TECNICAS DE IDENTIFICACION PARA

HONGOS Y LEVADURAS
Principales mtodos de identificacin de hongos filamentosos
La identificacin de los hongos filamentosos se basa en el examen macroscpico de la
colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas macroscpicas como la forma
de la colonia, el color de la superficie, la textura y la produccin de pigmentos son muy
tiles para la identificacin.
En general, la morfologa microscpica de los hongos es estable y presenta pocas
variaciones. La identificacin definitiva se basa en la forma caracterstica, mtodo de
produccin y ordenamiento de las esporas, siendo tambin importante conocer el tamao
y la disposicin de las hifas.
La preparacin del material para la observacin microscpica puede realizarse en fresco,
con cinta de celofn adhesiva o mediante cultivo sobre portaobjetos.

Preparacin en fresco
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin:

1.

Seleccionar una colonia aislada.

2.

Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar de forma que se

convierta en un objeto cortante.

3.

Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular de la colonia que contenga
adems un poco de agar en la parte inferior.

4.

Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se

ha depositado una gota de azul de lactofenol.

5.

Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia y el

agar; de esta forma, la muestra est disponible para su observacin al
microscopio.

Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios, ya que las muestras
se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas de las especies
de hongos ms habituales. El mayor inconveniente de la observacin en fresco es que se
puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al presionar con el
cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es vlido en los casos en que es
necesario conocer la disposicin de las esporas.

Fig. 1: Preparacin en fresco

Preparacin con cinta de celofn adhesiva

El procedimiento se lleva a cabo como sigue :

1.

Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la

superficie de una colonia.

2.

Colocar la cinta bien extendida sobre

una gota de azul de lactofenol o azul
de anilina colocada, a su vez, sobre
un portaobjetos.

3.

Observar al microscopio para

conocer la forma y ordenamiento
caracterstico de las esporas.

Este mtodo puede considerarse como el

ms simple, econmico y adecuado para la
identificacin de hongos, recomendable
para los laboratorios microbiolgicos de cualquier nivel.
La preparacin de la cinta transparente permite observar al microscopio como se
desarrolla el microorganismo en el cultivo. Generalmente las esporas se mantienen
intactas y la identificacin se realiza con facilidad.
Una de las desventajas de este mtodo es que si la
cinta transparente no se presiona con suficiente
firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no
es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la
cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar.
En los casos en que mediante este mtodo no se
observen esporas deber realizarse la preparacin en
fresco.

Fig. 2: Preparacin con cinta de celofn adhesiva

Cultivo sobre portaobjetos

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin:

1.

Cortar un bloque pequeo de un medio slido adecuado (agar), que ha sido

vertido en una cpsula de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede
cortarse con la ayuda de un bistur estril o con un tubo de ensayo estril sin
reborde (lo que permite obtener un taco redondo).

2.

Colocar un portaobjetos estril sobre una capa de agar al 2% contenida en una

cpsula de Petri.

3.

Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.

4.

Con una asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ngulo recto, inocular
los cuatro cuadrantes del taco con el microorganismo a identificar.

5.

Colocar un cubreobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar.

6.

Tapar la cpsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o C.

7.

Finalizado el perodo de incubacin, retirar el cubreobjetos (este proceso debe

realizarse en una cabina de seguridad biolgica), y colocarlo en un portaobjetos
que contenga azul de lactofenol o azul de anilina.

8.

La observacin al microscopio permite distinguir la forma y disposicin de las

esporas.

9.

Si con este proceso no ha sido posible la identificacin, el resto del cultivo puede
ser usado ms adelante si se contina incubando. Entonces se retira el bloque de
agar y se agrega una gota de azul de lactofenol o azul de anilina sobre la zona del
cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es recomendable realizar dos
cultivos sobre el mismo portaobjetos de modo que si en uno no se pueden
observar las caractersticas microscpicas puede disponerse del segundo despus
de un perodo adicional de incubacin.

Este mtodo permite la observacin microscpica del hongo mientras se desarrolla

directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las caractersticas microscpicas se
distinguen con facilidad, las estructuras se mantienen intactas y puede observarse un
gran nmero de reas representativas.

No deben realizarse cultivos en portaobjetos de hongos de crecimiento lento que pueden

ser patgenos dimorfos, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces derma titidis,
Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasilien sis o Sporothrix schenckii.

Fig. 3: Cultivo sobre portaobjetos

Principales mtodos de identificacin de levaduras

Se requiere una combinacin de pruebas bioqumicas y
morfolgicas para identificar las levaduras. En las caractersticas morfolgicas debe
incluirse el color de las colonias, la medida y la forma de las clulas, la presencia de
cpsula, la produccin de hifas o pseudohifas, y la produccin de clamidiosporas. Las
pruebas bioqumicas incluyen la asimilacin y fermentacin de azcares y la asimilacin
de nitrato.
Muchas levaduras asociadas con infecciones humanas pueden ser identificadas usando
alguno de los test comerciales que existen basados en la asimilacin de azcares. No
obstante, es importante recordar que el examen morfolgico es esencial para evitar
confusin entre microorganismos con perfiles bioqumicos idnticos. En consecuencia,
hay un nmero de pruebas simples para la identificacin presuntiva de algunas de las
levaduras ms importantes. stas incluyen la prueba del tubo germinativo para la
identificacin rpida de Candida albicans y la prueba de la ureasa para Cryptoccus neo
formans, que se describen ms adelante.
Si la prueba del tubo germinativo es positiva, el organismo es Candida albicans. Si se
observa una cpsula puede hacer pensar que el organismo es Cryptoccus neo formans.

La prueba de la ureasa es til para la identificacin de este organismo, pero debe

complementarse con otras pruebas adicionales. Si no se produce germinacin en el tubo
y no se observa la presencia de cpsula, deben efectuarse otras pruebas bioqumicas y
morfolgicas.
Actualmente existen en el mercado sistemas estandarizados de identificacin (kits) para
conocer el perfil bioqumico de las levaduras. Estos kits permiten una identificacin ms
rpida de las levaduras aisladas que los mtodos clsicos de asimilacin y fermentacin.
La ventaja ms importante es que estos sistemas proporcionan una identificacin que
surge de una base de datos sobre miles de biotipos de levaduras, que incluyen diversas
variaciones y patrones de utilizacin de substratos.
Prueba del tubo germinativo
Se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento:

1.

Suspender un inculo muy pequeo de clulas de la levadura obtenidas a partir de

una colonia aislada en 0,5 ml de suero de oveja (o de suero humano, procedente
de un individuo sano).

2.

Incubar los tubos a 35-37o C, no superando las 3 horas.

3.

Despus de la incubacin, tomar una gota de la suspensin y colocarla sobre un

portaobjetos. Observar con el microscopio a poco aumento la presencia de tubos
germinativos. Un tubo germinativo se define como un apndice con la mitad de
ancho y 3 a 4 veces el largo de la clula de la cual emerge. En la mayor parte de
los casos no existe constriccin en el origen del tubo germinativo.

Produccin de cpsula
El procedimiento se desarrolla del siguiente modo:

1.

Tomar una pequea cantidad del inculo suspendindola en una gota de una
solucin acuosa de tinta India al 50% en un portaobjetos.

2.

Observar al microscopio la presencia de la cpsula, que se distingue como un halo

claro alrededor de las clulas.

Prueba selectiva rpida para ureasa

Se realiza segn el siguiente procedimiento:

1.

Pasar un hisopo de algodn impregnado con un substrato con urea deshidratado

sobre la superficie de dos o tres colonias, de modo que la punta se cubra con el
microorganismo.

2.

Colocar el hisopo con la levadura dentro de un tubo que contenga 3 gotas de

cloruro de benzalconio al 1% (pH 4,86 0,01) y rotar con firmeza contra el fondo
para poner en contacto los microorganismos con las fibras de algodn.

3.

Tapar el tubo e incubar a 45oC durante 30 minutos.

4.

Examinar a los 10, 15, 20 y 30 minutos para detectar un cambio de color de

amarillo a prpura. Un color rojo a prpura indica produccin de ureasa.

Medidas de prevencin
Todos los trabajos realizados para la identificacin o el cultivo de los hongos deben
efectuarse en las condiciones adecuadas para no contaminar ni el laboratorio donde se
realizan los anlisis ni al personal que los manipula.
Todos los cultivos de hongos filamentosos han de ser manipulados en el interior de una
cabina de seguridad biolgica clase II, sin excepciones. Es permisible el manejo de los
cultivos de levaduras en la mesa del laboratorio pero deben ser tratados como material
infeccioso. Siempre que sea posible, se utilizarn asas de siembra de un solo uso y
cuando esto no sea posible se recurrir a la utilizacin de un incinerador o la llama de un
mechero para la descontaminacin del asa. Los cultivos de hongos deben ser sellados
con cinta adhesiva para evitar la contaminacin del laboratorio y deben ser esterilizados
en el autoclave o bien eliminarlos en los recipientes adecuados para residuos sanitarios
grupo III o de riesgo.
Si los hongos se manipulan tomando las precauciones habituales de seguridad y
observando con cuidado unas buenas prcticas de laboratorio cabe esperar muy pocos
problemas relacionados con la contaminacin del laboratorio o del personal

IDENTIFICACIN DE HONGOS MICELIALES

La identificacin se hace en base a su morfologa, que puede ser macroscpica y microscpica y
que vara en funcin del medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubacin.
La velocidad de crecimiento vara segn el hongo:

Hongos miceliales:
No dermatfilos ! crecen rpido 3-5 das
Dermatfilos ! 1-3 semanas

CARACTERSTICAS MACROSCPICAS

Textura de la colonia (mirar fotocopia 1):

o

Algodonosa:

micelio denso y largo

Glabra: consistencia crea. No micelio areo

Aterciopelada: micelio areo corto

Pulverulenta: gran cantidad de esporas y conidias

Coloracin

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
TCNICA CON PAPEL DE CELO CON AZUL
Cogemos un trozo de celo tocamos suavemente la parte superior del hongo del que
queremos observar sus caractersticas microscpicas y lo colocamos sobre un porta al que
anteriormente habamos aadido una gota de colorante azul algodn de lactofenol.
Observamos al microscopio con el objetivo de 40x o 100x.
CULTIVO O MICROCULTIVO EN PORTA
No se alteran las estructuras fngicas. Se utiliza un medio Saboraud que se vierte sobre una
placa de petri (capa delgada). Una vez solidificado cortamos cuadrados con un bistur estril
de 1-3 cm y los colocamos en un porta estril o flameado. El porta estar colocado en una
placa de petri estril, sobre un soporte. En el fondo de la placa aadiremos unas gotas de
agua para evitar la desecacin durante la incubacin.
Inoculamos o bien las esquinas, o bien los bordes del agar con el hongo a estudiar. Tomamos la
muestra con un asa estril humedecida con agua. Sellamos las placas con parafilm y llevamos a
incubar.

EXAMEN DE FRAGMENTOS DE COLONIAS AL MICROSCOPIO

Mediante esta tcnica se rompen los conidios y las esporas. Consiste en cortar con el asa un
fragmento de la colonia en el borde (asa en forma de cua) y depositarlo sobre un porta con una gota
de azul de lactofenol. Si se ha incluido agar, calentar suavemente para fundirlo y aplastar el cubre.

TCNICA PARA CONFIRMAR EL DIMORFISMO

Consiste en incubar la misma muestra a 25C, temperatura a la que crecen los hongos miceliales, y a
37C temperatura a la que crecen las levaduras (tejidos o medios especiales).
Las especies ms importantes dimrficas son: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis,
Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes imitis. Penicillium marneffei, Slorothrix schenckii.
Para la confirmacin es necesario convertir la fase filamentosa en levaduriforme. Para ello
incubamos parte de la colonia micelial en una placa de Agar Sangre (3-4 fragmentos). Sellamos e
incubamos a 37C. Examinamos peridicamente el crecimiento buscando levaduras. Si crece colonia
micelial repetimos la siembra hasta conseguir fase levaduriforme.

MEDIOS DIFERENCIALES

Resistencia a Cicloheximida Actidiona:

o

Dermatofitos y hongos dimrficos ! resistentes a 30C

Zigomicetos, algunas levaduras, mayora de agentes micetomas! inhibidos

Agar Maz (patata, arroz): permite la esporulacin de hongos

Desdoblamiento de urea: permite identificar especies de Trichophyton

incubando a 25C / 7 das.

IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
Test de filamentacin
Preparamos una suspensin de levaduras en 0.5-1 mL de suero de conejo e incubamos a 35-37C
no ms de 3 horas.
Transcurrido el tiempo observamos al microscopio la presencia o ausencia de tubos germinales, es
decir, de filamentos que no constrien su punto de origen en la levadura.
El test ser POSITIVO si se observan los tubos germinales (C. albicans)
El test ser NEGATIVO cuando no encontremos los tubos germinales ((otras especies de Cndida).

Medio diferenciador para levaduras

Posee cromgenos que colorean las colonias segn la especie. En el caso de la Cndida albicans,
las colonias son de color azul.

Asimilacin de azcares (API)

Tcnicas inmunolgicas y moleculares
Se utilizan para el estudio de hongos que producen micosis invasivas. Detectan Ag del Criptococo
(hongo que produce una cpsula con el Ag en su interior) en LCR o suero del paciente