RESUMEN: Disfuncin sinptica en sndromes miastnico

congnito
Los Sndromes miastnico congnito son trastornos hereditarios de la transmisin
neuromuscular caracterizado por debilidad muscular fatigables. El nmero de casos
reconocidos aumenta con un mejor diagnstico. Hasta la fecha se han identificado ms
de 300 mutaciones diferentes presentes en ms de 350 parentescos no relacionados.
Los defectos genticos subyacentes son diversos, que implica una serie de genes
diferentes con una variedad de diferentes fenotipos. El tipo de tratamiento y su
efectividad va a depender del mecanismo patognico subyacente. El objetivo del
estudio a tratar es definir el mecanismo molecular para cada mutacin identificada y
aadir esta informacin a la clnica como base para adaptar el tratamiento del
paciente. Aqu, se describen algunos de los mtodos que se pueden utilizar para definir
si una variante de secuencia de ADN es patgeno con referencia a las variantes en
DOK7. Destacamos un nuevo mecanismo para la interrupcin de la funcin AChR,
donde una mutacin en los genes subunidad AChR causas reduce la conductancia de
los canales inicos y discutir nuevos mtodos para identificar mutaciones genticas.
El estudio de estos trastornos est demostrando altamente informativo para la
comprensin de los diversos mecanismos moleculares que pueden subyacer a la
disfuncin sinptica.
Introduccin
Los sndromes miastnico congnito (CMS) son un grupo heterogneo de trastornos
causados por mutaciones en una serie de diferentes genes que afectan la transmisin
neuromuscular. Hasta la fecha, al menos 15 genes diferentes se han asociado con estos
trastornos. El fenotipo de la base de la debilidad muscular fatigable es compartida
entre los sndromes, y aunque puede haber indicios fenotpicos, predecir qu genes son
defectuosos desde el examen clnico a menudo es desafiante. La mayora de los casos
al menos se pueden tratar parcialmente, y en muchos casos el tratamiento conduce a
una profundo beneficio de la calidad de vida del paciente. Como siempre, el
tratamiento apropiado va a depender del mecanismo molecular subyacente. Por
ejemplo, en el sndrome de los canales lentos, donde hay un efecto excitotxica, el
tratamiento mdico actual se basa en el uso de bloqueadores de los canales que
sujetan la cintica de la canal inico del receptor de acetilcolina (AChR) sin inhibir la
transmisin de seales, mientras que en los sndromes de canal rpido, las estrategias
de tratamiento se basan en el aumento de la disponibilidad del neurotransmisor
acetilcolina. Si se puede determinar la base gentica y el mecanismo molecular
subyacente de un sndrome miastnico congnito, entonces el tratamiento puede ser
adaptado a cada paciente. En muchos centros, el cribado gentico apuntado es ahora
el principal mtodo utilizado para determinar que el sndrome miastnico congnito los
puertos de pacientes. En este enfoque pistas fenotpicas se reunieron a partir del
examen clnico, tales como la participacin del msculo del ojo, los patrones de
debilidad muscular y la aparicin de crisis de apnea y contracturas de las
articulaciones, y los resultados se introducen en neurofisiologa un algoritmo para
determinar el orden en que los genes son seleccionados para mutaciones. Este mtodo

ha demostrado ser extremadamente eficaz, y en el servicio de gentica Oxford, Reino

Unido, hemos identificado mutaciones en ms de 350 parentescos. Sin embargo, con el
advenimiento de las tcnicas de secuenciacin de prxima generacin, es probable que
en los prximos cinco aos la bioinformtica aplicadas a todo el genoma y datos de la
secuencia del exoma enteros jugar un papel nuevo y crtico en el diagnstico
gentico. Aunque hay varias mutaciones ms comunes probablemente asociado con los
efectos fundadores, tales como la c.1267delG4 o 12935 mutacin en CHRNE o la
mutacin de sentido errneo en p.Asp88Lys RAPSN, 6 la mayora de los genes
asociados-CMS tienen mltiples mutaciones "privadas", muchas de las cuales son
mutaciones sin sentido. Aunque varios programas de software estn disponibles para
predecir si una variante de secuencia es probable que sea patgena, ms a menudo
que no prueba de patogenicidad se establece mejor mediante el anlisis funcional de la
protena variante en sistemas de cultivo celular.
Mutaciones DOK7
DOK7 es una protena adaptadora que se une a almizcle y amplifica la va de
sealizacin que es en gran parte responsable tanto de la formacin de sinapsis unin
neuromuscular y, posteriormente, para el mantenimiento de la estructura sinptica.
Dentro de lo humano la poblacin gen DOK7 muestra un alto grado de variabilidad y la
deteccin de mutaciones revela numerosas variantes de la secuencia. Algunas
variantes pueden ser eliminados por referencia a bases de datos de variacin humanos
tales como dbSNP, o por anlisis de segregacin, pero en muchos casos las variantes
son miembros de la familia raras y otros no estn disponibles para el anlisis. Cuando
mioblastos C2C12 lnea celular de msculo de ratn se diferencian para formar
miotubos en cuture, grupos de receptores de acetilcolina (AChR) pueden ser inducidas
a formar en la superficie celular de miotubos por la adicin de neural agrin.
La agrina interacta con LRP4 para estimular MUSK que, a su vez, induce la agregacin
de AChR en grupos que se pueden visualizar bajo el microscopio con -bungarotoxina
marcado sobreexpuestas compresin de DOK7 en miotubos C2C12 tiene la notable
propiedad de inducir grupos AChR en ausencia de Agrin. Las mutaciones identificadas
en DOK7 CMS han demostrado afectar la eficiencia de la agrupacin AChR inducido en
miotubos C2C12, y es posible utilizar este sistema modelo para deteminar la
patogenicidad de DOK7 variantes detectadas en el gen screens , una caracterstica
clave de este sistema es asegurar una mayora de los mioblastos C2C12 son
transfectadas con DOK7 o la expresin mutante DOK7 construye antes de la
diferenciacin en miotubos. Para asegurar la mayora de las clulas expresan el
mutante, se puede usar un sistema de expresin / infeccin retroviral. Una vez
formados los miotubos infectadas con el constructo de expresin DOK7, los grupos
AChR se pueden visualizar despus de la incubacin, ya sea con -bungarotoxin
marcado con fluorescencia o anti-AChR anticuerpos y patogenicidad determinan a
travs de una reduccin en el nmero y la complejidad de los grupos formados. Tras el
cribado de posibles casos DOK7 CMS, el uso de este sistema, en combinacin con
tcnicas de gentica molecular estndar, activar 34 mutaciones patognicas diferentes
para ser identificado en 72 pacientes, y 27 variantes raras para ser clasificado como
mutacin no patognica
1124 es 1127dupTGCC una mutacin comn que se
encuentra en ms de la mitad de los pacientes DOK7 CMS que publica. Hay varias otras

incidencias de truncamientos en la gran exn 3 de DOK7 donde se conservan las

propiedades de la protena MUSK DOK7 necesarios para la unin, pero un adicional
aunque no la funcin crucial en la regin C-terminal se pierde. Mientras que los casos
DOK7 CMS descritos anteriormente tienen al menos un alelo con una mutacin en el
ltimo exn 3 del gen que codifica una gran regin C-terminal de la protena, fue
posible demostrar que se producen casos donde las mutaciones en ambos alelos estn
presentes hacia la regin N-terminal de la protena que contiene el pleckstrin( protena
perifrica de membrana) homologa y dominios de unin a fosfotirosina. Sin embargo,
incluso el uso de estas tcnicas para definir la naturaleza de la DOK7 variantes de unos
pocos casos adicionales se encuentran en las cuales slo una mutacin patgena se
identifica en la secuencia codificante. Potencialmente mutaciones adicionales pueden
ser identificados a nivel de ARN / protena a travs de anlisis de ARN de biopsia
muscular del paciente, pero la ubicacin de las mutaciones que causan empalme de
ARN alterado o expresin slo puede llegar a ser identificables cuando toda la
secuenciacin del genoma est disponible.
La identificacin de un gran nmero de mutaciones en DOK7, y sus diferentes efectos
sobre el nmero y la complejidad de las agrupaciones AChR, proporciona un conjunto
de informacin que potencialmente puede ser utilizado en la investigacin de la va de
sealizacin de la activacin de MUSK a la formacin de racimos asociado AChRRapSyn que sigue siendo en gran medida no determinados.
AGRN, mutaciones MUSK, y RAPSN
Metodologas similares utilizando clulas musculares cultivadas se pueden utilizar para
analizar los efectos de secuencia de las variantes identificadas en los genes que
codifican otras protenas clave en la va de la agrupacin AChR. Las mutaciones en
AGRN y MUSK son raras, pero las mutaciones son ms encontradas con frecuencia en
factores RAPSN. Otras tales como los niveles de expresin pueden estar involucrados
en que afecta a la funcin de la protena respectiva, pero analizar el efecto de una
mutacin en el agrupamiento de AChR en clulas cultivadas es til para evaluar la
patogenicidad. Por mutaciones en MUSK y RAPSN que es til tener disponibles clulas
musculares lneas que no expresan MUSK endgena o RapSyn, mientras que para las
mutaciones en AGRN es posible sintetizar la protena mutante, aadirlo a miotubos
C2C12 diferenciadas, y para comparar AChR clustering a la observada con expresado
de tipo salvaje agrin.Como se ha indicado, las mutaciones en AGRN y MUSK son raros,
pero esta metodologa se pueden utilizar para determinar la patogenicidad de mutacin
en RAPSN donde hay un nmero de mutaciones y tambin variantes de secuencia no
patgeno considerable.
Mutaciones AChR
Durante la evolucin de los genes que codifican el msculo AChR subunidad han sido
altamente conservadas. Como siempre, la seleccin nmero considerable de pacientes
potenciales CMS revela un sorprendente nmero de variantes poco comunes en la
poblacin humana. Las mutaciones de la CADH dar lugar a varias formas diferentes de
CMS, que incluyen sndromes de deficiencia AChR, sndrome del canal lento y el
sndrome de canal rpido Cuando ADNc que codifican las cuatro subunidades de AChR
se introducen en clulas HEK 293 que expresan AChR ensamblados en el superficie

celular. En patch clamp grabaciones electrofisiolgicas de los canales individuales AChR

las propiedades cinticas de la AChR montada como se parecen a los observados in
vivo de msculo humano biopsies. Anlisis de las grabaciones de canales individuales
revelar si una mutacin prolonga duracin de la rfaga de canal, abrevia duracin de
la rfaga, o no tiene ningn efecto. El uso de estas tcnicas, un procedimiento estndar
para el anlisis de secuencia de AChR variantes es mutagnesis in vitro de la
respectiva ADNc, la expresin del ADNc mutante en clulas HEK 293, seguida por la
unin de [125I] -bungarotoxina a la superficie de las clulas HEK 293. En raras
ocasiones, las mutaciones que causan la deficiencia de AChR se encuentran en el, o
subunidades, y estos pueden ser recogidos fcilmente en la superficie celular alfabungarotoxina experimentos de unin. Cmo siempre las subunidades alfa, beta y
delta,
pueden combinar en ausencia de la subunidad para generar alfa
bungarotoxina superficie de unin, y por lo tanto si la mutacin es en CHRNE (
subunidad), los niveles de expresin de la mutante AChR puede ser determinada por
inmunoprecipitacin de la AChR- [125I] -bungarotoxina complejo con un anticuerpo
especfico de la subunidad AChR, que slo detectar pentmeros AChR que albergan
la subunidad . Este ensayo ha demostrado ser eficaz en la determinacin de si el
mecanismo patognico principal es debido a la deficiencia de AChR placa terminal. Las
mutaciones en CHRNE causando defciencia AChR placa terminal son la causa ms
comn de del sndrome mastnico congnito. Sin embargo, los niveles de expresin en
la superficie de la variante de AChR son comparables con el de tipo salvaje AChR,
entonces variante de la subunidad puede ser no patgeno o tienen la cintica de los
canales alterados, resultando potencialmente en cualquiera de un sndrome de canal
lento o un sndrome de canal rpido. Solo parche canal de anlisis de la abrazadera de
HEK 293 clulas expres AChR est obligado a determinar ya sea activaciones de canal
prolongados o acortados indicativos de canal respectivo lenta o sndromes canal
rpido. En un informe reciente, se encontr que un paciente tiene mutaciones hetero
allelo en CHRNE (p.P282R y p.F266del) mutado p.P282R mostr reducida superficie
AChR expresin en clulas HEK 293, mientras que, sorprendentemente, p.F266del
expres as. Por lo tanto, es las propiedades de p.F266del que determina el fenotipo
del paciente. Cuando patch clamp de un solo canal se realiz en AChR acogida
p.F266del, la duracin de la rfaga de las activaciones de canal no difiri
significativamente de la de tipo salvaje AChR. Como siempre, el anlisis de las
amplitudes de corriente a diferentes potenciales de mantenimiento demuestra que esta
mutacin causa una reduccin del flujo de iones a travs del canal, y por consiguiente,
perjudicar la despolarizacin de la placa de extremo requerida para activar los canales
de sodio dependientes de voltaje.
Por lo tanto, un nuevo mecanismo molecular ha sido identificado para alteracin de la
funcin del canal inico AChR . Este mecanismo para la disfuncin de los canales
inicos mucho tiempo se ha postulado pero ha tomado hasta ahora para identificar un
caso. Las caractersticas fenotpicas de los pacientes con la conductancia del canal
inico reducido es probable que compartan algunas similitudes con el sndrome del
canal rpido, en que tanto causar una prdida de la funcin y requieren de una
mutacin en el segundo alelo para desenmascarar las propiedades con problemas del
canal inico causado por estas mutaciones.
Advenimiento de secuenciacin de prxima generacin

Las metodologas utilizadas para identificar el gen asociado con el sndrome miastnico
congnito se han basado en el conocimiento de las molculas clave que participan en
la transmisin de la seal a travs de la unin neuromuscular o que rigen la estructura
sinptica para proporcionar genes candidatos para el cribado. alternativa, anlisis de
ligamiento, si las familias son adecuados disponible, se puede utilizar para definir las
regiones genticas que luego se pueden utilizar para el hogar en el ms candidato
genes. Estas metodologas han demostrado fructfera, pero an quedan casos en los
que las mutaciones an no se han identificado. El advenimiento de la secuenciacin de
prxima generacin, ya sea la secuenciacin del exoma o la secuenciacin de todo el
genoma, ofrece una oportunidad para identificar la causa gentica de estos trastornos
restantes. Estratificacin del fenotipo es til y se ha utilizado para identificar las
mutaciones en DPAGT1.22 Sin embargo, con la masa de datos que se estn recogidos
en la secuenciacin de muchos genomas humanos, es potencialmente posible
identificar las mutaciones en un nuevo gen en un solo individuo. Es de notar que los
dos genes ms recientemente identificado asociados con CMS, GFPT122 y DPAGT1,23
son expres doquier y por lo tanto no son candidatos obvios para las mutaciones que
causan los trastornos de la unin neuromuscular.
El tratamiento de los sndromes miastnico congnito
Una razn principal de estudios funcionales de las mutaciones es establecer el
mecanismo patognico y proporcionar as una base racional para la terapia. Por
ejemplo, en el sndrome de los canales lentos el objetivo sera para bloquear el exceso
de cationes a travs de la entrada de AChR en la placa terminal a travs de frmacos
que bloquean el canal cuando en el estado abierto, tales como fluoxetina; mientras que
para un sndrome de canal rpido uno se destinara a reforzar la seal postsinptica ya
sea a travs de medicamentos anticolinestersicos o aumento la liberacin de
neurotransmisores a travs de bloqueo de canales de voltaje cerrados de potasio con
3,4-diaminopiridina.
Como siempre, un avance clave en el tratamiento de la CMS en los ltimos aos ha sido
el uso selectivo del receptor 2 adrenrgicos efedrina y salbutamol / albuterol. Despus
de la identificacin de las mutaciones en DOK7 como causa de la CMS, 12 se hizo
evidente que este conjunto de pacientes logra notable beneficio del tratamiento con
efedrina o salbutamol. Es de destacar que el efecto
no es inmediato, sino una mejora gradual se experimenta durante un perodo de meses
hasta la meseta de efectos beneficiosos, por lo general entre seis meses y un ao de
initiation.24 Aunque los efectos de estos frmacos son probablemente ms dramtico
en DOK7 CMS tambin hay varios informes de sus efectos beneficiosos en otros CMS,
como los pacientes con mutaciones en COLQ28 o incluso algunos casos de deficiencia
AChR .Al parecer, los 2-agonistas son probablemente proporcionar una compensacin a
travs del segundo vas mensajeras para ayudar a aliviar la desestabilizacin de las
estructuras de placa terminal causados por mutaciones de protenas de placa terminal.
Un reto para el futuro ser el de comprender los detalles de exactamente cmo estos
medicamentos tienen sus efectos en la regin de rodete de msculo. Esto, a su vez,
puede ayudar a punto de nuevos medicamentos y permitir una mayor optimizacin de
los tratamientos para el sndrome miastnico congnito.

INTEGRANTES:
Jorge Juica Navea
Sebastin Lpez Acosta
Tania Ledezma Maluenda
Nicols Olivares Mondaca