I.

Introduccin
La correcta identificacin de un microorganismo permite entender mejor el
comportamiento del mismo, para ello es importante el uso de tcnicas especializadas en
dicho campo, que permitan establecer diferencias morfolgicas, qumicas, fsicas entre
otras. Ante dicha necesidad, la tincin diferencial de Gram nos brinda la solucin, pues
permite la diferencia de 2 grupos de bacterias: Gram (+) y Gram (-), a partir de la
estructura de su pared celular.
Como toda tcnica de reconocimiento tiene cierto pasos que debe seguirse con
exactitud. Empezando por requerir 4 soluciones el primero, el colorante bsico que tie
la clula; el segundo el mordiente, ayuda en la fijacin del colorante en las estructuras;
el tercero, el decolorante que retira el colorante en las Gram (-) mientras que en el otro
grupo no tiene efecto dicha sustancia es principalmente quien establece diferencias
entre ambas divisiones y el cuarto que es el contrastante, da el color contrastante al
inicial principalmente en las Gram (-). Expuesto lo anterior se procede a mostrar los
procedimientos adecuados as como la fundamentacin tericos para desarrollar dicha
tcnica.

Objetivos:

Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram, la existencia de

dos grupos principales de bacterias.

Comprender el uso de cada compuesto que compone la tincin de Gram y

entender su propsito de uso.

Staphylococcus aureus teida por tincin Gram.

II. Materiales y mtodos

Materiales

PORTA
OBEJETOS

SOPORTE PARA
TINCIN

MECHERO

CRISTAL
VIOLETA

TUBO DE
ENSAYO CON
MUESTRA

ASA DE KOLLE

DECOLORAN
TE

ACEITE DE
INMERSIN

PINZA

MICROSCOPIO

SAFRANINA

LUGOL

PROCEDIMIENTO

1. Preparar 4 lminas fijas de:

1 Escherichia coli.
2 Staphylococus aureus.
3 Bacillus cereus.
4
Mezcla
de
los
3
mencionados anteriormente.

2.
Agregar
el
colorante
en
exceso:
Cristal
Violeta. Reposar 30
segundos y lavar la
muestra.

3.
Agregar
el
mordiente
en
exceso:
Lugol.
Reposar 2 minutos
y lavar la muestra.

4. Agregar el decolorante 68 gotas: Alcohol Acetona. Su

adicin sirve para retirar el
colorante debe repetirse 2
veces de ser posible para
una correcta tincin posterior
de las Gram (-). Lavar la
muestra.

5.

Agregar
el
colorante
contrastante
en
exceso: Safranina
Dejar reposar por
2 minutos y lavar.

6. Secar la muestra con

papel toalla. Debe ser con
toque suaves para evitar la
perdida de la muestra,
seguido limpiar con algodn
la parte anterior del cubre
objetos para quitar el humo
segregado por el mehero.
Colocar dos gotas de aceite,
colocar al
microscopio y
observar.

III. Resultados

Figura 1 Escherichia coli (EC) Gram negativa

Figura 2 Bacillus cereus (BC) Gram positiva

Figura 3 Staphylococcus aureus (ST) Gram positiva

Figura 4 - Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus

Bacterias (y
combinaciones)
Escherichia coli (EC).

Tincin Gram

Gram negativa.

Bacillus cereus (BC).

Gram positiva.

Staphylococcus
aureus (ST).

Gram positiva.

Visualizacin de la
muestra
Pequeas bacterias en
forma
de
cocobacilo
(muchas de ellas apenas
perceptibles a la vista), de
color rosado (no llego a
teirse de rojo intenso
como se esperaba).
Bacterias medianas en
forma de bacilo, de color
violeta intenso, mostrando
asociacin
de
estreptobacilo.
Bacterias medianas en
forma de coco, de color
violeta intenso, mostrando
asociacin de estafilococo.
Se observa la comparacin

Escherichia
coli,
Bacillus
cereus,
Staphylococcus
aureus.

del tamao de las tres

bacterias, donde el Bacillus
Gram
negativa,
Gram c. y el Staphylococcus a.
positiva y Gram positiva, muestran tener un tamao
respectivamente.
idntico. Mientras que la
Escherichia c. muestra
tener un tamao mucho
menor a tal punto que llega
a ser casi imperceptible a la
vista.

IV. Discusin de los resultados

Una de las coloraciones diferenciales ms aplicadas en microbiologa, la tincin Gram,
fue inventada por el mdico dans Christian Gram en 1884, cuando buscaba nuevos
mtodos para colorar bacterias. Dicha tincin consiste en tratar un frotis con un
compuesto de la pararosanilina (como por ejemplo, el cristal violeta, luego con una
solucin de ioduro de potasio (lugol), decolorarlo con alcohol y finalmente tratarlo con
un colorante llamado contraste (que puede ser la fucsina, safranina, marrn Bismarck,
etc). Las bacterias que no pierden el primer colorante luego de ser tratadas con alcohol,
apareciendo de color violeta, se llaman Gram positivas. Y aquellas que se decoloran con
el alcohol y se decoloran con el segundo colorante o de contraste, apareciendo teidas
de rosado, se denominan Gram negativas. As, este mtodo sirve para distinguir dos
grandes grupos de bacterias. (Garassini L.; 1958).
En la prctica, se trabajo con tres muestras de bacterias: La Escherichia coli, un bacilo
Gram negativo relacionado con las vas entricas (patgeno dentro y fuera de la misma),
es la causa ms comn de infecciones de las vas urinarias y de sepsis por bacilos Gram
negativos. Es una de las dos causas ms importantes de meningitis neonatal agente que
ms a menudo acompaa a la diarrea del viajero; tambin es el anaerobio facultativo
ms abundante en colon y heces. El bacillus cereus, un bacilo Gram positivo, que al
igual que los bacillos Gram positivos, es un formador de esporas, y es importante en
medicina debido a que causa intoxicacin alimentaria. Y por ltimo, el Staphylococcus
aureus, que al igual que los dems estafilococos, son cocos esfricos ordenados a
menudo en grupos irregulares, siendo un genero importante en medicina junto con el
gnero Streptococus, y careciendo de aparato locomotor y la habilidad de formar
esporas. (Wevinson W, Jawtz E.; 1999).

La propiedad de retener el colorante es una particularidad caracterstica no solo de

bacterias sino tambin de levaduras, pero esta propiedad puede variar con la edad de la
bacteria y con el pH. Del medio principalmente, pues se observa que cuanto ms joven
es el cultivo ms fuertemente reaccionan los microorganismos Gram positivos,
perdiendo esta propiedad a medida que el cultivo envejece, transformndose en Gram
negativos (Garassini L.; 1958). Se vuelven Gram negativos debido a que se tien por la
safranina. Anlogo efecto produce en ocasiones por cambios en el medio del organismo,
o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la prctica. Por este motivo, es preciso
atenerse, en la prctica del procedimiento establecido (Pelczar M., Reid R.; 1966). Un
ejemplo de mala praxis en la prctica, es dejar que el decolorante (el alcohol) acte
durante largo tiempo (en vez de echar unas cuantas gotas a modo de lavado, como se
recomienda en la mayora de los manuales, aplicar una gran dosis y/o dejar reposar el
decolorante por mucho tiempo) en la muestra. Consecuencia de ello es que los
organismos Gram positivos pueden decolorarse tambin, de manera que despus de que
la tincin se completa, aparecern como Gram negativos. Por otra parte, si la
decoloracin no se lleva a cabo durante tiempo suficiente (respetar el tiempo establecido
en la prctica de cada colorante), los organismos Gram negativos pueden aparecer como
Gram positivos. Por lo tanto, se necesita mucha prctica antes de llevar a cabo la tincin
de gran con xito (Burdon K., Williams R.; 1971).
Este distinto comportamiento de las bacterias se basa en la propiedad que tienen los
colorantes bsicos, derivados de la pararosanilina, de formar en presencia de soluciones
ioduradas, compuestos iodados, que se fijan intensamente sobre ciertas sustancias,
combinndose con ellos en forma estable y que los disolventes tardan en descolorar
(Garassini L.; 1958).
El cuerpo citoplasmtico de algunas bacterias contienen dichas sustancias, fijndose,
por lo tanto, el primer colorante fuertemente al actuar la solucin de lugol. Los
microorganismos, cuyo citoplasma no se combina con los compuestos iodurados del
cristal violeta, al tratarlos con el alcohol se descoloran y pierden este colorante, y al
tratarlos con otros colorantes se coloran nuevamente (Garassini L.; 1958).
Benians afirma que el yodo forma con e lvioleta genciana una gran molcula soluble en
el alcohol, que es arrastrada de las bacterias Gram negativas, y que retienen las Gram
positivas; la diferencia se debera a la distinta permeabilidad de la membrana celular en
los dos tipos de bacterias. Chruchman cree que los microorganismos Gram positivos
poseen una zona cortical que es responsable de la retencin del colorante. Stearns y
Atarns han demostrado que las protenas de las bacterias Gram positivas tienen un punto
isoelctrico ms cido que las de las Gram negativas, lo que explica por qu estos
microorganismos muestran mayor afinidad por los colorantes bsicos (Merchant I.,
Packer R.; 1970).
Una hiptesis sugiere que en las bacterias quedan reaccin positiva (que retiene el
cristal violeta) existe un complejo especial de magnesio-cido ribonucleico-protenahidrato de carbono, el cual forma un compuesto insoluble con el colorante y el iodo.

Una de las observaciones que apoyan esta hiptesis es el hecho de que, tratando las
bacterias gram-positivas con la enzima ribonucleasa, se hacen gran-negativas; la
ribonucleasa degrada el cido ribonucleico, y destruye as el complejo que se une al
colorante. (Pelczar M. Reid R.; 1966).
Deuszen afirma que la tincin de Gram se debe a una reaccin qumica dependiente de
la propiedad de la nucleoprotena bacteriana de formar nuevos compuestos. La teora de
Churchman ha sido reforzada cerca a la dcada de los setenta por Henry y Stacey,
quienes han logrado despojar a las bacterias Gram positivas de una parte escencial de su
material Gram positivo, dejando citoesqueletos y un extracto Gram negativos. Los
investigadores mencionados lograron obtener estos resultados realizando un extracto de
bacterias lavadas a 60oC con una solucin acuosa de una sal biliar al 2%, en presencia
de oxgeno. El producto extrado puede precipitarse por el alcohol y consiste en
ribonucleato de magnesio, polisacridos inertes y vestigios de protenas. Fue posible
devolver la Gram positividad a las bacterias aplicando el extracto al citoesqueleto.
Las bacterias fundamentalmente Gram negativas no responden a esta tcnica
(Merchant I., Packer R.; 1970).
Una nueva prueba en apoyo de sus investigaciones lo lograron Henry y Stacey cuando
consiguieron convertir en Gram negativas algunas especies conocidas por su Gram
positivdad, como Streptococcus salivarius cultivndolo en medio totalmente desprovisto
de magnesio (Merchant I., Packer R.; 1970).
De todas las citas mencionadas, en sntesis, se concluye que la explicacin ms
aceptable de la tincin Gram es que el material Gram positivo es un complejo macromolecular, formado por la combinacin de un substrato proteico bsico reducido, con
ribonucleato magnsico (Merchant I., Packer R.; 1970).
Una vez explicado el complejo que se forma en las Gram positivas y les da el color
caracterstico diferencial, se explicar a continuacin el porqu dicho material no se
escapa de las Gram positivas pero si de las Gram negativas una vez que se usa el
decolorante.
Burdon K. y Williams R. (1971) nos sugieren que el carcter especial de las paredes
celulares de los organismos Gram negativos puede ser el factor determinante. Estas
paredes celulares son relativamente delgadas y contienen abundante material graso
(quiz diez veces ms lpidos que en las paredes de las clulas Gram positivas). Se ha
supuesto que la permeabilidad de las paredes celulares de los organismos Gram
positivos puede disminuirse por efecto de deshidratacin al entrar en contacto con el
alcohol. El alcohol puede aumentar la permeabilidad de los Gram negativos por la
extraccin de los lpidos de la pared celular hecho que permite el escape rpido del
complejo yodo violeta de cristal.
Pelczar M. y Reid R. (1966) nos explican casi lo mismo: Los organismos Gram
negativos tienen un elevado contenido graso en sus paredes celulares, ascendiendo hasta
el 20% de dichas paredes. Las pruebas experimentales muestran que, durante la prctica

del procedimiento, el tratamiento alcohlico extrae las grasas, aumentando la porosidad

o permeabilidad de la pared celular en los microorganismos Gram negativos. El
complejo cristal violeta-iodo se extrae as por el alcohol, y el organismo Gram negativo
se decolora. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas, a causa de su
diferente composicin, se deshidratan por el alcohol, el tamao de los poros disminuye,
se reduce la permeabilidad, y el complejo cristal violeta-iodo no se extrae.
Una explicacin ms actual (siglo 21) proviene de Madigan M., Martinko J., Dunlan
P. y Clarck D. (2009), dichos autores nos explican lo siguiente: Las diferencias
estructurales entre las paredes celulares de bacterias Gram positivas y Gram negativas
son las responsables del diferente comportamiento de las clulas en la tincin Gram. En
dicha tincin, se forma dentro de las clulas un complejo insoluble cristal violeta-yodo
que en el caso de las Gran negativas puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram
positivas. Las bacterias Gram positivas tienen paredes celulares muy gruesas
compuestas por varias capas de peptidoglicano (representando el 90% del material de la
pared celular). stas se deshidratan por el alcohol, provocando el cierre de los poros de
las paredes e impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. Por el contrario, en
las Gram negativas el alcohol penetra rpidamente en la capa externa que es rica en
lpidos y la fina capa de peptidoglicano (representando un total del 10% de la pared
celular) no impide el paso del solvente u la extraccin del complejo. Despus del
tratamiento con alcohol, las bacterias Gram negativas son casi invisibles a menos que
reciban una tincin de contraste con un segundo colorante en la tincin de Gram.
Prescott L., Harley J. y Klein D. (2002) nos explican bsicamente lo mismo que los
autores del prrafo anterior, salvo con ciertas anotaciones: La retencin del colorante, en
Gram positivas, se debe a que el alcohol contrae los poros de la gruesa capa de
peptidoglicano. En consecuencia, el complejo colorante-yodo no es eliminado durante la
fase de decoloracin u las bacterias continuarn de color morado. Por el contrario, la
capa de peptidogliano de las bacterias Gram negativas es muy fina, sin tantos enlaces y
con poros de mayor tamao, adems, tambin es posible que el tratamiento con alcohol
extraiga suficientes lpidos de la envoltura de las clulas Gram negativas, como para
aumentar su porosidad. Por estos motivos, el alcohol elimina ms eficientemente el
complejo cristal violeta-yodo en las bacterias Gram negativas.
Con estas citas se concluye, que la naturaleza fsica de las paredes de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas, influyen bastante en evitar el escape del complejo cristal
violeta-yodo que se forma dentro de las bacterias. Adems, recalca la existencia de
dicho complejo que se forma en el interior de las clulas, y que les da el color
caracterstico de dicha tincin: morado o violeta.

V. Conclusiones

- La tincin diferencial de Gram efectivamente muestra la existencia de dos grandes

grupos de Bacterias: Las Gram positivas y las Gram negativas, tindose de morado y
rojo, respectivamente. Dichas bacterias se diferencian principalmente en la estructura de
su pared celular.
- Dicha tincin se fundamenta en la formacin de un complejo insoluble cristal violetayodo en el interior de las clulas, el cual da el color morado caracterstico de la tincin
Gram. Dicho complejo, una vez utilizado el decolorante, es retenido en las bacterias
Gram positivas y en las Gram negativas no, esto debido a la diferencia de la estructura
de sus paredes celulares: las Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano y
las Gram negativas una delgada capa de peptidoglicano junto con una pared externa,
adems de otras inclusiones en ambos casos.
- Es preciso atenerse al procedimiento establecido en la prctica, adems de desarrollar
la habilidad de manejo. Esto debido a que una mala praxis puede traer consigo
consecuencias no deseadas. Ambas observaciones en conjunto, aseguran el xito de la
prctica a desarrollar.

IV. Bibliografa
- Burdon K., Williams R. 1971. Microbiologa. Primera Edicin en espaol.
Publicaciones Cultural, S.A. Mxico, D.F.
- Garassini L. 1958. Microbiologa. Primera Edicin. Editorial Sucre C.A. Venezuela.
- Madigan M., Martinko J., Dunlan P., Clark D. 2009. Biologa de los microorganismos.
Duodcima edicin. Pearson Educacin, S.A. Madrid, Espaa.
- Merchant I., Packer. 1970. Bacteriologa y virologa veterinarias. Tercera Edicin
espaola-Primera reimpresin. Editorial Acribia. Espaa.
- Pelczar M., Reid R. 1966. Microbiologa. Segunda Edicin. Ediciones Castilla, S.A.
Madrid, Espaa. Prescott L., Harley J., Klein D. 2002. Microbiologa. Quinta Edicin.
Mc Graw Hill. Espaa.
- Wevinson W., Jawtz E. 1999. Microbiologa e inmunologa: Autoevaluacin y repaso.
Segunda Edicin en espaol, traducida de la segunda y tercera ediciones en ingles.
Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. Mxico, D.F.