NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.

DETERMINACIN
DE BACTERIAS COLIFORMES. TCNICA DEL NMERO MS
PROBABLE.

Objetivo general:

Esta Norma Oficial Mexicana establece el mtodo microbiolgico para

estimar el nmero de coliformes presentes en productos alimenticios,
por medio del clculo del nmero ms probable (NMP) despus de la
incubacin a 35 C de la muestra diluida en un medio lquido.
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada,
hielo y alimentos procesados trmicamente, as como a muestras
destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas sanitarias en la
industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando
la densidad esperada es como mnimo de una bacteria en 10 ml de
producto lquido o una bacteria por gramo de alimento slido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aqu citada y si la
naturaleza del alimento lo permite, utilizar el mtodo de filtrado en
membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por
mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o
utilizar el mtodo en placa.
Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el
territorio nacional para las personas fsicas o morales que requieran
efectuar este mtodo en productos nacionales o de importacin, para
fines oficiales.

Revisin bibliogrfica:
NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIN DE BACTERIAS
COLIFORMES. TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE.
Las bacterias coliformes son un grupo heterogneo compuesto por varios.
Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes
pertenezcan a un solo gnero taxonmico.
La falta de certeza en cuanto a su filiacin taxonmica y la imprecisa
correlacin entre los mtodos recomendados para la deteccin de
coliformes han presentado problemas. El primero, es que Escherichia coli es
aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no
producen gas de la lactosa o lo hacen despus de 48 horas, por lo que no se
les identifica por medio de esta tcnica. Segundo, la capacidad de fermentar
la lactosa est frecuentemente asociada a genes localizados en plsmidos.
Estos determinantes extracromosomales son fcilmente transferidos entre
otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que
pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del anlisis. No
obstante en la prctica, la tcnica ha demostrado su efectividad.

El nmero de organismos se establece mediante la cuenta de unidades

formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la Cuenta de
Microorganismos Coliformes Totales en Placa) o el uso de la tcnica del
nmero ms probable. Esta ltima, tambin llamada tcnica de dilucin en
tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana
presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento
positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Determinacin de coliformes NMP:

El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa
incubadas a 35 1C durante 24 a 48 horas, resultando una produccin de
cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin
utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta
determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril
sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos que
se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la
lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea
como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es
selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces
de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin
del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza
a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en
la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas
cuando son incubados a una temperatura dada.

Materiales y equipos requeridos:

Reactivos:
Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
Agua peptonada
Caldo lactosado
Caldo lauril sulfato triptosa

Caldo lactosa bilis verde brillante

Material:
Tubos con tapn de rosca
Pipetas
Matraz
Campanas Durham
Equipos:
Autoclave

Incubadora
Cuenta colonias

Para la preparacin de la muestra seguir la NOM-110-SSA1-1994,

Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico.

Parte experimental:
Preparar suficiente nmero de diluciones para asegurar que todos los tubos
correspondientes a la ltima dilucin rindan un resultado negativo.

Prueba presuntiva

Inoculacin. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor

concentracin. Usar una pipeta estril para tranferir a cada tubo 10 ml de la
muestra si es lquida o 10 ml de la dilucin primaria inicial, en el caso de
otros productos.
1. Tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de
enriquecimiento. Usar una pipeta estril para transferir a cada uno de
estos tubos 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la dilucin
primaria en el caso de otros productos.
2. Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el
prrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilucin.
Mezclar suavemente el inculo con el medio.
3. Incubacin. Incubar los tubos a 35 0,5 C por 24 2 horas y
observar si hay formacin de gas, en caso contrario prolongar la
incubacin hasta 48 2 horas.

Prueba confirmativa

De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en
un nmero igual de tubos con medio de confirmacin. Incubar a 35 0,5 C
por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo,
prolongar la incubacin por 48 2 horas.
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinacin de tres tubos
por cada dilucin de la serie. Para algunos productos y siempre que se
requiera una mayor precisin en los resultados, ser necesario inocular una
serie de cinco o diez tubos.

Resultados obtenidos y discusin:

Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas
despus del periodo de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros
correspondientes.Clculo del mtodo

Resultado:
La dilucin 1 y 2 dieron positivos en la presuntiva, formando burbujas por lo
que seria , + + - y en la confirmativa solo uno dio positivo, por lo cual
buiscando en las tablas no di con un dato que considero, por lo tanto se
declar como que no tiene coliformes totales.

Fuentes consultadas:

Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical

Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.
Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios.
Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios.
Mtodos para la cuenta de microorganismos coliformes totales en
placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara
de
Salud.
NOM-145-SSA1-1995.
Disposiciones
y
especificaciones sanitarias .Productos crnicos troceados y curados.
Productos crnicos curados y madurados. Norma Oficial Mexicana.
Mxico.
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms,
and Escherichia coli
as Quality and Safety Indicators. In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods
(2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL