MEDIOS DE FERMENTACION ( Medios de cultivo)

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es

una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Como ya se explic, los componentes de los medios constituyen los efectores
externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos
ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de
productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de
los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes
categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg;
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe,
Mn,Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro; y
c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por
componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son
sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras
celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos
aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en
1) medios sintticos o medios qumicamente definidos, y
2) medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,
harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya
mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin
variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer
lugar el diseo para tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los
mismos.
Diseo
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los
componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta
todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los
sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del
microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los
componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son
tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y
posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos
bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos, como es el caso de la
importancia del anin P04. Trataremos especialmente de los tres primeros.
Requerimientos nutricionales
Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo
celular, ya sea autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacterias, y los heterotrficos

que necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencial
est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02
es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolismo energtico. En la ausencia
del 0 2 , el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas
bacterias. Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan H2
para reducir el C02 a CH4 para obtener energa. Otras protistas obtienen su energa,
en condiciones anaerobias por reaccin de xido-reduccin realizadas sobre
compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser
fuente de energa.
Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno
que pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para
la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.
Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tambin
son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-asprtico
para su incorporacin a la pared de la clulas. En algunos casos se requieren
tambin pptidos de histidina.
Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados
en forma de P04 H y S04 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incorpora
en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis
de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A,
tiamina y otros componentes.
Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante
del primero est unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan
con los factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K actua como coenzima y probablemente acta como
catin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El in Mg es
esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas
reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en
forma de sales como fosfato y sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras: a) Los que son
frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b)
los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,
Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas
cualitativamente.
A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente
porque generalmente est presente en suficiente cantidad como impureza de
los componentes principales. Los requerimientos de stos compuestos pueden
aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por
ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo.
Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos
y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina,
etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales
en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de
las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento
son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte
de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los
requerimientos especficos del proceso considerado.
Un ejemplo es el caso de los precursores que constituyen la base de una molcula
que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil actico

para la penicilina. Otro ejemplo es el agregado de ciclo dextrinas en procesos de

produccin de Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de
inhibidores de crecimiento celular. El agregado de cloruros o bromuros en el caso de
algunos antibiticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas producidas por el
Streptomyces aureofaciens, responde tambin a requerimientos especficos para
inhibir la sntesis de productos no deseados, como ocurre tambin con el agregado
de mananos y barbitricos en la produccin de estreptomicina por S. griseus.
El agregado de sulfato, en el proceso de fermentacin alcohlica, que favorece
la formacin de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especfico.
El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y
evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso
caracterizado por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de amonio
como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn agregado que no
corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del
mismo.
Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de
fosfatos o de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con agregados
peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente
mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio especfico para la
produccin de cido ctrico debe considerar la influencia negativa que para el
proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio debe
disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversas materias primas)
considere una eliminacin total del hierro y posterior agregado del mismo en
cantidades controladas.
Disponibilidad de los componentes
Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar
disponibles para ser usados por la clula.
Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos
cuya concentracin es modificada por quelacin, ya que muchos constituyentes
del medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o pre
cipitantes, por ejemplo aminocidos, hidroxicidos, hidrxidos, y los aniones
P04 y C03-2 .
Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de
los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente
quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).
En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya
que existe una gran variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar,
secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la concentracin inica disponi
ble. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos, protenas, cidos
orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.
En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio
de cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos
disminuyendo su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminoci
dos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , RO , que
son los ms importantes. La dinmica de formacin del complejo est determinada
por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-ligando, y por la
velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la
formacin del complejo del in metlico (M) con el ligando (L) se expresa de la
siguiente forma:

El valor de K es prcticamente independiente de la naturaleza del ligando,

ya que depende particularmente del ion metlico. Se puede hacer una lista de
trminos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue: Fe+3 >
Pb2 + > Cu2+ > Ni2+ > Co3 + > Zn2+ > Co 2+ > Cd2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2+ >
Ca2+ >Sr2+ > Ba2+ > Na+ > K+ > y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el
ion
Cu2+ estar fundamentalmente como complejo mientras que Ca2+ ,Na+ y K+
estarn en forma de iones metlicos libres.
Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene tambin una
serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion: Sr2 + > Ca2 + > Zn2+
>Mn2+ > Fe2+ > Co2+ > Mg2+ > Ni2+. De ambas consideraciones surge por
ejemplo
que cuando se alcanza el equilibrio el ion Ca2+ estar casi siempre libre para ser
utilizado y si est complejado se har rpidamente disponible, en cambio el Mg2+
estar generalmente libre pero si est complejado se har disponible muy
lentamente.
En la misma forma se puede deducir que el Co2+ estar fundamentalmente
en forma complejada siendo disponible adems a muy baja velocidad. Por esa
razn ese elemento es potencialmente limitante.
En conclusin, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos
orgnicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y sobre todo el ion
metlico considerado, ya que la concentracin libre de ste es lo que interesa.
Materias primas fundamentales
Los componentes empleados en la industrias de fermentacin son generalmente
complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo
de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composicin qumica. Si
tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60%
del costo total de mucho productos obtenidos por fermentacin, se hace prioritario
disminuir el costo de los medios.
Las materias primas ms importantes corresponden a fuentes de carbono y
de nitrgeno.
Las fuentes de carbono pueden ser:
1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn,
dextrina;
2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y
3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy importantes tambin por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que
contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso,
etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que
por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos
como las vinazas de destilera, alpechn y residuos sulfiticos, que son sin embargo
solamente tiles para procesos de produccin de biomasa destinados al consumo
animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono
asimilables por los microorganismos, tambin contienen muchas impurezas que
impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado que
presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos.
Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco
o las sales de amonio. Las orgnicas estn representadas por varios productos,
como ser: 1) Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por

hidrlisis cida o enzimtica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes

rganos y animales, pescado, casena, gelatina, harina de soja, algodn, girasol,
etc.. Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis
es posible variar el tamao de la cadena de polipptidos. Aparte de su funcin como
fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas
como fosfatos y suministran tambin algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.
2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin
posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y
temperatura de la misma. 3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de
pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autlisis o plasmlisis de la levadura,
es bsicamente una mezcla de aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2 O y
carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta
de la cebada y 5) "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz
tiene mucha importancia por su utilizacin como componente esencial de los medios
para la produccin de varios antibiticos y enzimas.
Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente
cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben
considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede
acompaar a las distintas materias primas utilizadas.
Formulacin
La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es
decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas.
Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas
fuentes lo da el conocimiento de la composicin de biomasa del
microorganismo
a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa es (en
% de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0;
Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una
determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que
aseguren como mnimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.
La composicin de un medio mnimo basado en este principio, que adems tiene en
cuenta los requerimientos de las fuentes de energa, figura en la tabla 3, que ha
sido calculada por Pirt para la produccin de Klebsiella aerogenes en concentracin
de 10 gl -1 .
Tabla 3. Composicin de un medio mnimo para Klebsiella aerogens (Adaptado
de Pirt)

Por el conocimiento de la estequiometra de crecimiento y de formacin del

producto, es posible formular adecuadamente un medio.

En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentacin:

Fuente de C + fuente de N + 0 2 + minerales + nutrientes especficos
biomasa + productos + C02 + H20.
Supongamos que queremos formular un medio para la produccin de biomasa
de levadura de panificacin. En este caso se puede establecer la siguiente
ecuacin basada en la estequiometra:
0.585 C12 H22 012 + 3.205 02 + 0.61 NH3
(Sacarosa)
( Biomasa) C3,72 H6.11O1.95N0 .61 + 3.30 C02 +4.29 H 20 + 387 Kcal.
La ecuacin anterior representa as la formacin de 100 g de biomasa a partir
de 200 g de sacarosa. Debe aclararse que en la "frmula" de la levadura que
representa lo composicin centesimal de la misma faltan los elementos menores
como el P, el S y el Mg por lo cual la suma no da 100 g sino 90.46. Ms adelante
veremos que es conveniente utilizar en lugar de la frmula centesimal la
correspondiente a la frmula mnima que resulta de dividir el porcentaje de cada
elemento po 3.72, o sea haciendo uno al carbono. La ecuacin mencionada fue
establecida por Harrison y se ha comprobado que responde muy satisfactoriamente
en la prctica. En este caso se considera que toda la fuente de carbono se emplea
para la formacin de biomasa y de C02 , que se desprende sin formacin de otros
productos.
En la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones
que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidades de biomasa y
productos que se pueden obtener a partir de una determinada cantidad de fuentes
de carbono y de nitrgeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no
son necesarios de incluir en las ecuaciones.
Aplicando este criterio podemos establecer entonces que para obtener una
determinada concentracin de biomasa, por ejemplo 30 gl -1 , debemos formular el
medio como mnimo con 60 gl -1 de fuentes de carbono asimilable, que es en el
caso anterior la sacarosa. Con respecto a las fuentes de nitrgeno, sta debe estar
en concentracin tal como para satisfacer la ecuacin anterior, que es 0.61 moles de
NH3 o sea 10.37 g de amonaco, lo que representa 8.54 g de N 2 . Ya tenemos por
lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del conocimiento
de la composicin centesimal de otros componentes menores podemos establecer
as las cantidades a agregar.
Ahora bien, sabemos por otra parte que la levadura necesita para crecer algunas
vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, cido pantotnico, etc.
Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso
de produccin de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con
costos de produccin mnimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono,
nitrgeno y de vitaminas y minerales ms econmicos y disponibles que podamos
encontrar. Surge as la eleccin lgica de las melazas de caa de azcar o de
remolacha que reunen la mayor parte de las condiciones. Del conocimiento del
efecto Crabtree ya comentado y para evitar la formacin de alcohol y maximizar la
produccin de biomasa surge la necesidad de implementar una alimentacin
programada empleando melaza como sustrato limitante, de lo cual resulta la
eleccin de un sistema de "batch" alimentado para la produccin. Mediante el
conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formacin de biomasa y
producto y los valores de la energa de mantenimiento ser posible establecer

tambin los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un

medio.
Optimizacin
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de
los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de informacin respecto a coeficientes de rendimiento de
macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de
los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que
pueden causar inhibicin del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del
crecimiento y formacin del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante
las concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios gene
ralmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso,
se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la
concentracin de biomasa obtenida.
Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una
gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano
que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el mtodo resulta poco prctico. Por otra parte puede ocurrir
que la respuesta obtenida al variar la concentracin de un componente dependa
de los niveles de los otros, o sea, se produzca interaccin entre componentes. Se
puede mejorar mucho la optimizacin en batch empleando tcnicas estadsticas o
utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes.
Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado por un slo factor
o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudindose conocer por lo tanto el
efecto que su variacin ejerce sobre el cultivo al mantenerse los dems
componentes constantes.
En la fig. 8 se muestra la optimizacin de un medio lograda por el mtodo de los
pulsos trabajando con un cultivo continuo y en el cual se grfica la variacin de la
concentracin de biomasa en funcin del tiempo despus del pulso de un
componente dado.

Figura 8. Optimizacin de medios de fermentacin. 1. Nutriente no limitante.

2. Nutriente limitante. 3. Nutriente limitante a mayor concentracin.

4. Nutriente txico.

Esterilizacin
Es conveniente, al tratar este tema, dar una definicin clara del trmino y de
otros relacionados, ya que a veces suelen producirse confusiones.
Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o
material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo,
filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va.
Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente
en un dao a los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.
La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier
va de organismos vivos que pueden causar dao particular o infeccin. No significa
por lo tanto la destruccin de todos los microorganismos, sino solamente de aquellos
que pueden producir un resultado no deseado.
Un antisptico es un desinfectante, o sea un agente qumico usado para destruir
microorganismos dainos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados
en animales o humanos.
Asepsia es la exclusin continuada de microorganismos contaminantes. As
por ejemplo el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo
aspticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo
es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el cultivo
requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones aspticas.
Pasteurizacin es el trmino aplicado al proceso que se utiliza para la destruccin
de algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales
sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche, por
ejemplo a 62 C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y despus enfriarla
lo ms rpidamente posible. Esta tcnica no es de ninguna manera un
procedimiento de esterilizacin. Es solamente un mtodo para destruir organismos

patgenos y al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos organismos que ms

pueden deteriorar la leche.
La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial
es para evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir
as que el cultivo de microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de
fermentacin de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos.
Mtodos de esterilizacin
Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos: a) por destruccin total
de microorganismos; b) Por muerte o inactivacin; y c) Por eliminacin con medio
fsicos.
Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre
implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de
una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de
platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir
contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta
metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo.
La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que
exista necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por
calentamiento, seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor
hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de gran valor
en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en la industria
cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso
de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala
grande el equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado bajo presin, y la
presin requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe
ser purgado totalmente del sistema (como ocurre tambin en el caso de los
autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso.
Despus de la esterilizacin se mantienen las condiciones aspticas, haciendo pasar
vapor por las vlvulas y sellos.
La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases y lquidos.
Cintica de la esterilizacin por calor
La cintica de la esterilizacin por calor hmedo est caracterizada bastante
aproximadamente por una reaccin cintica de primer orden.
Si No es el nmero de organismos viables presentes inicialmente y N es nmero
viable al final tendremos que la ecuacin de velocidad de muerte ser:

N/No es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del tratamiento

por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destruccin, que
depende de la temperatura segn la clsica ecuacin de Arrhenius:

donde A = constante
E = energa de activacin
R = Constante general de los gases

T = Temperatura en grados Kelvin

Si se grfica el In k en funcin de 1/T se obtendr una lnea recta, siendo la
inclinacin igual a -E/R y la interseccin de la recta con la ordenada, el valor de
la constante de Arrhenius.
La ecuacin de velocidad de muerte necesita una aclaracin, ya que la misma
no admite una disminucin del nmero de organismos a cero, porque si N es cero,
t debera ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N = 0.1 y calculemos el valor correspondiente de t. No podemos decir que despus de ese
tiempo sobrevivir una dcima parte de un microorganismo, pero si podemos decir
que habr slo una probabilidad de 1 en 10 de que sobreviva un microorganismo.
La figura 9 muestra una curva tpica de la esterilizacin en "batch" de un medio
en un fermentador.

La curva AB representa la etapa de calentamiento, la parte BC corresponde a la

etapa de mantenimiento y CD es la etapa de enfriamiento. Durante la primera y
ltima etapa ocurre parte de la destruccin trmica de organismos presentes en el
medio debido a que se alcanza temperatura elevada sobre todo en la ltima parte de
la curva AB y la primera parte de la curva CD.
Se considera que la temperatura a partir de la cual se produce destruccin
de esporos es 100 C. Por lo tanto tendremos eliminacin de esporos de 100 a 120
C durante la etapa de calentamiento y de 120 a 100 C durante la correspondiente
al enfriamiento. Los tiempos de calentamiento y enfriamiento varan de acuerdo al
volumen del equipo. En fermentadores industriales de 60.000 1 por ejemplo esos
tiempos estn en el orden de 28-30 min. y 11-14 min. para los perodos de
calentamiento y enfriamiento respectivamente.
En la prctica de la esterilizacin es necesario tener presente que la calidad
nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razn por la cual, es
imprescindible disear un ciclo de esterilizacin lo ms efectivo posible pero al
mismo tiempo lo ms corto posible.
Podremos definir un trmino nabla (V) que representa la magnitud de la disminucin
del nmero de organismos viables de manera que:

Sin embargo, como ya dijimos, parte de la destruccin ocurre en la etapa de

calentamiento y otra parte en la de enfriamiento , de manera tal que:

Las partes
son obtenidas a temperatura variable de manera
tal que es necesario integrar la ecuacin:

para el perodo de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular la cantidad

de esporos que se eliminan durante ambos perodos. Conociendo el valor inicial de
esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo
de mantenimiento a 120 C para la esterilizacin completa del mismo.
Existen datos, en bibliografa, de clculo de tiempo de mantenimiento para la
esterilizacin de 45,000 l de medio (con un valor de No = 2 x 10 7 esp/ml) que
demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo de mantenimiento a
120 C.
Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son vlidas para el clculo
del tiempo de esterilizacin mnimo, a 120 C, en fermentadores industriales del
volumen considerado. En el caso del laboratorio cuando utilizamos un autoclave
y deseamos esterilizar distintos recipientes con volmenes diversos de medio, el
tiempo de calentamiento y de enfriamiento no son generalmente considerados,
salvo en el caso de equipos que tengan un perodo de calentamiento y de
enfriamiento prolongado, los que por otra parte no son recomendados para su uso
en el laboratorio. Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su
geometra y el volumen de medio a esterilizar.
El tiempo de esterilizacin (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 C) requerido
por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y para
tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml requieren de 30-35
min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14 min. En cambio un frasco
pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una botella de suero de 9000 ml
50-55 min. Estos tiempos aseguran la eliminacin de esporos bacterianos de las
especies ms resistentes.
Conservacin de la calidad nutriente
Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentacin utilizados en la
industria son casi siempre complejos y a menudo con slidos en suspensin, de
manera tal que los cambios que se producen durante la esterilizacin pueden ser
importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales
dependiendo del tiempo de esterilizacin.
Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilizacin 50 a 60 min se producen
prdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio
normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede
producir un efecto beneficioso.
La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de
un medio, durante la esterilizacin por calor, depender no solamente de la
naturaleza de los componentes sino tambin de la temperatura, duracin del
calentamiento, pH del medio, y de la agitacin. Un ejemplo tpico de interaccin
es la reaccin de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los
azcares con los grupos amino de protenas, aminocidos, etc. Se forman as

productos de condensacin con lo cual se inactivan significativas cantidades de

carbohidratos y nitrgeno amnico. Por ese motivo es necesario que los
carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados
orgnicos.
Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se
volatiliza.
En medios qumicamente definidos se puede observar prdida importante
de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitacin de sales poco
solubles como MgNH4PO4 , MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto
autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos.
Los aminocidos y factores de crecimiento son muy lbiles al calor. Entre los
aminocidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas
hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las ms susceptibles de sufrir
descomposicin. En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente
en pequeos volmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtracin.
Como ya dijimos es fundamental, adems de esterilizar correctamente los medios,
conservar al mximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma forma que la
inactivacin de microorganismos puede ser considerada una reaccin cintica de
primer orden, tambin la destruccin de algunos compuestos sensibles al calor
puede ser tratada en la misma forma.
La energa de activacin de tales reacciones est generalmente en el rango de
10,000-30,000 cal.mol-1 mientras que la correspondiente a la destruccin trmica de
esporos es superior (65,000-85,000 cal.mol-1 ). Una representacin grfica dara
una lnea recta para ambos casos con valores distintos de pendientes segn se
aprecia en la Fig. 10.

La figura muestra que a medida que la temperatura aumenta, el valor de k

para la reaccin con baja E (curva A) aumenta ms lentamente que en el otro caso.
Esto significa que un aumento de la temperatura acelera la destruccin de esporos
ms que la degradacin de nutrientes. Recordando la ecuacin anterior:
vemos que el tiempo requerido para la destruccin de esporos decrece en
proporcin al aumento de k. Por lo tanto si se emplea alta temperatura para la
esterilizacin se requiere un tiempo menor, por lo cual se concluye que la
esterilizacin llamada de alta temperatura-corto tiempo favorece la conservacin de
la calidad nutriente al mismo tiempo que produce la destruccin efectiva de los
esporos.

Es necesario aclarar que el uso de alta temperatura con tiempos cortos en escala
grande implica necesariamente el empleo de un sistema de calentamiento y
enfriamiento continuo en lugar de proceso de esterilizacin en batch.
Ctedra de Inmunologa II Parte.(2012)
Gmg
BIBLIOGRAFA

Monografa redactada por los doctores Rodolfo Ertola, Osvaldo

Yantorno y Carlos Mignone, Programa Regional de Desarrollo Cientfico
y Tecnolgico de la OEA

Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad de Farmacia. Universidad

de Salamanca. Dr. Pedro F. Mateos