Lineamientos Vig Epid Laboratorio EFE

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA
DE LA ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICA POR

LABORATORIO
DGE-InDRE-RNLSP
2014
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 1 de 67
enero 2014
PRIMERA EDICIN, 2014
ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICARNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el grupo
Tcnico Interinstitucional del Comit Nacional de Vigilancia Epidemiolgica (CoNaVE).
TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,

INDRE-DGE-SECRETARA DE SALUD
SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: LINEAMIENTOS

PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DE LA ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMTICA POR LABORATORIO VERSIN NO. 01. INDRE, 2014.
COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE:

ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS.

Francisco P Miranda 177 bis, Col. Lomas de Plateros Del. lvaro Obregn, C. P. 01480, Mxico,
D. F.
www.indre.salud.gob.mx
Tel. (55)53-42-75-50
LA EDICIN ESTUVO A CARGO

ALBERTO DAZ QUIONEZ
DE:
DRA. MA.
DEL
CARMEN GUZMN BRACHO, DR. JOS
EL DISEO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LPEZ
IMPRESO EN MXICO. PRINTED IN MEXICO
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 2 de 67
enero 2014
SECRETARA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LPEZ
SECRETARIO DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD
DR. CUITLHUAC RUZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA
DRA. MARA EUGENIA JIMNEZ CORONA
DIRECTORA GENERAL ADJUNTO DE EPIDEMIOLOGA
DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 3 de 67
enero 2014
INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
M. EN C. IRMA LPEZ MARTNEZ
DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO
LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO
SUBDIRECTORA DE OPERACIN
BIOL. NORMA ANGLICA MONTES COLIMA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA
QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY
ASESORA TCNICA DE LA DIRECCIN
QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M. EN C. MAYRA GISELA MELNDEZ HERNNDEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA
M. EN C. JUDITH ESTVEZ RAMREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOS ERNESTO RAMREZ GONZLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y
VALIDACIN DE TCNICAS
M. EN C. BELN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA
QFB. EDITH CRUZ RAMREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMTICAS (EFE)
COORDINADORA DE LA RED DE EFE
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 4 de 67
enero 2014
AUTORES
QFB. EDITH CRUZ RAMREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMTICAS (EFE)
COORDINADORA DE LA RED DE EFE
M. EN C. IRMA LPEZ MARTNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA
DR. JOS ERNESTO RAMREZ GONZLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y
VALIDACIN DE TCNICAS
QFB. SILVIA GONZLEZ MATEOS
ADSCRITA AL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMTICAS
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 5 de 67
enero 2014
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLGICA DE LA ENFERMEDAD
FEBRIL EXANTEMTICA POR
LABORATORIO
DGE-InDRERNLSP
2014
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 6 de 67
enero 2014
NDICE
INTRODUCCIN ............................................................................................................................... 8
ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
FEBRILES EXANTEMTICAS (EFES) .......................................................................................... 8
RED NACIONAL PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMTICA............................................................................................................................. 10
MARCO LEGAL ................................................................................................................................ 11
OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 11
Objetivo general .................................................................................................................................... 11
Objetivos especficos.............................................................................................................................. 11
ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD
FEBRIL EXANTEMTICA ............................................................................................................. 12
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMTICA............................................................................................................................. 12
Funciones del laboratorio nacional de referencia .................................................................................. 12
Funciones de los laboratorios estatales .................................................................................................. 13
Funciones de la coordinacin de la RNLSP ......................................................................................... 14
DEFINICIONES OPERACIONALES DE ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICA ... 14
TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRAS .............................................................................. 15
ALGORITMOS DE DIAGNSTICO ............................................................................................ 17
ESTNDARES DE CALIDAD........................................................................................................ 23
Captura de datos y emisin de resultados ............................................................................................. 23
PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) .......................... 24
Criterios para la liberacin del diagnstico de Sarampin y Rubola ................................................... 25
BANCO DE MATERIAL BIOLGICO ........................................................................................ 26
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES........................................................................................... 28
BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................. 29
ANEXOS .............................................................................................................................................. 31
TCNICAS DIAGNSTICAS......................................................................................................... 32
CARACTERSTICAS DE LOS EQUIPOS COMERCIALES ..................................................... 33
PREPARACIN DE REACTIVOS ................................................................................................. 34
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 7 de 67
enero 2014
INTRODUCCIN
En los aos 1990s, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) seal que el mundo estaba a un
paso de la eliminacin del sarampin, una enfermedad altamente infecciosa. Hoy esta perspectiva se
ve seriamente amenazada por el resurgimiento de este padecimiento en varios pases. De acuerdo a
la informacin de esta organizacin, en el periodo de enero a mayo del 2011 se han presentado
brotes de sarampin en 24 pases de Europa donde se han notificado ms de 6,500 casos. Entre los
pases con brotes destacan Francia que enfrent un brote con un acumulado de cerca de 5,000 casos
y Espaa que report ms de 800 casos en brotes desde octubre del 2010.
La situacin del incremento del sarampin ha sido revisada en la Asamblea Anual de la OMS,
organizacin que ha adoptado como objetivos concretos relacionados con el sarampin para el 2015,
alcanzar una cobertura del 90% en las campaas de inmunizacin a nivel nacional y del 80% en cada
distrito, lo que reducira los casos de sarampin a menos de cinco por un milln y la mortalidad en
un 95%, comparado con cifras del 2000.
En Mxico, el decremento de casos y defunciones por sarampin ha sido extremadamente notorio al
pasar de 68,782 casos en 1990 a solo dos en 1996, de 1997 a 1999 no se registr ningn caso y del
2000 a la fecha se han identificado un total de 167 casos de sarampin considerados como
importados. A partir del ao de 2007 no se han presentado casos de sarampin en el pas.
El 42% de los casos de sarampin en el ltimo ao en Amrica Latina han sido debido a la visita de
personas a pases con transmisin activa. No obstante la ausencia de casos en los ltimos cuatro aos
en Mxico, existe un incremento en el riesgo epidemiolgico de una reintroduccin del virus al pas
debido al aumento que se ha observado en otros pases.
La funcin permanente y primordial del Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemticas
(LEFE) del Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos (InDRE) (LEFE-InDRE), es
mantener la vigilancia epidemiolgica de las Enfermedades Febriles Exantemticas en nuestro pas,
identificando casos probables de tener la enfermedad y confirmarlos mediante pruebas de
laboratorio especializadas.
Antecedentes de la RNLSP para el Diagnstico de Enfermedades Febriles Exantemticas (EFES)
El Laboratorio de Enfermedades Virales se constituy en 1972 dentro del Instituto de Salubridad y
Enfermedades Tropicales (ISET), como resultado de un programa organizado por la Organizacin
de las Naciones Unidas (ONU) para el desarrollo de Laboratorios en Amrica Latina.
En 1973 qued estructurado con los siguientes laboratorios: virus exantemticos, enterovirus,
teratognicos, hepatitis A y B, respiratorios y Rickettsia sp. Fue hasta 1983 que se transform en
Departamento de Diagnstico de Enfermedades Virales.
A partir de 1992, Mxico pertenece a la red de laboratorios para el diagnstico de sarampin y
rubola donde el rgano rector es la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS). En diciembre
de ese mismo ao se estructur la Red Nacional de Laboratorios de Diagnstico Etiolgico de
Enfermedad Febril Exantemtica (RNLEFE) en el InDRE con la finalidad de promover el
diagnstico etiolgico de los cuadros de enfermedad febril exantemtica principalmente sarampin y
rubola, as como para apoyar los programas de control epidemiolgico de las mismas,
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 8 de 67
enero 2014
particularmente el Programa de Eliminacin del Sarampin en Mxico. Inicialmente, se integraron

a la red 7 laboratorios perifricos (Estatales) en los estados de Guerrero, Jalisco, Mxico, Nuevo
Len, Sonora, Veracruz y Yucatn; el Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemticas
(EFES) como laboratorio de referencia ubicado en el Departamento de Virologa Diagnstica del
Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos (InDRE) y la Subdireccin de Apoyo a la
Red Nacional de Laboratorios.
A partir de 1993 se realizaron actividades de capacitacin al personal operativo de diferentes
disciplinas de los laboratorios restantes con la finalidad de que incorporaran a la red de laboratorios,
en este perodo la ltima capacitacin se realiz en 1998.
El laboratorio de enfermedades febriles exantemticas de forma conjunta con la Direccin General
Adjunta de Epidemiologa (DGAE) son los responsables de la vigilancia epidemiolgica del
sarampin y la rubola, en el mbito federal.
En el 2002 la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP) se incorpor al Programa
Caminando a la Excelencia, programa cuya finalidad es evaluar el desempeo analtico de los
estados en relacin a los programas prioritarios de salud.
A partir del 2006 se preparan y envan los paneles de eficiencia a los laboratorios estatales para
medir el indicador evaluacin del desempeo. Esta actividad se ha venido realizando ao con ao
desde entonces y hasta la fecha.
En el ao 2007 en el InDRE se realiz el taller sobre tcnicas para el aislamiento y deteccin del
virus de sarampin y rubola a nivel internacional en colaboracin con los Centros de Control y
Prevencin de Enfermedades (CDC, por sus siglas en ingls) y La Organizacin Panamericana de
la Salud (OPS).
A partir de 2008 se realiza el Programa de Evaluacin Externa del Desempeo (PEED) dos veces
por ao mediante la ejecucin de un panel serolgico. Este laboratorio efecta la evaluacin a
aquellos laboratorios estatales que tienen implementado el diagnstico serolgico de Sarampin y
Rubeola para ratificar el desempeo tcnico de los mismos.
Fue en 2009 cuando se retomaron los cursos de actualizacin para el diagnstico de Sarampin y
Rubola con la finalidad de apoyar el proyecto para eliminar el Sarampin y la Rubola en 2010 en
Latinoamrica.
Durante 2010 se integr a la red de laboratorios de enfermedad febril exantemtica el ltimo
laboratorio estatal, para quedar conformada como se encuentra actualmente, por 31 Laboratorios
Estatales y un Laboratorio Nacional de Referencia (InDRE). Tambin se realiz un taller de
actualizacin en apoyo a las actividades a realizar para cumplir con el objetivo de la eliminacin del
sarampin y la rubola en Mxico.
En el curso de actualizacin para la red de laboratorios, que se imparti en 2011, se dieron a conocer
las modificaciones a los lineamientos de la enfermedad febril exantemtica para la vigilancia
epidemiolgica y se capacit a los asistentes en la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction, PCR, por sus siglas en ingls) en tiempo real, para que cada
laboratorio estatal lo implementara como parte de la metodologa de diagnstico en sus respectivos
laboratorios.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 9 de 67
enero 2014
A lo largo del brote de sarampin que afect a nuestro pas en el ao 2011, se realizaron diversas
actividades de diagnstico para dar respuesta inmediata a los requerimientos del momento. En la
actualidad, el laboratorio de EFES est realizando tcnicas serolgicas para el diagnstico de
sarampin y rubola, adems de la serologa para parvovirus B-19, Epstein Bar, varicela y parotiditis
como diagnstico diferencial, adems del diagnstico molecular de sarampin y rubola por tcnicas
de biologa molecular. Es as como han quedado consolidadas a travs de estos aos las funciones de
referencia para la Red de Laboratorios de Enfermedad Febril Exantemtica, conformada por 31
Laboratorios Estatales mediante la evaluacin de concordancia y desempeo.
Por ltimo, en el 2012 el LEFE-InDRE fue la sede del taller sobre identificacin y genotipificacin
de los virus de sarampin y rubola por tcnicas de RT-PCR en tiempo real y secuenciacin, siendo
anfitrin de diez pases de Amrica Latina. El evento fue auspiciado y coordinado por la OPS, el
CDC de Atlanta, Estados Unidos y el InDRE. El objetivo de este taller fue revisar el estatus de la
eliminacin del sarampin y la rubola en Latinoamrica.
RED NACIONAL
EXANTEMTICA.
PARA
LA
VIGILANCIA
DE
ENFERMEDAD
FEBRIL
Laboratorios estatales que estn integrados a la red de EFES

Laboratorio de EFES del InDRE (rgano rector)
Figura. 1. Conformacin de la Red de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP)
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 10 de 67
enero 2014
MARCO LEGAL
1. Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. Artculo 4. DOF 05/02/1917,
ltima Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artculo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF
7/02/1984, ltima Reforma D.O.F. 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiolgica. DOF:
19/02/2013.
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Proteccin ambiental-salud
ambiental-residuos peligrosos biolgico-infecciosos-clasificacin y especificaciones de
manejo.
5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las caractersticas,
el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos.
DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organizacin y funcionamiento de
los laboratorios clnicos. (DOF del 27 de marzo de 2012).
7. Secretara de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la Federacin
DOF: 12/12/2013.
8. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federacin, DOF: 20/05/2013,
www.dof.gob.mx
9. Secretara de Salud. Programa de Accin Especfico 2013-2018. Sistema Nacional de
Vigilancia Epidemiolgica, primera edicin 2014.
10. Lineamientos para programas de evaluacin externa del desempeo de la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pblica, InDRE- Secretara de Salud, 2014.
11. Criterios de Operacin para la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, InDRESecretara de Salud, 2014.
OBJETIVOS
Objetivo general
Establecer los procedimientos para la aplicacin del algoritmo de diagnstico para la Enfermedad
Febril Exantemtica y establecer el manejo adecuado de la informacin generada por laboratorio, a
travs de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP), en apoyo a la vigilancia
epidemiolgica de sarampin y rubola.
Objetivos especficos
Mantener la vigilancia virolgica de los agentes biolgicos causantes de las enfermedades febriles
exantemticas.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 11 de 67
enero 2014
Identificar la circulacin del virus de sarampin o rubola en Mxico.

Caracterizar la secuencia genmica de los virus identificados en caso aparicin por importacin
del virus o en caso de brote.
Delimitar las responsabilidades, mbito de competencia de las diferentes reas que integran la
red de laboratorios y, a su vez, servir de apoyo en la capacitacin del personal de laboratorio,
personal de nuevo ingreso (servidores pblicos de otros laboratorios locales) y de otras entidades
del sector salud o sector privado.
ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD

FEBRIL EXANTEMTICA
La RNLSP para el diagnstico de Enfermedad Febril Exantemtica est basada en los siguientes
niveles de organizacin:
1. Laboratorio Nacional de Referencia (InDRE)
2. Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP)
3. Coordinacin de la Red de LESP (CNRLSP)
Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemticas (LEFE)-InDRE
(Laboratorio Nacional de Referencia)
Muestras
Resultados
Control de calidad o Referencia de EFES

(Laboratorios Estatales)
Figura. 2 Interaccin dela RNLSP para el Diagnstico de Enfermedades Febriles Exantemticas
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD FEBRIL

EXANTEMTICA
Funciones del laboratorio nacional de referencia
1. Realizar la determinacin de anticuerpos IgM e IgG antisarampin y antirubola por la tcnica
de Ensayo por Inmunoabsorcin Ligado a Enzimas (ELISA, por sus siglas en ingls) para
diagnstico de sarampin, rubola y rubola congnita, siendo la capacidad instalada para 250
muestras semanales con un estndar de servicio de 4 das segn algoritmo.
2. Realizar la determinacin de anticuerpos IgM antisarampin y antirubola como control de
calidad a los Laboratorios Estatales (2% de muestras negativas y 100% de muestras positivas).
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 12 de 67
enero 2014
3. Realizar el aislamiento viral para sarampin en clulas Vero Slam como prueba de referencia.
Capacidad instalada 80 muestras semanales.
4. Realizar el aislamiento viral para rubola en clulas Vero y Vero Slam como prueba de referencia
para rubola y rubola congnita. Capacidad instalada 80 muestras semanales.
5. Realizar el diagnstico de sarampin y rubola mediante pruebas de biologa molecular (RT
PCR punto final y RT PCR tiempo real) a partir de muestras biolgicas como orina y exudado
farngeo. Capacidad instalada 60 muestras semanales.
6. Realizar la secuenciacin genmica por biologa molecular para sarampin y rubola, en los
casos confirmados.
7. Realizar el diagnstico serolgico diferencial por ELISA para Epstein Barr, Parvovirus B19,
Parotiditis y Varicela.
8. Reportar resultados serolgicos de sarampin y rubola en un lapso no mayor a 4 das naturales a
los usuarios.
9. Evaluar el desempeo tcnico de los laboratorios integrantes de la Red de EFES que realizan el
diagnstico serolgico de sarampin y rubola.
10. Actualizar a los laboratorios estatales por medio de capacitaciones para el diagnstico serolgico
de EFES as como en los lineamientos vigentes.
11. Participar en la evaluacin internacional del desempeo para diagnstico serolgico de
sarampin y rubola mediante el procesamiento de un panel de sueros enviado por los
organismos internacionales como OPS y CDC por ser pas colaborador en la regin de Amrica.
12. Enviar 20 muestras negativas, 20 muestras positivas y 20 muestras indeterminadas al CDC
como parte de la evaluacin externa por parte de la red de laboratorios para sarampin y rubola
de la regin de Amrica (OPS).
13. Realizar talleres de actualizacin en el diagnstico de sarampin y rubola dirigido a la red de
LESP de EFES.
14. Asistir a reuniones internacionales para presentar los resultados de la RNLSP de enfermedad
febril exantemtica.
15. Asistir a reuniones nacionales para el dictamen de los casos de rubola y rubola congnita como
parte de la vigilancia epidemiolgica.
16. Proporcionar reactivos (medio de transporte viral y controles positivos a sarampin) a los
laboratorios estatales o jurisdicciones sanitarias que lo soliciten.
17. Elaborar el boletn Caminando a la Excelencia con los resultados de concordancia y evaluacin
del desempeo para sarampin y rubola.
18. Realizar evaluaciones de estuches comerciales para el diagnstico de sarampin y rubola.
Funciones de los laboratorios estatales
1. Realizar el diagnstico serolgico de sarampin mediante la determinacin de anticuerpos IgM
por ELISA
2. Realizar el diagnstico serolgico de rubola mediante la determinacin de anticuerpos IgM por
ELISA, para el diagnstico de rubola y rubola congnita.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 13 de 67
enero 2014
3. Enviar al InDRE muestras de exudado farngeo y orina para la RT-PCR y el aislamiento viral
para sarampin y rubola.
4. Enviar al InDRE el 2% de muestras negativas y el 100% de muestras positivas para el control de
calidad por serologa de sarampin y rubola y RT-PCR de sarampin.
5. Reportar resultados en un lapso de 4 das naturales al departamento de epidemiologa de los
servicios estatales de salud y al usuario.
6. Enviar al InDRE un informe semanal del procesamiento de muestras para ambos diagnsticos.
7. Procesar un panel de sueros para el diagnstico de sarampin y rubola como parte de la
evaluacin del desempeo enviado por el InDRE.
8. Realizar RT-PCR en tiempo real para sarampin.
Funciones de la coordinacin de la RNLSP
1. Mantener una relacin permanente con los laboratorios estatales de la red LESP de EFES y el
laboratorio nacional de referencia.
2. Coordinar el envo de paneles de sueros como parte de la evaluacin del desempeo de los
laboratorios estatales pertenecientes a la red.
3. Coordinar la entrega de medio de transporte viral y controles positivos a los laboratorios
estatales o jurisdicciones sanitarias que lo soliciten.
4. Elaborar el boletn Caminando a la Excelencia para sarampin y rubola.
5. Enviar documentacin oficial con informacin relevante para la red de EFES.
DEFINICIONES OPERACIONALES DE ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICA

Caso Sospechoso: Toda persona de cualquier edad con cuadro de fiebre y exantema.
Caso probable: Persona de cualquier edad que presente fiebre, exantema maculopapular sin importar
la duracin del mismo y uno o ms de los siguientes signos y sntomas: tos, coriza y/o conjuntivitis.
Caso confirmado: Todo caso probable en el que se demuestre infeccin reciente mediante tcnicas
de laboratorio, Defuncin de caso probable en el que no se disponga de resultado de laboratorio y
que est asociado epidemiolgicamente a otro caso confirmado.
Caso descartado: Todo caso probable en el que se descarte infeccin reciente mediante tcnicas de
laboratorio. Todo caso probable que no contando con muestras para diagnstico por laboratorio,
cuenta con evidencia clnico-epidemiolgica suficiente para establecer un diagnstico diferente a
sarampin o rubola.
Caso de Sarampin confirmado como temporalmente relacionado con la vacunacin: Es aquel caso
probable de Sarampin que se ha presentado dentro de los 30 das posteriores a la administracin de
la vacuna AS, y que despus de haber terminado la investigacin del caso:
No se logra identificar alguna entidad nosolgica especfica, ajena a la vacunacin, como causa
de los signos y sntomas presentados.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 14 de 67
enero 2014
Los signos y sntomas presentados pueden ser explicados por el efecto de la o las vacunas
aplicadas.
Los signos y sntomas presentados estn reportados en la literatura mundial como evidencias que
favorecen o establecen una relacin causal con la o las vacunas aplicadas.
Definicin operacional de caso de Sndrome de Rubola Congnita (SRC)

Caso Sospechoso: Lactante de un ao en quien se sospecha de SRC debido a que:
a. Se detecta una o ms de las anormalidades: patologa ocular congnita (de tipo catarata,
disminucin de la visin, nistagmus, estrabismo, micro-oftalmos, glaucoma), defectos cardiacos
congnitos, prpura o hipoacusia y/o.
b. Historia de infeccin por rubola (confirmada o sospechosa) de la madre durante el embarazo.
Caso confirmado: Un caso podr ser confirmado por clnica o por laboratorio.
TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRAS
Suero
Para el diagnstico de enfermedad febril exantemtica enviar el suero de 0-35 das de evolucin, de
1.0 a 3.0 mL, no lipmico y no contaminado en un tubo con tapn de rosca. Con informacin
completa (fecha inicio del exantema, fecha de toma de la muestra, sintomatologa y fecha de
vacunacin). Para control de calidad, enviar marca del estuche, fecha de caducidad, resultado con
lecturas e interpretacin (negativos o positivos) y la informacin completa del paciente. Para
referencia, enviar las muestras indeterminadas con informacin completa del paciente como se
mencion anteriormente. En caso de una segunda muestra, tomarla 15 das despus de la primera
toma. Enviar en condiciones de refrigeracin (4-8 C).
Lquido cefalorraqudeo (LCR)
Para el diagnstico de Sarampin, Rubola, Epstein Barr, Varicela y Parvovirus B-19, enviar el
LCR con el formato de envo de muestra debidamente completado con fecha de inicio de sntomas,
fecha de toma y sintomatologa. En un tubo con tapn de rosca. Transportar en condiciones de
refrigeracin (4-8 C).
Exudado farngeo
Para diagnstico de enfermedades exantemticas tomar la muestra durante los 5 das inmediatos a la
aparicin del exantema. Enviar en medio de transporte viral en un tubo con tapn de rosca, con el
formato de envo de muestra completado con fecha de inicio del exantema, fecha de toma,
sintomatologa y fecha de vacunacin. Enviar las muestras a 4-8 C en un lapso no mayor a 24 horas
despus de la toma de la misma.
Orina
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 15 de 67
enero 2014
Para el diagnstico de enfermedades exantemticas tomar la primera muestra de la maana entre el

da 0 y 5 despus de la aparicin del exantema. Para tratar la orina, centrifugar a 1500 rpm durante
10 minutos, decantar y al sedimento adicionar 2.0 mL de medio de transporte viral en un tubo con
tapn de rosca. Enviar la muestra con el formato de envo de muestra completado con fecha de
inicio de exantema, fecha de toma, sintomatologa y fecha de vacunacin. Se enva en condiciones
de refrigeracin (4-8 C) y el tiempo de llegada al laboratorio no debe exceder de 24 horas despus
de haber tomado la muestra.
Para rubola congnita
Tipo de muestra Condiciones de toma
Suero
Del nacimiento hasta 12 meses
Transportar en condiciones de refrigeracin dentro de
las primeras 48 horas
Exudado
Del nacimiento hasta los 12 meses.
farngeo o
Hisopo en medio de transporte viral(MTV)
nasofarngeo
Orina
Del nacimiento hasta los 12 meses
10-50 mL. en recipiente estril
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Tcnica
Determinacin de
anticuerpos por
ELISA IgM e IgG
rRT-PCR y
aislamiento viral y
secuenciacin
rRT-PCR y
aislamiento viral y
secuenciacin
Pgina 16 de 67
enero 2014
Algoritmos de diagnstico
MARCO JURIDICO NORMA

Oficial Mexicana NOM-017SSA2-2012
Figura. 3. Algoritmo para el diagnstico de enfermedad febril exantemtica Claves del tabulador:
1A35110-02, 1A35110-03, 1A35130-01, 1A35130-02
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 17 de 67
enero 2014
RESULTADOS 30 DIAS

Figura. 4. Algoritmo para el aislamiento viral de Sarampin y Rubeola Claves del tabulador:
1A35110-01, 1A35130-03
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 18 de 67
enero 2014
Algoritmos realizados en los laboratorios de apoyo al LEFE
Registro en
el laboratorio
Recepcin de la
muestra
Registro en
La Red InDRE
Muestras de cultivo celular, exudado farngeo u orina
Extraccin de RNA
RT-PCR
PCR ANIDADO
Positivo
Electroforesis
Negativo
SECUENCIACIN
Reportar al
Laboratorio de
EFES
MARCO JURIDICO
NORMA Oficial Mexicana
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 5. Algoritmo de diagnstico molecular de Rubola Clave de tabulador: (1A3513004)
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 19 de 67
enero 2014
Recepcin de
la muestra
Registro en
el laboratorio
Registro en
La Red InDRE
Muestras clnicas: Exudado farngeo, orina o cultivo celular
Extraccin de RNA
RT PCR con iniciadores
59 y 63
Electroforesis
RT PCR con iniciadores
41 y 44
PCR Anidado con

iniciadores 59 y 63N
Electroforesis
Negativo
Reportar al
laboratorio de
EFES
Positivo
Secuenciacin
Enviar al Laboratorio
Genoma de patgenos
(GNMP)
MARCO JURIDICO
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 6. Algoritmo de diagnstico molecular de sarampin Clave de tabulador: (1A3511004)
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 20 de 67
enero 2014
Muestra
Exudado farngeo y orina
Tratamiento de muestras
RT PCR en Tiempo Real

a) Sarampin
b) Rubola
Resultado
Negativo
Positivo
Enviar muestra a
LPMS
Negativo
Procesar muestra
PCR Punto final
sarampin y
rubola LPMS
Positivo
Realizar Informe de
Resultados
Enviar informe a
LEFE
Verificar y aprobar
Informe de resultados
Enviar muestra a
GNMP
El Informe de
Resultados cumple
con los requisitos?
Si
Entregar Informe de
Resultados y Expediente
a REMU/InDRE
No
Corregir
informe
Realizar
Secuenciacin
Genmica

Figura. 7. Algoritmo de diagnstico molecular de Sarampin y Rubola por RT PCR tiempo real.
Clave de tabulador: (1A3511004)
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 21 de 67
enero 2014
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y VALIDACIN DE TCNICAS

LABORATORIO DE GENOMA DE PATGENOS
Genotipificacin de patgenos de importancia en salud pblica
Muestras a analizar
(Producto de PCR)
Envi de
resultados a
LEFE
Purificacin de Ac. Nucleicos

(ExoSap IT)
Genotipo
Verificar/cuantificar
(DNA CHIP)
PCR secuencia
(BigDye 3.1)
Repetir
purificacin de
cidos Nucleicos
Negativo
Analizar e interpretar
(secuencias de referencia)
Negativo
Editar secuencia
Electroforesis capilar y
lectura de datos
Resultado
Positivo
MARCO JURIDICO
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 8. Algoritmo de diagnstico para genotipificacin de patgenos de importancia en salud

pblica. Clave del tabulador: 1J635128
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 22 de 67
enero 2014
ESTNDARES DE CALIDAD
La funcionalidad de la red de diagnstico para la vigilancia epidemiolgica de enfermedad febril
exantemtica se evala por:
Desempeo tcnico
Se envan a los LESP, Paneles de Eficiencia para diagnstico serolgico de Sarampin y Rubola,
as como un cuestionario, 2 veces por ao.
Indicador de diagnstico confiable
Paneles aprobados con el 90% o ms Paneles recibidos x 100 = 90%
Indicador de diagnstico oportuno
Resultados de diagnstico informados en tiempo estndar (4 das a partir de la recepcin de
muestras) No. de muestras recibidas para diagnstico X 100 = 90%
Captura de datos y emisin de resultados

Aceptacin y registro de muestras
La captura de datos y su emisin son actividades que cubren, desde la entrega de oficios para
solicitud de diagnstico de acuerdo al Manual para la Toma, Envo y Recepcin de Muestras para el
Diagnstico del InDRE (REMU/InDRE), al rea de Recepcin de Muestras del LEFE (REMULEFE), la aplicacin de los criterios de aceptacin/rechazo de las muestras, el registro de las mismas
a una base de datos con nmero InDRE, la distribucin de muestras ya identificadas para
realizacin del proceso correspondiente, el tratamiento especfico y almacenamiento temporal previo
a su procesamiento, hasta el almacenamiento definitivo para el resguardo de muestras en el
laboratorio.
El personal asignado al rea de recepcin de muestras del Departamento de Virologa recibe las
solicitudes registradas en el Infolab por parte de REMU/InDRE.
El personal asignado al rea de recepcin de muestras del Departamento de Virologa revisa que
los datos descritos en la solicitud de estudio e historia clnica perteneciente a cada muestra
correspondan a los descritos en la Base de datos Infolab, para que posteriormente se lleve a cabo
la captura de resultados.
Una vez que los resultados han sido liberados, el Jefe de laboratorio solicita la base de EFE y
Base de Virologa Diagnstica (VID) en Excel al personal de la Direccin de Servicios y Apoyo
Tcnico.
El personal del laboratorio mantiene las muestras de suero a -20 C y las muestras de exudado
farngeo y orina tratadas a -70 C durante un ao, para la posterior seleccin de muestras para
banco de muestras.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 23 de 67
enero 2014
Emisin de resultados
La emisin de resultados concernientes al diagnstico de sarampin y rubola involucra varias
etapas, actividades y personal a cargo de ellas en el laboratorio de enfermedades febriles
exantemtica:
ETAPA
ACTIVIDAD
1
Realizar la revisin de los datos capturados en el sistema Infolab.
2
Obtener y validar los resultados de las pruebas diagnsticas (sarampin, parvovirus B-19,
parotiditis y varicela RT-PCR en tiempo real sarampin, RT-PCR en tiempo rubola,
aislamiento viral de sarampin y aislamiento viral de rubola)
Registrar los resultados en las bitcoras correspondientes de acuerdo a las pruebas

diagnsticas
Supervisar los resultados de las pruebas diagnsticas
Capturar los resultados en el Infolab
Imprimir los informes de prueba
Autorizar y libera los informes de prueba
Entrega los informes de prueba a recepcin de muestras InDRE
PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED)

Alcance
Este programa se aplica a los 31 LESP que pertenecen a la Red de EFES, as como al laboratorio
central de epidemiologa perteneciente al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) ya que
realizan el diagnstico serolgico de sarampin y rubeola utilizando los estuches comerciales
(SIEMENS) para determinacin de anticuerpos IgM e IgG (No. catlogo OWLI G15 y OWBO
G15, respectivamente).
El envo del Panel de sueros a los LESP se realiza dos veces al ao. Adems del panel, se enva la
notificacin oficial va electrnica a la coordinacin de la red del InDRE para su posterior envo a
los laboratorios integrantes de la RNLSP quienes de esta forma conocen a su vez la fecha en que
debern enviar los resultados (impresos y electrnicamente) a la direccin electrnica que se indica,
as como la fecha en la cual los LESP recibirn la notificacin de resultados. El informe oficial de
resultados se enviar de manera impresa posteriormente.
Preparacin del panel
Seleccin de las muestras
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 24 de 67
enero 2014
Se seleccionan 50 muestras de suero, previamente caracterizadas y con resultados para la

determinacin de anticuerpos IgM contra sarampin y/o rubola, deben tener un volumen mnimo
de 1.5 mL, el suero debe ser transparente y no presentar contaminacin, hemlisis ni lipemia.
Se preparan bloques de cinco, haciendo todas las combinaciones posibles para que en el bloque se
incluyan muestras positivas y negativas a sarampin y/o rubola. Estas combinaciones siempre
debern ir en relacin al volumen de la muestra que se tenga en existencia, ya que no se permite
hacer mezcla de ellas.
Evaluacin
El panel est compuesto por cinco muestras serolgicas que representan el 90% para el diagnstico
de sarampin y rubola.
Cada muestra concordante equivale al 9%.
El cuestionario tiene un valor del 10%.
El porcentaje obtenido en la calificacin del cuestionario ms el porcentaje obtenido en el
procesamiento panel de sueros harn un total de 100%.
La calificacin final del laboratorio estatal corresponder a la sumatoria de las muestras
concordantes ms el porcentaje de respuestas correctas del cuestionario.
No se califican los errores pre-analticos, analticos y pos-analticos a los laboratorios estatales, solo
se hacen recomendaciones para mejorar su desempeo.
El laboratorio de EFES realiza un anlisis de evaluacin para detectar las reas de oportunidad y
mejora; tomando en cuenta las sugerencias hechas por la RNLSP.
Criterios de evaluacin
La concordancia de los resultados emitidos por el LESP e InDRE de las muestras serolgicas para
diagnstico de sarampin y rubola se clasifica como el ndice del desempeo:
Sobresaliente: Concordancia >90%

Satisfactorio: Concordancia entre 70-89%. Se solicitan medidas correctivas al proceso y su
cumplimiento en mximo 2 meses mediante supervisin.
Mnimo: Concordancia entre el 50 y 69%. Se suspende el diagnstico por 6 meses y se dan
recomendaciones para cumplimiento en un plazo no mayor a 6 meses para incorporacin a la
red. Esto ser documentado oficialmente por las instancias pertinentes.
Precario: Concordancia menor al 50%. Se suspende el diagnstico por 12 meses y se dan
recomendaciones para cumplimiento hasta la incorporacin a la red. Esto ser documentado
oficialmente por las instancias pertinentes.
Criterios para la liberacin del diagnstico de Sarampin y Rubola

Laboratorios que requieren ingresar a la Red de EFE
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 25 de 67
enero 2014
El procedimiento para la evaluacin inicial del desempeo de los laboratorios solicitantes se har de
la siguiente forma:
Se enviar un primer panel de eficiencia (previa solicitud oficial), para evaluar el desempeo en
la determinacin de anticuerpos IgM contra sarampin y rubola.
Como parte del proceso de control de calidad, debern enviar al InDRE el 100% de los
positivos y el 2% de los negativos durante 3 meses.
Si con estos parmetros se obtiene la clasificacin de sobresaliente o satisfactoria durante el
periodo de evaluacin, se suspender el envo de muestras para control de calidad y nicamente
sern evaluados a travs de paneles de eficiencia dos veces por ao.
Si se obtiene un resultado No aceptable se proceder a solicitar un plan de mejora que debern
enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana, se realizar una auditora para evaluar
la competencia tcnica, posterior a esto se enviar un segundo panel, a peticin y compra del
LESP, que de nuevo servir para la evaluacin del desempeo, si se obtiene nuevamente
resultado No aceptable entonces se proceder a solicitar el cambio del analista para el
diagnstico de sarampin y rubola en el LESP y el nuevo analista recibir capacitacin en el
InDRE durante una semana y no podr realizar el diagnstico en tanto no compruebe la
competencia tcnica en el laboratorio.
Derivado del punto anterior y nicamente mientras dure el proceso de mejora debern enviar
para control de calidad el 100% de positivos y 2% de negativos de todas las muestras de
probables a sarampin y rubola.
Como seguimiento en el proceso de control de calidad, el InDRE solicitar al nuevo laboratorio
cada 4 meses a travs de correo electrnico, el envo de los registros de las corridas realizadas
junto con las lecturas obtenidas para cada una de las determinaciones que realizan durante una
semana continua, esto con el fin de evaluar la reproducibilidad y repetitividad de cada tcnica
empleada.
BANCO DE MATERIAL BIOLGICO

El LEFE-InDRE utiliza material biolgico para mantener el banco de muestras serolgicas que se
usan en la elaboracin de los paneles de eficiencia, por lo tanto:
Los LESP que tengan el diagnstico liberado enviarn semestralmente:
El 100% de muestras sricas con resultado positivo a IgM contra sarampin
El 2% de muestras sricas con resultado negativo a IgM contra sarampin.
El 100% de muestras sricas con resultado positivo a IgM contra rubola
El 2% de muestras sricas con resultado negativo a IgM contra rubola
LESP que no tengan el diagnstico liberado enviarn mensualmente como parte de las muestras
enviadas para control de calidad:
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 26 de 67
enero 2014
El 100% de muestras sricas con resultado positivo a IgM contra sarampin.

El 2% de muestras sricas con resultado negativo a IgM contra sarampin.
El 100% de muestras sricas con resultado positivo a IgM contra rubola.
El 2% de muestras sricas con resultado negativo a IgM contra rubola
Las especificaciones para el ingreso de muestras al banco de sueros son:

Las muestras sricas deben estar libres de lipemia, hemlisis y contaminacin, con un volumen
mnimo de 500 L (L = microlitros).
Utilizar material plstico (tubos de polipropileno o criotubos) rotulado con el nmero de folio
correspondiente.
Sellar la tapa del tubo con papel Parafilm.
Enviar las muestras acompaadas del oficio indicando el motivo de envo (banco de muestras
para EFES) as como una relacin con los datos de las muestras que se muestran en el siguiente
cuadro:
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 27 de 67
enero 2014
Cuadro 1. Base de datos para banco de sueros LEFE
Folio
Fecha de
inicio de
sntomas
Fecha de
toma de
muestra
Sexo
Edad Localidad
Resultado
de IgM
Sarampin
(Densidad
ptica)
Resultado
de IgM
Rubola
(Densidad
ptica)
Interpretacin
(positivo/negativo)
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD
ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
Curso terico-practico
Envo del primer panel a
los Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
Recepcin de resultados
del Panel en el InDRE
Envo de resultados a la
RNLSP
Envo del segundo panel a
los Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
Recepcin de resultados
del Panel en el InDRE
Envo de resultados a la
RNLSP
29
13
27
30
14
28
Nota: Si alguna fecha corresponde a un da no laborable, la actividad se realizar el siguiente da

hbil.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 28 de 67
enero 2014
BIBLIOGRAFA
1. Organizacin Panamericana de Salud. Eliminacin de la rubola y del sndrome de rubola
congnita. Gua prctica. Washington. 2005.
2. Organizacin Mundial de la Salud. Manual para el diagnstico de Laboratorio para los virus del
sarampin y la rubola. 2da. Ed, 2006.
3. Organizacin Panamericana de la Salud. Sarampin, Rubola y SRC Rubella Watch.
Washington. 2009.
4. Norma Oficial Mexicana NOM 017-SSA-2-2012. Para la vigilancia epidemiolgica.
5. Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos. Secretaria de Salud. Manual para la
Toma, Envo y Recepcin de muestras para Diagnstico. Mxico. 2012.
6. Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos. Secretaria de Salud. Manual de
Procedimientos para el diagnstico de Laboratorio de Parlisis Flcida Aguda y Enfermedad
Febril Exantemtica. Mxico. 2000.
7. Direccin General de Epidemiologa. Manual Simplificado de Enfermedades Prevenibles por
Vacunacin, Mxico. 2005.
8. Tipples G, Hamkar R, Mohktari T. Evaluation of Rubella IgM Enzyme Immunoassay. J. Clin.
Virol. 2004. 30(3):233-238.
9. Tipples G, Hamkar R, Mohktari T. Assessment of Immunoglobulin M Enzyme Immunoassay
for Diagnosis of Measles. J. Clin. Microbiol.2003. 41(10):4790-4792.
10. Reef S. MD, Reed S, Aberhathy E. MS, Icenogle J Ph.D. Manual for the Surveillance of
Vaccine-Preventable Diseases. Centers for Disease Control and Prevention. 4ta. ed. 2009.
11. Rota P.A, KHAN A.S, Durigon E, Yuran T, Villamarzo Y.S. y Bellini W.J., Detection of
measles virus: RNA in urine specimens from vaccine recipients; J. Clin. Microbiol, 1995, 33:
2485-2488.
12. Bellini W.J. y Rota P.A. Genetic diversity of wild-type measles viruses: Implications for global
measles elimination programs. Emerging Inf. Dis., 1998, 4:1-7.
13. Riddell M. A., Chibo D, Kelly H, Catton M. G, y Birch C.J., Investigation of Optimal
Specimen Type and Sampling Time for Detection of Measles Virus RNA during a Measles
Epidemic. Received 13 July 2000/returned for modification 13 September 2000/Accepted 23
October 2000.
14. Rota P.A., Liffick S.L., Rota J.S., Katz R. R., Redd S., Papania M. y Bellini W.J.M, Molecular
Epidemiology of Measles Viruses in the United States, Emerging Inf. Dis. 1997-2001, Sep 8
(9):902-908.
15. Chomezynski P. and N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159.
16. Bosma TJ, Corbett KM, OShea S, Banatvala JE, Best JM. PCR for Detection of Rubella Virus
RNA in Clinical Samples. J Clin. Microbiol, 1998, 33:5, 1075-1079.
17. Bosma TJ, Corbett KM, Eckstein MB, OShea S, Vijayalakshmi P, Banatuala JE, Morton K,
Best JM. Use of PCR for prenatal and postnatal diagnosis of congenital rubella, J Clin
Microbiol, 1997, 33: 2881-2887.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 29 de 67
enero 2014
18. Tzeng W-P, Zhou Y, Icenogle J, y Frey TK, Novel Replication-Based Reporter Gene Assay for
Detection of Rubella Virus in Clinical Specimens, J Clin Microbiol, 2005, 43: 2, 879-885.
19. Zhang D, Nikkari S, Vainionp R, Luukkainen R, yli-Kerttula U y Toivanen P, Detection of
Rubella, Mumps and Measles Virus Genomic RNA in Cells from Synovial fluid and Peripheral
Blood in Early Rheumatoid Arthritis, The Journal of Rheumatology, 1997, 24:7,1260-1264.
20. Revello MG, Baldanti F, Sarasini A, Zavattoni M, Torsellini M y Gerna G, Prenatal Diagnosis
of Rubella Virus Infection by detection and Semiquantitation of Viral RNA in Clinical Samples
by Reverse Transcription-PCR, J Clin Microbiol, 1997, 35:708-713.
21. Chomezynski P and N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162: 156-159.
22. Shyamala G, Malathi J, Moses Y.S., Therese KL y Madhavan HN, Nested reverse transcription
polymerase chain reaction for the detection of rubella virus in clinical specimens, Indian J Med
Res, 1997, 125: 73-78.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 30 de 67
enero 2014
ANEXOS
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 31 de 67
enero 2014
Anexo I
Tcnicas diagnsticas
La capacidad tcnica para las instituciones involucradas en la red de EFE es:
InDRE
Determinacin de anticuerpos IgM e IgG para sarampin y rubola en suero humano por
ELISA.
RT-PCR tiempo real para sarampin y rubola.
PCR punto final para sarampin y rubola.
Secuenciacin de productos.
Laboratorios Estatales de Salud Pblica
Determinacin de anticuerpos IgM para sarampin y rubola en suero humano por ELISA.
RT-PCR tiempo real para sarampin.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 32 de 67
enero 2014
Anexo II
CARACTERSTICAS DE LOS EQUIPOS COMERCIALES
Resultado de la evaluacin de estuches comerciales para determinacin de anticuerpos IgM contra
sarampin:
Resultado de la evaluacin de estuches comerciales para determinacin de anticuerpos IgM contra

rubola:
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 33 de 67
enero 2014
Anexo III
PREPARACIN DE REACTIVOS
Determinacin de anticuerpos IgM contra sarampin en suero humano por ELISA.
Enzygnost Anti-measles virus/IgM
MEASLES IgM
SIEMENS OWLIG15C0502
Preparacin de soluciones
Antes de realizar la prueba, asegurarse que los reactivos y las muestras a analizar estn a
temperatura ambiente (18-25 C).
No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene.
Las tiras de la placa que no se utilizarn en el ensayo, deben retirarse del soporte y guardarse en
la bolsa de polietileno para su uso posterior.
Si es necesario mezclar los reactivos o las soluciones de uso de los mismos, se debe evitar la
formacin de espuma.
Para cada placa de prueba, diluir 20 mL de solucin de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 mL. Una vez preparada la solucin puede almacenarse entre 2-8
C de temperatura (permanece estable durante una semana).
Colorear el tampn para muestras POD para la pre-dilucin de las muestras, no como base para
la placa de microtitulacin. Aadir 2.5mL de solucin colorante azul a 50 L de tampn para
muestras POD, tomando del reactivo adicional para Enzygnost*/TMB. Mezclar suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgM humana/POD en relacin 1+50 con tampn microbiolgico para
conjugado. Para una placa de prueba aadir 0.25 mL del conjugado Anti-IgM humana/POD
diluido a un frasco de 12.5 mL de tampn microbiolgico para conjugado. Mezclar agitando
suavemente.
Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromgeno TMB con 10 mL de tampn/sustrato
TMB en el frasco de plstico vaco adjunto y mantener protegido de la luz. Despus de su uso,
enjuagar cuidadosamente el frasco con agua bidestilada. La solucin permanece estable durante
5 das entre 2-8 C y 8 horas a temperatura ambiente (18-25 C).
Disolver el contenido del frasco absorbente de factor reumatoide (FR) con 5.0 mL de agua
destilada estril; la solucin est lista para su uso. Esta solucin permanece estable una vez
disuelto el factor durante una semana a temperatura entre 2 y 8 C y 3 meses a -20 C si es
dividido en alcuotas (fraccionado).
Desarrollo de la tcnica
Preparacin de la muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, as como los controles Anti-virus del sarampin P/P
(positivo) y Anti-virus del sarampin P/N (negativo) en proporcin 1+20 con el Tampn para
muestras POD coloreado, por ejemplo colocar 20 L de muestra en un tubo de dilucin y adicionar
400 L de Tampn de muestras POD, mezclar cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede
conservarse durante toda la noche entre 2-8 C (refrigerada) en recipientes cerrados con baja
formacin de protena.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 34 de 67
enero 2014
1. Absorcin del factor reumatoide (FR)

Tomar de cada una de las muestras pre-diluidas 1 + 20 de la solucin absorbente (FR) lista para su
uso (dilucin de la muestra 1:42). Dejar incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (entre
15 y 25 C) o durante la noche entre 2 y 8 C (refrigerada).
Nota: Los controles no son tratados con el absorbente (RF). Para la validacin de la prueba el
control anti-virus del sarampin P/P debe estar entre los valores de tolerancia proporcionados en la
cuadro de valores bar-code (cdigo de barras) incluida en el estuche.
2. Esquema de distribucin
Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a analizar + cantidad de
determinaciones de control P/N o P/P = cantidad de pollos necesarios). El control P/N se coloca
una vez como control negativo al comienzo de la serie a analizar (pocillos A1/A2) o de la placa de
prueba. El control P/P se coloca como segunda (pocillo B1/B2) y ltima muestra de la serie a
analizar o de la placa de prueba.
3. Distribucin de las muestras
En cada uno de los primeros pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, segn el plan de
distribucin, agregar 150 L de control P/P y P/N pre-diluidos. Con ello la dilucin de la prueba es
de 1:21.
Agitar bien las muestras tratadas con el absorbente RF y agregar 150 L de cada muestra en un
pocillo recubierto con Ag y Ag-Control. Con ello la dilucin de la prueba es de 1:42. La colocacin
de las muestras en la placa de prueba debe efectuarse sin interrupciones en un plazo mximo de 15
minutos para cada placa de prueba.
4. Incubacin de las muestras
Cubrir con una lmina adhesiva las placas de la prueba por un lapso no mayor de 15 minutos
despus de terminar la distribucin de muestras e incubar durante 60 minutos ( 2 min) a 37 1 C;
lavar a continuacin como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lmina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos, con ayuda de un lavador de
placas automtico o por aspiracin manual o bien desechar el lquido volteando la placa. Lavar
cuatro veces con solucin de lavado POD pre-diluida. Al finalizar la etapa de lavado continuar
inmediatamente con la siguiente distribucin de los reactivos, para evitar la sequedad y perder la
actividad de los compuestos.
6. Distribucin del conjugado
Colocar en cada pocillo 100 L de la dilucin lista para su uso del Anti-IgM humana/ POD. Al
finalizar, cubrir la placa con la nueva lmina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
7. Incubacin del conjugado
Incubar durante 60 min ( 2 min) a 37 1 C; lavar inmediatamente despus.
8. Lavado
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 35 de 67
enero 2014
Como se describe en el punto 5.

9. Distribucin del sustrato
Agregar en cada pocillo 100 L de solucin de uso del cromgeno. Cubrir la placa de
microtitulacin con una nueva lmina adhesiva.
10. Incubacin del sustrato
Inmediatamente despus de finalizar la distribucin del sustrato incubar durante 30 2 minutos a
temperatura ambiente (entre 18 y 25 C), protegido de la luz.
11. Reaccin de paro
Retirar la lmina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 L de solucin de parada POD, mantener
el mismo ritmo que para la distribucin del sustrato.
12. Medicin
Leer las absorbancias en el lector de pacas a 450 nm en un plazo mximo de una hora. Como
longitud de onda de referencia se aconseja 650 nm o, longitudes de onda entre 615 y 690 nm.
Clculo del factor de correccin
Para una reproducibilidad ptima de los resultados es indispensable utilizar un factor de correccin
de los resultados tanto para la valoracin cuantitativa, como para la cualitativa.
Calcular a partir de las diferencias entre las lecturas de extincin de la control Anti-virus del
sarampin P/P, el valor promedio. El valor terico dado para esto en la tabla de valores [cdigo de
barras (bar-code)], se divide por el valor promedio A obtenido para la diferencia P/P y as se
determina el factor de correccin:
A valor nominal
Factor de correccin= Media A valor del suero control P/P

Los resultados se expresan segn los siguientes criterios:
Negativo
<0.100
Positivo
>0.200
Indeterminado
(0.100-0.200), solicitar una segunda muestra
Interpretacin por laboratorio
Un resultado negativo significa que no se detectaron anticuerpos IgM especficos del virus. El
sujeto no ha sido infectado de forma aguda con el virus del sarampin a pesar de haber estado
expuesto a una infeccin o haya sido vacunado no tiene (an) la capacidad de producir IgM
especfica del virus. En personas que a pesar de estar vacunados se enfermen de sarampin, con
frecuencia, no se puede reconocer ninguna IgM especfica del virus, se debe tomar una segunda
muestra por lo menos 7 das ms tarde y analizar junto con la primera.
La valoracin de la muestra como positiva significa que se determinaron anticuerpos IgM
especficos contra el virus y que el paciente cursa con una infeccin aguda. En el primer da de la
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 36 de 67
enero 2014
aparicin de las erupciones de la piel ya se puede encontrar IgM especfica contra el virus en ms
de la mitad de los pacientes.
En el caso de una infeccin del hgado crnica activa, que no haya sido ocasionada por el virus de
la hepatitis B, pueden aparecer IgM especficos del virus del sarampin.
La IgM especfica del virus no se puede tomar como un marcador para una panencefalitis
esclerosante subaguda (PEES).
Cuando las muestras son valoradas como indeterminadas despus de una repeticin de la prueba,
se hace necesario tomar una segunda muestra por lo menos 7 das despus e investigar junto con
la primera.
Determinacin de anticuerpos IgG contra sarampin en suero humano por ELISA

Enzygnost Anti-measles virus/IgG
MEASLES IgG
SIEMENS OWLNG15C0502
Antes de iniciar la prueba, asegurarse que todos los reactivos y las muestras a analizar se
encuentran a una temperatura ambiente entre 18-25 C.
formacin de espuma.
Para cada placa de prueba diluir 20 mL de solucin de lavado POD con agua destilada o
C y permanecer estable durante una semana.
Colorear el Tampn para muestras POD para la pre-dilucin de las muestras, no como base
para la placa de microtitulacin. Aadir 2.5 mL de solucin colorante azul a 50 L de Tampn
para muestras POD, tomando del reactivo adicionales para Enzygnost*/TMB. Mezclar
suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgG humana/POD en relacin 1+ 50 con Tampn microbiolgico
para conjugado. Para una placa de prueba aadir 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5 mL
de Tampn microbiolgico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromgeno TMB con 10 mL de Tampn/sustrato
5 das a una temperatura entre 2-8 C y 8 horas a temperatura ambiente (18-25 C).
1. Preparacin de las muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, as como el control Anti-sarampin P/N (positivo) en
proporcin 1+20 con el Tampn para muestras POD coloreado, por ejemplo aadir con pipeta 20
L de muestra en un tubo de dilucin y adicionar 400 L de Tampn de muestras POD, mezclar
cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede conservarse durante toda la noche a una temperatura
entre 2 y8 C (refrigeracin) en recipientes cerrados, con baja formacin de protena.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 37 de 67
enero 2014
El nmero necesario de pocillos de la placa de microtitulacin se deduce del nmero de muestras a

investigar ms el nmero de determinaciones (N=2) del control Anti-sarampin P/N.
En cada uno de los pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, se adicionan 200 L de Tampn
para muestras sin colorear. Adicionar segn el plan de distribucin, 20 L de control P/N prediluidos en cada uno de los dos primeros pocillos recubierto con Ag y Ag-control. En los siguientes
pocillos distribuir 20 L de cada una de las muestras problema. En los dos ltimos pocillos de la
serie o de la placa, pipetear una vez ms 20 L del control P/N pre-diluido.
No se debe aadir primero el P/N al inicio y al final de la serie y despus las muestras problema,
sino que debe seguirse el orden de la serie. Despus de agregar el control y la muestras en el orden
correspondiente, mezclar por lo menos dos veces por aspiracin y expulsin con ayuda de la
micropipeta. Para cada muestra debe utilizarse una punta diferente.
despus de terminar la distribucin de muestras e incubar durante 60 minutos ( 2 min) a 37 1 C;
lavar a continuacin como se indica en el siguiente punto (6).
6. Lavado
Retirar la lmina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos con ayuda de un lavador de
placas automtico o por aspiracin manual o bien desechar el lquido volteando la placa. Lavar
Colocar en cada pocillo 100 L de la dilucin lista para su uso del Anti-IgG humana/ POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lmina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
Incubar durante 60 min ( 2 min) a 37 1 C; lavar inmediatamente despus.
9. Lavado
Como se describe en el inciso 6.
10. Distribucin del sustrato:
microtitulacin con nueva lmina adhesiva.
12. Reaccin de paro
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 38 de 67
enero 2014
13. Medicin
Evaluacin cuantitativa de la prueba
Para la evaluacin, las diferencias de las extinciones, obtenidas por placa de prueba y la placa control
Anti-Virus de sarampin P/N para las medidas con el antgeno control virus de sarampin, deben
encontrarse como valor nico dentro de los lmites superiores e inferiores de tolerancia dados en la
tabla de valores del cdigo de barras (valor que se incluye en cada estuche) dependiente del lote:
Valor de tolerancia inferior valor de tolerancia lmite de tolerancia superior.
Adems las diferencias de las seales de los valores aislados (control Anti-Virus de sarampin P/N,
al comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser ms de 20% del
valor promedio de ellas.
Evaluacin cualitativa de la prueba
Para la valoracin cualitativa se deben aplicar los siguientes criterios:
Antivirus sarampin /IgG, negativo
Antivirus sarampin /IgG, positivo
Antivirus sarampin /IgG, valor indeterminado
A <0.100 (valor lmite)

A >0.200
0.100 A 0.200
Valoracin cuantitativa con el mtodo

Las muestras que presentan anticuerpos IgG por encima del valor lmite pueden ser valoradas con
ayuda del mtodo .
No se deben emplear en el clculo
Lecturas (A) corregidas <lmite
Lecturas (A) no corregidas >2.5
El clculo en UI/mL se realiza segn la siguiente frmula:
Log 10 UI/mL = () x (A)
Los valores para las constantes y y se deben tomar de la tabla del cdigo de barras incluido en
cada estuche.
El proceso del clculo se hace para una dilucin de muestra de 1+230. Para las diluciones de las
muestras 1+2309 se debe multiplicar por 10 el resultado y no la densidad ptica.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 39 de 67
enero 2014
Los resultados de las muestras se expresan en mUI/mL de suero.

Negativo
Positivo
Indeterminado
<0.100
>0.200
(0.100-0.200), solicitar una segunda muestra
Estas densidades pticas deben ser expresadas en UI/mL utilizando el mtodo , los valores
obtenidos son considerados como el valor de corte de la prueba.
Interpretacin por laboratorio
Los resultados son analizados en conjunto con los datos clnicos del paciente.
Un resultado negativo en la valoracin cualitativa significa que no fue posible reconocer
anticuerpos IgG especficos para el virus de sarampin. Si a pesar de obtener un resultado
negativo se sospecha que el paciente se expuso al virus se debe tomar una segunda muestra, dos
o tres semanas despus del tiempo en que se sospecha que estuvo expuesto al virus, debe
analizarse en conjunto con la primera toma.
Muestras con resultados indeterminados despus de haber repetido la prueba, indica una
infeccin, en este caso debe tomarse una segunda muestra, por lo menos 7 das despus de la
primera muestra y analizarse junto con la primera.
Una muestra positiva significa que se encontraron anticuerpos IgG especficos contra el virus
de sarampin y si en esta misma muestra no se encuentran anticuerpos IgM especficos para el
virus se puede asumir que el paciente estuvo previamente expuesto al virus.
Un aumento significativo en la actividad de anticuerpos en un par de muestras tomadas en un
periodo de 7 das indica una reactivacin del virus.
Madres de recin nacidos vacunadas presentan por lo general una actividad de IgG contra el
virus de sarampin menor que en mujeres con una infeccin por virus silvestre, en el caso de
abortos se encuentran por lo general niveles bajos de anticuerpos.
Determinacin de anticuerpos IgM contra rubola en suero humano por ELISA
Enzygnost Anti-Rubella virus/IgM
RUB IgM
SIEMENS OWBOG15C0503
Antes de iniciar la prueba cercirese que todos los reactivos y las muestras a analizar estn a
temperatura ambiente; 18-25 C.
formacin de espuma.
desionizada hasta obtener 400 mL. Una vez preparada la solucin, sta puede almacenarse entre
2-8 C de temperatura y permanece estable durante una semana.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 40 de 67
enero 2014
para la placa de microtitulacin. Aadir 2.5 mL de solucin colorante azul a 50 L de tampn
para muestras POD, tomando del reactivo para Enzygnost*/TMB. Mezclar suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgM humana/POD en relacin 1 + 50 con el tampn microbiolgico
para conjugado. Para una placa de prueba aadir, 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5
mL de Tampn microbiolgico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
5 das si se mantiene a una temperatura de entre 2 y 8 C y 8 horas, a temperatura ambiente (1825 C).
Disolver el contenido del frasco absorbente de factor reumatoide (FR) con 5.0 mL de agua
destilada estril; la solucin est lista para su uso. Esta solucin permanece estable por una
semana entre s se almacena a 2-8 C y por 3 meses a -20 C si es dividido en alcuotas
(fraccionado).
1. Preparacin de las muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, as como tambin los controles Anti-virus de rubola P/P
(positivo) y Anti-virus de rubola P/N (negativo) en proporcin 1 + 20 con el Tampn para
muestras POD coloreado, por ejemplo aadir con micropipeta 20 L de muestra en un tubo de
dilucin y adicionar 400 L de Tampn de muestras POD, mezclar cuidadosamente. La muestra
pre-diluida puede conservarse durante toda la noche a temperatura de entre 2 y 8 C en recipientes
cerrados, con baja formacin de protena.
Absorcin del factor reumatoide (FR)
Tomar 200 L de cada una de las muestras pre-diluidas y aadirles 200 L de la solucin
absorbente (FR) lista para usar (dilucin final de la muestra 1:42). Dejar incubar durante 15
minutos a temperatura ambiente (entre 15 y 25 C) o durante la noche entre 2 y 8 C.
Nota: Los controles no son tratados con el absorbente (RF). Para la validacin de la prueba el
control anti-virus de rubola P/P debe estar entre los valores de tolerancia dados en la Tabla de
valores del cdigo de barras (bar-code) incluida en el estuche.
Esquema de distribucin
Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a analizar + cantidad de
determinaciones de control P/N o P/P=cantidad necesaria de pocillos). El control P/N se coloca
una vez como control negativo al comienzo de la serie a analizar (pocillos A1/A2) o de la placa de
prueba. El control P/P se coloca como segunda (pocillo B1/B2) y ltima muestra de la serie a
analizar o de la placa de prueba.
Distribucin de las muestras
En cada uno de los primeros pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, segn el plan de
distribucin, adicionar 150 L de control P/P y P/N pre-diluidos. Con ello la dilucin de la prueba
es de 1:21. Agitar bien las muestras tratadas con absorbente RF, adicionar 150 L de cada muestra
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 41 de 67
enero 2014
en un pocillo recubierto con Ag y Ag-Control. Con ello la dilucin de la muestra es de 1:42. La

colocacin de las muestras en la placa de prueba debe efectuarse sin interrupciones en un plazo
mximo de 15 minutos para cada placa de prueba.
Cubrir con una lmina adhesiva las placas de la prueba en un lapso no mayor de 15 minutos despus
de terminar la distribucin de muestras, e incubar durante 60 minutos ( 2 min) a 37 1 C; lavar a
continuacin como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lmina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos (con ayuda de un lavador de
placas automtico, por aspiracin manual o bien desechar el lquido volteando la placa). Lavar
Colocar en cada pocillo 100 L de la dilucin lista para su uso del Anti-IgM humana/POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lmina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
Incubar durante 60 min ( 2 min) a 37 1 C; lavar inmediatamente despus de que finalice la
incubacin.
8. Lavado
9. Distribucin del sustrato:
10. Incubacin del sustrato:
11. Reaccin de paro
12. Medicin
Leer las absorbancias en el lector de placas a 450 nm en un plazo mximo de una hora. Como
Para la evaluacin, las diferencias de las extinciones, obtenidas por la placa de prueba y la placa
control anti-Virus de rubola P/P y para las medidas con el antgeno control virus de rubola, deben
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 42 de 67
enero 2014
encontrarse como valor nico dentro de los lmites superiores e inferiores de tolerancia
proporcionados en la tabla de valores del cdigo de barras dependiente del lote:
Valor de tolerancia inferior A control P/P lmite de tolerancia superior.
Adems las diferencias de las seales de los valores aislados (control Anti-Virus de rubola P/P, al
comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser ms de 20% del
El valor de A para la control Anti-Virus de rubola P/N debe ser en todos los casos menor que 0.1
(0.099).Si las condiciones anteriores no se cumplen, no se puede valorar la prueba.
Cada preparado del control Anti-Virus de rubola P/P debe alcanzar o superar un valor de extincin
mnimo de 0.2 A.
A control P/P 0.2
Correccin de las medidas
Para una reproducibilidad ptima de los resultados es indispensable utilizar un factor de correccin
de los resultados tanto para la valoracin cuantitativa, como para la cualitativa.
Calcular a partir de las diferencias entre las lecturas de extincin del control Anti-virus de la rubola
P/P, el valor promedio. De la siguiente manera:
El valor terico proporcionado, en la tabla de valores del cdigo de barras se divide entre el valor
promedio A obtenido para la diferencia P/P y as se determina el factor de correccin, es decir:
Factor de correccin**=
A Valor nominal
Media de A valor del suero control P/P
Con este factor de correccin se deben multiplicar todas las diferencias de extincin que fueron
determinadas en la serie. Si se tienen varias placas de prueba se debe determinar para cada placa de
prueba su factor de correccin y utilizarse.
Para la interpretacin son vlidos los siguientes criterios:
Antivirus rubola /IgM, negativo
Antivirus rubola /IgM, positivo
Antivirus rubola /IgM, valor indeterminado

A >0.200
0.100 A 0.200 Solicitar segunda muestra.
Determinacin de anticuerpos IgG contra rubola en suero humano por ELISA

Enzygnost Anti-Rubella virus/IgG
RUB IgG
SIEMENS OWBFG15C0502
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 43 de 67
enero 2014
Antes de empezar la prueba verificar que todos los reactivos y las muestras a analizar estn a
temperatura ambiente (18-25 C).
formacin de espuma.
C de temperatura. La solucin permanece estable durante una semana.
para la placa de microtitulacin. Aadir 2.5 mL de solucin colorante azul a 50 L de Tampn
para muestras POD, tomando del reactivo adicional para Enzygnost*/TMB. Mezclar
suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgG humana/POD en relacin 1 + 50 con Tampn microbiolgico
para conjugado. Para una placa de prueba aadir 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5 mL
de Tampn microbiolgico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
TMB en el frasco de plstico vaco adjunto y mantenerlo protegido de la luz. Despus de su uso,
5 das a una temperatura de entre 2 y 8 C y 8 horas, a temperatura ambiente (18-25 C).
1. Pre-diluir todas las muestras de sueros, as como tambin el control Anti-rubola P/N (positivo)
en proporcin 1+20 con el Tampn para muestras POD coloreado, por ejemplo agregar 20 L
de muestra en un tubo de dilucin y adicionar 400 L de Tampn de muestras POD, mezclar
cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede conservarse durante toda la noche entre 2-8 C
de temperatura en recipientes cerrados con baja formacin de protena.
El nmero necesario de pocillos de la placa de microtitulacin se deduce del nmero de
muestras a investigar ms el nmero de determinaciones (N=2) del control Anti-rubola P/N.
En cada uno de los pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, se adicionan 200 L de
Tampn para muestras sin colorear. Aadir con micropipeta segn el plan de distribucin, 20
L de control P/N pre-diluidos en cada uno de los dos primeros pocillos recubierto con Ag y
Ag-control. En los siguientes pocillos distribuir 20 L de cada una de las muestras problema.
En los dos ltimos pocillos de la serie o de la placa, agregar una vez ms 20 L del control P/N
pre-diluido.
No se debe adicionar primero el P/N al inicio y al final de la serie y despus las muestras
problema, sino que debe seguirse el orden de la serie. Despus de aadir el control y las
muestras, mezclar por lo menos dos veces por aspiracin y expulsin con ayuda de la
micropipeta. Para cada muestra debe utilizarse una punta diferente.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 44 de 67
enero 2014

despus de terminar la distribucin de muestras e incubar durante 60 minutos ( 2 min) a 37 1
C; lavar a continuacin como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lmina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos (con ayuda de un lavador
de placas automtico, por aspiracin manual o bien desechar el lquido volteando la placa).
Lavar cuatro veces con solucin de lavado POD pre-diluida. Al finalizar la etapa de lavado
continuar inmediatamente con la siguiente distribucin de los reactivos, para evitar la sequedad
y perder la actividad de los componentes.
Colocar en cada pocillo 100 L de la dilucin lista para su uso del Anti-IgG humana/ POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lmina adhesiva e inmediatamente colocarla en el
incubador.
Incubar durante 60 min ( 2 min) a 371 C; lavar inmediatamente despus.
8. Lavado
9. Distribucin del sustrato
Inmediatamente despus de finalizar la distribucin del sustrato incubar durante 302 minutos a
temperatura ambiente (entre 18 y 25 C), protegindolo de la luz.
11. Reaccin de paro
Retirar la lmina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 L de solucin de parada POD,
mantener el mismo ritmo que para la distribucin del sustrato.
12. Medicin
Para la evaluacin, las diferencias de las extinciones, obtenidas por placa de prueba y la placa control
Anti-Virus de rubola P/N para las medidas con el antgeno control virus de rubola, deben
encontrarse como valor nico dentro de los lmites superiores e inferiores de tolerancia dados en la
tabla de valores del cdigo de barras (valor que se incluye en cada estuche) dependiente del lote:
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 45 de 67
enero 2014
Valor de tolerancia inferior valor de tolerancia lmite de tolerancia superior.

Adems las diferencias de las seales de los valores aislados (control Anti-Virus de rubola P/N, al
comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser ms de 20% del
Para la valoracin cualitativa se deben aplicar los siguientes criterios:
Interpretacin
Antivirus rubola /IgG, negativo
Antivirus rubola /IgG, positivo
Antivirus rubola /IgG, valor indeterminado

A >0.200
0.100 A <0.200
Valoracin cuantitativa con la ayuda del mtodo-.

Las muestras que presentan anticuerpos IgG por encima del valor lmite pueden ser valoradas con
ayuda del mtodo-.
No se deben emplear en el clculo:
Lecturas (A) corregidas < lmite
Lecturas (A) no corregidas >2.5
El clculo en UI/mL se realiza segn la siguiente frmula:
Log 10 UI/mL = () x (A)
Los valores para las constantes y , se deben tomar de la tabla del cdigo de barras incluido en
cada estuche.
Deteccin del virus de rubola mediante RT PCR Tiempo Real
CDC protocols for the molecular epidemiology of measles virus and rubella virus; version of
03/06/2012
La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR, por sus siglas
en ingls) tiene la facultad de producir una gran cantidad de copias de cido Desoxirribonucleico
(ADN) [DNA, Desoxyribonucleic Acid, por sus siglas en ingles] de doble cadena y en conjunto con
la reaccin de retro-transcripcin (RT) es posible obtener adems molculas de cido
Desoxirribonucleico complementario (ADN), a partir de una muestra de cido Ribonucleico
(ARN) [RNA, Ribonucleic Acid, por sus siglas en ingles]. El ADN extrado de las muestras clnicas
o de un cultivo de clulas es convertido en cADN y posteriormente amplificado para obtener una
gran cantidad de copias.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 46 de 67
enero 2014
La RT-PCR en tiempo real, es un ensayo que tiene la capacidad de monitorear el progreso de la

amplificacin. Los datos son colectados desde el primer ciclo de reaccin hasta el ltimo,
permitiendo realizar cuantificacin de ADN o ARN. La deteccin de la amplificacin de una
secuencia especfica es monitoreada mediante la captacin de seales de fluorescencia emitida
durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de ARN o de nmero de copias
de material gentico evidenciar un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la
reaccin. Por lo contrario, bajas concentraciones de ARN permitirn obtener un incremento de
fluorescencia en los ltimos ciclos de la reaccin.
El virus de rubola se encuentra en circulacin en concentraciones detectables durante la fase aguda
de la enfermedad (0-5 das) y esta caracterstica hace que este ensayo sea utilizado nicamente
durante esta fase.
Gabinete de Bioseguridad para PCR

Estacin de trabajo con Flujo Laminar
Refrigerador de 2 puertas
Congelador
Ultracongelador
Microcentrfuga
Agitador magntico
Micropipeta de volumen variable entre 0.5-10 L
Micropipeta de volumen variable entre 20-200 L
Micropipeta de volumen variable entre 100-1000 L (2)
Termociclador en tiempo real
Materiales
Puntas con filtro, estriles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 0.5-10 L
Puntas con filtro, estriles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 2-20 L
Tubos tipo eppendorf, estriles, libres de ARNsa y ADNsa con capacidad de 1.7 mL
Gasas estriles
Guantes de nitrilo (libres de talco)
Batas desechables
Papel aluminio
Gradillas de unicel para tubos tipo eppendorf
Estaciones para trabajo en fro para tubos tipo eppendorf
Placas de polipropileno con 96 pozos claros especiales para PCR en tiempo real con capacidad
de 5.0-125 L.
Tiras con 8 tubos especiales para PCR en tiempo real con capacidad de 0.2 mL.
Tiras con 8 tapas pticas ultra claras especiales para PCR en tiempo real.
Marcadores indelebles de punto fino.
Contenedores y bolsas para desecho de material biolgico-infeccioso.
Pinzas
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 47 de 67
enero 2014
Reactivos y materiales biolgicos

Cepa de Referencia utilizada como control positivo.
Estuche para extraccin de ARN viral, (QIAamp Viral ARN Mini Kit) Marca QIAGEN,
catlogo 52906.
Enzima para amplificacin: SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum, Marca Invitrogen,
catlogo 11372-088 o Marca Bio-Rad, catlogo 170-8894.
Agua calidad PCR libre de ARNsa, Marca Roche, catlogo: 033 159 32 001.
Iniciador Rubola Forward (RV11): 5 CAA CAC GCC GCA CGG ACA AC 3
Iniciador Rubola Reverse (RV12): 5 CAA CAC GCC GCA CGG ACA AC 3
Iniciador Rubola Reverse (RV12-2): 5 CCA CGA GCC GCG AAC AGT CG 3
Sonda Rubola: 5 FAM AG GTC CAG GTC CCG CCC GAC -BHQ 3
Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-F): 5 AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3
Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-R): 5 GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 3
Sonda (BHQ1 HURNASE-P):5FAM TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1
3
Etanol al 75%.
Etanol grado biologa molecular (96-10%)
Hipoclorito de sodio al 5%.
Solucin para eliminacin de ADN, ADNZap, Marca Ambion, catlogo 9892G.
Notas:
Las cepas de referencia fueron donadas por los Centros para el Control y Prevencin de
Enfermedades (CDC).
Los fluorforos pueden ser cambiados por otros, siempre y cuando se encuentren en el mismo
canal de adquisicin. Esto depender de la disponibilidad en la sntesis, de cada empresa.
Procedimiento
Preparacin del rea de trabajo
Cada una de las reas de trabajo debe contar con material, equipo, reactivos y personal exclusivo.
Antes de empezar, el gabinete de bioseguridad o flujo laminar de cada una de las reas de trabajo
(extraccin de ARN, preparacin de mezcla maestra de reaccin y de ARNs de muestras
problemas) deber limpiarse con hipoclorito de sodio al 5%, agua bidestilada y etanol al 75%,
siguiendo ese orden. Irradiar con luz ultravioleta durante 20 minutos antes y despus de a trabajar.
Si se cuenta con soluciones inhibidora de ARNs y ADNs se recomienda realizar la limpieza con
estas soluciones antes y despus de trabajar. El material necesario que se va a usar debe estar listo en
cada rea de trabajo.
Extraccin de cidos nucleicos
El estuche de extraccin simplifica la extraccin de ARN viral a partir de fluidos libres de clulas
mediante un procedimiento rpido de centrifugacin en columna. No se requiere utilizar fenolcloroformo. El ARN se une especficamente a la membrana de slica-gel, por la cual pasan todos los
contaminantes. Los inhibidores de PCR como los cationes divalentes y protenas, son
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 48 de 67
enero 2014
completamente removidos durante los pasos de lavado dejando el ARN puro y listo para ser
desprendido de la membrana con la solucin de elucin.
Preparacin de reactivos
a. Agregar 310 L de solucin amortiguadora AVE (solucin para eluir ARN) al tubo que
contiene 310 g de acarreador de ARN liofilizado, para obtener una solucin de trabajo de
1.0g/L.
b. Disolver perfectamente, realizar alcuotas en volmenes suficientes para trabajar 5-10 muestras y
almacenar a 20 C.
c. Evitar ciclos de congelacin-descongelacin ms de tres veces.
d. Preparar solucin AVL (solucin amortiguadora para lisis viral), agregando acarreador de ARN
en relacin de: 0.56 mL de AVL + 5.6 L de acarreador de ARN por cada muestra a procesar
(mximo 24 muestras).
e. La solucin de lavado 1 (AW1), debe ser preparada agregando 125 mL de etanol (96-100%)
grado biologa molecular y marcar el frasco para indicar que se le agreg etanol.
f. La solucin de lavado 2 (AW2), debe ser preparada agregando 160 mL de etanol (96-100%)
grado biologa molecular y marcar el frasco para indicar que se le agreg etanol.
Obtencin de ARN
a. Elaborar la bitcora de trabajo correspondiente para la realizacin de extraccin.
b. Etiquetar los tubos tipo eppendorf de 1.7 mL necesarios, dependiendo del nmero de muestras
a procesar.
c. Aadir 560 L de solucin AVL/acarreador de ARN a cada uno de los tubos tipo eppendorf.
d. Agregar 140 L de suero o plasma y agitar durante 15 segundos.
e. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar brevemente a 1500 rpm por 30
segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
f. Adicionar 560 L de etanol grado biologa molecular, agitar durante 15 segundos y centrifugar
brevemente a 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
g. Remover del empaque las columnas/tubo colector a utilizar y etiquetarlas.
h. Tomar 630 L de la solucin anterior (paso f) y agregarlos cuidadosamente dentro de la
columna, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 C.
i. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y repetir el paso anterior.
j. Cambiar otra vez la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 L de solucin de lavado
AW1, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 C.
k. Cambiar nuevamente la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 L de solucin de
lavado AW2, centrifugar a 14,000 rpm durante 3 minutos a 4 C.
l. Cambiar la columna a otro tubo tipo eppendorf de 1.7 mL, limpio, estril, libre de ARNsa y
ADNsa, etiquetado (con el nmero de muestra correspondiente) y agregar 60 L de solucin de
elucin (AVE) a cada una de las columnas. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto
y centrifugar a 8000 rpm por un minuto a 4 C.
m. Descartar la columna y cerrar el tubo tipo eppendorf que contiene el ARN de inters.
n. Almacenar a -20 C si se lleva a cabo la amplificacin dentro de las primeras 48 horas, de no ser
as, se almacena a -70 C, hasta su anlisis.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 49 de 67
enero 2014
Notas:
Todos los desechos de los tubos colectores se deben descartar en un recipiente exclusivo para su
posterior eliminacin.
Las soluciones de extraccin AVL y AW1 contienen sales de guanidina, las cuales pueden
formar compuestos altamente reactivos cuando se combinan con cloro.
En caso de incorporar un control interno, este deber adicionarse junto con el acarreador a la
solucin AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucletidos, molculas ms pequeas
no promueven un buen rendimiento de ARN.
En caso de que se requiera realizar la extraccin de ms de 30 muestras, se deber usar el equipo
automatizado, siguiendo el Instructivo de extraccin automatizada de cidos nucleicos y el
Instructivo de Operacin del Equipo MagNA Pure LC 2.0. En este caso se deber utilizar la
bitcora de trabajo de extraccin automatizada.
AMPLIFICACIN
Calculo de reactivos y ubicacin de muestras.
a. Con base al nmero de muestras y controles (positivos y negativos) se realizan los clculos
correspondientes para preparar la mezcla maestra de reaccin, estos datos se deben anotar en la
bitcora de trabajo correspondiente. La persona encargada de realizar la mezcla maestra de
reaccin, determinar el nmero requerido de tubos/pozos, de acuerdo al nmero de muestras
problema y controles.
b. Realizar los clculos de cada uno de los reactivos, de acuerdo al nmero de muestras y controles.
Considerar un excedente para una muestra ms.
c. Anotar la ubicacin de las muestras y controles en la bitcora de trabajo as como todos los datos
solicitados en la misma. La ubicacin de los controles debe estar lo ms alejado posible de las
muestras problema.
d. Abrir el programa del termociclador para crear un nuevo documento (placa) basndose en el
formato existente (Plantilla Rubola); para ubicar en la misma posicin las muestras y
controles en la placa del programa as como en la bitcora de trabajo.
e. Guardar el documento elaborado con el formato de fecha (dd/mm/aa) en la carpeta
correspondiente.
Preparacin de mezcla maestra de reaccin
a. Limpiar el rea como se indic anteriormente y sacar del congelador los reactivos a utilizar,
mantenindolos en fro en un contenedor con cama de hielo.
b. Trabajar siguiendo las buenas prcticas de laboratorio para biologa molecular.
c. Agregar a un tubo tipo eppendorf de 1.7 mL cada uno de los reactivos que conforman la mezcla
maestra de reaccin en base a la bitcora de trabajo realizada.
d. Agregar 22.5 L de la mezcla maestra de reaccin a cada tubo/pozo a utilizar.
e. Agregar 2.5 L de agua calidad biologa molecular al tubo/pozo que contendr el control
negativo de reactivos y taparlo.
f. Pasar al rea de adicin de ARN los tubos/pozos que contienen la mezcla maestra de reaccin
evitando exponerlos al ambiente, para ello se deben trasladar en una caja limpia, cerrada y libre
de ARNas y ADNas.
Adicin de los ARN de muestras problemas
a. Limpiar el rea como se indic anteriormente.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 50 de 67
enero 2014
b. Agregar 2.5 L del ARN de la muestra problema a cada tubo/pozo siguiendo la ubicacin de la
bitcora de trabajo correspondiente, en primer lugar se agrega el ARN de la muestra problema,
al final los controles positivos y estndares (en caso de cuantificacin). Al terminar de colocar
una hilera esta deber de taparse usando tiras de tapas. Evitar el contacto directo de los guantes
al momento de tapar.
c. Ingresar los tubos/pozos al termociclador, seleccionar en el programa el protocolo de
amplificacin (Rubola) e iniciar la corrida.
Interpretacin de las curvas de amplificacin
a. Los valores de amplificacin se expresan en valores de Ct (del ingls Cycle threshold), donde un
Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa rebasan el punto de corte o
umbral. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN presente en la
muestra.
b. A cada uno de los fluorforos se le asign un color para diferenciar el ARN viral del ARN del
RP (ARNsa P humana) , como se indica a continuacin:
c. Fluorforo FAM (5 o 6-carboxifluoresceina), color verde para identificar al RP de las muestras
clnicas.
d. Fluorforo FAM color azul para identificar al ARN viral de las muestras clnicas.
e. Para que la muestra sea considerada positiva deber presentar curvas sigmoides.
f. Muestras con valor de Ct menor o igual a 40 son positivas para Sarampin.
g. Muestras con valor de Ct mayor o igual a 40 son negativas.
h. Muestras con Ct menores a 35, pero con curvas no sigmoides (artefactos), no deben reportarse y
deben repetirse las muestras por duplicado.
i. Muestras con valor de Ct entre 36 y 38, se debern repetir por duplicado. Si se obtiene
nuevamente el mismo resultado se debe repetir el ensayo desde la extraccin de ARN y en caso
de obtener el mismo resultado se reporta como positivo.
Notas:
En caso de incorporar un control interno se deben seguir las instrucciones de uso del fabricante.
Los controles positivos y negativos sirven para monitorear alguna falla en alguno de los reactivos
del ensayo y para validar el ensayo per se.
El ensayo se debe repetir si alguno de los controles positivos no amplifica o si estuvieran fuera del
rango esperado o s el control negativo amplificara.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 51 de 67
enero 2014
Figura. 9. Resultados de amplificacin. Grficas de amplificacin presentadas en formato

logartmico
Deteccin del virus de rubola mediante RT PCR tiempo real

CDC protocols for the molecular epidemiology of measles virus and rubella virus; version of
03/06/2012
La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR por sus siglas
en ingls) tiene la facultad de producir una gran cantidad de copias de ADN de doble cadena y en
conjunto con la reaccin de retro-transcripcin (RT) es posible obtener molculas de ADN
complementario, a partir de una muestra de ARN. El ARN extrado de las muestras clnicas o de un
cultivo de clulas es amplificacin. Los datos son colectados desde el primer ciclo de reaccin hasta
el ltimo, permitiendo realizar cuantificacin de ADN o ARN. La deteccin de la amplificacin de
una secuencia especfica es monitoreada mediante la captacin de seales de fluorescencia emitida
durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de ARN o de nmero de copias
de material gentico evidenciar un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la
reaccin. Por lo contrario, bajas concentraciones de ARN permitirn obtener un incremento de
fluorescencia en los ltimos ciclos de la reaccin.
El virus de la rubeola se encuentra en circulacin en concentraciones detectables durante la fase
aguda de la enfermedad (0-5 das) y esta caracterstica hace que este ensayo sea utilizado nicamente
durante esta fase.
Equipo
Gabinete de bioseguridad para PCR
Estacin de trabajo con flujo laminar
Refrigerador de 2 puertas
Congelador
Ultracongelador
Microcentrfuga
Agitador magntico
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 52 de 67
enero 2014
Micropipeta de volumen variable entre 0.5-10 L

Micropipeta de volumen variable entre 20-200 L
Micropipeta de volumen variable entre 100-1000 L (2)
Termociclador en tiempo real
Materiales
Puntas con filtro, estriles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 0.5-10 L
Tubos tipo Eppendorf, estriles, libres de ARNsa y ADNsa con capacidad de 1.7 mL
Gasas estriles
Guantes de nitrilo (libres de talco)
Batas desechables
Papel aluminio
Gradillas de unicel para tubos tipo eppendorf
Estaciones para trabajo en fro para tubos tipo eppendorf
Placas de polipropileno con 96 pozos claros especiales para PCR en tiempo real con capacidad
de 5 -125 L
Tiras con 8 tubos especiales para PCR en tiempo real con capacidad de 0.2 mL
Tiras con 8 tapas pticas ultra claras especiales para PCR en tiempo real.
Marcadores indelebles de punto fino
Contenedores y bolsas para desecho de material biolgico-infeccioso.
Pinzas
a. Cepa de referencia utilizada como control positivo.
b. Estuche para extraccin de ARN viral, (QIAamp Viral ARN Mini Kit) Marca QIAGEN,
catlogo 52906.
c. Enzima para amplificacin: SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum, Marca Invitrogen,
catlogo 11372-088 o Marca Bio-Rad, catlogo 170-8894.
d. Agua calidad PCR libre de ARNsa, Marca Roche, catlogo: 033 159 32 001.
e. Iniciador Sarampin MVN1139-F: 5 TGG CAT CTG AAC TCG GTA TCA C 3
f. Iniciador Sarampin MVN1213-R: 5 TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA 3
g. Sonda Sarampin MVNP1163-P: 5 FAM CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG
A -BHQ1 3.
h. Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-F): 5 AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3.
i. Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-R): 5 GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 3.
j. Sonda (BHQ1 HURNASE-P):5FAM TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1
3.
k. Etanol al 75%.
l. Etanol grado biologa molecular (96-100%)
m. Hipoclorito de sodio al 5%.
Solucin para eliminacin de ADN, DNaZap, Marca Ambion, catlogo 98
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 53 de 67
enero 2014
Nota: Las cepas de referencia fueron donadas por los Centros para el Control y Prevencin de
Enfermedades (CDC).
Los fluorforos pueden ser cambiados por otros, siempre y cuando se encuentren en el mismo canal
de adquisicin. Esto depender de la disponibilidad en la sntesis de cada empresa.
Procedimiento
Preparacin del rea de trabajo
Cada una de las reas de trabajo debe contar con material, equipo, reactivos y personal exclusivo.
Antes de empezar, el gabinete de bioseguridad o flujo laminar de cada una de las reas de trabajo
(extraccin de ARN, preparacin de mezcla maestra de reaccin y de ARNs de muestras
problemas) deber de limpiarse con hipoclorito de sodio al 5.0%, agua bidestilada y etanol al 75%,
siguiendo ese orden. Irradiar con luz ultravioleta durante 20 minutos antes y despus de a trabajar.
Si se cuenta con soluciones inhibidora de ARNs y ADNs se recomienda realizar la limpieza con
estas soluciones antes y despus de trabajar. El material necesario que se use debe estar listo en cada
rea de trabajo.
Extraccin de cidos nucleicos
El estuche de extraccin simplifica la extraccin de ARN viral a partir de fluidos libres de clulas
mediante un procedimiento rpido de centrifugacin en columna. No se requiere utilizar fenolcloroformo. El ARN se une especficamente a la membrana de silica-gel, por la cual pasan todos los
contaminantes. Los inhibidores de PCR como los cationes divalentes y protenas, son
completamente removidos durante los pasos de lavado dejando el ARN puro y listo para ser
desprendido de la membrana con la solucin de elucin.
Preparacin de reactivos
a. Agregar 310 L de solucin amortiguadora AVE al tubo que contiene 310 g de acarreador de
ARN liofilizado, para obtener una solucin de trabajo de 1.0g/L.
b. Disolver perfectamente, realizar alcuotas en volmenes suficientes para trabajar 5-10 muestras y
almacenar a 20 C.
c. Evitar ciclos de congelacin-descongelacin ms de tres veces.
d. Preparar solucin AVL, agregando acarreador de ARN en relacin de: 0.56 mL de AVL + 5.6
L de acarreador de ARN por cada muestra a procesar (mximo 24 muestras).
e. La solucin de lavado AW1, debe ser preparada agregando 125 mL de etanol (96-100%) grado
biologa molecular y marcar el frasco para indicar que se le agreg etanol.
f. La solucin de lavado AW2, debe ser preparada agregando 160 mL de etanol (96-100%) grado
biologa molecular y marcar el frasco para indicar que se le agreg etanol.
Obtencin de ARN
a. Elaborar la bitcora de trabajo correspondiente para la realizacin de la extraccin.
b. Etiquetar los tubos tipo eppendorf de 1.7 mL necesarios dependiendo del nmero de muestras a
procesar.
c. Adicionar 560 L de solucin AVL/acarreador de ARN a cada uno de los tubos tipo eppendorf.
d. Agregar 140 L de suero o plasma y agitar durante 15 segundos.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 54 de 67
enero 2014
e. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar brevemente a 1500 rpm por 30

segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
f. Agregar 560 L de etanol grado biologa molecular, agitar durante 15 segundos y centrifugar
brevemente 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
g. Remover del empaque las columnas/tubo colector a utilizar y etiquetarlas.
h. Tomar 630 L de la solucin anterior (inciso f) y agregarlos cuidadosamente dentro de la
columna, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 C.
i. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y repetir el paso anterior.
j. Cambiar la columna nuevamente a un tubo colector limpio y agregar 500 L de solucin de
lavado AW1, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 C.
k. Cambiar la columna otra vez a un tubo colector limpio y agregar 500 L de solucin de lavado
AW2, centrifugar a 14,000 rpm durante 3 minutos a 4 C.
l. Cambiar la columna a otro tubo tipo eppendorf de 1.7 mL limpio, estril, libre de ARNsa y
ADNsa, etiquetado (con el nmero de muestra correspondiente) y agregar 60L de solucin de
elucin (AVE) a cada una de las columnas. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto y
centrifugar a 8000 rpm por un minuto a 4 C.
m. Descartar la columna y cerrar el tubo tipo eppendorf que contiene el ARN de inters.
n. Almacenar a -20 C si se lleva a cabo la amplificacin dentro de las primeras 48 horas y de no
ser as se almacena a -70 C, hasta su anlisis.
Notas:
Todos los desechos de los tubos colectores se deben descartar en un recipiente exclusivo para su
posterior eliminacin.
Las soluciones de extraccin AVL y AW1 contienen sales de guanidina, las cuales pueden
formar compuestos altamente reactivos cuando se combinan con cloro.
En caso de incorporar un control interno, este deber adicionarse junto con el acarreador a la
solucin AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucletidos, molculas ms pequeas
no promueven un buen rendimiento de ARN.
En caso de que se requiera realizar la extraccin de ms de 30 muestras, se deber usar el equipo
automatizado, siguiendo el Instructivo de extraccin automatizada de cidos nucleicos y el
Instructivo de Operacin del Equipo MagNA Pure LC 2.0. En este caso se deber utilizar la
bitcora de trabajo de extraccin automatizada.
AMPLIFICACIN
Clculo de reactivos y ubicacin de muestras
a. Con base al nmero de muestras y controles (positivos y negativos) se realizan los clculos
correspondientes para preparar la mezcla maestra de reaccin, estos datos se deben anotar en la
bitcora de trabajo correspondiente. La persona encargada de realizar la mezcla maestra de
reaccin, determinar el nmero requerido de tubos/pozos, de acuerdo al nmero de muestras
problema y controles.
b. Realizar los clculos de cada uno de los reactivos, de acuerdo al nmero de muestras y controles.
Considerar un excedente para una muestra ms.
c. Anotar la ubicacin de las muestras y controles en la bitcora de trabajo as como todos los datos
solicitados en la misma. La ubicacin de los controles debe estar lo ms alejado posible de las
muestras problema.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 55 de 67
enero 2014
d. Abrir el programa del termociclador para crear un nuevo documento (placa) basndose en el
formato existente (Plantilla Rubeola); para ubicar en la misma posicin las muestras y
controles en la placa del programa como en la bitcora de trabajo.
e. Guardar el documento elaborado con formato de fecha (dd/mm/aa) en la carpeta
correspondiente.
Preparacin de mezcla maestra de reaccin
a. Limpiar el rea como se indic anteriormente y sacar del congelador los reactivos a utilizar,
mantenindolos en un contenedor con cama de hielo. Agregar a un tubo tipo eppendorf de 1.7
mL cada uno de los reactivos que conforman la mezcla maestra de reaccin con base en la
bitcora de trabajo realizada.
b. Agregar 22.5 L de la mezcla maestra de reaccin a cada tubo/pozo a utilizar.
c. Agregar 2.5 L de agua calidad biologa molecular al tubo/pozo que contendr el control
negativo de reactivos y taparlo.
d. Pasar al rea de adicin de ARN los tubos/pozos que contienen la mezcla maestra de reaccin
evitando exponerlos al ambiente, para ello se deben trasladar en una caja limpia, cerrada y libre
de ARNas y ADNas.
Adicin de los ARN de muestras problemas
a. Limpiar el rea como se indic anteriormente y sacar los ARN de las muestras problema del
congelador.
b. Trabajar siguiendo las buenas prcticas de laboratorio para Biologa Molecular.
c. Agregar 2.5 L del ARN de la muestra problema a cada tubo/pozo siguiendo la ubicacin de la
bitcora de trabajo correspondiente, en primer lugar se agrega el ARN de la muestra problema,
al final los controles positivos y estndares (en caso de cuantificacin). Al terminar de colocar
una hilera esta deber de taparse usando tiras de tapas. Evitar el contacto directo de los guantes
al momento de tapar.
d. Ingresar los tubos/pozos al termociclador, seleccionar en el programa el protocolo de
amplificacin (Rubeola) e iniciar la corrida.
Interpretacin de las curvas de amplificacin
a. Los valores de amplificacin se expresan en valores de Ct (Cycle threshold, por sus siglas en
ingls), donde un Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa rebasan el
punto de corte o umbral. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN
presente en la muestra.
b. A cada uno de los fluorforos se le asign un color para diferenciar el ARN viral del ARN del
RP, como se indica a continuacin:
c. Fluorforo FAM color verde para identificar al RP de las muestras clnicas.
d. Fluorforo FAM color azul para identificar al ARN viral de las muestras clnicas.
e. Para que la muestra sea considerada positiva deber presentar curvas sigmoides.
f. Muestras con valor de Ct menor o igual a 40 son positivas para Rubola.
g. Muestras con valor de Ct mayor o igual a 40 son negativas.
h. Muestras con Ct menores a 35, pero con curvas NO sigmoides (artefactos), no deben reportarse
y deben repetirse por duplicado.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 56 de 67
enero 2014
i. Muestras con valor de Ct entre 36 y 38, deben repetirse por duplicado. Si se obtiene
nuevamente el mismo resultado se debe repetir el ensayo desde la extraccin de ARN, en caso
de obtener el mismo resultado se reporta como positivo.
Notas:
En caso de incorporar un control interno se deben seguir las instrucciones de uso del fabricante.
Los controles positivos y negativos sirven para monitorear alguna falla en alguno de los reactivos
del ensayo y para validar el ensayo.
El ensayo se debe repetir si alguno de los controles positivos no amplifica o si estuvieran fuera
del rango esperado o s el control negativo amplificara.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 57 de 67
enero 2014
Figura. 10. Resultados de amplificacin. Grficas de amplificacin presentadas en formato

logartmico
Mtodo de Retro-transcripcin acoplada a la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) para

la deteccin del Virus de Sarampin
El mtodo de RT-PCR permite realizar el diagnstico de sarampin, usando la transcriptasa reversa
se obtiene el cido Desoxirribonucleico complementario (cADN por sus siglas en ingls). En una
reaccin de PCR convencional, el cADN es amplificado empleando la enzima Taq polimerasa. Los
productos de PCR se someten a un corrimiento electrofortico para determinar el tamao del
fragmento de ADN.
La reaccin de RT-PCR para diagnstico de sarampin utiliza un par de iniciadores: PARMV43 y
PARMV44 los cuales estn dirigidos a una regin conservada del gen de la nucleocpside (N),
dando u fragmento de 300 pb, este fragmento no puede usarse para secuenciar.
Una segunda reaccin de RT-PCR es empleada para genotipificar el virus de sarampin, utilizando
los iniciadores PARMV59 y PARMV63 esta combinacin de iniciadores da como resultado un
amplicon de 831 pb. Para obtener un fragmento ms especfico se realiza PCR nested (PCRn) en el
cual se utilizan un par de iniciadores internos PARMV60 y PARMV63N (se encuentran en la parte
final de la regin carboxilo COOH del gen N) que dan un fragmento de 563 pb.
Muestra primaria
El ARN es extrado y purificado por el mtodo de columna, mencionado en el instructivo para la
extraccin por columna del ARN viral con el estuche QIAMP QIAGEN (LPMS-I-01/0) a partir
de aislamientos en las lneas celulares B95 (linfocitos B de mono titi) o Slam, muestra original como
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 58 de 67
enero 2014
exudado farngeo y orina. En el caso de brotes el nmero de muestras aumenta y si este es mayor a
cincuenta se hace la extraccin automatizada con el equipo MagNAPure LC2.0 Roche.
El ARN total obtenido en el proceso de extraccin es colectado en tubos estriles tipo eppendorf
calidad PCR de 1.7 mL libres de ADNas y ARNas, estos debern ser conservados a -20 C, para
evitar la degradacin del material gentico y conservar su pureza hasta el momento de su anlisis.
Equipo
Agitador tipo vortex
Cabina de bioseguridad clase II tipo A
Termociclador
Micropipeta de 0.5 a 10 L
Refrigerador
Congelador
Ultracongelador
Espectrofotmetro
Materiales
Microtubos calidad PCR con tapa plana de 1.7 mL, 500 L y 200 L libres de ARNas y
ADNas
Puntas con filtro, estriles para pipeta automtica de varios volmenes 0.1 a 10 L, 10 a 100 L,
20 a 200 L
Gradillas para tubos y microtubos
Congelador porttil para tubos eppendorf LabCooler
Contenedor para puntas de desecho
Lentes de seguridad
Batas desechables
Guantes
Reactivos y Materiales Biolgicos
Solucin ARNse AWAY (Invitrogen catlogo 10328-011)
Agua libre de ARNas y ADNas
Solucin amortiguadora 10x para PCR con 1.5mM de MgCl2 (Roche catlogo 11 271 318 001)
DNA Taq-Polimerasa de 5 U/L (Roche catlogo 11 418 432 001)
Inhibidor ARNsin de 40 U/L de placenta (Roche catlogo 03 335 399 001)
Agua grado PCR (Roche catlogo 03 315 932 001)
Transcriptasa Reversa del virus de Mieloblastosis Aviar (RT-AMV) (Roche catlogo 10 109
118 001).
Iniciador PARMV41 para diagnstico
Iniciador PARMV44 para diagnstico
Iniciador PARMV59 para secuenciacin
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 59 de 67
enero 2014
Iniciador PARMV63N para secuenciacin

RNA extrado del sobrenadante de clulas con el virus de sarampin
DNA obtenido de la RT-PCR para secuenciacin
Control positivo: sobrenadante de cultivo de cepas de referencia aisladas en las lneas celulares
Vero Slam o B95a (linfocitos B de mono titi): Edmonston, Moraten, Swartz y Chicago.
dNTPs 2.5mM marca Sigma.
Etanol al 70%
Procedimiento
Realizar la extraccin manual del ARN viral conforme al instructivo del estuche comercial para
la extraccin por columna.
En caso de tener un gran nmero de muestras, realizar la extraccin automatizada en el robot
MagNAPure LC 2.0 Roche.
Llevar a cabo la prueba de RT-PCR para el diagnstico de sarampin.
Para realizar esta metodologa es indispensable contar con reas separadas y suficientes
operadores para evitar contaminaciones entre el mismo material gentico del virus de sarampin
y de los controles positivos o con ADN genmico
Preparar la mezcla de reactivos de la siguiente forma:
Trabajar en cabina de bioseguridad tipo II exclusiva para preparar la mezcla de reactivos.
Limpiar la cabina empleando una solucin descontaminante de DNAsa y RNAsa,
posteriormente con una solucin de etanol al 70%.
Poner el material que se usar para preparar la mezcla de reactivos e irradiarlo con luz
ultravioleta (UV) por 20 minutos.
Ventilar la cabina durante 20 minutos antes de su uso.
En el rea Pre-PCR, se preparar la mezcla de reactivos para la RT-PCR. En un tubo
eppendorf de 1.7 mL preparar la mezcla de reaccin (mantener el tubo en el congelante porttil
para tubos a -20 C)
Adicionar los reactivos a las siguientes concentraciones finales y en el siguiente orden: solucin
amortiguadora 1X para PCR con MgCl2, 200 M de cada DNTPs, 10 picomoles de los
iniciadores PARMV41 y PARMV44, 8 U de RT AMV, 5 U de ARNsin, 2 U de Taq
polimerasa y H2O calidad PCR.
En el rea de aislamiento de RNA, se preparar una serie de tubos eppendorf de 200 L segn
el nmero de muestras que se est trabajando. A un tubo adicionar 5.0 L de ARN del control
negativo y cerrar el tubo perfectamente, en otro tubo poner 5.0 L del control de reactivos (H2O
con la que se prepar la mezcla de reactivos) y finalmente poner 5.0 L de la muestra problema
en cada tubo y tapar perfectamente.
En el rea de PCR, se colocarn 5.0 L de ARN de los controles positivos (Edmonston,
Moraten, Swartz y Chicago) en tubos eppendorf de 200 L. Despus incubar en el
termociclador segn el programa indicado para hacer la PCR nested (anidada) bajo las
siguientes condiciones: 35 ciclos de amplificacin, 94 C, 30 segundos; 55 C, 45 segundos y 72
C, un minuto, un ciclo final de 72 C durante 7minutos y una fase estacionaria de 4 C por
tiempo indefinido para preservar el ADN amplificado.
Retirar las muestras del termociclador, apagar el equipo y desconectarlo. Los productos de ADN
se almacenan a -20 C.
Realizar el corrimiento electrofortico de los productos en geles de agarosa.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 60 de 67
enero 2014
Interpretacin de resultados
Negativo: ausencia de amplificado.
Positivo: presencia del amplificado esperado. Los casos positivos se envan al Laboratorio de
Genoma de Patgenos (GNM) para su secuenciacin.
Los resultados son interpretados por comparacin de la presencia y tamao del producto de PCR de
todas las muestras contra el control positivo (ADN obtenido de los aislamientos: Edmonston,
Moraten, Swartz y Chicago). El producto final de la reaccin para diagnstico es de 300 pb, en el
caso de secuenciacin es de 831 pb y en la PCRnested es de 563 pb.
Mtodo de Retro-transcripcin acoplada a la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) para
la deteccin del Virus de Rubola.
El mtodo de RT-PCR permite realizar el diagnstico de rubola. El cido ribonucleico viral es
convertido a ADNc (cido Desoxirribonucleico complementario) usando la transcriptasa reversa
(RT). En una reaccin de PCR convencional, el ADNc es amplificado empleando la enzima Taq
polimerasa. Los productos de PCR se someten a un corrimiento electrofortico en geles de agarosa
y poliacrilamida-bisacrilamida para determinar el tamao del fragmento de ADN.
En la sntesis de ADNc y en la reaccin de PCR se utilizan un par de iniciadores R2 y R7 que se
encuentran en el marco de lectura abierto del genoma del virus de rubola, del gen E1 que codifica
para una protena estructural.
Esta combinacin de iniciadores da como resultado un amplicn de 185 pb. Para tener un
diagnstico ms especfico se realiza un PCR nested [PCRn (PCR anidado)] en donde se utilizan
un par de iniciadores internos llamados R8 y R11 para obtener un fragmento de 144 pb.
Muestra
El ARN es extrado y purificado por el mtodo de columna mencionado en el instructivo para la
extraccin por columna del ARN viral con el estuche QIAMP QIAGEN (a partir de las lneas
celulares Vero Slam y Vero). En el caso de contar con un mayor nmero de muestras, realizar la
extraccin automatizada con el robot MagNAPure LC 2.0 Roche.
El ARN total obtenido en el proceso de extraccin es colectado en tubos estriles tipo eppendorf
calidad PCR de 1.7 mL libres de ADNas y ARNas, deber ser conservado a -20 C, para evitar la
degradacin del material gentico y conservar su pureza hasta el momento de usarlo.
Equipo
Agitador tipo vortex

Cabina de bioseguridad clase II tipo A
Termociclador
Micropipeta 2 a 20 L
Micropipeta 1 a 10 L
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 61 de 67
enero 2014
Refrigerador
Congelador
Ultracongelador
Espectrofotmetro
Materiales
Microtubos calidad PCR con tapa plana de: 1.7 mL, 500 L y 200 L, libres de ARNas y
ADNas.
Puntas con filtro, estriles para pipeta automtica de diferentes volmenes: 0.1 a 10 L, 10 a
100 L, 20 a 200 L.
Gradillas para tubos y microtubos
Congelador porttil para tubos eppendorf (LabCooler)
Contenedor para puntas de desecho
Lentes de seguridad
Batas desechables
Guantes desechables

Solucin ARNse AWAY (Invitrogen No. de catlogo 10328-011)
Agua libre de ARNas y ADNas
Solucin amortiguadora 10x para PCR con 1.5 mM de MgCl2 (Roche catlogo 11 271 318001)
Solucin amortiguadora 10x para PCR sin 1.5 mM de MgCl2 (Roche catlogo 11 699 113001)
Solucin de Dithiothreitol (DTT) ((Roche catlogo 11 788 558 001)
ADN Taq-Polimerasa de 5 U/L (Roche no de catlogo 11 418 432 001)
Inhibidor ARNsin de 40 U/L de placenta (Roche catlogo 03 335 399 001)
Agua grado PCR (Roche catlogo 03 315 932 001)
Etanol grado biologa molecular (96-100%)
Solucin de etanol al 70%
Transcriptasa Reversa del virus de Mieloblastosis Aviar (RT-AMV) (Roche catlogo 10 109
118 001)
Iniciador R2
Iniciador R7
Iniciador R8
Iniciador R11
ARN extrado del sobrenadante de clulas Vero Slam y Vero infectadas con el virus de rubola
ADN obtenido de la RT-PCR de rubola
Control positivo: sobrenadante de cultivo de la vacuna RA27/3 en tercer pase
Procedimiento
Realizar la extraccin del ARN viral conforme al instructivo del estuche para la extraccin por
columna, si el nmero de muestras es mayor, hacer extraccin automatizada en el robot
MagNAPure LC 2.0 Roche
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 62 de 67
enero 2014
Llevar a cabo la prueba de RT-PCR para el diagnstico de rubola

Es indispensable contar con reas separadas y suficientes operadores para evitar contaminaciones
con el material gentico del virus de rubola y de controles positivos o con ADN genmico
Preparar la mezcla de reactivos de la siguiente forma:
Trabajar en cabina de bioseguridad tipo II exclusiva para preparar la mezcla de reactivos.
El gabinete deber limpiarse empleando una solucin descontaminadora de ADNsa y
ARNsa
Retirar con una solucin de etanol al 70%
Poner el material que se usar para preparar la mezcla e irradiarlo con luz ultravioleta
(UV) por 20 minutos, despus ventilar el rea.
En el rea de Pre-PCR, se preparar la mezcla de reactivos para la RT-PCR. A cada muestra se
le agregan 20 L de la siguiente mezcla: solucin amortiguadora 1X para PCR con MgCl2, 5
mM DTT, 250 M de cada dNTP, 10 picomoles de los iniciadores R2 y R7, 25 U de RT
AMV, 10 U de ARNsin, 2 U de Taq polimerasa y H2O c. b. p. y 5.0 L de muestra para un
volumen final de 25 L de reaccin.
Utilizar tubos eppendorf de 200 L y adicionar 20 L de mezcla de reactivos para la RT-PCR,
seleccionar un tubo para el control negativo y otro para el control de reactivos, adicionar
respectivamente a cada uno de ellos 5.0 L de ARN obtenido de la lnea celular Vero Slam sin
infectar y 5.0 L del agua utilizada en la preparacin de la mezcla de reactivos. Todos los tubos
deben taparse perfectamente y llevarse al rea en donde se colocaran las muestras de ARN
infectadas con el virus de rubola.
En el rea para extraccin o aislamiento de ARN el mismo operador A seleccionar un tubo
para el control positivo. Destapar los tubos uno por uno y adicionar 5.0 L de ARN de la
muestra. Mezclar los tubos ligeramente en agitador tipo vortex, evitando la formacin de
burbujas.
El operador B trabajar en el rea de PCR y adicionar 5.0 L de ARN del control positivo
(RA27/3) al tubo seleccionado en el paso anterior.
Colocar los tubos en el termociclador, el programa inicia con la retro-transcripcin, seguido de
una fase de 5 minutos de desnaturalizacin (para eliminar los restos de enzima), despus 35
ciclos cada uno con tres etapas: desnaturalizacin, alineacin y extensin, seguido de un ciclo de
extensin para terminar partes incompletas y por ltimo una etapa de enfriamiento (4 C) para
preservar el ADN sintetizado.
Terminada la corrida se retiran las muestras del termociclador y se conservan a 4 C. Apagar el
equipo y desconectarlo.
Realizar primero las diluciones 1:20 para la PCRnested e interpretar los resultados.
PCRnested o PCR anidada
En el rea de PCR se har primero la limpieza necesaria e irradiacin con luz ultravioleta (UV).
Despus se harn diluciones 1:20 de los productos de la RT-PCR. Primero proceder a mezclar
en el agitador tipo vortex los tubos que contienen los productos de ADN.
Poner 38 L de agua libre de ARNas y ADNas en tubos eppendorf de 500 L. Seleccionar tres
tubos uno para el control negativo, el otro para el control de reactivos y uno para el control
positivo (trabajar al final). Abrir uno de los tubos y agregar 2.0 L del producto de RT-PCR del
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 63 de 67
enero 2014
control negativo, tapar. Abrir el siguiente tubo y agregar 2.0 L del producto de RT-PCR del
control de reactivos y tapar. Abrir el siguiente tubo y agregar 2.0 L del producto de RT-PCR
de la muestra infectada con virus de rubola, tapar. Esto se repite segn el nmero de muestras
que se vayan a procesar.
Se trasladarn los tubos al rea de extraccin es decir, el tubo que contiene agua y el producto de
la RT-PCR con el control positivo. Abrir los tubos y agregar 2.0L del control positivo, tapar
ambos tubos.
Agitar todos los tubos en el agitador tipo vortex y etiquetar.
En el rea de Pre-PCR se har la preparacin de la mezcla de reactivos para la PCRnested.
Realizar la asepsia necesaria en el rea de trabajo e irradiar con luz UV.
La mezcla de reaccin deber contener: Solucin amortiguadora (Buffer 1X) sin MgCl2, 1.0
mM de MgCl2, 300 M de cada dNTP, 5 picomoles de iniciadores R8 y R11, 2 U de Taq
polimerasa y la cantidad de agua necesaria para completar un volumen de 45 L. Agitar en
vortex para homogenizar la mezcla.
Utilizar tubos eppendorf de 200 L y agregar 45 L de mezcla de reactivos para la PCRnested,
tapar los tubos y trasladar al rea de PCR.
En el rea de PCR, se trabajar con la dilucin del control de reactivos. Destapar el tubo que
llevar el control de reactivos y agregarle 0.5 L de la dilucin correspondiente, taparlo, agitar
suavemente en el agitador tipo vortex y observar que no se formen burbujas.
En el rea de extraccin o aislamiento de ARN, se trabajar con la dilucin de las muestras
problema. Destapar el tubo que contiene la mezcla de reaccin y agregar 5.0 L de la dilucin
correspondiente que tiene la dilucin con la muestra problema, taparlo, despus agitar sin que se
formen burbujas en el agitador tipo vortex.
Dilucin del control positivo. Destapar el tubo que llevar el control positivo y agregar 5.0 L
de la dilucin correspondiente, taparlo, despus agitar con suavidad en el agitador tipo vortex y
observar que no se formen burbujas.
Incubar en el termociclador y utilizar el protocolo que guarda el programa en el que se incubaran
las muestras para sintetizar la PCRnested: 20 ciclos de amplificacin: 94 C, 30 segundos; 56
C, 45 segundos y 72 C, un minuto, un ciclo final de 72 C durante 7minutos y una fase
estacionaria de 4 C por tiempo indefinido para preservar el ADN amplificado.
Retirar las muestras del termociclador, apagar el equipo y desconectarlo. Si el operador contina
con la electroforesis puede mantener la muestra a temperatura ambiente mientras carga el gel, de
lo contrario, almacenar en refrigeracin.
Interpretacin de resultados
Negativo: ausencia de amplificado
Positivo: presencia del amplificado esperado
Los resultados son interpretados debido a la comparacin de la presencia y tamao del productos de
PCR de todas las muestras contra el control positivo que es la vacuna RA27/3. El producto final de
la reaccin es de 143 pb.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 64 de 67
enero 2014
Genotipificacin de Sarampin
El principio de la secuenciacin automtica se basa en el mtodo de Sanger (1977) y permite
obtener la secuencia de productos de PCR de diferentes patgenos de importancia mdica como el
sarampin.
La genotipificacin de sarampin se basa en analizar una ventana de 634 nucletidos
correspondientes al gen que codifica para la nucleoprotena, por lo que es necesario amplificar por
RT-PCR en tiempo real un producto de amplificacin de 854 pares de bases y obtener su secuencia
para posteriormente compararla filogenticamente con los secuencias de los diferentes genotipos de
sarampin reportados en todo el mundo.
Para conseguir este objetivo se utiliza el estuche Measles Genotyping Kit versin 2.0 para producir
los fragmentos de ADN y secuenciarlos siguiendo el mtodo (Biologa Molecular, InDRE).
Reactivos y Equipo
Secuenciador Automtico Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer.
Termociclador GeneAmp con una velocidad de calentamiento de 1 C/s, Marca Applied
Biosystems, Modelo PCR system 9700
Estuche Measles Genotyping Kit
Iniciador MeV214 5 TGGAGCTATGCCATGGGAGT 3
Iniciador MeV216 5 TAACAATGATGGAGGGTAGG 3
Enzima ExoSAP-IT (USB Corporation)
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)
Solucin amortiguadora Big Dye Terminator Buffer 5x (Applied Biosystems)
Polmero POP-7 y/o POP-6 (Applied Biosystems)
RT-PCR
Extraer el material gentico manualmente mediante columnas Qiagen ARN miniviral o
automticamente con el estuche MagnaPure Total Nucleic Acids, dependiendo del nmero de
muestras.
Preparar la mezcla de reaccin de RT-PCR utilizando el estuche SuperScript III de Invitrogen:

Agua:
6.0 L
Solucin amortiguadora 2X:
12.5 L
Primer MeV214:
0.5 L
Primer MeV216:
0.5 L
RT/Taq:
0.5 L
Muestra (RNA):
5.0 Ll
Colocar lo tubos en el termociclador con el siguiente programa:

Transcripcin Reversa: 50 C/60 min
Desnaturalizacin: 94 C /2 min
40 ciclos de:
Desnaturalizacin 94 C/30 s
Alineacin a 60 C/30 s
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 65 de 67
enero 2014
Extensin a 68 C/60 s
Extensin a 68 C/2 min
Mantener a 4 C.
Cuantificacin y Purificacin
Determinar la calidad y la cantidad de ADN de cada producto para su purificacin y para la
reaccin de secuenciacin
Agregar por cada 5.0 L de producto de PCR, 0.5 L de la enzima ExoSAP-IT.
Incubar a 37 C por 15 min en el termociclador AB 9700
Inactivar la enzima a 80 C por 15 min y mantener los productos a 4 C.
Reaccin de Secuencia
Agregar por cada tubo de reaccin los siguientes reactivos:

Reactivo
Terminator Ready Reaction Mix (BigDye 3.1v)
Iniciador (3.3 pmol/L)
BigDye terminator Buffer 5x para 1.1v y 3.1v (solucin amortiguadora)
Producto de PCR
H2O grado biologa molecular
a.
b.
c.
d.
Cantidad
2.0 L
1.0L
3.0 L
Volumen necesario
Ajustar a 20 L
Colocar los tubos en el termociclador y llevar a cabo la reaccin de secuenciacin por 40 ciclos
con las siguientes condiciones:
Desnaturalizacin a 96 C por 10 s
Alineacin a 50 C por 5 s
Extensin a 60 C por 4 min
Mantener a 4 C
Purificacin de los productos de extensin

Preparar y etiquetar las columnas DyeEx 2.0 Spin y los tubos de coleccin de hidratacin.
Colocar en el centro de cada columna (sin tocar la silica) cada una de las muestras segn
corresponda. Centrifugar las columnas a 3500 rpm durante 3 min a temperatura ambiente.
Agregar 16 L de formamida a cada tubo de coleccin para suspender el producto y agitar
vigorosamente con el agitador tipo vortex.
Colocar cada una de las muestras de la placa, desnaturalizar y montar la placa en el secuenciador
3130xl.
Electroforesis capilar
En el equipo ABIprism 3130xl abrir el programa Data Collection Software y crear una corrida
para las muestras a ensayar.
Abrir las puertas del Secuenciador 3130xl y checar visualmente las condiciones ptimas del
equipo.
Ensamblar la placa en el soporte y asegurarla con el sujetador.
Colocar la placa en la posicin A o B del autosampler del secuenciador y ligar la palanca.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 66 de 67
enero 2014
Iniciar la corrida dando un click en play.
Anlisis de secuencia
Abrir el software Sequencing Analysis que se encuentra en el escritorio, agregar los datos
obtenidos por el secuenciador e iniciar el anlisis.
Verificar el electroferograma y el Raw Data de cada producto secuenciado y salvar el anlisis
de las secuencias.
Editar los electroferogramas de cada producto empleando el Programa Chromas y
complementar ambas secuencias para obtener una secuencia completa.
Obtener la secuencia completa en formato FASTA (formato de texto) de los electroferogramas
y salvarlos en formato de texto.
Interpretacin
Depositar la secuencia en cdigo fasta o txt en el software MEANS (Measles Nucleotide
Surveillance) disponible libremente en red con previo registro (http://www.hpabioinformatics.org.uk/Measles/Public/Web_Front/register.php).
Solicitar el anlisis filogentico al equipo de acuerdo a los valores predeterminados en el mismo
y obtener el genotipo.
EFES-RNLSP/InDRE
Versin No. 01
Pgina 67 de 67
enero 2014

Lineamientos Vig Epid Laboratorio EFE

Caricato da

Informazioni sul documento

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Lineamientos Vig Epid Laboratorio EFE

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA

DE LA ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICA POR

PRIMERA EDICIN, 2014

ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICARNLSP

TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,

SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: LINEAMIENTOS

COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE:

INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS.

LA EDICIN ESTUVO A CARGO

CARMEN GUZMN BRACHO, DR. JOS

EL DISEO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LPEZ

IMPRESO EN MXICO. PRINTED IN MEXICO

INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA

particularmente el Programa de Eliminacin del Sarampin en Mxico. Inicialmente, se integraron

Laboratorios estatales que estn integrados a la red de EFES

Identificar la circulacin del virus de sarampin o rubola en Mxico.

ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD

Control de calidad o Referencia de EFES

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD FEBRIL

DEFINICIONES OPERACIONALES DE ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMTICA

Definicin operacional de caso de Sndrome de Rubola Congnita (SRC)

Para el diagnstico de enfermedades exantemticas tomar la primera muestra de la maana entre el

MARCO JURIDICO NORMA

MARCO JURIDICO NORMA

Algoritmos realizados en los laboratorios de apoyo al LEFE

Muestras de cultivo celular, exudado farngeo u orina

Figura. 5. Algoritmo de diagnstico molecular de Rubola Clave de tabulador: (1A3513004)

Muestras clnicas: Exudado farngeo, orina o cultivo celular

PCR Anidado con

Figura. 6. Algoritmo de diagnstico molecular de sarampin Clave de tabulador: (1A3511004)

RT PCR en Tiempo Real

MARCO JURIDICO NORMA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y VALIDACIN DE TCNICAS

Purificacin de Ac. Nucleicos

Figura. 8. Algoritmo de diagnstico para genotipificacin de patgenos de importancia en salud

Captura de datos y emisin de resultados

Registrar los resultados en las bitcoras correspondientes de acuerdo a las pruebas

Supervisar los resultados de las pruebas diagnsticas

Capturar los resultados en el Infolab

Imprimir los informes de prueba

Autorizar y libera los informes de prueba

Entrega los informes de prueba a recepcin de muestras InDRE

PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED)

Se seleccionan 50 muestras de suero, previamente caracterizadas y con resultados para la

Sobresaliente: Concordancia >90%

Criterios para la liberacin del diagnstico de Sarampin y Rubola

BANCO DE MATERIAL BIOLGICO

El 100% de muestras sricas con resultado positivo a IgM contra sarampin.

Las especificaciones para el ingreso de muestras al banco de sueros son:

Cuadro 1. Base de datos para banco de sueros LEFE

Nota: Si alguna fecha corresponde a un da no laborable, la actividad se realizar el siguiente da

Laboratorios Estatales de Salud Pblica

Resultado de la evaluacin de estuches comerciales para determinacin de anticuerpos IgM contra

1. Absorcin del factor reumatoide (FR)

Como se describe en el punto 5.

Factor de correccin= Media A valor del suero control P/P

Determinacin de anticuerpos IgG contra sarampin en suero humano por ELISA

El nmero necesario de pocillos de la placa de microtitulacin se deduce del nmero de muestras a

A <0.100 (valor lmite)

Valoracin cuantitativa con el mtodo

Los resultados de las muestras se expresan en mUI/mL de suero.

en un pocillo recubierto con Ag y Ag-Control. Con ello la dilucin de la muestra es de 1:42. La

A <0.100 (valor lmite)