROCEDENCIA

TIPO DE MUESTRA

FECHA MUESTRA

EXAMEN

Carga Viral del Virus de la Hepatitis B

MTODO

Cuantificacin del ADN circulante del Virus de la Hepatitis B


(HBV) mediante PCR en tiempo real (COBAS Taqman HBV
Test, Roche Diagnostics).
Rangos de cuantificacin entre 35 y 640.000.000 copias/mL
(6-110.000.000 UI/mL)

RESULTADO

Se detecta ADN circulante del HBV:


1) bajo los rangos de cuantificacin del ensayo
2) Copias de DNA/mL: ; Log: .
UI/mL
: ; Log: ..

_____________________________
Dr. Marcelo Bustamante C. PhD.
Bioqumico
Director Laboratorio de Diagnstico Molecular

_____________________________
Hctor Contreras M. M.Sc.
Bioqumico
Ejecutor de la Tcnica