LAS RESPUESTAS DEL INTERFERN GAMMA DE CD4 Y CD8 DE CLULAS T SON

CUANTITATIVAMENTE DIFERENTES E INDEPENDIENTES EL UNO DEL OTRO

DURANTE LA INFECCIN PULMONAR POR MYCOBACTERIUM BOVIS BCG

ABSTRACTO
El tipo 1 respuesta inmune mediada por clulas T es esencial para la defensa del husped
contra la infeccin micobacteriana intracelular. De hecho, los anfitriones deficiente en tanto
CD4 y las clulas T CD8 sucumben fcilmente a la infeccin por
micobacterias (9, 13, 26, 28). Aunque las clulas T CD4 se cree tradicionalmente para
desempear un papel protector importante, el CD4 y subconjuntos de clulas T CD8 han
cada han encontrado para ser capaz de conferir proteccin inmune (4, 5, 20, 21, 25, 26), y
una falta de clulas T CD8 resultados en debilitada defensa del husped contra la infeccin
micobacteriana (9, 13, 26). El interfern gamma (IFN-) desempea un papel fundamental
en la inmunidad de las clulas T a travs de sus efectos activadores potentes
sobre Mycobacterium macrfagos infectados y formacin de
granulomas (2, 27,28). Aunque las clulas T, clulas NK y macrfagos son capaces de
producir IFN- (6, 24), las clulas T CD4 y CD8 se considera que son las fuentes primarias
de esta citocina durante la infeccin micobacteriana(20, 25, 26, 29) . La evidencia reciente
sugiere que el IFN-, pero no actividad citotxica, es necesaria para la proteccin inmune
mediada por antimicobacteriana clulas T CD8 (3, 11, 20). Sin embargo, la contribucin
relativa de CD4 y subconjuntos de clulas T CD8 para IFN- respuestas durante la infeccin
micobacteriana se ha mantenido en gran medida a determinar. Ms especficamente, se
queda por determinar si las clulas CD4 y CD8 T producen cantidades diferenciales de
IFN- y, en caso afirmativo, si dicha produccin de IFN- diferencial se atribuye a la
diferencia de las frecuencias de antgeno especfico de subconjuntos de clulas T,
diferencial IFN- capacidades de secrecin de gamma, o ambos. Adems, tambin se
entiende todava no completamente si las clulas T CD4 y CD8 son dependientes uno del
otro para su activacin y respuestas de IFN-gamma durante la infeccin
micobacteriana. Una mayor comprensin de la regulacin y la capacidad de las clulas CD8
produccin de clulas T IFN- durante la infeccin por micobacterias es importante en el
desarrollo de estrategias profilcticas y teraputicas eficaces para dirigirse a las clulas T
CD8 en huspedes de clulas T-CD4 deficientes, tales como la inmunodeficiencia humana
por virus individuos infectados.
Hemos utilizado aqu un modelo de infeccin pulmonar por micobacterias para analizar y
comparar las respuestas de IFN- en las clulas CD4 y CD8 de clulas T subconjuntos
purificados cocultured con clulas presentadoras de antgeno (APC) mediante el uso de

tanto inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA) y enzima inmunospot ligado (ELISPOT)

tcnicas de ensayo para la determinacin de protena total IFN- en libertad en medios de
cultivo, las frecuencias de clulas IFN-? secretoras, y la capacidad de secrecin de IFNgamma. Tambin hemos investigado el papel de las clulas T CD4 en la activacin de
clulas T CD8 durante ambas infecciones micobacterianas primarias y secundarias.
Ir:

MATERIALES Y METODOS
Ratones.

Todas las cepas de ratones utilizados en el presente estudio tenan una H-2 b C57BL / 6 (B6)
antecedentes genticos. Mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII) - / -, CD4 - / -, CD8 - / -, y RAG2 - / - ratones originalmente adquiridos de Taconic Farms y
criados en casa y C57BL / 6 ratones adquirieron de Harlan Criadores ( Indianapolis, IN) se
mantuvieron en las condiciones especficas libres de patgenos en la Instalacin Animal
Central de la Universidad de McMaster.
Infeccin por micobacterias pulmonar primaria y secundaria.

M. bovis BCG (cepa Connaught) se prepar como se ha descrito

previamente (26, 28). Brevemente, el Mycobacterium cepa se cultiva en medios
Middlebrook 7H9 (Difco) suplementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC
(Invitrogen), 20% de glicerol, y 0,05% de Tween 80 durante 10 a 15 das, y las muestras se
dividieron en alcuotas y se almacen a -70 C. BCG se lav dos veces con solucin salina
tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,05% de Tween 80 y se resuspendi en PBS. A
continuacin, se pas a travs de una aguja de calibre 27 10 veces para dispersar grumos y
despus se diluy con PBS hasta la concentracin deseada antes de su uso. Un volumen de
40 l por ratn se utiliz para la inyeccin intratraqueal (IT). Para la infeccin BCG
primaria, C57BL / 6 y MHC II - / - ratones fueron infectados con 0.5 millones de CFU de
BCG. Para el desafo de micobacterias secundaria, los ratones infectados fueron desafiados
con 1,5 millones UFC de BCG 6 semanas despus de la infeccin primaria con BCG. El
antibitico isoniacida se administr a los ratones 3 semanas despus de la infeccin
primaria para minimizar el nivel de permanecer organismos vivos in vivo antes de la
infeccin secundaria. Tabletas de isoniazida (100 mg) se disolvieron en 20 ml de PBS y se
filtraron con filtros de 0,22 micras-de tamao de poro antes de la inyeccin. Cada ratn fue
inyectado intraperitonealmente con 50 mg de isoniazida / kg (peso corporal) por da durante
7 das consecutivos.

Aislamiento de esplenocitos enteros y clulas de ganglio linftico.

Ambos esplenocitos y clulas de ganglios linfticos se aislaron y cultivaron como se ha

descrito previamente (25, 26, 28). Brevemente, las clulas del bazo se liberan en medio
RPMI por maceracin bazos entre portaobjetos de vidrio. Despus de lisis de glbulos rojos
con un kit de eritrocitos de ratn de lisis (R & D Systems), los esplenocitos se filtraron y se
resuspendieron en medio completo RPMI (cRPMI) (suero bovino fetal al 10%, 1% de
penicilina-estreptomicina, un 1% L -glutamine). Clulas de los ganglios linfticos fueron
liberados de los ganglios linfticos del mediastino en medios cRPMI.
La purificacin de las clulas y cocultivo con APCs T CD4 y CD8.

Selecciones positivas de CD4 y las clulas T CD8 se llevaron a cabo con MACS utilizando
imn VarioMAC, columnas LS, y CD4 o CD8a microperlas (Miltenyi Biotec) de acuerdo
con el protocolo del fabricante, con la excepcin de que el proceso de purificacin se
repiti una vez para las fracciones positivas en a fin de maximizar la pureza de la clula.En
pocas palabras, por cada 10 7 se utilizaron esplenocitos totales o clulas de los ganglios
linfticos, 10 l de perlas magnticas y 90 l de tampn MACS (0,5% de albmina de suero
bovino y EDTA 2 mM en PBS), y la mezcla se incub a 4 C durante 15 minutos. El
exceso de perlas se lavaron de distancia, y el total de clulas se volvieron a suspender a un
10 8 clulas / 500 l. Despus las clulas se cargaron en una columna prelavado, y la fraccin
negativa se dej fluir a travs, seguido por tres lavados de 3 ml de la columna.Finalmente,
la fraccin positiva fue purgada con un mbolo y se centrifug y se resuspendi en cRPMI
para su uso posterior. La pureza de subconjuntos de clulas T purificadas fue
consistentemente> 90%, determinada por fluorescencia de clulas activadas (FACS), y la
viabilidad de estos subconjuntos fue> 95%.Todos los cultivos celulares se realizaron con
placas de 96 pocillos de poliestireno de fondo plano. Se utiliz un volumen total de 250 l de
medio cRPMI por pocillo, y las clulas se incubaron durante 3 das a 37 C.Sobrenadantes
de cultivo celular (200 mu l) se recogieron de cada pocillo despus de la incubacin y se
almacenaron a -20 C.
Para cocultivo de subconjuntos de clulas T purificadas y vehculos blindados, medio
milln purificado CD4 o clulas T CD8 se cocultivaron con M. bovis APCs en un volumen
total de 250 l BCG infectado-como se detalla anteriormente (29). Mycobacterium APCs
infectados fueron siempre prepararon el da antes de la purificacin de clulas T en placas
macrfagos alveolares recin aisladas de los pulmones de ingenuo C57BL / 6 ratones en
concentraciones de 4.000 clulas por pocillo en 100 l de penicilina-estreptomicina-libre de
RPMI (suero bovino fetal al 10%, 1% L -glutamine) y se infectaron in vitro con el BCG
vivo a una multiplicidad de infeccin de 40 CFU. Los pocillos de control incluyen las
clulas CD4 o CD8 T solamente, APC no infectados, APC infectados, CD4 o clulas T CD8

cultivadas con APC no infectadas o clulas CD4 o CD8 T con BCG vivo, pero no hay
vehculos blindados. Todos estos controles no produjo o niveles insignificantes de IFN-
produccin. Cocultivo se llev a cabo durante 3 das antes de que se recogi el
sobrenadante para la medicin de citoquinas por ELISA.
Medicin de la produccin de IFN- por las clulas T CD4 y CD8 cultivadas.

Los niveles de IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo de clulas se evaluaron

mediante kits de ELISA para IFN- murino (R & D Systems). La sensibilidad de deteccin
fue de 2 pg / ml.
Determinacin de la frecuencia de-micobacteriana especfica de antgeno, IFN-
liberadora de clulas T CD4 y CD8 mediante el ensayo ELISPOT.

El ensayo ELISPOT de IFN-gamma se llev a cabo de acuerdo con el protocolo del

fabricante con los anticuerpos de captura y deteccin suministrados monoclonales (MAb) y
reactivos de desarrollo de color (R & D Systems) en placas de 96 pocillos con fondo de
nitrocelulosa (Millipore). La placa se recubri con captura de anticuerpos que el da antes
de chapado celular. Clulas CD4 o CD8 T (0,3 0,15 millones de dlares) se cocultivaron
con 0,2 millones de APCs (esplenocitos gamma-irradiado desde ingenuo C57BL / 6
ratones) y se estimularon con 2 g de Mycobacterium tuberculosis protena de filtrado de
cultivo (CFP) en un volumen total de 100 l de cRPMI por pocillo durante 1 da a 37
C (25). Los pocillos de control incluyen APC, APC adems PPC; Las clulas CD4 o clulas
T CD8 solo, CD4 o CD8 T con APC o clulas CD4 o CD8 T con el PPC, pero no
APC. Todos estos controles generan un nmero mnimo de puntos de fondo que se restaron
de los resultados positivos. Despus del cultivo, la placa se incub con anticuerpos de
deteccin y se someti a desarrollo de color de las manchas. IFN-gamma + manchas se
cuantificaron, y la frecuencia de clulas IFN-? Secretoras se expres como el porcentaje de
IFN- + clulas entre el nmero total de clulas cultivadas en placas. Para determinar la
capacidad de secrecin de IFN- de T CD4 y CD8 subconjuntos, la cantidad de la
produccin de IFN- determinada por ELISA se dividi por el nmero de IFN- + clulas
CD4 o CD8 T determinado mediante el ensayo de ELISPOT por cada milln de clulas
cultivadas .
Determinacin de la proliferacin de clulas CD8 T por [3 H] timidina incorporacin de
ensayo.

Purificadas a partir de clulas T CD8 C57BL / 6 y MHC II - / - ratones despus de la

exposicin micobacteriana secundaria se cultivaron como se describe anteriormente. A las
20 h antes de la terminacin de la incubacin de 3 das, 1 Ci de [3 H] timidina se aadi a
cada pocillo. Los cultivos de clulas se sometieron entonces a la congelacin y

descongelacin de una vez. El uso de un recolector de clulas, las clulas se lavaron, y sus
contenidos se lisaron y se recogieron en placas de filtro de GFC (Perkin-Elmer). La
radioactividad de los contenidos de clulas lisadas se midi con un lector de radiactividad
Top Count.
Cell inmunotincin superficie y anlisis FACS.

Todos los MAbs utilizados aqu se compraron de BD Pharmingen. Las clulas fueron
bloqueadas durante la unin no especfica de sus receptores Fc con anticuerpos anti-CD16 /
CD32 durante 15 min y luego se tieron durante 30 min en hielo con las combinaciones
apropiadas de los MAb conjugados con fluorocromo. Se utilizaron anticuerpos
monoclonales conjugados con fluorocromo a CD3, CD4, CD8, CD44, CD45, CD25,
CD62L y. Clulas sin teir se utilizaron como control. Los datos fueron recogidos con
FACScan, LSRII o FACSCanto (todo BD Biosciences) citmetros utilizando CellQuest o
software FACSDiva fluyen y se analizaron con WinMDI o software FlowJo.
La transferencia de clulas T adoptivos.

Varios das antes de la transferencia de clulas T, el nmero deMycobacterium especficos

de las clulas CD8 T en el bazo se predeterminado en C57BL infectada con BCG / 6 y
MHC-II - / - ratones mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma. Esta informacin se utiliza
para el clculo de tal manera que RAG2 - / - ratones inmunodeficientes recibir un nmero
igual de clulas especficas de antgeno CD8 T aisladas de ambos infectados con BCG de
tipo salvaje B6 y MHC-II - / -ratones. Purificadas a partir de clulas T CD8 C57BL infectada
con BCG / 6 y MHC-II - / - ratones fueron inyectados por va intravenosa en RAG2 - /
ratones inmunodeficientes. Cada ratn destinatario ha recibido clulas T CD8 en un
volumen de 200 a 300 l travs de la vena de la cola.
El anlisis estadstico.

El anlisis estadstico se evalu mediante el uso de software de hoja de clculo Excel

(Microsoft). Los datos se recogieron y se representan como la media de las muestras con o
sin barra de error estndar. Siempre que sea aplicable, la significacin estadstica entre las
diferencias se determin con el Student t prueba. Un P valor de 0.05 se considera
significativa.

RESULTADOS
IFN- produccin por los esplenocitos enteros y purificados subconjuntos CD4 y CD8
de clulas T durante la infeccin micobacteriana pulmonar.

Antes de examinar la cintica de CD4 y de clulas T respuestas de IFN- CD8, que

examin por primera vez la cintica de la produccin de IFN- por esplenocitos enteros. No
slo el bazo servir como una ventana fiable con el tipo de pulmn 1 inmunidad despus de
la infeccin micobacteriana (25, 26, 28, 29), pero es una fuente rica de clulas T especficas
de antgeno. Esplenocitos se aislaron enteros en diversos momentos despus
pulmonar M. bovis BCG infeccin y se estimularon con M. tuberculosis PPC. El nivel de
IFN- se midi por ELISA. Los esplenocitos produjeron las mayores cantidades de IFN- a
las 3 semanas despus de la infeccin BCG, y los niveles de IFN-gamma respuestas
disminuyeron marcadamente en las semanas 5 y 10 (Fig. (Fig.11).

FIG. 1.
Kinetic la produccin de IFN-gamma por los linfocitos esplnicos enteros
despus de la infeccin micobacteriana pulmonar. C57BL / 6 ratones fueron
infectados con M. bovis BCG para 3, 5, o 10 semanas.La cultura de esplenocitos
se estimularon con M. tuberculosis PPC. El IFN- ...

Para comenzar a examinar la contribucin relativa de cada subconjunto de clulas T a IFNgamma respuestas en todo el esplenocitos, el mismo nmero de clulas T CD4 y CD8
purificados a partir de los esplenocitos enteros aislados en diversos momentos se analiz
mediante cocultivo con Mycobacterium APCs infectados.La pureza de las clulas CD4 y
CD8 T esplnicas aisladas utilizados para tal cocultivo fue consistentemente mayor que
90% segn lo evaluado por FACS. Por ejemplo, las purezas de las clulas CD4 y CD8 T
aisladas eran 92, 91, y 94% y 94, 92, y 95%, respectivamente, en las semanas 3, 5, y 10
(Fig. (Fig.22 y y3).3). Mediante el uso de ELISA, se encontraron clulas T CD4 para
producir niveles mucho ms altos de IFN- que en el mismo nmero de clulas T CD8 en
todos los puntos de tiempo examinados tras la estimulacin in vitro
conMycobacterium infectado con-APC (Fig. (Fig.2) .2). CD4 clulas T aisladas a las 3
semanas despus de la infeccin produjeron las mayores cantidades de IFN-, de acuerdo
con altos niveles de respuestas IFN-? Por esplenocitos enteros en este momento
(Fig. (Fig.11).

FIG. 2.
Comparacin de la produccin cintica de IFN- por CD4 y subconjuntos de
clulas T CD8 despus de la infeccin micobacteriana
pulmonar. Mycobacterium infectados con C57BL / 6 ratones fueron sacrificados
a los 3, 5, y 10 semanas. Clulas T CD4 y CD8 fueron purificados a partir de
esplenocitos enteros ...

FIG. 3.
(A) Comparacin de las frecuencias de antgeno especfico, IFN- liberadora de
clulas T CD4 y CD8. Las frecuencias de IFN + CD4 y IFN- + clulas CD8 fueron
evaluados por IFN-gamma ELISPOT ensayo donde las clulas CD4 o CD8
purificados ...
Frecuencias y IFN- capacidad de secrecin de clulas micobacterianas especficas de
antgeno T CD4 y CD8 durante la infeccin pulmonar primaria.

Puesto que cantidades mayores de protena IFN- medidos en sobrenadantes de cultivo de

las clulas T CD4 pueden ser resultado de una mayor capacidad de produccin de IFN- en
una base por clula o de mayores frecuencias de clulas T especficas de antgeno o de
ambos, se analiz la frecuencia de las micobacterias especficas de antgeno T CD4 y CD8
clulas mediante el uso de ensayo ELISPOT. En promedio, hubieron 0.3 a 0.5% de las
clulas T CD4 IFN- siendo positiva entre la semana 3 y 10 en comparacin a 0,1 a 0,2%
de las clulas T CD8 siendo positivo (Fig. (Figura 3A).3A). Esto sugiere que un mayor
nmero de clulas CD4 T especficas de antgeno cuenta, al menos en parte, por cantidades
mucho mayores de protena IFN- liberados a partir de cultivos de clulas T CD4
(Fig. (Fig.2).2). Por lo tanto, basado en el hecho de que siempre haba el doble de clulas
totales CD4 T como las clulas T CD8 en el bazo en varios momentos tal como se evalu
mediante anlisis de FACS (datos no mostrados), claramente haba muchas ms clulas
CD4 T especficas de antgeno por bazo que sus homlogos de clulas T CD8 en todos los

puntos de tiempo examinados [por ejemplo, haba (100 4,0) x 10 3 y (40 3,5) x
10 3 IFN-gamma + T CD4 clulas frente a (13 0,2) 10 3y (13,5 0,1) x 10 3 IFNgamma + clulas T CD8 en las semanas 3 y 5, respectivamente].
Usando la informacin generada por los ensayos ELISA y ELISPOT, tambin se determin
la capacidad de secrecin de IFN- relativo de clulas T CD4 y CD8 especficas de
antgeno. Hemos encontrado que las clulas T CD4 IFN--positivos tenan una capacidad
mucho mayor secrecin de IFN- que las clulas T CD8 IFN-gamma-positivo (Fig. (Figura
3b).3B). Esto sugiere que las clulas individuales especficas de antgeno T CD4 probable
liberan ms IFN- que sus homlogos de las clulas T CD8 individuales. Por lo tanto, no
slo no haba un mayor nmero de clulas T CD4 IFN-gamma que producen, pero cada
CD4 de clulas T activadas secretada IFN- ms que cada clula CD8 T activado. Es de
destacar que las clulas CD4 T aisladas a las 3 semanas producen mucho ms IFN- que las
clulas T CD4 aislados en momentos posteriores (Fig. (Figura 2), 2), y sin embargo, la
frecuencia de clulas CD4 T especficas de antgeno en las semanas 3 fue similar a los de
puntos de tiempo posteriores (Fig.(figura 3A),3A), lo que sugiere que mayor produccin de
IFN- por las clulas T CD4 en las semanas 3 era probablemente debido a la activacin de
clulas T ms pronunciada.
Papel de las clulas CD4 T en la activacin de clulas T CD8 y las respuestas de IFNgamma durante la infeccin micobacteriana pulmonar primaria.

Se sabe que CD4 y subconjuntos de clulas T CD8 pueden afectar a la activacin de cada
uno en un nmero de modelos de enfermedades infecciosas (14, 19). Para investigar el
potencial efecto regulador recproco de subconjuntos de clulas T en las respuestas de cada
uno de IFN-, que examin por primera vez las respuestas de clulas T CD4 en infectada
CD8 ratones de clulas T deficientes en 3 o 12 semanas despus de la infeccin. Tanto la
produccin de IFN- y la frecuencia de clulas CD4 T especficas de antgeno no se vieron
afectados por la falta de clulas T CD8 (datos no mostrados). Para investigar si se requieren
clulas T CD4 para la activacin de las clulas T ptima CD8, MHC-II-deficiente (MHCII - / -) ratones fueron infectados con micobacterias, y las clulas T CD8 fueron purificados
en diversos momentos y se compararon con los aislados de B6 ratones de tipo salvaje
infectados. En comparacin con CD4-deficiente (CD4 - / -)ratones, MHC-II - / - ratones
representan "ms limpia" y mejores anfitriones de clulas T con deficiencia de CD4 para el
estudio de las respuestas de clulas T CD8 desde CD4 - / - se encontraron ratones para
desarrollar restringidas por MHC-II aberrante CD8 + y CD4 - / CD8 - poblaciones de clulas
T (12, 22). Por lo tanto, MHC-II - / - ratones se utiliza como un anfitrin o principal
herramienta CD4 de clulas T deficientes en nuestro estudio. Hemos encontrado que a las 3
semanas, el nivel de produccin de IFN- por las clulas T CD8 de MHC-II - / - ratones fue
comparable a la de tipo salvaje las clulas T CD8, mientras que en los ltimos tiempos

parece an mayor por las clulas T CD8 en MHC-II - / - ratones que en los ratones B6 de tipo
salvaje (Fig. (figura 4A).4A). Adems, la frecuencia de las clulas CD8 T especficas de
antgeno examinados en diversos puntos temporales tambin fue similar entre los CD4 de
las clulas T de tipo salvaje y deficientes hosts (Fig. (Figura 4B).4B). Capacidad de
secrecin de IFN- de las clulas T CD8 en las clulas CD4 anfitriones de clulas T
deficientes se encontr que era incluso mayor en las semanas 5 y 10 (Fig. (Figura 4c), 4C),
lo que explica los niveles algo ms altos de IFN- la produccin de por estas clulas en los
momentos posteriores (Fig.(figura 4a).4A). Resultados similares tambin se obtuvieron con
las clulas T CD8 purificados a partir de ratones de CD4 deficientes infectados (datos no
mostrados). Tras el examen de la activacin de clulas T y los marcadores de superficie de
memoria CD45, CD25, CD44, y CD62L, se encontr que el porcentaje de clulas
CD3 + CD8 + CD45 + o CD3 + CD8 + CD25 + (activacin), CD3 + CD8 + / CD44 + (memoria
efectora / activacin), o CD3 + CD8 + / CD44 + CD62L + (memoria central) las clulas T del
bazo de infectada MHC-II - / - ratones fue comparable a la de ratones de tipo salvaje
infectados (Tabla ( Tabla 1).1). Aunque hubo diferencias pequeas pero significativas en la
proporcin de CD8 y CD45 + clulas T CD8, la intensidad de fluorescencia media, que tiene
en consideracin de intensidad media tincin fluorescente de todas las clulas positivas, no
es diferente para todos los grupos de comparacin entre MHC- II - / - y ratones B6 (datos no
mostrados). Estos resultados juntos sugieren que durante la infeccin micobacteriana CD4
ayuda de clulas T no es necesaria para la diferenciacin y activacin de las clulas T CD8.

FIG. 4.
(A) Comparacin de la produccin cintica de IFN- por las clulas T CD8
generados en hosts CD4 de clulas T-eficientes y CD4 de clulas T deficientes
despus de la infeccin micobacteriana pulmonar. C57BL / 6 de tipo salvaje y
MHC-II - / - ratones fueron infectados con ...

MESA 1.

Comparacin de los fenotipos de activacin de CD3

salvaje y MHC-II - / - ratones

clulas T CD8 + de tipo

Habiendo demostrado que la falta de clulas T CD4 tuvo poco efecto sobre la frecuencia y
el IFN- produccin de clulas T CD8 especficas de antgeno, se analiz el nivel de
infeccin micobacteriana en ratones CD4 de clulas T deficientes despus de la infeccin
micobacteriana pulmonar. De inters, en las semanas 3 y 5 despus de la infeccin el nivel
de infeccin micobacteriana pulmonar en MHC-II - / - ratones fue similar o incluso menor
que en ratones B6 de tipo salvaje (Fig. (Fig.5),5), una observacin de acuerdo con nuestros
resultados anteriores (26). Sin embargo, aunque el nivel de infeccin se redujo
marcadamente en el pulmn de ratones B6 de tipo salvaje en la semana 10, se mantuvo alta
en los pulmones de MHC-II - / -ratones (Fig. (Fig.5).5). Tendencias similares se encuentran
tambin en los bazos de MHC-II - / - y ratones B6 (datos no mostrados). Tales cargas
bacterianas altas en los pulmones de MHC-II - / - ratones pueden haber contribuido a las
respuestas estadstica y significativamente mayor de IFN- por las clulas T CD8 de MHCII - / - ratones en la semana 10 (Fig. (Figura 4A ).4A). Estos datos sugieren que las clulas
CD8 T activadas en la ausencia de clulas T CD4 podran as controlar la infeccin
micobacteriana primaria al menos inicialmente.

FIG. 5.
Comparacin de los niveles de infeccin micobacteriana en los pulmones de
ratones C57BL / 6 y MHC-II - / - ratones. Los ratones fueron infectados
con M. bovis BCG para 3, 5, o 10 semanas. Los ttulos de micobacterias CFU en
los pulmones homogeneizados fueron determinadas por la formacin de
colonias ...
Papel de las clulas CD4 T en la activacin de clulas T CD8 y las respuestas de IFNgamma durante la infeccin micobacteriana pulmonar secundaria.

Habiendo demostrado que la falta de clulas T CD4 tuvo poco efecto sobre las respuestas
de clulas T CD8-IFN-gamma durante la infeccin micobacteriana primaria, se investig si
esto tambin podra ser cierto de las respuestas de clulas T CD8 despus de la infeccin
micobacteriana pulmonar secundaria. Con este fin, los ratones de tipo salvaje B6 y MHCII-deficientes fueron infectados con micobacterias, y en la semana 3 fueron tratados
diariamente con el antibitico isoniacida antimicobacteriana por un perodo de 7 das para
reducir la infeccin primaria en ambos B6 y MHC- II - / - ratones. Este rgimen teraputico

fue encontrado para reducir eficazmente el nivel de infeccin por cerca de 150 veces en el
pulmn (785.250 a 900.000 CFU sin isoniazida contra 5.400 a 6.975 CFU con el
tratamiento con isoniazida) y para eliminar la infeccin en el bazo en ambas cepas de ratn
cuando se evalu poco antes a la reinfeccin. En la semana 6 despus de la infeccin
primaria, estos ratones fueron reinfectados con una alta dosis de micobacterias. Los ratones
se sacrificaron 7 das despus de la infeccin secundaria, y las clulas T CD8 se purificaron
a partir de los bazos y los ganglios linfticos locales de drenaje y se analizaron para sus
actividades despus de la infeccin micobacteriana secundaria. Purificada clulas T CD8 de
infectarse MHC-II - / - ratones proliferaron ex vivo a un ritmo similar o incluso superior a la
de las clulas de los ratones B6 de tipo salvaje (Fig. (Figura 6a).6A). Adems, la
produccin de IFN- por las clulas T CD8 y las frecuencias de especficas de antgeno, las
clulas T CD8 IFN-? Productoras de MHC-II - / - ratones tambin fueron similares o incluso
mayores que los de B6 de tipo salvaje T CD8 clulas en el bazo (Fig. (figura 6B).6B). La
capacidad de secrecin de IFN- de las clulas CD8 T de MHC-II - / - ratones se encontr
que era mayor que la de los homlogos de tipo salvaje (Fig. (Figura 6B).6B). Ambos
tambin se encontraron las frecuencias de las clulas T CD8-gamma productoras de IFN y
la capacidad de secrecin de IFN- de estas clulas para ser casi idntica entre los de tipo
salvaje B6 y CD4-deficiente (CD4- / -) ratones (datos no mostrados) . Que la capacidad de
secrecin de IFN- de las clulas CD8 T de MHC-II- / - ratones fue mayor que la de CD4 - /
ratones, con relacin a B6 de control de tipo silvestre, probablemente refleja una mayor
medida de la compensacin por las clulas T CD8 de MHC-II - / - ratones ya que estas
clulas son totalmente dependientes de la va de MHC-I para la activacin. En
comparacin, CD4 - / - ratones desarrollan restringidas por MHC-II aberrante CD8 + y
CD4 - CD8 - poblaciones de clulas T (12, 22). Tambin se examinaron los fenotipos de
activacin y / o de la memoria de las clulas T CD8 de infectarse MHC-II - / - ratones y
encontramos que la proporcin de memoria efector clulas T CD8 (CD44 +CD62L -) fue ligeramente
superior tanto en el bazo y en el ganglios linfticos de drenaje de MHC-II - / ratones (datos no presentados). Los ttulos de
micobacterias en el pulmn a los 7 das despus de la exposicin micobacteriana
secundario tambin eran muy similares entre los de tipo salvaje B6 y MHC-II - / - o CD4 - /
ratones (datos no presentados). Estos datos en conjunto sugieren que la falta de clulas T
CD4 no afecta negativamente respuestas de activacin de clulas T CD8-IFN-gamma y tras
la exposicin micobacteriana secundaria en huspedes infectados previamente.

FIG. 6.
Comparacin de las respuestas secundarias de la memoria las clulas T CD8
generados en huspedes CD4 de clulas T CD4-eficiente y de clulas T
deficientes. C57BL / 6 de tipo salvaje y MHC-II - / - ratones fueron infectados con
micobacterias y a las 6 semanas despus de la infeccin fueron desafiados ...
Proteccin inmune por las clulas CD8 T activadas generadas en el entorno de clulas T
con deficiencia de CD4.

Habiendo mostrado que la falta de clulas T CD4 no result en cualquier deficiencia en

tanto la activacin de clulas T y IFN-gamma respuestas primarias y secundarias CD8, se
examin si las clulas CD8 T cebadas en ausencia de clulas T CD4 podran proporcionar
proteccin inmune contra desafo de micobacterias en la transferencia adoptiva a un
husped inmunodeficiente. Con este fin, MHC-II - / - y de tipo salvaje ratones B6 fueron
infectados con M. bovis BCG, y las clulas T CD8 esplnica fueron purificados a las 6
semanas. Las frecuencias de las clulas T CD8 especficas de antgeno fueron
predeterminados por ensayo ELISPOT, y esta informacin se utiliz para permitir la
transferencia de un nmero igual de clulas T CD8 especficas de antgeno derivados tanto
de tipo salvaje B6 y MHC-II - / - ratones . Las clulas T CD8 purificados se transfirieron por
va intravenosa a naive inmunodeficiente RAG2 - / - ratones, que despus se desafi
con M.bovis BCG. El nivel de infeccin micobacteriana en los pulmones y bazos
de Mycobacterium infectados con RAG2 - / - ratones se determin a 5 semanas despus del
desafo. Las clulas T CD8 de imprimacin por BCG MHC-II - / - ratones ofrecen una
proteccin significativa a RAG2 desafiado-BCG - / - ratones, tanto en los pulmones y el
bazo, y este nivel de proteccin fue incluso mejor que el alcanzado por las clulas T CD8
de imprimacin por BCG C57BL / 6 ratones (Fig. (Fig.7).7). La mejor proteccin
proporcionada por las clulas T CD8 de MHC-II - / - ratones fue probablemente debido a su
mayor capacidad de produccin de IFN- y respuestas secundarias (Fig. (Figura

4c4C y and6).6). Aunque una evaluacin en un punto de tiempo adicional ms all de 5

semanas despus de la exposicin micobacteriana ser til, nuestros datos actuales apoyan
la conclusin de que las clulas T CD8 generan en un entorno de CD4 de clulas T
deficientes son por lo menos tan capaz de proteccin como los generados en un anfitrin de
tipo salvaje (proteccin en un solo punto de tiempo, de 4 a 6 semanas, despus del desafo,
se utiliza tambin con frecuencia en estudios de vacunas como un ndice del potencial de
proteccin de la endgeno o clulas T especficas de antgeno transferidos en cuestin).

FIG. 7.
La proteccin inmune de los ratones inmunodeficientes por las clulas T CD8
adoptivamente transferidas generados en Mycobacteriuminfectados con C57BL
/ 6 de tipo salvaje y MHC-II - / - ratones. B6 y MHC-II - / - ratones fueron infectados
con micobacterias durante 6 semanas ...
Ir:

DISCUSIN
Tipo 1 citocina IFN- inmunolgico juega un papel fundamental en la defensa del husped
antimicobacteriana travs de sus efectos activadores potentes sobre actividades
micobactericidas macrfagos, incluyendo la produccin de NO (2, 22, 27). Aunque las
clulas, incluyendo las clulas T, clulas NK y macrfagos son capaces de producir IFN (6, 24), las clulas T CD4 se cree que son la fuente celular principal de esta citocina
durante la infeccin micobacteriana. Adems de sus actividades citotxicas de linfocitos T,
las clulas T CD8 tambin son capaces de producir IFN- (19). De hecho, estudios
recientes han demostrado claramente que tanto las clulas CD4 y CD8 contribuyen a la
inmunidad contra la infeccin micobacteriana. En este sentido, el papel inmunoprotectora
por las clulas T CD8 es principalmente a travs de su capacidad de producir IFN- y no
sus actividades citotxicas de linfocitos T (3, 10, 11, 20). Sin embargo, ha habido una falta
de estudios que comparan directamente los dos subconjuntos de clulas T por sus
contribuciones relativas a IFN- respuestas durante la infeccin por micobacterias
pulmonar. Adems, an no est completamente entendido si la ausencia de un subconjunto
de clulas T tiene un impacto en las funciones de activacin y efectoras de la

otra (diecisiete - diecinueve). Es particularmente relevante para investigar si se requieren

clulas CD4 para las respuestas primarias y secundarias ptimas de las clulas T CD8. Las
respuestas a estas preguntas pueden mejorar nuestra comprensin de la biologa de las
clulas T y ayudar con el desarrollo de vacunas de micobacterias antipulmonary y
inmunoterapia que pretenden activar las clulas T CD8 en las personas infectadas por el
virus de inmunodeficiencia humana que pueden sufrir diferentes grados de deficiencia de
CD4 de clulas T .
Aunque nosotros y otros han demostrado previamente que las clulas tanto CD4 y / o CD8
T en ratones de tipo salvaje son capaces de la secrecin de IFN- en el curso de la infeccin
micobacteriana, se obtuvo la evidencia de respuestas IFN-gamma en estos subconjuntos de
clulas T principalmente mediante el examen de las poblaciones de clulas mononucleares
totales sin purificar con una sola tcnica, tales como ARNm de deteccin, la inmunotincin
intracelular de citoquinas, o ensayo ELISPOT (7, 16, 23, 25, 29). Tambin se usaron
mtodos similares para examinar respuestas de activacin de clulas T CD8 y IFN-gamma
en ratones CD4 T-clula o MHC-II-deficiente (1, 15, 25, 26). Estos enfoques
lamentablemente slo proporcionan informacin cualitativa y no permiten una evaluacin
cuantitativa y la comparacin. Por ejemplo, porcentajes similares de IFN gamma
secretoras-CD4 y CD8 de clulas T subconjuntos determinados en el total de clulas
mononucleares mediante el uso de citoquina intracelular inmunotincin tcnicas no
muestran si estos subconjuntos de clulas T pueden secretar cantidades similares de IFN- o
si hay nmeros similares de clulas T CD4 y CD8 IFN-? secretoras en el rgano
examinaron. Una evaluacin cuantitativa adecuada implica la purificacin de CD4 y de
clulas T CD8 subconjuntos, el cocultivo de las clulas T purificadas con APCs
micobacteriana-cargadas con antgeno, y el anlisis de las respuestas de IFN- de clulas T
mediante el uso de una combinacin de varias tcnicas para la cuantificacin de la
produccin total de IFN-, las frecuencias de clulas T IFN-? secretoras, y las capacidades
de la secrecin de IFN- sobre una base por clula.
Utilizamos aqu un modelo de infeccin por micobacterias pulmonares con vivas
atenuadas M. bovis BCG y, en diversos momentos despus de la infeccin, se cuantific y
compar las respuestas de IFN- en las clulas CD4 y CD8 de clulas T subconjuntos
purificados cocultured con Mycobacterium infectados con APC mediante el uso de ambas
tcnicas ELISA y ELISPOT para la determinacin de protena total IFN- liberado en
medios de cultivo, las frecuencias de clulas IFN-? secretoras y capacidades de secrecin
de IFN-gamma.Encontramos que las clulas CD4 T en el momento reestimulacin antgeno
son capaces de liberar mucho ms IFN- que en el mismo nmero de clulas T CD8 en
diversos momentos despus de la infeccin micobacteriana. Los niveles ms altos de
produccin de IFN- por las clulas T CD4 son atribuidos tanto a un mayor nmero de

clulas CD4 T especficas de antgeno y a la mayor capacidad de secrecin de IFN- de

estas clulas. Adems, demostr que la falta de clulas T CD4 no afecta negativamente las
respuestas de clulas T primarias o secundarias de IFN- CD8, como se demuestra por la
produccin de IFN- y la frecuencia de las clulas T CD8 IFN-gamma secretoras
especficas de antgeno. Nuestros resultados establecen que mientras que las clulas tanto T
CD4 y CD8 son capaces de IFN- produccin, los primeros representan un mucho mayor
fuente celular de IFN-. Por otra parte, durante la infeccin micobacteriana, la activacin de
clulas T CD8 es independiente de la activacin de clulas T CD4.
De hecho, encontramos que no slo las clulas T CD8 activadas en ausencia de clulas T
CD4 no demostraron una respuesta de IFN- deteriorada pero tambin montado un nivel
algo ms alto de la respuesta de IFN-, sobre todo en momentos posteriores despus de la
infeccin, debido principalmente al aumento de la capacidad de secrecin de IFN-. Estos
hallazgos sugieren que primero activacin de clulas T CD8 en la infeccin micobacteriana
es independiente de las clulas T CD4 y segundo que, tal vez por la compensacin por la
falta de clulas T CD4, clulas T CD8 pueden someterse a un mayor grado de proliferacin
y activacin. En efecto, hemos detectado clulas de dos a tres veces ms esplnicas totales
T CD8 en MHC-II - / - ratones que en los ratones B6 de tipo salvaje en diversos momentos
despus de la infeccin (datos no presentados). Este hecho subraya adems la importancia
de comparar las respuestas de clulas T CD8 en de tipo salvaje y CD4 de clulas T hosts
deficientes mediante el uso de mtodos cuantitativos, es decir, el uso de CD4 y de clulas T
CD8 subconjuntos purificados y mltiples inmunoensayos, como hemos mostrado En el
presente estudio. Aunque los mecanismos de este an no se han comprendido, la falta de
subconjuntos T reguladoras CD4 puede contribuir a la activacin de las clulas T CD8
aumentada (8). Mediante el uso de un modelo de la vacunacin BCG parenteral con ratones
de CD4 deficiente y un mtodo de inmunotincin-IFN intracelular, tambin hemos
observado recientemente una mayor proporcin de clulas CD8 T activadas, aunque tales
clulas CD8 T activadas muestra inicialmente un movimiento retrasado desde linftico de
drenaje los nodos a los sitios sistmicos (25). Cabe sealar que, en el presente estudio, se
hizo posible la comparacin cuantitativa cintica detallada en las respuestas de IFN- de
CD4 y subconjuntos de clulas T CD8 en un modelo mediante el uso de virus vivos
atenuados M. bovis BCG y, debido a algunas diferencias entre BCG y M. la tuberculosis, el
estudio no tena la intencin de examinar completamente los acontecimientos en la
infeccin de tuberculosis pulmonar. En estudios futuros, sera de inters comparar la
activacin de clulas T CD8 tanto en M. bovis BCG y M. tuberculosis infectados con
ratones. Sin embargo, para apoyar nuestras conclusiones actuales, hemos demostrado
recientemente que las clulas T CD8 IFN-gamma-liberacin activados en las clulas CD4 - /
ratones mediante la exposicin BCG fueron capaces de proporcionar robusta
inmunoproteccin desde pulmonar M. tuberculosis desafo (25). Adems, aunque de nuevo

slo se utilizaron los mtodos cualitativos, estudios previos han mostrado tambin que el
porcentaje de clulas T CD8 IFN--positivas en los pulmones o los rganos perifricos de
MHC-II - / - o CD4 - / - ratones fue similar a que en los de tipo salvaje anfitriones despus
de M. tuberculosis infeccin (1, 17, 25). En el presente estudio, hemos demostrado,
adems, que las clulas T CD8 activadas en ausencia de clulas T CD4, despus de la
transferencia adoptiva a inmunodeficientes RAG2 - / - ratones, podran conferir proteccin
contra desafo micobacteriano tanto en el pulmn y en el bazo. De nota, como control, las
clulas T CD8 generados en ratones de tipo salvaje, despus de la transferencia adoptiva,
confirieron proteccin en el bazo pero no en el pulmn. Esto es probablemente debido al
hecho de que, como hemos mostrado, las clulas T CD8 generan en un entorno de CD4
deficientes se someti a un mayor grado de activacin que los generados en un entorno
CD4-eficiente de tipo salvaje y que el nmero de antgeno especfico- las clulas T CD8
transferidos era limitado. Nuestro hallazgo es, de hecho, de acuerdo con un informe de
Feng y Britton que purifica las clulas T CD8 de tipo salvaje anfitriones, despus de la
transferencia a ratones inmunodeficientes, siempre mucho menos proteccin
contra M. bovis desafo BCG en el pulmn que en el bazo (5).
Creemos que nuestros resultados mejoran nuestra comprensin de los mecanismos de
activacin de las clulas T y las contribuciones relativas de CD4 y subconjuntos de clulas
T CD8 para organizar la defensa contra la infeccin por micobacterias. Tal comprensin
ayudar con el desarrollo futuro de las vacunas antimicobacterianos y teraputica.