Presencia de la enzima Reductasa Fosfatasa y Peroxidasa en una muestra de

leche de cantina de la zona quinta de Usme y leche cruda de la localidad de

Suba
Nubia Mara Quiroga1, Fanny Daz Figueroa1
1

Estudiantes de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Pregrado en Bacteriologa y Laboratorio Clnico
Correspondencia: nubiamqa@gmail.com
Fannydf9104@hotmail.com

Resumen
La prueba de deteccin de enzimas bacteriana o medicin del tiempo de
decoloracin del azul de metileno en leche se basa en que cuando se aade una
pequea cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37C, se
produce una decoloracin debida al metabolismo bacteriano. La velocidad a la que
se produce el cambio de color es directamente proporcional al nmero de
grmenes presentes. De esta manera se puede determinar de manera indirecta la
calidad higinica de la leche. En este artculo se describe el fundamento de la
determinacin de la prueba de la Reductasa, peroxidasa y fosfatasa bacteriana en
leche. Tambin se explica cmo interpretar los resultados en trminos de
crecimiento microbiano y calidad higinica de la leche.(1)
Introduccin

Marco terico
L
leche
contiene
numerosas
enzimas relacionadas con el grupo de
las albuminas, con las cuales
generalmente precipitan. Algunas se
encuentran concentradas en la
membrana superficial de los glbulos
grasos y son arrastradas por la nata
( reductasa aldehidica y fosfatasa)
otras precipitan con la casena a pH
otras sean secretadas por el tejido
glandular mamario. (2)

4.6 (proteasa y catalasas). El origen

de la leche explica la presencia de
estas
enzimas,
existentes
en
numerosas clulas y especialmente
en los leucocitos de la sangre que
emigran a travs del tejido mamario.
A algunas por lo tanto se les puede
considerar como productos de
excrecin, pero no se excluye que

Importancia de las enzimas de la

leche
1. su sensibilidad al calor permite
el control del calentamiento de
la leche en las zonas
de
temperatura de pasteurizacin.
2. La
cantidad
de
enzima
depende del numero de
leucocitos o bacterias que se
encuentran en la leche , de
esta manera se pueden
obtener datos sobre la calidad
higienica de la leche.
3. El contenido de enzimas no es
el mismo para todas las
leches; esta caracterstica
puede ser un medio para
distinguirlas.
4. Algunas
enzimas
tienen
actividad
bactericida
y
constituyen una proteccin
limitada de la lehe.
Cuadro 1. Principales enzimas de
la leche.

lechera. Editorial reverte s.a 4ta Edicion Barcelona

Espaa 2003.

REDUCTASA
La mayora de los grmenes de la
leche cuando se multiplican elaboran
enzimas reductasas que modifican el
potencial de xido-reduccin de la
misma.
Para
demostrar
ese
fenmeno basta aadir a la leche una
sustancia que se decolore al pasar de
la forma oxidada a la forma reducida.
La rapidez con que cambia de color
est en funcin de la poblacin
bacteriana y, por ello, puede ser un
ndice del grado de contaminacin de
la leche. El colorante ms empleado
en la industria lctea para realizar
esta prueba es el azul de metileno,
pero tambin se pueden utilizar la
resazurina y el cloruro de 2, 3, 5,
trifenil-tetrazolium, ya que son
colorantes fcilmente absorbibles por
las clulas vivas y se decoloran a una
velocidad proporcional a la actividad
de las reductasas microbianas.(1)
La presencia de microorganismos en
la leche y por su accin reductora, se
produce una modificacin del color
del azul de metileno, pasando de
color azul intenso a azul claro,
pudiendo desaparece totalmente de
acuerdo a la carga microbiana
presente. Una leche con un contenido
bajo en microorganismos, no modifica
el tinte azul del colorante o tarda
mucho tiempo en modificarlo.
Se pueden calcular aproximadamente
los resultados de la prueba del azul
de metileno segn la Tabla 1.

cH ALAIS CIENCIA DE LA LECHE, principios de tcnica

FOSFATASA
La fosfatasa es una enzima
normalmente presente en la leche
cruda. En las condiciones ordinarias
de pasteurizacin (lenta, rpida o
ultrarpida) la enzima se inactiva. Se
ha demostrado que esta enzima es
ms difcil de destruir que la mayora
de
los organimos patognicos
termoresistentes que pudieran estar
presentes en la la leche, como por
ejemplo el bacilo tuberculoso.
La prueba es de gran utilidad para
decidir si la leche ha sido o no
pasteurizada, si la leche pasteurizada
se ha mezclado con leche cruda, o
incluso su la pasteurizacin ha sido
deficiente.
Este mtodo se basa en la hidrlisis
del fenil fosfato que en presencia de
la fosfatasa de la leche libera fenol;
este se determina colorimtricamente
hacindolo reaccionar con 2.6
dibromoquinonclorimida obtenindose
un color azul. (2).

compuestos dadores de hidrgeno,

como fenoles (guayacol, pirogalol) y
aminas aromticas (o-fenilendiamina)
por medio de perxidos. El substrato
oxidable ms usado es el guayacol,
que es oxidado a un complejo
coloreado de tetraguayacol en
presencia de peroxidasa:.
Como la mayora de las enzimas, la
peroxidasa puede ser inactivada por
el calor, siendo una de las que
precisa mayor temperatura y ms
tiempo para su inactivacin. Posee,
adems, la propiedad peculiar de la
regeneracin
enzimtica.
Este
fenmeno consiste en que al
inactivarla por medio del calor
recupera parcialmente su actividad
despus de un cierto tiempo. Esto ha
sido explicado, aduciendo que la
fraccin proteica de la enzima sufre
una desnaturalizacin slo parcial,
con prdida de su estructura terciaria,
si el calor se aplica un tiempo muy
corto, producindose luego una
reversin de la protena a su estado
normal por recombinacin de sus
grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.(3).

PEROXIDASA
La peroxidasa es una enzima que
cataliza la oxidacin de ciertos

Materiales y mtodos

Para el estudio se utiliz leche cruda

de la localidad de suba, de cantina
localidad de Usme y como un control
se utiliz leche UHT de Alpina

Determinacin de Reductasa TRAM

1. En un tubo de ensayo se
transfiri 1ml de Azul de
metileno.
2. Adicionar 10ml de leche tapar
el tubo
3. Colocar los tubos al bao
mara
y
observar
los
resultados cada 30 minutos.

Fotografa 2

Determinacin peroxidasa
Antes de iniciar el procedimiento la
leche se debe mezclar bien, estar a
una temperatura entre 20 y 30C y no
estar acidificada.
1. Medir en 1 tubo de ensayo 3ml
de leche. Agregar 10 gotas de
Guayacol
2. Agitar y esperar 1 minuto.
Observar el color.
3. Agregar 5 gotas de peroxido
de
hidrogeno
(
agua
oxigenada)
4. Observar el color.
Interpretacin:

Fotografa 1.

Si en el lapso comprendido entre la

adicin del primer reactivo y el
segundo aparece coloracin (Curuba
o salmon) indica la presencia de agua
oxigenada y de peroxidasa.
Si despus de la adicion del segundo
reactivo aparece por debajo de la
superficie de la leche un anillo de
color curuba( salmon) indica la
presencia de peroxidasa. Esperar 5
minutos despus de la adicion del
agua oxigenada.
Determinacin de fosfatasa

Fotografa 4
Fotografa 3

Resultados
TRAM

PEROXIDASA

Fotografa 5

Fotografa 6.

Tabla 1

Grup
o

Muestra

TRAM

Leche cruda
Suba

Leche cruda
Suba

Leche UHT
Alpina
Leche cantina
Usme
Leche cantina
Usme
Leche cantina
Suba

30 min
NEGATIVA
60 min
30 min
NEGATIVA
60 min
NEGATIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min
NEGATIVA
60 min POSITIVA

4
5
6

Discusin

Fosfatas
a
alcalina
POSITIV
A

Peroxida
sa
POSITIV
O

NEGATIV POSITIV
A
O

NEGATIV
A
NEGATIV
A
NEGATIV
A
POSITIV
A

NEGATIV
A
POSITIV
O
NEGATIV
O
POSITIV
O

Referencias
1. Garca Martnez, Eva. Fuentes
Lpez, Ana , Fernndez
Segovia, Isabel. Determinacin
de la calidad higinica de la
leche mediante la medicin
indirecta
del
tiempo
de
reduccin del azul de metileno
o prueba de la reductasa
microbiana. Disponible en
https://riunet.upv.es/bitstream/h
andle/10251/38380/Eva
%20Garc%C3%ADa.
%20Calidad%20leche2014.pdf?sequence=1.
Consulta el 13 de septiembre
del 2015.
2. cH ALAIS CIENCIA DE LA
LECHE, principios de tcnica

lechera. Editorial reverte s.a

4ta Edicion Barcelona Espaa
2003.
3. CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS
Y
MICROBIOLOGICAS DE LA
LECHE.
Disponible
en:
http://analisisquimicosdelalech
e.blogspot.com.co/2011/11/ana
lisis-quimicos-de-la-leche.html.
Consulta el 13 de septiembre
de 2015,
4. DETERMINACIN
DE
ACTIVIDAD DE PEROXIDASA Y
DE
SU
REGENERACIN.
Disponible
en:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repo
sitorio/lb/ciencias_quimicas_y_far
maceuticas/schmidth02/parte08/0
2.html. Consulta el 13 de
septiembre de 2015.