BIOLOGIA MOLECULAR

Enzimas de restriccin
Para algunos de los estudios en biologa molecular se utilizan enzimas de
restriccin. Las enzimas de restriccin son endonucleasas de ADN doble
hlice que se obtienen de organismos procariontes. Su funcin normal en
estos organismos es eliminar ADN forneo.
Estas enzimas cortan de distintas formas segn el tipo de enzimas que
sean. Algunas al cortar dejan extremos de adhesin y otras dejan extremos
romos.
Extremos romos: dejan la doble hlice armada.
Extremos de adhesin: dejan un segmento pequeo de cadena simple.

ELECTROFORESIS
Consiste en un proceso basado en un campo elctrico que separa molculas
en base a tamao y/o carga. Segn las cargas algunas sustancias migrarn
para un NODO o un CTODO (Ej: cidos nucleicos, cuyos grupos fosfato
tienen carga negativa, migran haca un nodo).
Los geles utilizados para la transferencia son comnmente de poliacrilamida
y agarosa. La tincin posterior se hace con bromuro de etidio, el cual va a
ser fluorescente frente a cierto tipo de iluminacin.
La identificacin se hace por medio de SONDAS: ADN o ARN que se une
hibrida- por complementariedad. Las sondas estn marcadas generalmente
con nucletidos radiactivos.
BLOTTING
Tipo
Analiza
Preparacin
muestra
Electroforesis
Tratamiento

Transferencia
Identificacin

Southern
ADN
Fragmentacin

Northern
ARN
-

Western
Protenas
-

Tamao
Desnaturalizaci
n
alcalina
Capilaridad
Sonda

Tamao
-

Tamao/carga
-

Capilaridad
Sonda

Campo elctrico
Anticuerpos

SECUENCIACIN DE ADN
Mtodo de terminacin de cadena
En este mtodo de secuenciacin se utilizan didesoxirribonucletidos que no
pueden unirse a otras bases por no poseer el OH en el extremo 3.
Se usa una cantidad de hebra molde de ADN simple cadena, un primer, una
polimerasa, gran cantidad de desoxirribonucleotidos y poca cantidad de
didesoxirribonucletidos distribuidos en 4 tubos de ensayo, uno para el
didesoxirribonucletido de ADENINA, otro para GUANINA, otro para
CITOSINA y otro para TIMINA. Al hacer esto, se comienza a polimerizar en
cada tubo de ensayo las hebras faltantes de cada muestra de ADN y se va
deteniendo dependiendo de cundo se aade a la misma un
didesoxirribonucletido. Esto quiere decir que en cada tubo voy a obtener
distintos fragmentos de ADN polimerizados hasta un cierto punto, donde
hay un stop dado por un didesoxirribonucletido de Adenina, Guanina,
Citosina o Timina, dependiendo el tubo. Al hacerlos correr por electroforesis
y separarse por tamao, quedan ordenados por tamao y por nucletidos,
por lo que se puede determinar la secuencia de bases.

PCR (Polymerase chain reaction)

Este proceso hace una duplicacin y amplificacin de un segmento
especfico de ADN. Se necesitan para el proceso: el ADN a amplificar,
oligonucletidos (primers), NTPs, un buffer neutro y una ADN polimerasa
estable a cambios de temperatura.
El mtodo se inicia con una separacin de las hebras de ADN por
desnaturalizacin a 95 durante 15 minutos. Luego se hace una hibridacin
de la cadena con los primers al disminur la temperatura, y al aumentar la
temperatura a unos 72, comienza el trabajo de la polimerasa.
Este ciclo se repite y se crean copias del ADN haciendo una amplificacin.
Estos ciclos se pueden hacer repetitivamente utilizando un fluocromo, que
se une a la doble cadena y avisa por medio de fotones cundo se debe
elevar la temperatura a un termociclador.
CLONADO DE ADN
Para esta tcnica, parte de un ADN forneo se intrudoce en un vector y este
es llevado a una clula hospedadora. La introduccin de ADN en un
plsmido para llevar a este a una bacteria sera un ejemplo.
Para introducir el ADN forneo se deben utilizar enzimas de restriccin. Las
ms usadas son las que producen extremos adhesivos.

MARCACIN DE LOCI EN CROMOSOMAS

Este proceso se hace con hibridacin in situ de cromosomas parcialmente
desnaturalizados con genes marcados.
Algunos conceptos sobre gentica:
Polimorfismo: Variaciones en el ADN, ya sea por cambio de base, deleccin o
insercin. Los polimorfismos son la base de la variabilidad gentica, pero
pueden ser base tambin para la etiopatogenia de enfermedades
hereditarias.
Regiones hipervariables del ADN: Son repeticiones de secuencias en
tndem. Los fragmentos repetidos son distintos en todos los individuos. Se
usan para determinar ADN en medicina forense (por ejemplo, en la

incriminacin de un sospechoso) y son conocidos como la huella digital del

ADN.
PRODUCCIN DE PROTENAS TERAPUTICAS
Si se asla una colonia de bacterias y a sus protenas se las somete a un
Western Blot, se puede saber si las mismas producen protenas que pueden
ser de utilidad para distintas situaciones en medicina. Va insertar un ADN
forneo en un plsmido, puedo obtener protenas por ADN recombinante (la
mezcla de dos ADNs).
Por ejemplo, la bacteria E.coli se utiliza para la produccin de GH. En el caso
de que las protenas requieran modificaciones postraduccionales, se pueden
utilizar sistemas eucariontes.
Entonces, si yo quiero expresar algn gen en comn en una colonia para
que ellas me produzcan una cierta protena, se puede hacer por medio del
mtodo de ADN recombinante con insercin de un plsmido con ADN
forneo.
VACUNAS
En las vacunas, actualmente se utiliza crear la protena de membrana
(antgeno) del virus, y poner esta misma protena en sangre (sola, sin el
virus) para que la protena sea reconocida por los anticuerpos y se pueda
desencadenar la respuesta sin tener riesgos de que el virus pueda infectar.
La creacin de esta protena de membrana se logra por ADN recombinante
con posterior glicosilacin (modificacin postraduccional) de la misma en
sistemas eucariontes.

TERAPIA GNICA
La terapia gnica se basa en la introduccin de genes de retrovirus (virus
con ARN) o adenovirus (virus con ADN lineal doble cadena), o con
receptores destinados a un especfico tipo celular; para modificar la
actividad de la clula, reemplazando, por ejemplo, material gentico
defectuoso.
Cito textual:

La terapia gnica slo funcionar si se logra entregar un gen normal a un

gran nmero de clulas -por ejemplo, varios millones- en un tejido. Y tienen
que ser las clulas correctas, en el tejido correcto. Una vez que el gen
llegue a su destino, debe ser activado, y producir la protena codificada por
el gen. La entrega y activacin del gen son los mayores obstculos que
enfrentan los investigadores de terapia gnica. La orientacin de un gen a
las clulas correctas es crucial para el xito de cualquier tratamiento de
terapia gnica. Igualmente importante, sin embargo, es asegurarse de que
el gen no se incorpore a las clulas equivocadas. La entrega de un gen en
otro tejido sera ineficaz y podra causar otros problemas de salud al
paciente.