CAPITULO 15

METODOS DE ANALISIS PARA LA DETERMINACION DE NITROGENO

Y CONSTITUYENTES NITROGENADOS EN ALIMENTOS

Nalda Romero
METODOS DE DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL
1. Mtodo de Kjeldahl

Fundamento
Se caracteriza por el uso de ebullicin, cido sulfrico concentrado que
efecta la destruccin oxidativa de la materia orgnica de la muestra y la
reduccin del nitrgeno orgnico a amonaco el amonio es retenido como
bisulfato de amonio y puede ser determinado in situ o por destilacin
alcalina y titulacin.
Dificultades qumicas y prcticas
Digestin prolongada.
Conversin cuantitativa de nitrgeno a amonaco.
Espumosidad excesiva.
Accin corrosiva de cido sulfrico sobre el sistema de extraccin de
humos.
Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y
contaminacin de aguas con catalizadores metlicos.
Soluciones
Aumentar relacin sulfato de potasio/cido sulfrico (1 g.1 m1) t 370410C.
Uso de catalizadores metlicos.
Uso de H2O2.

Catalizadores metlicos utilizados

a) Oxido de mercurio
Ventaja
Oprima recuperacin de nitrgeno
Desventajas
Txico.
Alto costo.
Contaminacin de aguas.
Formacin de compuesto estable con amonaco el que debe ser
descompuesto con adicin de tiosulfato de sodio.
b) Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio
Desventaja
El selenio puede producir prdida de nitrgeno.
c) Mezcla de sulfato de cobre y dixido de titanio
Ventajas
til en anlisis de cereales.
Uso a gran escala como rutina.
Desventaja
Menos efectiva en recuperar nitrgeno.
Determinacin de amonio

El amonio en el digestor puede ser determinado por diversos mtodos:

a. Adicin de exceso de lcali al digestor, destilacin del amonio y
titulacin.
b. Mezcla alcalina de fenol con hipoclorito de sodio que da una
coloracin azul con amonio.

c. Mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e

hipoclorito de sodio que da una coloracin verde esmeralda
brillante con amonio.
d. Determinacin electromtrica usando un electrodo de ion
especfico y una solucin de hidrxido de sodio al 1 % .
Ventajas del mtodo de Kjeldhal

Apropiado para varios tipos de productos.

Alta fiabilidad.
Usado como mtodo de referencia.
Desventajas del mtodo de Kjeldhal

Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.

Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
2. Mtodo de Dumas
Fundamento
Se caracteriza por pirlisis completa de la muestra y medicin del
contenido de nitrgeno de los gases de combustin.
El nitrgeno puede ser medido con manmetro despus de absorber el
dixido de carbono en una solucin alcalina o por conductividad trmica
en mtodos automatizados.
Ventaja
Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el mtodo de
Kjeldahl en anlisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores
levemente mayores.
Desventajas
Incluye nitrgeno inorgnico.
Requiere pequeas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y
homognea para minimizar el error de muestreo.

Este mtodo no puede aplicarse a material hmedo por lo que debe

efectuarse un secado previo.
3. Mtodos radioqumicos
Se han descrito dos mtodos:
a) Activacin neutrnica
Fundamento
Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce
el paso de N a N. Este positrn tiene una vida media de 10 minutos y
emite radiaciones gamma las que se registran en un contador de
centelleo . Las cuentas se relacionan con el contenido de nitrgeno de la
muestra.
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Ventajas
Simple; rpido.
Sin problemas de contaminacin.
Los valores encontrados presentan
buena correlacin con el mtodo de
Kjeldahl.
Desventaja
El costo de infraestructura es muy elevado.
b) Activacin protnica
Fundamento
Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con
protones y se efecta la conversin de N a O, un istopo que decae
con la emisin de un protn y de radiaciones gamma las que son
registradas y relacionadas con el contenido de nitrgeno de la muestra.
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METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS

Existen diversos mtodos alternativos para determinar protenas:

1. Utilizacin del factor de conversin

a) Determinar el contenido de nitrgeno total y multiplicar por un factor de

conversin de nitrgeno a protena. Este factor se calcul considerando
el porcentaje de nitrgeno que contiene la protena en los alimentos.
Desventajas del uso del factor de conversin:
Para efectos de clculo se considera el contenido de nitrgeno de la
protena principal y no de toda la mezcla.
La fraccin analizada no necesariamente es protena pura.
No se realizan correcciones de nitrgeno no proteico.
Se ha sugerido determinar el factor de conversin de nitrgeno a
protena utilizando la composicin de aminocidos del alimento a
analizar, lo que se complica al combinar los alimentos, por lo cual se
prefiere continuar con el uso de los factores tradicionales informando a
su vez el factor utilizado.
b) Determinar el contenido de nitrgeno proteico y multiplicar por un
factor de conversin de nitrgeno a protena.
Se han utilizado diversos mtodos para separar la protena de
compuestos nitrogenados no proteicos entre los que se sealan:
dilisis y ultrafiltracin por membrana;
coagulacin por calor (no es efectivo para casena y gelatina);
-

uso de agentes precipitantes como: cido tngstico, cido

tricloroactico, hidrxido de cobre, xido frrico, acetato de plomo,
cido fosfotngstico, cido metafosfrico, cido tnico, cido
sulfosaliclico, etanol, mezcla cloroformo y octanol (8:1), mezcla fenol,
cido actico y agua (1:1:1).

Desventajas
Diferencias en las fracciones proteicas obtenidas por los diversos
mtodos. Debe considerarse posibles retenciones sobre la protena
precipitada de pequeas molculas no proteicas por adsorcin o
intercambio inico. Problemas relacionados con el uso del factor de
conversin de nitrgeno a protena.

2. Mtodos qumicos

Fundamento
Las protenas presentan un amplio rango de comportamiento qumico
debido a la propiedad de los aminocidos de tener diferentes tipos de
grupos funcionales, a las reacciones qumicas de estos grupos y a los
enlaces peptdicos.
Consideraciones en la aplicacin de los mtodos qumicos:
-

Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos mtodos empricos e
indirectos sean calibrados con el mtodo de Kjeldahl;

se espera una buena correlacin entre estos dos tipos de determinacin de protena cuando la
relacin N no proteico/N proteico es baja y constante; y
son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayora de los vegetales y
mezclas de alimentos.

a) Mtodo de Biuret
Principio qumico
La reaccin se caracteriza por una coloracin prpura cuando los
iones cpricos son complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino.
El matiz del color depende del tipo de protena y su intensidad depende
del contenido de protena presente.
Reactivo utilizado
Solucin alcalina conteniendo iones cpricos complejados con tartrato de
sodio y potasio.
Lectura
550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
Desventaja
Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la
presencia de interferentes como azcares reductores que reducen el ion

cprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios.

Ejemplo: leche.
b) Mtodo "dye-binding"
Principio qumico
Se caracteriza por la formacin de un cogulo de protena, coloreado e
insoluble producto de la reaccin de la protena con una solucin
coloreada de cido sulfnico a pH 2. El anin coloreado se une por
asociaciones electrostticas a los sitios bsicos de la protena, por
ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol
de histidina y aminos terminales. Adems se producen atracciones
intermoleculares por interacciones hidrofbicas entre la protena y la
mitad no inica del anin y entre el anin unido a protena y la mitad no
inica del anin en solucin.
El cogulo se separa por filtracin y se mide colorimtricamente el
exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el
contenido de protena.
Lectura
A595nm
Consideraciones
El mtodo es emprico por lo que se debe buscar la concentracin de
tintura ideal que sature la protena y forme el cogulo pero que no pierda
sensibilidad.
Ventajas
Util en anlisis de rutina de muestras similares.
Econmico y rpido.
Preciso como el mtodo de Kjeldhal.
Usado como mtodo de referencia.
Desventajas
Dificultad en encontrar tinturas puras.

Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricacin a

otro, por lo que se require la calibracin del mtodo con cada lote.
No es aplicable a alimentos que varen su contenido en grupos aminos
(protelisis, pardeamiento).
c) Mtodo de destilacin alcalina
Fundamento
La hidrlisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amonaco
el cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de
protena.
Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente
reproducible para una protena dada.
d) Mtodo de Lowry
Reactivo
Acido fosfomolbdico-fosfotngstico
Fundamento
Cuando se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un
complejo azul de molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina,
triptfano, cistina, cisterna e histidina.
Lectura
A750 nm
Ventajas
Alta sensibilidad y simple de operar.
Desventajas
La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de protena.
La intensidad del color no es estrictamente proporcional a
la concentracin de protena.

Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en

la reaccin.
e) Mtodo de titulacin con formol
Fundamento
A la muestra neutralizada con lcali se le agrega formaldehido en exceso
el cual reacciona con cada grupo bsico de lisina y arginina. El exceso de
formaldehido se neutraliza con un exceso de lcali estndar el cual se
titula, y se relaciona con el contenido de protena.
Desventaja
Su reproducibilidad es menor a la de otros mtodos alternativos.
3. Mtodos fsicos
Consideraciones
Son ms simples, rpidos y el costo por anlisis es menor aunque el
costo de los equipos es elevado. La exactitud de estos mtodos se
relaciona con las caractersticas del material a analizar. La concordancia
con nitrgeno total depende de que el material no vare de muestra en
muestra.
a) Espectroscopa infrarroja
Fundamento
Se aprovecha la absorcin del grupo amida del enlace peptdico a 6,46
Tm.
Ventajas
Rpido, anlisis de multicomponentes No destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibracin complejo.
b) Espectroscopa infrarroja reflectante

Fundamento
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a
la radiacin infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Consideracin
Es necesaria la calibracin contra un conjunto de muestras
estadsticamente significativas, analizadas por mtodos de referencia
tradicionales.
Ventajas
Rpido, anlisis de multicomponentes. Aplicable a materiales slidos.
Cuantifica protena en presencia de agua.
Desventajas
Interfieren almidones y lpidos.
Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en
las partculas.
Proceso de calibracin complejo.
c) Espectrofotometra ultravioleta
Fundamento
Mide protenas en solucin con absorcin mxima a 280 nm atribuible a
los anillos aromticos de tirosina y triptfano y entre 180-220nm.
Ventajas
Rpido, no destructivo.
Util para monitorear eluentes en columnas cromatogrficas.
Desventaja
Interferencia de otros compuestos (cidos nucleicos, nucletidos).
d) Mtodos refractomtricos
Fundamento

Mide la refraccin directa de la protena en solucin o el cambio de ndice

de rafraccin causado por la remocin de la protena de la solucin.
e) Mtodo turbidimtrico
Fundamento
Mide la reduccin de la intensidad de la luz al pasar por una suspensin
de partculas de protenas. Este cambio se relaciona con el contenido de
protena.
f) Espectroscopa electrnica
Fundamento
Irradiacin del material con rayos X y cuantificacin de los fotoelectrones
liberados caractersticos al tomo de N del grupo amida de la protena.
Ventaja
Buena correlacin con contenido de N total.
Pueden determinarse simultneamente otros grupos de inters (grupos
sulfuras de aminocidos).
g) Polarografia
Determina trazas de protena.
METODOS DE DETERMINACION DE AMINOACIDOS

Los aminocidos constituyen la estructura primaria de la protena y le

confieren el valor nutricional a los alimentos.
Para el anlisis de los aminocidos es necesario romper los enlaces
peptdicos de las protenas por medio de hidrlisis que puede ser cida,
alcalina o enzimtica. La hidrlisis cida se realiza con cido clorhdrico
de concentracin 6N. El reactivo debe ser puro y no debe dejar residuos
por lo que se recomienda una hidrlisis en fase gaseosa. Para que la
hidrlisis de las protenas sea completa es necesario tener en cuenta
factores como la razn cido/protenas, la temperatura y el tiempo de
hidrlisis y evitar la presencia de oxgeno en el medio aplicando vaco y
nitrgeno para minimizar la oxidacin de los aminocidos.

Consideraciones de la hidrlisis cida

La hidrlisis cida afecta la estructura de ciertos aminocidos, como:
a. Destruccin parcial de treonina, serina, cistina, cisterna, metionina
y tirosina.
La destruccin de cistina, cistena y metionina se evita oxidando
primero la muestra con cido perfrmico y se determinan en su
lugar el cido cisteico y metionina sulfona.
El triptfano se destruye totalmente con el cido clorhdrico por lo
que para su determinacin es necesario realizar una hidrlisis
alcalina.
b. Conversin de: tirosina a un cloro- derivado; asparagina a cido asprtico; y glutamina a cido glutmico.
c. Liberacin lenta de isoleucina y valina.
Para compensar las prdidas producidas en los aminocidos y adems
para cuantificar los aminocidos presentes se puede adicionar a la
muestra antes de la hidrlisis, una cantidad conocida de un estndar
interno que puede ser el cido 2-aminobutrico.
Los aminocidos libres se derivatizan por mtodos precolumna o
postcolumna y se separan aplicando la cromatografa de intercambio
inico, la cromatografa lquida de alta resolucin o la cromatografa gaslquido.
Requisitos de una derivatizacin precolumna:
Condiciones de reaccin suave y rpida.Que forme derivados estables y
de respuesta lineal.
Que los factores de respuesta sean similares para todos los
aminocidos.
Que sea reproducible.
Alta resolucin de los derivados de aminocidos.
Que reaccione con aminocidos primarios y secundarios.
BIBLIOGRAFIA

1. Alaiz, M., et al. 1992. Amino acid analysis by high-performance

liquid chromatography after derivatization with diethyl

ethoxymethylenemalonate. (Journal of Chromatography 591:181186).

2. Greenfield, H. and Southgate, D.A.T. 1992. Food Composition
Data. London, Elsevier Appllied Science.
3. King. 1978. Developments in Food Analysis Techniques. London,
Applied Science Publishers.
4. Pomeranz, C. and Meloan. 1971. Food Analysis; Theory and
Practice. Westport, Connecticut, The AVI Publishing.