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Ingeniera de Fermentaciones
INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE
INGENIERAS CAMPUS GUANAJUATO
INGENIERA FARMACUTICA
INGENIERIA DE FERMENTACIONES
Elaboracin de la penicilina mediante la fermentacin
del Hongo Penicillium Chrysogenum
6FV1
FECHA DE ENTREGA
03/12/2013
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Ingeniera de Fermentaciones
INTRODUCCIN
Un antibitico se conoce como aquel compuesto qumico producido ya sea por hongos o
bacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismos
presentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes que
necesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos del
metabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera un
metabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento
bacteriano. [3-4]
Estructura general del antibitico
El compuesto orgnico principal es el cido 6- aminopenicilnico (6 APA), su frmula
condensada es C16H18N2O4S y su esqueleto se muestra a continuacin:
Figura 1: Estructura Orgnica general de la molcula de penicilinas
Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazoldinico con un anillo - lactmico, y una
parte variable acilada en la posicin 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de
penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molcula.
Imagen extrada de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]
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Se aprecia la ruta biosinttica del compuesto para dar como producto final penicilinas del tipo G y V
Imagen extrada de: Microbiologa General 2008
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Por ltimo, para la separacin del antibitico se utiliza la cromatografa en columna, esta
tcnica permite la separacin de mezclas de sustancias, sus caractersticas y los factores
que en ella intervienen. Generalmente esta tcnica se emplea en la purificacin de
compuestos qumicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestos
inmersos en la mezcla por la fase mvil o estacionaria, estos compuestos son arrastrados
por un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todos
los compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendo
el antibitico de inters, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayor
velocidad que los otros. [1,4]
Presencia de penicilina mediante cuantificacin de susceptibilidad microbiana
Existe una tcnica fundamental dentro de la microbiologa clnica llamada quimioterapia
con antimicrobianos, esta tcnica ha venido jugando un papel vital para el tratamiento de
diversas enfermedades infecciosas en seres humanos. Desde que se desarrollaron
diferentes investigaciones acerca de las colonias microbianas por parte de Alexander
Fleming en 1924, Gerhard Dogmak en 1927 y Selman Waskman en 1932, han surgido
cientos de agentes antimicrobianos, donde algunos han sido sintetizados y unos cuantos
se encuentran disponibles para usos clnicos. Gracias a la gran variedad de agentes
antimicrobianos existentes, podemos diagnosticar con un grado de certeza confiable, los
agentes ms apropiados para el tratamiento de diversos padecimientos a manera
rutinaria. [5-7]
Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversos
antibiticos.
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Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo que
debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayora de los microorganismos aislados.
La indicacin primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibitico ms
apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayora
de los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibitico de amplio
espectro (o una combinacin de antibiticos) hasta obtener resultados acerca de la
identificacin del germen causal de la infeccin. Posteriormente al obtener una respuesta,
puede indicarse un antibitico ms especfico. [2,8]
En este momento existen varios mtodos basados en la biologa molecular que pueden
ser usados para detectar resistencia especfica a varios antimicrobianos, pero su uso de
rutina no est indicado. Estos mtodos son principalmente usados con fines
epidemiolgicos, para monitorear resistencia a antibiticos. [7]
Reactivos
Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3
Etanol al 90
Caja petri con hongo de penicillium cultivado
Tubo con esporas
Ciclohexanona
Solucin acido sulfrico 1 N
Agar PDA
Agar Bacteriolgico
Peptona de Casena
Cloruro de sodio
Penicilina Comercial
Tubo eppendorf con esporas
Cepa de cultivo con Lotto
Cepa de cultivo con E. Coli
Cepa de cultivo con Salmonella
Agua destilada
Equipo
Equipo para filtracin al vacio
Bomba
Bomba peristltica
Fermentador Instrumentado
Microscopio
Autoclave
Refrigerador
Incubadora a 29C
Espectrofotmetro Uv-vis
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Pesar en la balanza
la cantidad
correspondiente de
cada reactivo
Aadir a la solucion
el extracto de
levadura y agitar
Agitar
vigorosamente
efectuando una
disolucion
posteriormente
aadir cada una de
las sales pesadas en
la balanza
Aadir lentamente
la glucosa a la
solucion y agitar
mientras se va
adhiriendo.
Seguir agitando
vigorosamente
nuestra solucion
hasta que todos los
componentes esten
disueltos
Microcultivo
En base a lo observado,
determinar el tipo de
cepa para cada muestra
y su especie.
Observar el hongo al
microscopio utilizando
objetivos 20 x y 40 x
Colocar 2 ml de agua
destilada (no se pudo
efectuar), sellar la caja
e incubarla por 36
horas a 37 C
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Introducir el matraz
con todo y el medio de
cultivo al autoclave
para esterilizar,
asegurando la muerte
de toda bacteria
Meter el medio de
cultivo inoculado a un
conservador durante 4
dias.
Encender el mechero y
destapar el medio de
cultivo, flameando el
boquete del matraz y el
tapon de algodon
Flamear de nueva
cuenta el Aza y todo lo
que se utilizo.
Introducir la porcion
extraida del hongo en
el medio de cultivo,
flameando el boquete
del matraz y la tapa de
algodon, cerrando
nuestro medio.
Esterilizar tanto el
biorreactor como las
fuentes de acido
(H2SO4 1N) y alcali
(NaOH 1N).
Programar el biorreactor
en base a las
condiciones del hongo
penicillium
Chrysogenum y accionar
para comenzar la
fermentacin.
Verter el inoculo al
biorreactor, realizar
este procedimiento
cuidando un ambiente
completamente esteril
para evitar
contaminacin
Ajustar pH y conectar
las fuentes de acido y
alcali a las
alimentaciones
correspondientes.
Dejar el biorreactor
fermentando una semana
y posteriormente realizar
una filtracion para separar
el producto de la biomasa.
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Posteriormente tratar el
caldo por centrifugacion,
colocando en tubo de 50
mL con tapa por 10 min
a 5000 rpm
Colocar el sobrenadante
en un recipiente.
Verter la susbtancia en
un embudo de
decantacion y separar la
fase acuosa de la
organica.
Dejar reposar en el
solvente organico los
primeros 7 dias en una
gabeta, y los otros 6 dias
en refrigeracion
Desechar la fase
organica y colocar la fase
acousa en un vaso de
precipitados para
tratarla posteriomente
Preparar la columna
anionica cromatografica
de intercambio ionico
Lavar la columna
anionica con una
solucion de H2SO4 [1 N],
(realizar calculos previos
para su preparacin)
Rotular un frasco
determinado para
guardar el producto
resultante de la
cromatografia
Tratar el restante de la
fase acuosa pasando la
misma por la columna
cromatografica
Guardar el producto
final en refrigeracion por
un periodo de 2 semanas
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Preparar diferentes
diluciones a distintas
concentraciones de
penicilina comercial
Preparar el equipo de
espectrofotometria Uvvis con tubo blanco a
200 nm
Calibrar el
espectrofotometro
Construir la curva de
calibracion
correspondiente a las
asbrobancias obtenidas
en el espectro
Determinar la
absorbancia para cada
tubo con su
concentracion
Introducir los
diferentes tubos con
las diluciones reaizadas
con la penicilina
comercial
Elaboracin de antibiograma
Pesar las cantidades
correspondientes de cada
reactivo para preparar
medio LB y realizar la
solucion
Esterilizar en autoclave el
material necesario tal:
matraz con agua
destilada, caja petri de
vidrio con discos y matraz
con medio LB
Determinar las
concentraciones de
peniciina presente en el
caldo de extraccion y la
fase acousa de la
decantacion
Verter 15 mL de medio LB a
temperatura ambiente sobre
las 9 cajas petri esteriles,
cuidando que se tenga un
ambiente esteril
Posterior a la inoculacion,
colocar el sensidisco
impregnado con la dilucion
correspondiente y rotular la
localizacion del mismo en la
caja petri
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Resultados y Discusin
Preparacin de 200 mL de medio de cultivo enriquecido
Se utilizaron las siguientes cantidades de cada reactivo:
Tabla 1: Cantidades y reactivos empleados para la elaboracin del medio de cultivo enriquecido
Reactivos
Cantidad (g)
Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3
8
0.6
0.4
0.1
0.1
0.1
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Reactivos
Cantidad (g)
Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3
16
1.2
0.8
0.2
0.2
0.2
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Dilucin
0
1
2
3
4
5
6
7
Concentracin Absorbancia
500
1.218
125
1.005
62.5
1.052
31.25
0.702
7.8125
0.561
3.90625
0.483
1.953125
0.464
0.48828125
0.289
Absorbancia
1.2
1
0.8
Absorbancia
0.6
0.4
Logartmica
(Absorbancia)
0.2
0
0
100
200
300
400
500
600
Concentracin y Dilucin
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Absorbancia
1
0.8
0.6
Series1
0.4
Lineal (Series1)
0.2
0
0
20
40
60
80
Concentracin y Dilucin
Con esta grfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibracin
de la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbancia
realizadas al producto de la cromatografa de penicilina, que fue de 1.886, el resultado
nos otorga una concentracin final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,
que fue de 1.795, el resultado fue una concentracin final de 134.805 mg/mL.
Un factor que puede interferir en la lectura de la absorbancia para la penicilina comercial,
son los excipientes contenidos en este medicamento, en especial la solucin inyectable
que se adjunta en la presentacin del mismo, otorgando valores no solo de la penicilina
sino tambin de los componentes mencionados. [4]
Al comparar los resultados del grafico con varios anlisis estadsticos en minitab, se
elucida que este mtodo es de los ms exactos para la determinacin de un
comportamiento grafico til para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionar
que este tipo de datos resulto indispensable para la determinacin de la concentracin en
productos de penicilina obtenida por la fermentacin, y como las concentraciones tuvieron
un rango de nmeros aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del mtodo de
referencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]
Elaboracin de Antibiograma
Se realizaron 9 antibiogramas en total con tres cepas de diferentes hongos (Lotto, B.
Subtilus y Salmonella) y tres muestras distintas de penicilina (Comercial, sobrenadante y
producto de cromatografa), para comparar ambas y determinar la presencia de penicilina
obtenida despus de la fermentacin.
Las imgenes se aprecian a continuacin:
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Contaminacin
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Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibicin penicilina
sobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella
Contaminacin
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Considerando que cada antibitico tiene un mecanismo de accin diferente, y cuenta con
diferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, se
usaron tres muestras distintas del mismo antibitico, penicilina, aproximando las
concentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de manera
comercial tanto en forma farmacutica, como medicamentos.
Como podemos apreciar en las siguientes imgenes, hubo inhibicin en todos los cultivos
donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el
laboratorio, la mayor inhibicin apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,
posteriormente el producto obtenido de la cromatografa y al ultimo la muestra
sobrenadante. Con los halos de inhibicin obtenidos se corrobora la presencia y
produccin de penicilina en la fermentacin, y se aprecia que la excesiva biomasa
(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtencin del antibitico, sino
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato
Profesora: Diana Ramrez Senz
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de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las
cepas de las imgenes 3 y 6, se observa una inhibicin en el crecimiento de los hongos
enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtencin del antibitico
puro, a tal magnitud de propagarse una combinacin de hongos por invasiones de
espacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibitico impeda
mencionada propagacin, por consiguiente, la afectividad de los antibiticos ayudo a
inhibir una mayor contaminacin en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]
La penicilina es un antibitico que pertenece al grupo de las aminopenicilinas, de manera
general, se sabe que la accin de este tipo de antibiticos, es bactericida, por lo que
actan sobre la pared celular inhibiendo la actividad transpeptidasa de las protenas
enzimticas fijadoras en bacterias. [Fara Reyes & et al., 2000]
Un mecanismo de resistencia a este antibitico, es la disminucin de porinas de la pared
celular, disminuyendo as la permeabilidad, teniendo como consecuencia una inhibicin, la
nica bacteria capaz de inhibir por completo el antibitico, es la Gram (-) Enterobacter,
Lotto y salmonella en cambio fueron las bacterias ms susceptibles ya que muestran
halos de inhibicin ms extensos. [6-8]
Imagen 11: Antibiograma ms llamativo y sobresaliente, halos de inhibicin de la muestra
sobrenadante en la fermentacin de penicilina, a distintas concentraciones en cultivo Lotto
67.4 mg/mL
33.7 mg/mL
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Base de Calculo
Medio PYM de cultivo composicin para 1 L
Reactivo
Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de
Levadura
KCl
MgSO4
FeCl3
0.5
0.5
0.5
0.4
0.4
0.4
0.1
0.1
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