UNIVERSIDAD DE CRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
PRACTICA N 3
CINTICA DE LA HIDRLISIS ENZIMTICA DE LA UREA
OBJETIVOS
1. Calcular la constante de Michaelis-Menton para la hidrlisis de la urea catalizada
por la ureasa.
2. Determinar la concentracin sustrato por encima de la cual comienza la inhibicin
irreversible de la ureasa.
3. Ilustrar el envenenamiento irreversible de la ureasa por iones plata mediante
medidas de conductividad.
TEORIA RELACIONADA
En la hidrlisis enzimtica de disoluciones acuosas de urea se produce dixido de carbono
y amoniaco. La presencia de estas especies genera un aumento de conductividad, lo cual
permite estudiar la cintica de hidrlisis de la urea mediante medidas de conductividad a
diferentes concentraciones de sustrato.
De acuerdo a Michelis-Menton, el mecanismo de la reaccin catalizada considera la
formacin de un intermedio enzima-sustrato ES, el cual es formado por la enzima E y el
sustrato S en una reaccin de equilibrio preintermedio y su posterior descomposicin en el
producto P, sin que sea alterada la enzima E. La velocidad de reaccin segn MichelisMenton para la formacin de producto de concentracin (C p) en el tiempo (t) se puede
expresar como:
V = dCp/dt = (K1K2CE0Cs)/(K1 + K2 + K1Cs)

(1)

Donde: KM = (K1 + K2)/K1 es la constante de Michelis-Menton.

CE0 = concentracin de la enzima libre + concentracin del complejo enzima-sustrato.
Cs es la concentracin del sustrato.
Diversos tratamientos han sido usados para la determinacin de la constante de MichelisMenton de una enzima. Lineweaver-burk expresa la ecuacin (1) de la forma:

1/V = 1/K2 + (KM/K2) .1/Cs

(2)

De acuerdo a la ecuacin (2) un grfico de 1/V contra 1/C s permite calcular K2 a partir de la
ordenada en el origen y KM/K2 como la pendiente de lnea recta, con la consecuente
determinacin de KM.
Mediante la adicin de un exceso de sustrato, la enzima puede ser inhibida, mientras que
por adicin de un inhibidor apropiado, la enzima puede ser envenenada, cesando
irreversiblemente la conversin del sustrato.
MATERIALES
9 matraces aforados de 100 mL
Matraz aforado de 10 mL
Vaso de precipitados de 50 mL
Vaso de precipitados de 100 mL
Agitador magntico
Conductmetro
Pipeta de 50 L
Soporte universal
Pinza para soporte
Esptula
Agua destilada
Ureasa al 0.2% en glicerina
Urea
PROCEDIMIENTO
1. Determinacin de la constante de Michelis-Menton.
Preparar 100 mL de soluciones de urea: 0.4%, 0.2 %, 0.1%, 0.05%, 0.025, 0.0125%.
Agregar 40 mL de la solucin de urea respectiva en un vaso de 100 mL, introducir la
pastilla magntica y comenzar la agitacin. Introducir el electrodo de conductividad y luego
agregar 50 L de solucin de ureasa, a partir de este momento realizar las lecturas de
conductividad a los 100 y 200 segundos. Proceder del mismo modo para cada una de las 6
soluciones; la diferencia entre los valores de conductividad a los 100 y 200 segundos
dividido entre 100 segundos, representa la velocidad de reaccin y tiene unidades de
S/cm.s. Grafique dCp/dt (S/cm.s) contra Cs(mmol/L), al igual que la representacin de
Lineweaver-burk (ecuacin 2). Cual es el valor de la constante de Michelis-Menton para la
ureasa?

2. Determinacin de la inhibicin de sustrato.

Preparar 100 mL de soluciones de urea: 1.6 %, 0.8%, 0.4%, 0.2 %, 0.1%, 0.05%, 0.025,
0.0125%.
Agregar 40 mL de la solucin de urea respectiva en un vaso de 100 mL, introducir la
pastilla magntica y comenzar la agitacin. Introducir el electrodo de conductividad y luego
agregar 50 L de solucin de ureasa, a partir de este momento realizar las lecturas de
conductividad a los 100 y 200 segundos. Proceder del mismo modo para cada una de las 8
soluciones. Grafique dCp/dt (S/cm.s) contra Cs(mmol/L), cual es la concentracin sustrato
por encima de la cual comienza la inhibicin irreversible de la ureasa?
3. Envenenamiento de la enzima.
Colocar inicialmente 40 ml de solucin de urea al 1.6 % en un vaso de 100 mL, introducir
la pastilla magntica y comenzar la agitacin. Introducir el electrodo de conductividad y
luego agregar 50 L de solucin de ureasa. Realizar las mediciones de conductividad cada
100 segundos. Despus de haber pasado 5 minutos, agregar 1 mL de solucin al 1% de
nitrato de plata, a partir de este momento, seguir realizando las mediciones cada 100
segundos hasta haber transcurrido 600 segundos. Grafique dCp/dt (S/cm.s) contra t.
analice el comportamiento del grfico.

Bibliografa
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2005.
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Plumer, David T. Editorial McGraw Hill. Bioqumica prctica. 1981.
Linder, Maria C. Nutritional Biochemistry and Metabolism. Segunda edicin. 1991
Anzola, Cecilia y Lpez, E. Guas de laboratorio de Bioqumica. Universidad Nacional
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