Unidad Educativa Hontanar

Ao Lectivo 2015 - 2016

Laboratorio de Biologa N # 3
Nombre: Ana Paula Flores, Mara Paz Aguinaga, Andrea Germn, Antonio Robalino y Daniela Mancheno.
Curso: Segundo Bachillerato A
Fecha de prctica: 29/10/15
Fecha de entrega: 12/11/15
Grupo # 4
TEMA: Tincin de Gram

1.
2.
3.

OBJETIVOS:
Utilizar adecuadamente las tcnicas bsicas de identificacin de microorganismos.
Determinar los pasos para realizar la tincin de Gram
Usar adecuadamente los colorantes

FUNDAMENTO TERICO: Investiga y explica

1. Qu es una tincin diferenciada? Dos ejemplos.
O coloracin Diferencial son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera ms explcita los
microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales (combinacin de colorantes,
mordentes y decolorantes), que se componen de ms de una sustancia tintrea. Las tinciones diferenciales
ms importantes que se emplean en bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-resistente, tambin est
la Tincin de Ziehl-Neelsen. Estas se utilizan para obtener informacin acerca de la composicin de las
capas de la pared celular de las clulas bacterianas. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que
aun cuando tengan igual morfologa, presenten diferencias en su composicin qumica. Pone de manifiesto
diferencias entre clulas bacterianas o entre partes de una misma clula.
2. En qu consiste el proceso de fijacin de una placa? Cmo se fija una muestra utilizando metanol?
Fijacin es toda manipulacin sobre un ser vivo, o bien sobre parte de l, que tiene por objeto mantener toda
su arquitectura tanto estructural como qumica lo ms inalterada posible, de tal forma que sus componentes
celulares mantengan las mismas caractersticas que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. Por otra parte,
un fijador prepara tambin de alguna forma el tejido o la clula para la posterior manipulacin, bien en el
proceso de inclusin, actuando como mordiente o como fijador del colorante dependiendo de su naturaleza.
Mecanismo que consiste en matar a la clula lo ms rpidamente posible para permitir que se mantengan las
propiedades fisiolgicas y morfolgicas del organismo vivo. Los fijadores solidifican el coloide
protoplasmtico mediante coagulacin o precipitacin, convirtindolo en un gel insoluble. La fijacin evita
que el tejido se pudra u se desintegre, produciendo puentes entre protenas y diferentes materiales de los
tejidos.
Una forma de fijar la muestra es con calor, el cual fijar las bacterias al portaobjetos de forma que no se
enjuaguen tan fcilmente durante la tincin, se debe pasar por el portaobjetos dos o tres veces por la llama
de un mechero Bunsen.
Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la mancha seca,
drenando el exceso de metanol y dejando que se seque con el aire. Este mtodo minimiza el dao a las
clulas husped, dndoles un fondo ms limpio.
La muestra que va a ser fijada no debe tener menos de tres milmetros de espesor, porque, de lo contrario, el
fijador, que penetra por difusin, no actuaria por igual en todas las clulas de la muestra. Adems, el lquido
fijador debe exceder en 50:1 al de la muestra. Hay que tener en cuenta que los lquidos fijadores son

voltiles. Existe un tiempo adecuado de fijacin, que no debe excederse, una vez concluido, se lava la
muestra para quitar el exceso de fijador. Adems de mantener las propiedades del objeto de estudio, los
fijadores, dependiendo de los casos, pueden servir para endurecerlos o ablandarlos, o aumentar su afinidad
tintorial.
Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores fsicos y fijadores qumicos.
Fijadores fsicos.El calor: Es el ms antiguo y ms utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiologa, como en el frotis de
clulas animales, la fijacin se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulacin rpida de las protenas
y por tanto su estabilizacin.
El fro: congelacin, fija pero sobre todo es un agente conservador.
La criodesecacin (liofilizacin): Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50C y eliminar el agua a
una presin baja.
Fijadores qumicos.La fijacin se hace en recipientes con la muestra y el fijador poniendo cantidades muy superiores de fijador
frente al volumen de la muestra y se deja un tiempo de infiltracin. Este proceso debe realizarse lo ms
pronto que se pueda despus de la recoleccin de material.
Metanol: La fijacin con solventes orgnicos permeabiliza las membranas por lo que en este caso no ser
necesario un paso de permeabilizacin posterior.
3. Qu es un mordiente en una tincin?
Los Mordientes, como el Lugol, son sustancias que aumentan la afinidad de la clula por el colorante.
Suelen aadirse despus del colorante en determinadas tinciones diferenciales. Aunque no son colorantes,
tienen gran importancia en algunas tcnicas de tincin. Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no
podran ser visualizados de otra forma. Son los reactivos o sustancias que preparan al tejido para la
coloracin, comunicndole las apetencias colorantes.
4. Por qu la edad de cultivo puede influir en la tincin Gram?
La tincin de Gram influye en los cultivos viejos, que estn muertos o tengan problemas en la pared celular.
Cuando est ms compleja se vuelve ms permeable a lo que entran tintes y reacciona el Gram negativo,
pero uno falso. Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de retener el complejo
cristal violeta - yodo.
La reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden
perder capas de peptidoglicanos y teirse como gram negativos) y la tcnica empleada (al decolorar por un
tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram
negativas). Al hacerte est ms vieja se vuelve ms permeable a la entrada de tintes y reacciona como Gram
negativo. Es decir obtienes un falso Gram negativo.
5. Explica que hace (funcin desempeada) cada reactivo en la tincin Gram
I.
Cristal violeta: colorante bsico catinico que penetra en todas las clulas bacterianas, tanto Gram
positivas como Gram negativas, a travs de la pared bacteriana. En una solucin acuosa, el cristal violeta
(CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-). Estos iones penetran a travs de la pared celular y la
membrana celular de ambas clulas. El ion CV+ interacta con los componentes con carga negativa de
las clulas bacterianas para mancharlas de violeta. Tie a clulas de morado.

II.

Lugol: es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio),
los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta
se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un
complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. El yodo, en la forma de iones con carga
negativa, interacta con los iones CV+ para formar grandes compuestos de cristal violeta y yodo dentro
de las capas interiores y exteriores de la clula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la clula, en el
lugar en el que la haya teido. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante
primario con la clula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve
para intensificar el color del tenido.
Alcohol-acetona: sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal
violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin:vdeshidratante de
protenas y solvente de lpidos.

III.

Safranina:
Para
poner
de
manifiesto
las
clulas
Gram
negativas
se
utiliza
una coloracin de contraste. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial
para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste
adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiendo las bacterias decoloradas (Gram
negativas) de rosado o rojo.
Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si
no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
MATERIALES Y REACTIVOS
1. Palillos
7. Cristal violeta.
2. Portaobjetos
8. Lugol
3. Goteros
9. Alcohol acetona.
4. Frasco lavador.
10. Safranina
5. Microscopio
11. Aceite de inmersin.
6. Lmpara de alcohol.
PROCEDIMIENTO:
1. Primero realizamos un raspado de nuestra mejilla con un palillo, colocamos el portaobjetos haciendo
un crculo central con la nuestra.
2. Despus proseguimos a fijar la muestra al calor utilizando la lmpara de alcohol, pasamos por la
flama 3 veces y el portaobjetos.
3. Agregamos gotas de cristal violeta hasta cubrir la muestra y dejar que actu el colorante por 1 min.
4. Lavamos nuestra muestra con el frasco lavador.
5. Agregamos gotas de Lugol hasta cubrir la muestra y dejamos que actu por 1 min.
6. Lavamos la muestra de nuevo.
7. Agregamos gotas de alcohol acetona y dejamos que actu por 20 segundos.
8. Agregamos gotas de Safranina por 1 min.
9. Volvemos a lavar nuestro portaobjetos.
10. Secamos con cuidado y procedemos a observar con el microscopio poniendo previamente el aceite
de inmersin
11. Podemos observar la diferencia de bacilos, cocos, racimos.
RESULTADOS:
Reaccin y coloracin de las bacterias
Paso del proceso
Solucin de cristal
Violeta
Se deja actuar 1 minuto

GRAM positivas

GRAM negativas

Clulas color violeta

Clulas color violeta

Solucin Lugol
Se deja actuar 1 a 2 minutos

Formacin del complejo

yodo- cristal violeta en el
interior de las clulas. Las
clulas
permanecen
violetas.
Solucin de alcohol acetona
El complejo yodo
Se deja actuar 20 segundos
cristal violeta no sale de
las clulas, las que
conservan
el
color
violeta.
Solucin de safranina
Las clulas conservan el
Se deja actuar 1 a 2 minutos
color violeta.
Lavar, secar y observar al microscopio.

Formacin del complejo

yodo- cristal violeta en el
interior de las clulas.
Las clulas permanecen
violetas.
El complejo yodo
cristal violeta no sale de
las clulas, las que
pierden el color y no
pueden observarse.
Las clulas decoloradas
se tien de rojo

Al realizar la prueba se pudo ver que existe en la saliva de Andrea German clulas Gram positivas ya
que se observ que la muestra se tio de morado, la saliva tiene bacterias.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de
las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea. Por esto las clulas se tien con safranina y las observamos rojas. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando
los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloracin azul-violeta.
Las gram positivas retienen la tincin azul y conservan el complejo yodocolorante. Las gram negativas
quedan decoloradas y pierden el complejo yodocolorante y pueden ser anaerbicos y aerobicos.
Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido
a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad
celular), dando como resultado la prdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas
captan entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas bacterias se observan de color rojo al
microscopio.
El alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared
ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms
fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el
tinte en su interior.
Safranina. Se utiliza para teir de rojo las clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
La tincin bacteriana tiene dos propsitos fundamentales:
a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
b) Con base en la identificacin, indicar el tratamiento correcto (los antibiticos no funcionan por igual
para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
La tincin de GRAM aporta: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas
bacterianas.
Realizar esta prctica nos permiti ver las formas bsicas en que se puede visualizar la
morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares.
Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces
de gran tamao

Divisin a lo largo del mismo plano,

Divisin a lo Divisin a lo largo de 3 planos
formando cadenas cortas
forma
largo
de
2
esfrica:
planos
se llama 2
cocos
4 - 20 en cadenas: diferentes:
regularmente:
irregularmente:
Coco
juntos:
Ttradas
Estreptococos
Sarcinas
Estafilococos
Diplococos
Bacilos: Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Dos bacilos juntos: Cadenas de bacilos: Empalizadas, Bacilos lado con
Bacilos
Diplobacilos
Estreptobacilos
lado o en figuras en X, V o Y
Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos: observados en el microscopio:
Racimos

Cadenas:
forma
tpica
de Streptococcus
Tetradas:

Bacilos Gram-positivos
Gruesos:

Ramificados:

Finos

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que
otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas en el paso de
decoloracin, est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe al hecho de que
en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la clula. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus
paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al
disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son
incoloras.
CONCLUSIONES:
Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se realiza con cuidado se corre el
riesgo de no obtener ningn resultado.
En conclusin en este laboratorio se pudo observar la funcin de diferentes reactivos utilizados en
laboratorio, ampliando nuestro conocimiento. Cada reactivo tiene un papel fundamental: el cristal
violeta (colorante bsico), lugol (mordiente), alcohol cetona (decolorante) y safranina (colorante de
contraste) los cuales nos permitirn ver si las clulas son Gram positivas o negativas.
Los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente importante para el
diagnstico y buen tratamiento de la patologa relacionada microorganismos es necesario saber cmo
influyen en las manifestaciones clnicas las diferencias existentes entre la pared celular de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas en su deteccin y en el tratamiento.
En conclusin pudimos notar la importancia de la tincin para la microbiologa debido a que: 1)
Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar
varios tipos morfolgicos. 2) Permite el estudio de las estructuras internas de la clula bacteriana.
Ambas son fundamentales para el desarrollo de la microbiologa y en si del ser humano.

 La tincin de Gram se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para
poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria
Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que
se visualizan de color rosa. Se utiliza principalmente en microbiologa para la visualizacin de
bacterias, sobre todo en muestras clnicas.
Realizando esta prueba se logr ver estructuras de las clulas como son bacilos, cocos y racimos, se
pudo comparar y contrastar estas.
Es fundamental para la realizacin de todo esto el dominio del microscopio para enfocar en 100x,
adems ser cuidadosos con el proceso de aplicacin de reactivos ya que si no se cumple con los
tiempos no lograremos una buena fijacin, adicionalmente se debe tener un previo conocimiento de
bacilos, cocos y racimos para lograr identificar en la muestra.
GRFICOS:

 Bibliografa
Karp G (2011). Biologa Celular y Molecular, Conceptos y Experimentos. 6a. Edicin. Editorial
McGraw-Hill interamericana
Editores, S.A de C.V., Mxico D.F., Mxico.
Lodish, H., Damell, J., Baltimore, D., Lawrence, Z.S., Berk, A., Matsudaria, P. (2006). Biologa Celular
y Molecular. Editorial Mdica Panamericana
Donnersberge, A. Lesack, Laboratorio de Anatoma y Fisiologa. Editorial Paidotribu
http://inter-micro-uvm.over-blog.es/article-33657401.html
http://tlaboratorio.blogspot.com/2009/10/coloracion-diferencial-o-tincion.html
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm
http://www.ecured.cu/index.php/Reactivos_mordientes
http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO-231-P-071/BIO231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm