20/11/2015

Apiscinadeferrolbil:caracterizao,mensuraoeparticipaoemprocessoscelulares
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Angelica Kodama Bueno Lopes

Socorro

FreeRadicalBiologyandMedicine
Volume33,Issue8,15deOutubrode2002,Pages10371046

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Apiscinadeferrolbil:caracterizao,mensuraoe
participaoemprocessoscelulares1

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resumo
Palavras-chave
Abreviaes
Propriedades gerais do pool de ferro
Quantificao e localizao de LIP e
Lbio quando uma entidade regulad
A interao entre o LIP e produo
Outras propriedades de clulas afet
Concluses
Agradecimentos
Referncias

As figuras e tabelas

OuKakhlonum,Z.IoavCabantchik

,Uma,

Mostremais
doi:10.1016/S08915849(02)010067

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resumo
Ocelularpiscinaferrolbil(LIP)umapiscinadeferrochelatableeredoxativo,que
transitriaeservecomoumaencruzilhadadometabolismodoferrocelular.Vrias
tentativastmsidofeitasparaanalisarosnveisdeLIPseguintesrompimentocelular.A
identidadequmicadapiscinapermaneceupoucocaracterizadosdevidomultiplicidade
deligandosdeferropresentesnasclulas.Noentanto,osnveisdeLIPrecentemente
foramavaliadoscomnovastcnicasseminterrupesquedependemdaaplicaode
metalosensorsfluorescentes.Metodologicamente,umquelantefluorescentecarregado
emclulasvivasseligaacomponentesdoLIPesofreestequiomtricaextinoda
fluorescncia.Esteltimoreveladaequantificadainsituporadiodefortesagentes
quelantesdeferropermeando.Dependendodadistribuiointracelulardassondasde
detecoequelantes,LIPpodeserdiferencialmentemarcado,deestruturas
subcelulares,permitindoaavaliaodinmicadosseusnveisefunesem
compartimentoscelularesespecficos.AnaturezainstveldoLIPtambmfoirevelado
pelasuacapacidadedepromoveraformaodeespciesreativasdeoxignio(ROS),
querapartirdefontesredoxativoendgenoouexgeno.NveisdoLIPeROSforam
mostradasaseguirsimilar"ascensoequeda"padrescomoresultadodemudanas
naimportaodeferrocontraagentesquelantesdeferroouferritinadegradao(FT)
vs.sntesedeferritina.EssespadresestoemconformidadecomopapelaceitadaLIP
comoumapiscinadeautoregulaoquedetectadaporprotenasreguladorasdeferro
citoslica(IRPs)efeedbackreguladospelaexpressodependentedoIRPde
importaoearmazenamentodeferromquinas.Noentanto,tambmLIPpodeser
moduladapormecanismosbioqumicosquesubstituemaslaadasreguladorasPIAe,
dessemodo,contribuirparaasfunescelularesbsicas.Estaavaliaolidacom
novasmetodologiasparaavaliarLIPcelularecomestudosrecentesemqueas
mudanasnosnveisdeROSLIPedesempenharamumpapeldeterminanteem
processoscelulares.

Palavraschave
FerroEstresseoxidativoFluorescnciaOcrescimento
celularFerritinaTransferrinaChelatorsRadicaislivres

Abreviaes
DFO,deferrioxamineFAC,citratodeamniofrricoFAS,sulfatodeamnio
ferrosoFL,fluorescenaFLDFO,FLconjugadoDFOFLTF,TfFLconjugadoFT,
ferritinaIRE,elementoferroresponsivoIRP,protenareguladoradeferroLIP,lbil
piscinaferroROS,espciesreativasdeoxignioSIH,salicilaldedoisonicotinoil
hidrazonaTf,transferrinaTfR,receptordetransferrina

Propriedadesgeraisdopooldeferrolbil(LIP)
Ocelularpiscinaferrolbil(LIP)definidacomoumconjuntodecomplexosdeferro
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redoxactivo.ElefoisugeridapelaprimeiravezporJacobs[1]comoumapiscina
intermediriooutransitrioentreoferroextracelulareferrocelularassociadoprotenas.
Operacionalmenteistodefinidacomoumapiscinachelatableclulaquecompreende
ambasasformasinicas,deferro(Fe2eFe+3)associadoscomumapopulaodiversa
deligandos,taiscomoaniesorgnicos(fosfatosecarboxilatos),polipeptdeos,eos
componentesdesuperfciedemembranas(porexemplo,gruposdecabeade
fosfolipidos).Assim,adefiniomaisampladeLIPimplicaqueconsistedeformas
qumicasquepodempotencialmenteparticipamredoxciclismo,maspodeser
scavengedporquelantesdepermeantes.Asltimaspropriedadessoabaseparaa
quantificaodeLIPcelular,oque,emcondiesquiescentes,representaapenasuma
fracomenor(<5%)doferrototaldeclulas(50100uM)[2].Emboraafracopode
alterardinamicamenteseguinteestmulosbioqumicos,asalteraesresultantesso
habitualmentetransitriasehomeostticonanatureza.Noentanto,emcasosextremos
desobrecargadeferroouprivao,asalteraespodemexcederacapacidade
homeostticadaclula,comprometendoassimasuaintegridade.
Asprimeirastentativasdedefinirferrolbilemclulasetecidos
Asprimeirastentativasparaidentificarumpoollbiletransitriadeferroforam
baseadosemquatroabordagens.Noprimeiroferromarcadacomrdio,fornecidocomo
clulasTffoitraadonointeriordaclulaseguinteperseguiopulsoefracionamento
celular.EsteltimoincludosubfraccionamentodocitosolemaltaebaixaMr
componentes.Ajustificativadaabordagem"metaltracking"residianaideiadequeantes
dasuaincorporaoalvosestveis,organelaresouproteicos,ferrorecentemente
entreguedevepassarporumapiscinaintermediriodeferrolbilouchelatable.Embora
umapiscinachelatabledistintamentediferentedaferritinaclula(FT)foiidentificadoe
associadocomlesodaclulaevocadooxidante[3],dificuldadesnaprevenodasua
transfernciaparaalvosestveis
porumalavagemafrioimpedidoasuaidentificao

comooLIPputativo.Umasegundaabordagemcomplementartentaramdeterminar
intracelulardeferro"livre"emhomogeneizadosdetecidosporcomplexaodometal
comDFOesuadetecoporressonnciaparamagnticaeletrnica(EPR)[4].Este
mtodofoiutilizadoparaavaliarqualquerexpansooucontracodolbioputativode
tecidosapsexposioaoxidanteseoutrascondies[5].
Aterceiraabordagemfoibaseadanofraccionamentodecomponentescitoslicosde
pesomolecularbaixocomoobjectivodeidentificarquimicamentecomplexosdeferro
[6].
Aquartaabordagemconsistiuemensaiosdestinadosadeterminaropossvel
envolvimentodeferrolbilnamodificaoqumicadecomponentescelulares(por
exemplo,danosnoADN[7]e[8],lesotecidualdeisquemia/reperfuso[9]).O
envolvimentodeferrofoideduzidaapartirdoefeitoprotectorproporcionadopelo
tratamentocomquelantesdeferro[7].
Oproblemaprincipalassociadocomosmtodosacima,anecessidadederupturada
clula,umamedidaquepodelevara:(i)descompartimentaoe,portanto,a
redistribuiodometalentreosligandosputativose(ii)dasalteraesemquantidades
relativasdeFe2vs.Fe+3formas.Adificuldadeemdefinirquimicamentepiscina
intermediriodetrficodeferrointracelularemclulasespecializadastemlevadoalguns
investigadoresadisputarasuaprpriaexistncia.Ponkaecolaboradores[10]proposto
que,emclulaseritrides(ouseja,osreticulcitos),ferrodeTfFeenroutepara
mitocndriaspodeignorarocitosoldeummodosemelhanteablindagemdecobrede
entradadestinadoaenzimascelularesespecficosoutransportadores[11].A
observaodequeTfcontendoendosomespodeinteragirfisicamentecom
mitocndriasforneceapoioindiretopara"Beijoecorrer"passosnaentregadeferro
intracelular[10].Umoutrosistemanoqualoferrotomadopelasclulasescapa
libertaonocitosoltemsidopropostoparaentercitotranscitosedeferroapartirde
apicalparabasolateralatravsdemembranasdetrficovesicular[12].Noentanto,na
maioriadasclulas,aabsorodeferroligadotransferrina(TBI)pormeiode
endocitoseounontransferrinboundferro(NTBI)portransportadoraslevaparauma
entregarpidadeferrolbilparaocitosol,onde,eventualmente,eledetectadopor
protenasreguladorasdeferrocitoslica(IRPs),osprincipaisreguladoresdo
metabolismodoferrocelular.

QuantificaoelocalizaodeLIPemclulasvivas
QuantificaodeLIP
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UmaabordagemmaisrecenteparaestimaroLIPpresumesesercompostade
complexosdeferrorelativamentebaixaafinidadenoqualoferroestemequilbrio
dinmicoepassveldequelao([13]revisodetalhada[14]e[15]).Estaabordagem
contoucomquelantesquepoderiamfuncionarcomosensoresdeferrocelularessem
afetaraintegridadecelularougravementeesgotandoasclulasdoLIPessencial.Um
dadoagentequelanteadequadoseriaconsideradocomoumsensordecluladeferro,
ouseja,capazdereportaraquantidadedeferronolbio,sepudesse:(i)sercolocado
numaclulaearetidasemafectarasuaintegridade(ii)provocarumdeslocamento
menornoequilbriodinmicodeferroparaocomplexodeagentequelantee,(iii)
submeterseaumaalteraoespectroscpicarpida,reversvel,edetectvelcomo
umresultadode[1]e[2].Asegmentaodasondaparaumcompartimentocelular
particularumacaractersticadesejvelquepodeserconseguidoporconferir
propriedadesadicionaissobreasmolculasde[15].Orepertriodisponveldesensores
deferroquesatisfaaessescritriosaindalimitada[14],[15],[16],[17],[18]e[19],
quecompreendemolculasfenantrolinaessencialmenteEDTAlikeemarcoucom
unidadesfluorescentescomodispositivosdemetalreprter.
Calcein(CAL),fluorescenaconjugadocomumaporoEDTAlike(Fig.1A),cumpriua
maioriadoscritriosexigidosapartirdeumasondaparaadeterminaoinsituLIP.
Podeserrapidamentecarregadoemclulasatravsdoseuacetomethoxyno
fluorescenteprecursorCALAM.Umaveznointeriordasclulas,asondafluorescente
livreCALfoiretidoporlongosperodosdetempo.Asondaintracelularforamsubmetidos
amudanasrpidasnafluorescnciaquandoasclulasforamexpostasafontesde
ferroouferropermeante(+2ou+3)quelantes.Emsoluofoiextintaeficientemente,at
90%,por1:1estequiomtricadeligaodeferro.MetaiscomoCaouMgnoafetaram
CALfluorescncianemaextinodeferro.Cu(1,2),emboraquimicamentemais
reactivodoqueoferro[7],aparentementenoencontradaemclulasemformas
instveis,e,nocontextodosensaiosdefluorescncia,dificilmentemobilizadoapartir
declulasporSIH[13].Assim,emtermosprticos,declulasdeCunointerferecom
asmediesLIPcelulares,amenosqueometallibertadoemquantidades
substanciaisdevidoadanosnasclulas[9].Finalmente,opHestarnagamade6,57,5
teveapenasumefeitomenorsobreCalfluorescncia.Todasestaspropriedades
indicaramqueintracelularCALpodiasentirferrocluladinamicamenteetransmitir
informaesrelativassalteraesnosnveisdoLIPcelulares.Aquestodequal
formulrio(2ou3)sentidadiretamentepeloCALFenopodeserrespondidano
contextodeclulasporcausadamultiplicidadedeligantesconcorrentes,aatividade
redoxdaclula,eapropensodeFe(+2)paraoxidarquandodaligaocomasonda
numambienteaerbico.

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Figo.1.
Estruturasqumicasdecalcena(CAL)(A)efenverdeSK(PGSK)(B).(C)PGSK(1,1uM)eCAL(1,2
uM)foramdissolvidosemsoluosalinatamponadacomHEPES,pH7,4,etitulousecomsulfatode
amnioferroso(FAS),demodoaatingiroindicado[Fe].Aintensidadedefluorescncia(ex=485nm,in
=535nm)aps20minutosdeleiturafoinormalizadaparaocorrespondenteaFe=0.Alinhaatracejado
representatmperamximaobtidacom2,0^MdeFe(+2).Aslinhasderegressoatravsdaprimeira
40%dospontosexperimentaisrepresentamagamalineardetitulao(r>0,99)easuaextrapolaopara
alinhatracejadarepresentaaconcentraosaturantedeFeparaaconcentraodadadesondausada
(Fbkg=fluorescnciadefundo).(D)CAL(1uM)(quadradosacheio)eFLdextrano(FLDex)(crculosa
cheio)foramdissolvidosemsoluosalinatamponadacomumamisturade20mMdeMES,HEPES,e
TrisdemodoaatingiropHindicadoeafluorescnciamedidaa485nmdeexcitao/emissode535nm
(dadaemunidadesrelativasaovalordeintensidade,apH7,4).
Figuraopes

OmtodopeloqualCALutilizadoparaestimaroLIP(Fig.2)assumequeintracelular
CALseligaaumcomponentedolbioesofreextinodefluorescnciaapsa
formaodeCALFedeumaformaproporcionalconcentraodeferropresentelbil.
Umavezqueossistemasexperimentaisalcanarnveisdeestadoestacionriode
fluorescnciadentrodeminutos,presumesequeadeterminaoLIPporsisno
perturbaradistribuiodeferrointracelularacurtoprazo.AfracodeCALqueseliga
aoferrodeclulasmostrousersemelhanteemumavariedadedetiposdeclulas
crescidasemcondiespadrodecultura[13].Determinaodaassociadasclulas
CALFebaseiasedequenchingdosinaldefluorescnciaporadiodeumquelante
altamentepermeantequeexibeumaelevadaafinidadedeligaoparaometal.A
magnitudedamudananafluorescnciaelicitada(dequenching)emconjuntocom
mediesdeclulatotaldeCALfornecidaumaestimativafivelde[CALFe],a
concentraodeferroCALchelatable[13].Similarvalores[CALFe]foramobtidoscom
quelantesqueexibemelevadaafinidadeparaFe+2e/ouFe+3,indicandoque,emclulas,
essasduasformasdeferrosointerconversveissobreasualigaoaumquelanteespecial[15].Almdisso,
avelocidadecomqueumagentequelanteespecficodequenchesfluorescncia
associadasclulasproporcionaumamedidaparaacapacidadequelantepara
permearemclulaseeliminarferrointracelular[15].AoestimaroKddeCALdeligao
aoferroportitulao,querinsitu(clulasintactas),emlisados
celulares,ouemsolues

desimulaodecitosol,tambmpossvelobterumamedidadolbiltotal(CAL
detectvel)aconcentraodeferro.

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Figo.2.
OmtodoCALparamedirapiscinadeferrolbil.(A)Asclulassocarregadascomoderivado
acetomethoxydeCAL(CALAM).CALAMnofluorescenteemembranapermevel.Aquandoda
entradaparaasclulas,CALAMhidrolisadoparadaroCALfluorescente,queseapagaquandoda
ligaodeferro.Osanticorposanticalsoadicionadosparagarantirqueafluorescnciaintracelular.
SIH,umafortequelantedeferropermeantevocadequenchingfluorescncia(Af)porligaodeferroCAL
bounddeformaproporcionalaoferroCALbound[CALFe].(B)UmaexperinciarepresentativaLIP
correspondenteaosestgiosdescritosem(A).ConcentraodeferroCALbounddadapor[CALFe]=
[CAL]tot*Af,onde[CAL]totobtidoapartirdeumacurvadecalibraoCAL(nodetalhe).SabendooKd
deseligaraCALdeferro,possvelcalcularaconcentraodeferroCALlivre[Fe]livrepor[Fe]livre=Kd*
[CALFe]/([CAL]tot[CalFe]).[CALFe]e[Fe]livre,juntos,constituemoLIP.Adaptadoapartirde[10].
Figuraopes

PhenverdeSK(PGSK)(Fig.1B),umasondafluorescentebasedefenantrolinapara
Fe2,tambmfoiutilizadoparaestimaroferrochelatableintracelularcomoocomponenteprincipaldolbio[16]
e[17]aseguirosprincpiosestabelecidoanteriormenteparaCAL.Estasonda
geralmentemaissensvelparaadetecodeferrodoqueCALdevidoaoelevado(3:1)
estequiometriadasonda:ligaodemetaiseafinidaderelativamenteelevadade
ligaodeferroparaoFe+2,aformasolveldometal(Figura1C.).Noentanto,umavez
formado,oFe+2complexosPGSKsomaisdifceisdedissociarcompetindoFe+2
quelantesemexcesso.Istodificultaumpoucoaquantificaodometalassociada
sonda,isto,osinaldefluorescnciatemperada,elimitaousodasondapararastreio
dinmicodometal.Nesteponto,noestclaroseounoadetecodePGSKlbilFe
+2emclulasdependetambmoumesmoprincipalmentesobreacapacidaderedutora
celularparaconverterlbilFe+3paraFe+2.Assim,aindaqueamaioriadolbiopode
sercompostadeFe+3complexos,PGSKligaodeFe2poderiaprovocarareduode
Fe3apartirdefonteslbeiseeliminaramaiorparteoutodoometalapartirdolbio.
Estapropriedadecombinadadealteraoevocadaporquelantenoestadodeoxidao
doaspropriedadesoxidoredutoradaclulademetaleminimizaasdiferenas
intrnsecasentreCALePGSKcomosondasparaclulasespecficasdeestadosde
oxidaoFe.Assondas,emboraambososderivadosFl,diferemnasuarespostaaopH,
comoPGSKmostraadependnciadopHrelativamentemaisntidodefluorescnciana
gamadepH6,07,5(Fig.1D).
Osmtodosbaseadosemfluorescnciapermitiramamonitorizaoemlinhade
mudanasnolbioemclulasvivasatravsdeumavastagamadeconcentraesde
ferro.AFigura3exemplificaautilizaodoLACparaadetecodeafluxodeferronas
clulasexpostasaosulfatodeamnioTfouferroso(FAS).Aquantidadedeferro
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tomadodeterminadaapartirdoincrementodeLIP(LIP),quereveladoporadio
deSIHquelantedepermeante.Outrasaplicaeseprincipaisvantagense
desvantagensnassondasdeusoparaavaliarLIPforamdiscutidosemcomentrios
publicadosrecentemente[14].

Figo.3.
IngressodeferronolbiodeclulasK562crescidasemsuspensodevida.CALAMfoiadicionadaa
clulasparagerarCALfluorescenteintracelular,algunsdosquaisseligaaoferroLIPassociado,apso
queextintaCALFeformado.Estafluorescncianormalizadoa0paratodosostratamentoseas
alteraesnafluorescnciasoemrelaoaoestareferncia.Umalinhaestvelestabelecidoem
clulastratadascom50pMdeDFO.QuandosuplementadocomSIH(100M),afluorescnciaassociada
comasclulasaumenta,indicandoalibertaodeintracelularCALFeporSIHefornecerumamedida
paraLIP.Estaltimapodeseraumentadadeumamaneiradependentedotempo,fornecendoaoferro
clulascomoFe2(FAS),ouTf(20uMcada).DTPAumquelantedeferroimpermevelqueimpedeFe+2
importao.Ferrodeentradaparaasclulaslevaaumadiminuiodependentedotemponosinalde
fluorescncia,quepodeserrestauradaatravsdaadiodeSIHpermeando.Onveldefluorescncia
extintaporferrodeentrada([CALFe],paraqueasclulastratadascomoDFO300nM)descritocomo
barrasdoladodireito.
Figuraopes

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