Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

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PRCTICA
Verificacin del funcionamiento de un espectrofotmetro.

Nombre: Rodrguez Elizarraras Miguel ngel

Grupo: 5QM1
Seccin: 2
Fecha de entrega: 20-oct-15
Nombre profesora: Olgun Ruiz Gabriela E.

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Objetivos
Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotmetro.
Verificar la exactitud de la escala de la longitud de onda, la
presencia de radiacin dispersa, el ancho de banda, la exactitud
fotomtrica, la proporcionalidad de respuesta y el rendimiento
global del instrumento.

Fundamento
La espectrofotometra es el mtodo de
anlisis ptico ms usado en las
investigaciones
biolgicas.
El
espectrofotmetro es un instrumento
que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una
solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que
contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber
energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente
transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro
visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.
La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada
sustancia qumica.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida;
la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas
longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan
pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.
-Exactitud de la escala de longitud
Se refiere a la adecuada seleccin de la longitud de onda evita que se
produzcan desviaciones importantes en la exactitud fotomtrica, para
esto se utiliza un patrn que contenga un espectro de absorcin con
picos y valles bien definidos.
-Luz dispersa
Es aquella luz que llega hasta el detector cuyas longitudes de onda no
se encuentran comprendidas en la banda de radiacin seleccionada por
el monocromador, esta puede generar lecturas de transmitancia
mayores a las esperadas.
-Ancho de banda
Se pude definir como la diferencia entre la longitud de onda mxima y
mnima de las longitudes de onda que salen del monocromador que
alcanzan al menos el 50% de transmitancia mxima de la banda de
radiacin.

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-Proporcionalidad o linealidad
Relacin entre la intensidad de radiacin registrada en el detector de la
lectura en general es deseable una relacin lineal entre ambas
magnitudes. Un intervalo de longitudes de onda o de concentraciones en
las que existe una relacin lineal entre A vs o entre A vs C permite
evaluar lo que se denomina intervalo dinmico lineal.
DATOS EXPERIMENTALES
Exactitud de la
Tabla 1. Espectro Longitud
de
didimio
onda(nm)
490
Longitud
%T
de
500
onda(nm)
510
400
42
520
410
52
530
420
68
540
430
50
550
440
45
560
450
46
570
460
46.6
580
470
44
590
480
48

%T
87
54
41
30
31
49
65
60
34
11
6

escala de longitud de onda

de transmisin del filtro de

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Espectro de Transmisin del diltro de didimio

100
90
80
70
60
%T

50

didimio

40
30
20
10
0
350

400

450

500

550

600

longitud de onda

Fig. 1 Grafica del espectro de transmisin del filtro

de didimio
Coincidieron
los mximos y los mnimos con las longitudes de onda
informadas por el fabricante? En qu longitudes de onda no fue as?
Los valores que obtuvimos del espectrofotmetro con respecto a los
mximos y mnimos si coinciden con los del fabricante pero cabe
resaltar que los valores de 580-590 nos dan valores ms pequeos.
FABRICANTE
Max: 420, 490, 550
Min: 470, 520
Tabla 2. Espectro de transmisin de la solucin de NISO46H2O al 20%

650

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-Verificar la
obtuvo
el
El
valor
nos indica
sin embargo
nos sali en
-Cmo es
longitud de
longitud de
En base a
obtenidos
NiSO4 6H2O
valores
la escala de
400nm.

Longitud
de
onda(nm)
380
390
400
410
420
430
440
450
460
470
480
Longitud
de
onda(nm
)
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590

%T
%T

6
4
5
6
15
21
40
58.5
67
67.5
84

90
91
91.5
90
87
85
82
89.5
74
67
60

longitud de onda en la que se

valor mximo en el % T.
mximo y mnimo que el fabricante
se encuentra a los 500nm y 400nm
al analizar el espectrofotmetro
la lectura de 510nm y 390nm.
la exactitud de la escala de
onda del espectrofotmetro a esta
onda?
los
valores
experimentales
por este mtodo de la solucin de
al 20% y comparados con los
informados, no existe exactitud en
longitud
de
onda
del
espectrofotmetro a 500 nm y

-Ventajas y desventajas de los mtodos empleados en la prctica para

estimar la exactitud de la escala de longitud de onda.
Ventajas
Desventajas
Sus espectros de transmisin y
La longitud de onda es limitada
absorcin se obtuvieron con el
mismo ancho de banda que
trabaja el espectrofotmetro que
se evala.
Los filtros de didimio evitan
Sus posiciones se alteran por la
distorsiones pticas debido a la
anchura de la rendija.
posicin.

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Espectro de Transmisin de la solucin de NISO46H2O

100
90
80
70
60
%T

50

solucin de NISO46H2O

40
30
20
10
0
350

400

450

500

550

600

longitud de onda

Fig. 2 Grafica del espectro de transmisin de la solucin de

NISO46H2O
PROPORCIONALIDAD FOTOMETRICA
Tabla 3. Proporcionalidad entre A y longitud de onda para el NISO 46H2O
al 20%
Longitud de onda (nm)
Absorbancia
530
0.0604
540
0.0705
550
0.0861
560
0.0481
570
0.1307

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Proporcionalidad entre A y longitud de onda para el NISO46H2O al 20%

0.14

0.12

0.1

f(x) = 0x - 0.57
R = 0.34

0.08

solucin de NiSO46H20 al
20%

Absorbancia

Linear (solucin de
NiSO46H20 al 20%)

0.06

0.04

0.02

0
520 530 540 550 560 570 580
Longitud de onda

-Qu se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotomtrica en

este intervalo de longitudes de onda?
A partir de la grfica y el valor del coeficiente de correlacin
(R2=0.3411), podemos concluir que la lectura que nos da el
espectrofotmetro es incorrecta ya que hay la R2 de referencia es de
0.97736 por lo que debe haber algn problema con el detector, debido a
que la radiacin (en forma de fotones) que llega al detector no es
proporcional a la energa (en forma de electrones) que se transmiten y
que el aparato registra dando lecturas incorrectas.
-Qu relacin existe entre la absorbancia y la longitud de onda en este
intervalo de longitudes de onda?
La relacin que existe entre la absorbancia y la longitud de onda no es
lineal ni proporcional, debido a que la recta generada no cumple con la
ley de Bouguer y Beer.

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LUZ DISPERSA
a) % T de los filtros de luz dispersa y la solucin de NiSO46H2O al 20%.
Filtro
Longitud de
%T
%T
onda (nm)
experimental
referencia
Filtro 325-405
500
0
0.1
NISO46H2O al
400
5
5.6
20%
b) Qu puede concluir a la existencia de luz dispersa del instrumento
que evalu?
De acuerdo a los valores de %T obtenidos experimentalmente, y a los
%T de referencia permitidos para luz dispersa, con una tolerancia del 3
%T, el instrumento (espectrofotmetro) se encuentra dentro de los
lmites, por lo que no existe luz dispersa presente en el instrumento.
ANCHO DE BANDA
a) % T de la solucin de NiSO46H2O al 20%.
Filtro
Longitud de
%T
onda (nm)
experimental
NISO46H2O al
520
90
20%

%T
referencia
93.8

b) Qu puede concluir respecto al ancho de banda del instrumento?

El porcentaje de transmitancia que se obtuvo para evaluar el ancho de
banda del espectrofotmetro no entra en los intervalos reportados, lo
cual indica que el instrumento tiene alguna diferencia significativa en el
ancho de banda, es decir, presenta problema alguno en el
monocromador.
c) Qu ocurre con el ancho de banda si l %T disminuye y si l %T
incrementa?
Al incrementar el %T, el monocromador deja salir una banda con
menores longitudes de onda, haciendo as que la muestra absorbe
una menor cantidad de energa radiante, lo cual indica que el
ancho de banda se redujo.
Al disminuir el %T, se genera un aumento en los mximos del
espectro de absorcin, nos indica que la muestra absorbi una
mayor cantidad de radiacin electromagntica, por lo que el
monocromador deja salir una banda con mayores longitudes de
onda.
EXACTITUD FOTOMETRICA
E.1) Mtodo del filtro de transmisin.
a) % T del filtro de vidrio neutro.

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Filtro
Vidrio neutro

Longitud de
onda (nm)
530

%T
experimental
86

%T
referencia
87.4

b) Qu se puede concluir sobre la exactitud fotomtrica del

instrumento?
El valor de %T que se obtuvo experimentalmente por el filtro de vidrio
neutro, fue de 86%. Por lo tanto, este valor entra dentro del intervalo de
%T ya que el valor de referencia que nos dan es de 87.4 con una
variacin del 5 %T y por lo tanto existe exactitud fotomtrica en el
instrumento.
c) Qu otros mtodos se utilizan comnmente para verificar la
exactitud fotomtrica en el UV - VIS?
-340nm: soluciones de dicromato de potasio en HClO4 (0.001N) con
absorbancia certificada.
-405nm: soluciones de p-nitrofenol en NaOH (0.1N) con absorbancia
certificada o soluciones de sales de Ni(H2O)6+2 con absorbancia
certificada.
-505nm: soluciones de sales de Co (H2O)6+2 en SO4H2 (0.47N) con
absorbancia
certificada
-540nm: soluciones de cian - metahemoglobina con absorbancia
certificada
d) Qu puede ocurrir con la escala de exactitud fotomtrica si la escala
de longitud de onda esta mala calibrada?

E.2) Mtodo de la solucin estndar de NiSO4 - 6H2O al 20%.

Exactitud fotomtrica. Mtodo del NiSO4 - 6H2O al 20%.
Parametro
Longitud de onda
400nm
500nm
Absorbancia esperada
1.252
0.028
Tolerancia aceptada
Absorbancia medida
1.3010
0.0409
Al comparar las absorbancias medidas con la absorbancias esperadas, estas se
encuentras dentro del intervalo esperado, lo que indica que el espectrofotmetro
cuenta con exactitud fotomtrica.

INTERVALO DINMICO LINEAL DE CONCENTRACIN.

Tabla 4. Intervalo dinmico lineal de la concentracin

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Tobo
b

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Concentracin de
NiSO46H2O al 20%
(M)
0
0.0095
0.0285
0.0665
0.1045
0.1425
0.1520
0.1710
0.1805
0.19

A400
Serie a

Serie b

0
0.0861
0.1487
0.3279
0.4814
0.6382
0.6777
0.7212
0.7695
0.8239

0
0.0655
0.1487
0.3187
0.4814
0.6382
0.6777
0.7447
0.7695
0.8239

Concentracin de NiSO46H2O al 20% (M)

0.9

f(x) = 0.1x + 0.02

R = 0.93

0.8
0.7
0.6

serie a

0.5
Absorbancia

serie b

0.4

Linear (serie b)

0.3
0.2
0.1
0
0

10

Concentracin de NiSO46H2O al 20% (M)

Para determinar la concentracin de NiSO46H2O al 20% en los tubos,

realizamos el siguiente clculo.
Ejemplo tubo 2 y 2:
V1=0.2ml (Este volumen vara de acuerdo a la cantidad agregada

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NiSO46H2O en el tubo)
C1=0.19M (concentracin del NiSO4 6H2O)
V2=4ml (Volumen Total en el tubo)
C2=
V1 C1 = V2 C2
C2= V1 C1 /V2
C2= 0.2 ml (0.19M) /4ml
C2= 0.0095M
Cmo es el intervalo dinmico de concentracin, respecto al sealado
por el profesor?
Se puede observar en la grfica, el intervalo dinmico lineal de la
concentracin, que presenta un coeficiente de correlacin de R2: 0.9342
y el que nos proporcion el profesor fue de R2: 0.99924, lo cual indica
que existe alguna falla en la presencia de luz dispersa, en la fuente de
radiacin, en el monocromador o en el detector del espectrofotmetro.
Qu puede indicar el que el intervalo sea menor al esperado?
Que existen desviaciones negativas en el intervalo dinmico de
concentracin a la ley de Bouguer y Beer.
Tabla 5. Resumen de resultados
Parmetro
Valores de
estudiado
Referencia
EXACTITUD EN LA
ESCALA DE LONGITUD
DE ONDA
1.Filtro de didimio
Mximos(,nm)
Mnimos(,nm)
2. Solucin de NiSO4
6H2O al 20 %.
Mximos(,nm)
Mnimos(,nm)

PROPORCIONALIDAD
FOTOMTRICA
Datos de regresin
(530 nm a 570 nm)

Valores
estudiados

420, 490, 550

470, 520

420, 490, 550

470, 520,580,590

500
400

510
390

R2: 0.97736

R2: 0.3411

Conclusin
-Los valores que
obtuvimos del
espectrofotmetro
con respecto a los
mximos y mnimos
si coinciden con los
del fabricante pero
cabe resaltar que los
valores de 400-590
nos dan valores ms
pequeos.
-El valor mximo y
mnimo que el
fabricante nos indica
se encuentra a los
500nm y 400nm sin
embargo al analizar
el espectrofotmetro
nos sali en la
lectura de 510nm y
390nm.
-A partir de la grfica
y el valor del
coeficiente de
correlacin
(R2=0.3411),
podemos concluir
que la lectura que

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nos da el
espectrofotmetro es
incorrecta ya que
hay la R2 de
referencia es de
0.97736 por lo que
debe haber algn
problema con el
detector, debido a
que la radiacin (en
forma de fotones)
que llega al detector
no es proporcional a
la energa (en forma
de electrones) que se
transmiten y que el
aparato registra
dando lecturas
incorrectas.

LUZ DISPERSA
Solucin de NiSO4 6H2O al 20 %. (%T a
400 nm)
%T a 500 nm

ANCHO DE BANDA
%T a 520 nm

EXACTITUD
FOTOMTRICA 1.
Mtodo del filtro de
vidrio neutro. %T a
530 nm
2. Mtodo de la
solucin de NiSO4 6H2O al 20 %

5.6
0.1

5
0

93.8

90

87.4

86

1.256
0.028

1.3010
0.0409

De acuerdo a los
valores de %T
obtenidos
experimentalmente,
y a los %T de
referencia permitidos
para luz dispersa,
con una tolerancia
del 3 %T, el
instrumento
(espectrofotmetro)
se encuentra dentro
de los lmites, por lo
que no existe luz
dispersa presente en
el instrumento.
El porcentaje de
transmitancia que se
obtuvo para evaluar
el ancho de banda
del
espectrofotmetro no
entra en los
intervalos
reportados, lo cual
indica que el
instrumento tiene
alguna diferencia
significativa en el
ancho de banda
El valor de %T que se
obtuvo
experimentalmente
por el filtro de vidrio
neutro, fue de 86%.
Por lo tanto, este
valor entra dentro
del intervalo de %T
ya que el valor de

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referencia que nos
dan es de 87.4 con
una variacin del 5
%T y por lo tanto
existe exactitud
fotomtrica en el
instrumento.

Absorbancia a 400nm
Absorbancia a 500nm

INTERVALO DINMICO
LINEAL DE
CONCENTRACIN
Datos de la regresin
lineal
Intervalo de
concentracin

R2:0.99924

R2: 0.9342

Se puede observar
en la grfica, el
intervalo dinmico
lineal de la
concentracin, que
presenta un
coeficiente de
correlacin de R2:
0.9342 y el que nos
proporcion el
profesor fue de R2:
0.99924, lo cual
indica que existe
alguna falla en la
presencia de luz
dispersa, en la
fuente de radiacin,
en el monocromador
o en el detector del
espectrofotmetro.

Discusiones
Podemos empezar mencionando que el
espectrofotmetro que se utiliz en la
prctica para la lectura es muy antiguo y
ya casi no se utiliza a nivel industrial ni
en el laboratorio ya que estos se han
reemplazado por espectrofotmetros
digitales que dan lecturas ms rpidas y
exactas.
Empezamos con la determinacin de la exactitud en la escala de
longitud de onda, este parmetro se basa principalmente en seleccionar
longitudes de onda donde no produzcan desviaciones en la exactitud
fotomtrica y para medir la exactitud, se recurre comnmente a un
patrn (filtros o soluciones de tierras raras) cuyos espectros de absorcin
o transmisin, cuentan con sus crestas (mximos) y valles (mnimos). En
la prctica se utiliz un filtro de didimio, para evaluar la exactitud en la
escala de longitud de onda del espectrofotmetro. Los mximos que nos
proporcionaron como referencia fueron 420, 490, 550 los cuales
coincidan con los experimentales. Por otro lado, los mnimos (valles) de
referencia que nos proporcionaron fueron de 500nm y 400nm los cuales
no coincidieron con los obtenidos experimentalmente, cuyos valores

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obtenidos fueron de 470,

520, 580,590 concluyendo as que no Espectrofotmetro analizado
existe exactitud en la escala de longitud en la prctica (nmero 9).
de onda del instrumento a travs de
este mtodo, al no coincidir los valores de experimentales con los de
referencia.
Otro mtodo a evaluar fue la exactitud en la escala de longitud de onda
del espectrofotmetro por la solucin de NiSO4 6H2O al 20 %, cuyo
mximo que nos proporcionaron fue de 500nm el cual no coincidi con el
obtenido experimentalmente que fue de 510nm. Por otro lado, su
mnimo de referencia se presenta a 400nm el cual no coincidi en los
valores obtenidos experimentalmente que fue de 390nm.
Hablando en general en ambos mtodos para evaluar la exactitud en la
escala de longitud de onda no coincidieron con lo informado, por lo cual
no hay exactitud en la escala de longitud de onda del espectrofotmetro.
Se realiz un grfico (absorbancia en funcin de la longitud de onda),
para comprobar la proporcionalidad fotomtrica, cuya recta generada
nos dio un R2 de 0.3411 y la referencia que nos dieron fue de R2:
0.97736 lo cual nos indica que el espectrofotmetro no presenta una
proporcionalidad fotomtrica a esas longitudes de onda, es decir que no
cumple la ley de Bouger y Beer, que nos expresa que al permanecer
constante el paso de luz a travs de la cubeta y la absortividad.
Otro mtodo que se realizo fue el de la luz dispersa y este se define
como aquella luz que llega hasta el detector, donde las longitudes de
onda no se encuentran comprendidas en la banda de radiacin
seleccionada por el monocromador, lo cual genera lecturas de
transmitancia mayores, lo que causa desviaciones negativas a la ley de
Beer, para determinar este tipo de luz se realizarn 2 metodos el de la
solucin de NiSO4 6H2O (420 nm) y los filtros (450 nm y 500 nm),
verificando que no existe luz dispersa presente en el instrumento,
debido a que los valores experimentales de ambos mtodos entran
dentro de los lmites.
Se determin el ancho de banda el cual nos representa la diferencia
entre la longitud de onda mxima y mnima de las longitudes de onda
que salen del monocromador y el % de transmitancia que se obtuvo
para evaluar el ancho fue del 90% que entra en los intervalos de
referencia 93.8 %T (3%), lo cual indica que el instrumento tiene alguna
diferencia significativa en el ancho de banda, es decir, presenta
problema alguno en el monocromador.
Unos de los ltimos mtodos que se realizo fue el de la exactitud
fotomtrica que representa la medida de absorbancia, o del % de
transmitancia en la escala del espectrofotmetro la cual se determin
utilizando el filtro de vidrio neutro y la solucin NiSO4 6H2O al 20%,
comprobando por ambos mtodos que si hay exactitud fotomtrica en el
instrumento, debido a que los valores experimentales d %T entran
dentro de los intervalos de referencia.

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Por ltimo se realiz el Intervalo dinmico de concentracin

que representa la relacin entre la intensidad de radiacin registrada en
el detector y la lectura, cabe menconar que el intervalo dinmico de
concentracin es directamente proporcional y lineal, debido a que
cumple con la ley de Bouger y Beer. Con respecto a los resultados
obtenidos se obtuvo un R2 de 0.9342 dndonos un valor de referencia
de R2:0.99924 lo cual indica que existe alguna falla en la presencia de
luz dispersa, en la fuente de radiacin, en el monocromador o en el
detector del espectrofotmetro.
Conclusiones

No hay exactitud en la escala de longitud de onda.

No hay proporcionalidad fotomtrica.
No presenta luz dispersa o parasita en sus interiores.
Presenta uno diferencia significativa en el ancho de banda.
Si hay exactitud fotomtrica.
No existe un intervalo dinmico lineal.

Bibliografa

Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 5 Ed., Joha Wiley and

Sons Inc. New York.
Skoog, D. A. and D.M., West, 1989, Quimica Anlitica, 4a Ed.,
Edit. Mac Graw Hill, Madrid.

PREGUNTA EXTRA

Seale dos causas que originen:

Luz extraa
- Que el aparato no est bien cerrado lo cual hace que pase luz
extraa y de una lectura falsa
-La lmpara est en mal estado o no est trabajando a su
capacidad

Cambio en el ancho de banda

-Una mala calibracin
-Una inadecuada preparacin de las disoluciones