Universidad Andrs bello

Departamento de Ciencias Qumicas

Laboratorio de Qumica e Instrumental

LABORATORIO N6
CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
DETERMINACIN DE TEOFILINA EN UNA MUESTRA PROBLEMA

INTEGRANTES

GRUPO
PROFESOR
FECHA
ENTREGA

:
:
:

RODRIGO AGUILAR
CHRISTOPHER ESPINOZA
N4
LUIS RAUL DE LA NUEZ
16/11/2015

RESULTADOS
Determinacin de la concentracin
muestra problema (MP)

de Teofilina en una

Se trabaj con una fase mvil isocrtica (30:70 = Metanol, Agua), a un flujo
de 1mL/min y utilizando una longitud de onda deteccin de 260nm.
Por el mtodo de estndar interno (10ppm de Teobromina) se determinara la
concentracin de MP, ya que se hace una curva de calibracin previamente
medida usando patrones de Teofilina de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm.
Luego del anlisis en el cromatgrafo liquido de alta resolucin de todos los
patrones de Teofilina y la MP, se tabularon los siguientes datos.

TABLA N1: MEDICIN CROMATOGRAFICA

Flujo
1mL/min

5ppm

10ppm

15ppm

20ppm

25ppm

MP

Teob

Teof

Teob

Teof

Teob

Teof

Teob

Teof

Teob

Teof

Teob

Teof

25837

28760

24420

40086

24442

90427

24398

118137

24325

137076

24594

106304

Tr

5,092

6,842

5,275

7,392

5,083

6,958

5,133

7,042

5,233

7,217

5,158

7,083

1,12

1,37

1,23

0,99

1,16

1,63

1,18

1,56

1,14

1,43

1,18

1,52

Tm

1,617

1,592

1,583

1,583

1,583

A: rea de pico; Tr: Tiempo de retencin; w: Ancho de banda; Tm: Tiempo muerto

TABLA N2: VALORES PROMEDIO DE MEDICION CROMATOGRAFICA

Valores promedio
(Flujo 1mL/min)

Teob

Teof

24684,4

82897,2

Tr

5,1632

7,0902

1,166

1,369

Tm

1,5916

1,592

 Influencia del flujo de la fase mvil

Se trabajo con un patrn de 10 ppm de Teofilina y una fase mvil isocrtica (30:70=
Metanol, Agua). Se midi a 260 nm con flujos de 0,8 mL/min y 1,2 mL/min.
Se tabularon los siguientes datos:
TABLA N3: FLUJO DE FASE MOVIL (10ppm) POR TIEMPO (mL/min)

Flujo

0,8 mL/min

1,0 mL/min

A
Tr
W
Tm

Teob
Teof
21659
44550
6,292
8,608
1,31
1,14
1,942

Teob
Teof
24420
40086
5,275
7,392
1,23
0,99
1,592

1,2 mL/min
Teob
22028
4,3
1,13

Teof
49296
5,792
1,35
1,358

A partir de la medicin se obtuvieron los siguientes datos:

TABLA N4: CONCENTRACION DE TEOFILINA (ppm), AREA DEL PICO DE

TEOFILINA Y TEOBROMINA

Concentracin
Teofilina (ppm)
5

rea del pico

Teofilina
28760

rea del pico

Teobromina
25837

10

40086

24420

15

90427

24442

20

118137

24398

25

137076

24325

Muestra

106304

24594

Para determinar la concentracin de la MP, se hizo una curva de calibracin en

donde se grafica rea del pico de teofilina/rea del pico del patrn interno en funcin
de la Concentracin de Teofilina.

TABLA N5: CONCENTRACION TEOFILINA V/S ATEOF/ATEOB

Concentracin de Teofilina (ppm)

5
10
15
20
25
Muestra

ATeof/ATeob
1,113
1,641
3,699
4,842
5,635
4,322

Segn esta tabla se obtiene el siguiente grfico:

GRAFICO N1 CURVA DE CALIBRACION: [ ] TEOFILINA V/S COCIENTE

ENTRE AREA TEOF Y TEOB

[ ] Teofilina (ppm) V/S ATeof/ATeob

7

ATeof/ATeob

y = 0,2449x - 0,2871
R = 0,9681

5
4
3
2
1
0
0

10

15

[TEOFILINA]ppm

20

25

30

Para calcular la concentracin de Teofilina en la muestra problema se reemplaza

Y = 4,322 (ATeof/ATeob con los datos obtenidos de la Tabla N5 para la muestra) en
la ecuacin de la recta obtenida, entonces:
= +
= 0,2449 0,2871
4,322 = 0,2449 0,2871
=

4,322 + 0,2871
= 18,82
0,2449

Por lo tanto la concentracin de Teofilina la muestra problema es 18,82 ppm

Teofilina.

Determinacin promedio de platos tericos

Se procede en calcular los platos tericos en base a la tabla N3.
Entonces: = 16 (

2
)

- Para la Teobromina con un flujo 0,8 mL/min

= 16 (

6,292 2
1,31

) = ,

- Para la Teofilina con un flujo de 0,8 mL/min

= 16 (

8,608 2
) = ,
1,14

- Para la Teobromina con un flujo de 1,0 mL/min

5,275 2
= 16 (
) = ,
1,23

- Para la Teofilina con un flujo de 1,0 mL/min

7,392 2

= 16 (0,990) = ,02

- Para la teobromina con un flujo de 1,2 mL/min

4,300 2
= 16 (
) = ,
1,13

- Para la Teofilina con un flujo de 1,2 mL/min

5,792 2
= 16 (
) = ,
1,35

Con los clculos sealados se genera esta tabla:

TABLA N6: PLATOS TEORICOS TEOBROMINA Y TEOFILINA EN LOS 3

FLUJOS MEDIDOS
FLUJO FASE MOVIL
(mL/min)

Teobromina

Teofilina

0,8

369,11

912,25

1,0

294,28

892,02

1,2

231,69

294,52

Ahora se puede calcular los promedios de los platos tericos para cada flujo

TABLA N7: RESUMEN CALCULOS DE PROMEDIOS PLATOS TEORICOS

FLUJO (mL/min) PROMEDIO PLATOS TEORICOS

0,8

N=

1,0

N=

1,2

N=

, + ,

,+ ,

,+,

= 640,68
= 593,15
= 263,11

DETERMINACIN DE ALTURA DE PLATOS TERICOS

Luego calcular los platos tericos (N) se puede obtener la altura de platos tericos
aplicando la siguiente ecuacin:

En donde L= altura de la columna y H= altura de platos tericos.

Para este prctico la altura de columna es de 25cm. Entonces por simple despeje
nos queda:

Entonces para cada flujo seria as:

TABLA N8: RESUMEN DE CALCULO DE ALTURA DE PLATOS TEORICOS
POR CADA FLUJO FASE MOVIL

FLUJO FASE MOVIL (mL/min)

0,8

1,0

1,2

ALTURA PLATOS TEORICOS

H=

H=

H=

25
640,68
25
593,15
25
263,11

= 0,0390 cm

= 0,0421 cm

= 0,0950 cm

DETERMINACIN DE LA RESOLUCIN (Rs)

Para obtener la resolucin se ocuparon los datos de la Tabla N3 y la siguiente
ecuacin:

2 (() ())
() ()

Tr: Tiempo de retencin; W= ancho de pico

Entonces para flujo 0,8 mL/min

=

2 (8,608 6,292)
= 1,891
(1,31 + 1,14)

Para flujo 1,0 mL/min

2 (7,392 5,275)

(1,23 + 0,99)

= 1,907

Y, para el flujo 1,2 mL/min

2 (5,792 4,300)
(1,13+1,35)

= 1,203

TABLA N9: RESOLUCIONES CALCULADAS A 0,8; 1,0 Y 1,2 mL/min

FLUJO FASE MOVIL

(mL/min)

RESOLUCIN
(Rs)

0,8

1,891

1,0

1,907

1,2

1,203

DETERMINACIN DE LA SELECTIVIDAD ()

Para calcular la selectividad de cada flujo se necesita aplicar la siguiente ecuacin:

=

()
()

Tr: Tiempo de retencin; Tm: Tiempo muerto

Entonces, para el flujo de 0,8 mL/min

=

(8,608 1,942)
= 1,532
(6,292 1,942)

Para el flujo de 1,0 mL/min

=

(7,392 1,592)
= 1,575
(5,275 1,592)

Y, para el flujo 1,2 mL/min

=

(5,792 1,358)
= 1,507
(4,300 1,358)

TABLA N10: RESUMEN DE CALCULO DE SELECTIVIDAD ()

FLUJO FASE MOVIL

(mL/min)

SELECTIVIDAD
()

0,8

1,532

1,0

1,575

1,2

1,507

DISCUSION

En el presente practico utilizamos la tcnica de cromatografa liquida de alta

resolucin (HPLC), con el cual determinamos la concentracin de una muestra
problema que contena teofilina utilizando como patrn interno teobromina (10 ppm).
Para determinar la concentracin de la muestra problema utilizamos una curva de
calibracin con el cual preparamos soluciones con diferentes concentraciones de
teofilina y el patrn interno (teobromina) obteniendo a travs de la grfica
Aanalito/Apatron interno vs concentracin del analito. La ecuacin de la recta en la cual
obtuvimos el siguiente valor Y =0,2449x- 0,2871, donde y corresponde al valor del
rea del analito de la muestra problema obtenido. Y x corresponde al valor de la
concentracin del analito. Al despejar la x de la ecuacin de la recta se obtuvo la
concentracin del analito correspondiente a 18,82 ppm. El coeficiente de regresin
dio un valor lejano al ideal (R2= 0,9681), puesto que el punto N2 correspondiente a
1,641 - 10 ppm (y,x), se desva haca la parte inferior del grfico, por lo tanto el
clculo de la concentracin del analito en la muestra problema estar afectada por
algn tipo de error, lo ms probable que por parte del cromatgrafo no hay mucho
error porque es manejado, entonces el error se debe con mayor certeza de una falla
humana de manipulacin, ya que el cromatgrafo de alta resolucin es un
instrumento extremadamente sensible se necesita una prolijidad ya sea para
maniobrar la bomba presin, la cual se encarga de introducir el soluto a presin para
una ptima separacin, y por la intensidad de corriente que debe haber durante el
proceso de anlisis ya que no debe hacer baja de voltaje porque el cromatgrafo es
muy costoso y tambin para que su anlisis sea confiable.
En cuanto a la Influencia del flujo de la fase mvil podemos decir que a medida que
se aumente el flujo de la fase mvil el tiempo de retencin y el rea de la teofilina y
de la teobromina disminuyen, estando en una relacin inversamente proporcional
entre el flujo y el rea y/o el tiempo de retencin (1).
En cuanto a la resolucin medida a un flujo de 1mL/min que dio 1,907 comparado
con la resolucin a un flujo de 1,2mL/min que dio 1,203 se evidencia claramente
que el aumento de flujo afecta la resolucin pero no baja del valor aceptable que
1,0.(2).
Cada plato terico representa un equilibrio terico de distribucin del soluto entre
las fases. El nmero total de platos tericos de una columna representa el poder de
separacin de la columna. Una buena columna tiene un nmero alto de platos
tericos(3). En este practico se midieron los platos a 3 flujos los cuales dieron, para

un flujo de 0,8mL/min =640,68; para un flujo de 1,0mL/min = 593,15 y para un flujo

de 1,2mL/min = 263,11. Entonces en un flujo de 0,8mL/min los platos fueron
mayores contra los medidos para los otros flujos, cabe destacar que en la medicin
de 1,0mL/min se produjo un error anteriormente sealado, el cual pudo haber
incidido en los clculos de platos.
Por ltimo se calcularon las selectividades a 0,8mL/min; 1,0mL/min y 1,2mL/min,
siendo 1,532; 1,575 y 1,507 respectivamente. Como La selectividad se refiere a la
capacidad del mtodo para distinguir las propiedades de los componentes a nivel
molecular y que permite diferenciarlos, por eso que su selectividad son muy
parecidas porque solo medimos una mezcla de Teobromina y Teofilina las cuales
tienen igual formula molecular y solo difieren en su conformacin.

CONCLUSION

Se obtuvieron resultados muy fiables, por lo que podemos decir que la

concentracin de la muestra problema es de 18,82ppm de Teofilina y se obtuvo al
interpolar la seal que dio el cromatgrafo en la ecuacin de la recta que dio la curva
de calibracin.
Con los datos obtenidos por el anlisis se pudo calcular: promedio platos tericos
para cada flujo, altura de platos para cada flujo, resolucin para cada flujo y
selectividad.
En conclusin aprendi todo el manejo para poder operar un cromatgrafo de alta
resolucin ya que es una herramienta fundamental En la actualidad, ya que ha
alcanzado tal nivel de fineza y especializacin que cada uno de sus tipos constituyen
herramientas imprescindibles en las reas de la ciencia y la tecnologa, en la
industria qumica, farmacutica, cosmtica, en estudios ambientales, en la clnica,
en alimentos, etc(4).
Buen laboratorio

BIBLIOGRAFIA

(1)Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.

(2) Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science.
John Wiley and Sons, Canada, 1973.
(3) Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C12C18 fatty acids by
reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532538.
(4) Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51,
Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990