INTRODUCCIN

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la clula de duplicar el ADN.
FUNDAMENTO
Se trata de una tcnica usada para crear un gran nmero de copias de un segmento
de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento con cebadores y
extensin por una ADN polimerasa termoresistente.
Hasta la dcada de 1980, el nico mtodo para obtener grandes cantidades de un
fragmento de ADN era clonndolo en vectores adecuados e introducindolo y
multiplicndolo en bacterias. En el ao 1985, un investigador norteamericano, Kary
Mullis (acreedor del Premio Nobel en Qumica 1993 por este aporte), desarroll un
mtodo que permite, a partir de una muestra muy pequea de ADN, obtener millones
de copias de ADN in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar clulas
vivas. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), requiere
conocer la secuencia de nucletidos de los extremos del fragmento que se quiere
amplificar. Estas secuencias se usan para disear dos oligonucletidos sintticos de
ADN complementarios a una porcin de cada una de las dos cadenas de la doble
hlice.
REACTIVOS REQUERIDOS
Mix 1x
Primers
dNTP
NH4
MgCl2
H2O
Taq
ADN
Programa

0.8ml
0.8ml
2ml
1ml
13.52ml
0.1ml
19ml carga
2ml

8ml por tubo

8ml por tubo
20ml por tubo
10ml por tubo
135.2ml por tubo
10ml por tubo

29x

95
94
56

5min
30seg
30seg

D15

&

H6
72
72
15

45seg
5min
15min

PROCEDIMIENTO
1. Colocar en hielo los reactivos de PCR (polimerasa taq permance en hielera a
-20C)
2. Pasar al refrigerador tubos de ADN.
3. Realizar clculo de mix de corrida (inculir+1)
4. Pipetear reactivos a tubo de mi (no agregar polimerasa)
5. Pipetear ADN a tubos de PCR
6. Correr programa PCR.
ACTIVIDADES
1. Descubridor/ diseador de la PCR: Kary Mullis.
2. Funcin del MgCl2: La concentracin de magnesio es un factor crucial que
afecta el funcionamiento de la enzima Taq ADN polimerasa. Su carencia
puede inactivar la enzima y su exceso reduce la fidelidad de la enzima y
puede incrementar las uniones inespecficas. Por tales razones resulta
imprescindible determinar la concentracin ptima de esta sal, la cual
generalmente se encuentra en el rango de 1.5 a 3.0 mM.
3. Uso de la pipeta:

a. Se calibra a la cantidad que vamos a utilizar.

b. Se hace una puncin hasta donde tope la primera vez, antes de
someter a la solucin.
c. Enseguida se mete a la solucin y se suelta la puncin.
d. Finalmente se saca y se coloca en el tubo realizando una puncin
fuerte la cual pase la que hicimos primero, para as arrojar el lquido.
4. Qu significa taq y de donde se obtiene? Es una enzima termoestable
obtenida

de Termus aquaticus (Taq), una

bacteria

que

soporta

altas

temperaturas.
CONCLUSIN
En esta prctica pudimos generar un buen conocimiento acerca del uso adecuado
del la tcnica de PCR, ya que de no saber programarlo de una manera correcta, las
pruebas no responderan a resultados correctos, cada uno de los reactivos as como
sus mezclas deben aadirse en cantidades exactas y tiempo correcto de no ser as
los resultados no serian favorables. Es de gran importancia evitar contaminaciones,
ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad
muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Para evitar la
aparicin de resultados falsos negativos, producidos generalmente por errores al
pipetear o presencia de inhibidores, se recomienda emplear controles internos que
compiten con la muestra problema.
Es sencilla de realizar esta prctica solamente es necesario seguir las normas.