Protocolo de Adsorção

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
LABORATRIO DE TECNOLOGIA ENZIMTICA
SELEO DE SUPORTES E PROTOCOLOS DE

IMOBILIZAO DE LIPASES PARA A SNTESE
ENZIMTICA DE BIODIESEL
Adriano Aguiar Mendes
SO CARLOS
2009

ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
LABORATRIO DE TECNOLOGIA ENZIMTICA

Adriano Aguiar Mendes
Tese de doutorado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica da Universidade
Federal de So Carlos como parte dos
requisitos necessrios obteno do
grau de Doutor em Engenharia
Qumica.
Orientadoras: Profa. Dra. Raquel de
Lima Camargo Giordano e Profa. Dra.
Heizir Ferreira de Castro
SO CARLOS
2009
iii
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitria/UFSCar
M538ss
Mendes, Adriano Aguiar.

Seleo de suportes e protocolos de imobilizao de
lipases para a sntese enzimtica de biodiesel / Adriano
Aguiar Mendes. -- So Carlos : UFSCar, 2009.
194 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de So Carlos,
2009.
1. Tecnologia de enzimas. 2. Imobilizao. 3. Lipase. 4.
Transesterificao. 5. Biodiesel. I. Ttulo.
CDD: 660.634 (20a)
Dedico esta tese de doutorado minha me

Maura e aos meus irmos Andr, Jaqueline e
Aldo Henrique que sempre me deram apoio,
carinho, dedicao, incentivo durante todos
estes anos. Vocs so a razo desta conquista.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo que ele representa em minha vida.

minha me Maura por ter me incentivado sempre a estudar, pelo apoio financeiro e moral,
carinho, incentivo e AMOR. Obrigado por tudo que voc fez por ns, pois sempre lutou e
nunca mediu esforos em nos ajudar.
Aos meus irmos Aldo Henrique, Jaqueline e Andr pelo apoio, carinho, incentivo e palavras
de conforto. Sem vocs, minha vida no teria sentido. Quero agradecer em especial ao meu
irmo, Dr. Andr Aguiar Mendes, meu principal companheiro de vida acadmica.
s minhas orientadoras Profa. Raquel de Lima Camargo Giordano e Profa. Heizir Ferreira de
Castro pelo incentivo, apoio, carinho, confiana, amizade e pela competncia em orientar este
trabalho. Quero agradecer a Profa. Heizir pelo voto de confiana em mim depositado por
continuar a trabalhar com as lipases e por ter me acompanhado desde 2001 na minha carreira
acadmica. Agradeo tambm aos professores Roberto Giordano, Tereza Zangirolami e Paulo
Tardioli pelo apoio e tima convivnvia durante o meu doutorado.
Ao Dr. Jos Manuel Guisn e Dr. Roberto Fernndez-Lafuente do Instituto de Catlisis y
Petroleoqumica ICP/CSIC pelas valiosas contribuies a este trabalho, pela orientao no
estgio realizado em Madrid e pelo carinho, amizade e excelente convivncia.
Aos doutores Jos M. Palomo e Dra. Glria Fernndez-Lorente pelas valiosas contribuies,
ensinamentos e amizade e ao Dr. Benevides Pessela (Beni) e a Maricarmem pelo apoio,
carinho, amizade e a simpatia.
Ao casal Raquel e Francisco e toda famlia Monti pela amizade e apoio, me proporcionando
momentos muito alegres. Vocs so sinnimo de luta e superao.
Aos meus amigos do Departamento de Engenharia Qumica da UFSCar Dasciana, Gesa,
Karolliny, Wellington, Rafael, Aline, Danielle, Cssia, Juliana Teodoro, Carolina (Lora),
Tiago Martins, Andria, Andr (morcego), Adilson, Edson, Any, Juliana, Sandra, Willian e a
Mnica Iemma e Fabiana Batigalhia pela excelente convivncia, amizade, festas e churrascos
e companheirismo. Quero agradecer em especial Danielle Vieira Reis, pela linda amizade
que construmos durante estes dois ltimos anos e que perdurar para sempre, minha grande
vii
amiga e companheira. Agradeo tambm em especial aos amigos Wellington e Dasciana pelas
discusses pertinentes ao meu trabalho, amizade e companheirismo durante estes quatro anos.
Aos meus amigos do Laboratrio de Biocatlise da EEL-USP Ariela, Patrcia, Guilherme,
Gisele, Larissa, Grazielle, Raquel, Mateus, Andr, Renato, Felipe e a Ana Paula pela amizade,
tima convivncia e apoio durante os meses de estgio em Lorena. Aos meus amigos do
Departamento de Biotecnologia da EEL-USP pela amizade e excelente convivncia, em
especial a Jussara e a Larissa Canilha.
Aos amigos Ernandes, Cleide, Michele, Ktia Rocha, Andria, amigos de longa data.
Agradeo em especial, Andria por ter me acolhido em sua casa durante o ltimo estgio em
Lorena e pelo carinho, afeto e pela linda amizade que construmos. Em um dos momentos
mais tristes de minha vida voc e a sua famlia me estenderam a mo. Agradeo tambm
Elaine Braga (Minhoca) pela ajuda e amizade.
Aos meus amigos de So Carlos Maria Carolina, Naiene, Gustavo (Barba), Juliana
Donadone, Camila, Felipe (Pipo), Ana Flora, Simone de Lima, Paulo Tardioli, Flvia, Emilie,
Breno, Eliana (Lili), Carmen, Hel, Alia, Lucimara (Fta) e s famlias Toledo de Pierri
(Karen, Vivian, Jlia e Douglas) e Rodrigues Tognetti (rica, Z, Bruno, Marilza e Beto) pela
amizade, confiana e companheirismo. Vocs fizeram meus dias mais alegres aqui em So
Carlos. Todos vocs so muito especiais para mim. Quero agradecer em especial Maria
Carolina, a pessoa mais importante para mim em So Carlos pela convivncia, quase quatro
anos morando juntos, e forte amizade que construmos durante este perodo.
Aos amigos do Bar Pimenta Alan, Marcelo (Gigante), Maurcio, Thiago, Luiz e Jairo pela
amizade, excelente companhia e por servir o melhor chopp de So Carlos.
Aos amigos Juanma, Palomo, Fernando, Javier, Zaida, Beni, Pilar, Csar Godoy e Csar
Mateo pelo carinho, amizade e as excelentes recreaes durante o estgio em Madrid. Quero
agradecer ao Horcio Falcn pela amizade e por me acolher em Madrid.
s secretrias Alcione, Ktia, Evelyn, Josiane, Thaisa e Claudia pela simpatia e presteza.
Rosana, Lena, Eva, Masa, Silvana, Ivnia e Lu pela simpatia, carinho e amizade.
Novozymes S.A. pela doao das lipases CALB, Lipex 100L e LTL empregadas no
presente trabalho.
FAPESP pelo suporte financeiro e CAPES pela concesso da bolsa durante o estgio na
Espanha.
viii
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo preparar e selecionar derivados imobilizados

de lipases com elevada atividade cataltica e estvel termicamente para mediar a sntese de
biodiesel a partir dos leos de palma e babau pela rota etlica. O trabalho experimental foi
desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, diferentes fontes de lipases incluindo as
lipases de Thermomyces lanuginosus (LTL), Candida antarctica tipo B (CALB), pncreas de
porco (LPP), Bacillus thermocatenulatus (BTL2), Pseudomonas fluorescens (LPF) e Lipex
100L foram imobilizadas em diferentes suportes ativados por diferentes protocolos usando
dois procedimentos de imobilizao, adsoro fsica e ligao covalente multipontual. As
seguintes matrizes foram testadas: agarose, Toyopearl, complexos polieletrolticos de
quitosana, octil-agarose, hexil-toyopearl e PHB e os agentes de ativao testados foram:
glutaraldedo, epicloridrina e glicidol. Como esperado o procedimento de imobilizao,
suporte e fonte de lipase afetaram as propriedades catalticas dos derivados imobilizados e
adequao para mediar a sntese proposta. Com exceo da LPP, todas as preparaes de
lipase (LTL, PFL, Lipex 100L e CALB) mostraram elevada estabilidade em meio alcalino
(72 h em pH 10,05) e resultaram em derivados com elevada atividade hidroltica. As
atividades hidrolticas mais elevadas foram obtidas pela LTL imobilizada em glioxil-agarose,
glioxil-quitosana-alginato-TNBS, epxi-quitosana-alginato e Lipex 100L imobilizada em
epxi-quitosana-alginato e em glioxil-agarose. Na sntese de butirato de butila, as reaes
catalisadas por LTL e LPF imobilizadas em glioxil-agarose e glioxil-amino-toyopearl
apresentaram converses superiores a 65%. As estabilidades trmicas mais elevadas foram
obtidas para BTL2 no-aminada imobilizada em glioxil-agarose 10BCL (FE=2648) e aminada
ix
quimicamente (FE=4360), seguido de CALB aminada imobilizada em glioxil-agarose 6BCL

(FE=290) e LTL imobilizada em glioxil-agarose 6BCL (FE~300). Usando quitosana-alginato,
as estabilidades trmicas mais elevadas foram obtidas para LTL imobilizada em quitosanaalginato-TNBS ativados com grupos glioxil e glutaraldedo (FE=45). A imobilizao de
lipases BTL2, CALB e LTL em suportes hidrofbicos octil-agarose e hexil-toyopearl por
adsoro fsica resultaram em derivados estveis termicamente com elevada atividade
cataltica em reaes de hidrlise. Lipases tambm foram imobilizadas em poli(hidrxibutirato) (PHB) por adsoro fsica e os derivados preparados apresentaram alta
atividade cataltica em meio aquoso e orgnico. Tomando por base as propriedades catalticas
em meio aquoso e orgnico, bem como a estabilidade trmica foram selecionados para mediar
a sntese de biodiesel os derivados de LTL e LPF imobilizados em gis glioxil-agarose e
glioxil-amino-toyopearl e LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS por ativao com
glicidol, derivados preparados das lipases LTL, LPF, Lipex 100L e CALB em PHB. Para as
lipases imobilizadas por ligao covalente multipontual e nas condies testadas, a converso
total em steres de etila foi alcanada entre 24 a 48 h, dependendo do leo vegetal. Para os
derivados preparados por adsoro fsica em PHB, um maior tempo de reao (72 h) foi
necessrio para atingir a converso total em steres de etila. Apesar da elevada atividade de
esterificao, BTL2 imobilizada em PHB no catalisou a reao de etanlise de ambos os
leos vegetais, mas mostrou alta atividade de esterificao. Os valores de viscosidade das
amostras de biodiesel purificadas (3.4-4.5 cSt) atendem as espeficaces recomendadas pela
Agncia Brasileira de Petrleo (ANP) para ser usado como biocombustvel.
Palavras-chave: Suportes, imobilizao, lipases, transesterificao, biodiesel.
ABSTRACT
The objective of this thesis was to prepare and select immobilized lipase
derivatives with high catalytic activity and thermal stability to mediate the biodiesel synthesis
from palm and babassu oils by ethanolic route. The experimental work was carried out in two
steps. In the first, different lipases sources, including lipases from Thermomyces lanuginosus
(TLL),
Candida
antarctica
type
(CALB),
porcine
pancreas
(PPL),
Bacillus
thermocatenulatus (BTL2), Pseudomonas fluorescens (LPF) and Lipex 100L were

immobilized on different supports activated by several protocols using two immobilization
methods, such as physical adsorption and multipoint covalent attachment. The following
matrixes were used: agarose, Toyopearl, chitosan, alginate-chitosan, octyl-agarose, hexyltoyopearl and PHB and activating agents were: glutaraldehyde, epichlorohydrin and glycidol.
As expected the immobilization procedure, support and lipase source affected the catalytic
properties of the immobilized derivatives and their suitability for the proposed reaction. With
an exception of PPL, all lipase preparations (TLL, PFL, Lipex 100L and CALB) showed
high alkaline stability under the immobilization conditions (72 h at pH 10.05) resulting in
immobilized derivatives having high hydrolytic activities. The highest hydrolytic activities
were obtained by TLL immobilized on glyoxyl-agarose, glyoxyl-chitosan-alginate-TNBS,
epoxy-chitosan-alginate and Lipex 100L immobilized on epoxy-chitosan-alginate and
glyoxyl-agarose. Under non-aqueous media using butyl butyrate synthesis as a model system,
TLL and PFL immobilized on glyoxyl-agarose and glyoxyl-amine-toyopearl showed similar
conversions. The highest thermal stability were obtained for non-aminated BTL2 immobilized
on glyoxyl-agarose 10BCL (Stability Factor- SF =2648) and chemically aminated (SF=4360),
xi
followed by aminated CALB immobilized on glyoxyl-agarose BCL (SF=290) and TLL

immobilized on glyoxyl-agarose BCL (SF~300). Using chitosan-alginate, the highest thermal
stability was obtained for TLL immobilized on chitosan-alginate-TNBS activated with
glyoxyl groups and glutaraldehyde (SF=45). The immobilization of lipases BTL2, CALB and
TLL on hydrophobic supports such as octyl-agarose and hexyl-toyopearl by physical
adsorption allowed obtaining thermal stable derivatives. In addition, immobilized derivatives
on poly-(hydroxybutyrate) (PHB) showed high catalytic activity in both hydrolysis and
esterification reactions. In the second step and based on their catalytic properties under both
aqueous and non-aqueous media as well as thermal stabilities the following immobilized
derivatives: TLL and PFL immobilized on glyoxyl-agarose and glyoxyl-amine-Toyopearl,
TLL immobilized on chitosan-alginate-TNBS activated with glyoxyl and glutaraldehyde;
TLL, PFL, Lipex 100L and CALB immobilized by physical adsorption on PHB were
selected to mediate the synthesis of biodiesel from palm and babassu oils. For derivatives
prepared by multipoint covalent attachment and under the conditions used, total conversion in
ethyl esters was achieved within 24 to 48 h, depending on the vegetable oil. For immobilized
derivatives prepared by physical adsorption on PHB, a slight higher reaction time (72 h) was
needed to attain total conversion in ethyl esters. Despite its high esterification activity, BTL2
immobilized on PHB failed to mediate the ethanolysis of both vegetable oils. The viscosity
values for the biodiesel samples (3.4-4.5 cSt) are in accordance with specifications
recommended by the Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel.
Keywords: Supports, lipases immobilization, thermal stablization, transesterification,

biodiesel.
xii
LISTA DE FIGURA
FIGURA 2.1.
Reaes catalisadas pelas lipases...............................................
FIGURA 2.2.
Mecanismo da influncia de tensoativos sobre a atividade

cataltica de lipases.....................................................................
12
Estrutura qumica da resina acrlica Toyopearl AF-Amino650M.........................................................................................
16
FIGURA 2.4.
Estrutura dos biopolmeros quitina, quitosana e celulose..........
19
FIGURA 2.5.
Influncia do pH sobre a estrutura do hidrogel..........................
23
FIGURA 2.6.
Estrutura qumica de quitosana reticulada com glutaraldedo

(A) e epicloridrina (B)................................................................
26
Imobilizao de lipases por adsoro fsica em suportes

hidrofbicos................................................................................
30
Esquema representativo de imobilizao de enzimas em

suportes glioxil...........................................................................
31
Mecanismo de aminao dos grupos carboxlicos da lipase

ativados com EDAC na presena de EDA.................................
35
Esquema representativo de imobilizao de enzimas em

suportes epxi.............................................................................
36
Equao geral de transesterificao de leos e gorduras com

alcois de cadeia curta na sntese de biodiesel...........................
41
Produo de biodiesel por transesterificao alcalina (A) e

enzimtica (B) de leos e gorduras............................................
45
Esquema representativo de preparao dos polieletrlitos de

quitosana.....................................................................................
57
FIGURA 2.3.
FIGURA 2.7.
FIGURA 2.8.
FIGURA 2.9.
FIGURA 2.10.
FIGURA 2.11.
FIGURA 2.12.
FIGURA 3.1.
xiii
FIGURA 3.2.
FIGURA 3.3.
FIGURA 4.1.
FIGURA 4.2.
FIGURA 4.3.
FIGURA 4.4.
FIGURA 4.5.
FIGURA 4.6.
Mecanismo de reao entre TNBS e os grupos amino de

hidrogis de quitosana................................................................
58
Esquema representativo do processo de aminao qumica de

enzimas em fase slida por EDA na presena de EDAC...........
67
Estabilidade alcalina da lipase LPP em tampo bicarbonato

pH 10,05 () e em tampo borato ()........................................
81
Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes

das suspenses de imobilizao das lipases LTL (A), LPF (B),
Lipex 100L (C) e CALB (D) empregando como suporte gel
de agarose ativado por glicidol (), epicloridrina () e
glutaraldedo () em tampo bicarbonato 100 mM pH 10,05
na presena de 0,15% de Triton X-100 a 25 C. Carga de
protena oferecida de 5 mg.g-1 de gel e a atividade da soluo
enzimtica nas condies de imobilizao (soluo controle
()).............................................................................................
84
Perfil de inativao trmica de LTL imobilizada em gel

glioxil-agarose ativado por glicidol (A), epicloridrina (B) e
glutaraldedo (C) a 70 C em tampo fosfato pH 8,0 100 mM..
90

das suspenses de imobilizao de lipase CALB em gel
glioxil sepabeads sem aminao qumica (A) e aminada
quimicamente (B) e em gel glioxil agarose sem aminao
qumica (C) e aminada quimicamente (D) na presena de 1%
de Triton X-100. A imobilizao foi realizada por 24 h em
tampo bicarbonato 50 mM pH 10,05 a 25 C. Atividade da
suspenso () e do sobrenadante ()..........................................
101

das suspenses de imobilizao de lipase BTL2 em gel
glioxil-agarose sem aminao qumica (A) e aminada
quimicamente (B) na presena de 1% de Triton X-100. A
imobilizao foi realizada por 24 h em tampo bicarbonato 50
mM pH 10,05 a 25 C. Atividade da suspenso () e do
sobrenadante ().........................................................................
103
Estabilidade trmica de CALB (A) e BTL2 (B) solveis () e

imobilizadas em glioxil-sepabeads na forma aminada () e
no aminada () e em glioxil-agarose na forma aminada () e
no aminada ().........................................................................
106
xiv
FIGURA 4.7.
FIGURA 4.8.
FIGURA 4.9.
FIGURA 4.10.
FIGURA 4.11.
FIGURA 4.12.
FIGURA 4.13.
FIGURA 4.14.
FIGURA 4.15.
Estabilidade em dioxano (A) e etanol (B) dos derivados de

CALB aminada () e no-aminada () e de BTL2 aminada
() e no-aminada () imobilizada em glioxil-agarose.............
108

das suspenses de imobilizao de lipase LTL imobilizada em
gel quitosana-alginato-TNBS ativado por glicidol (),
epicloridrina () e glutaraldedo () em tampo bicarbonato
100 mM pH 10,05 na presena de 0,15% de Triton X-100 a 25
C. Carga de protena oferecida de 5 mg.g-1 de gel e a
atividade enzimtica nas condies de imobilizao do
controle ().................................................................................
113
Estabilidade trmica da lipase LTL solvel () e imobilizada

em quitosana-alginato-TNBS ativado com glicidol (),
epicloridrina () e glutaraldedo (). A inativao trmica foi
realizada a 70 C em tampo fosfato 100 mM pH 8,0...............
115
Cintica de adsoro do corante hidrofbico Rosa de Bengala

em hidrogis hbridos de quitosana-alginato () e quitosanaalginato-TNBS ().....................................................................
116
Porcentagem de reticulao de hidrogis de quitosanaalginato-TNBS e ativados por diferentes protocolos.................
118
Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL

solvel () e imobilizada em quitosana-alginato-TNBS
ativada com glicidol (), epicloridrina () e glutaraldedo ()..
126
Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL

solvel () e imobilizada em quitosana-alginato-TNBS
ativada com glicidol (), epicloridrina () e glutaraldedo ()..
127
Inativao trmica das enzimas solveis () e dos derivados

preparados de LTL (A) e LPF (B) imobilizados em glioxiltoyopearl ativados por glicidol (), epicloridrina () e
glutaraldedo () incubados a 70 C na presena de tampo
fosfato pH 8,0 100 mM..............................................................
Estabilidade trmica de derivados de LTL imobilizados em
suporte epxi-(A) e tiol-epxi-(B) por 12 (), 24 (), 48 ()
e 72 h () e da lipase solvel ()...............................................
133
136
xv
FIGURA 4.16.
FIGURA 4.17.
FIGURA 4.18.
FIGURA 4.19.
FIGURA 4.20.
FIGURA 4.21.
FIGURA 4.22.
Estabilidade trmica das lipases () solveis e dos ()

derivados de Lipex 100L (A) e de LPF (B) imobilizados por
24 h em suporte epxi-quitosana-alginato.................................
143
Cintica de imobilizao de lipase LTL por adsoro fsica em

suportes hidrofbicos (A) octadecil-sepabeads, (B) hexiltoyopearl e (C) octil-agarose. () atividade hidroltica do
controle, () suspenso e () sobrenadante. Imobilizaes
realizadas em tampo fosfato pH 7,0 5 mM a 25 C com
carregamento de protena de 1 mg.g-1 de gel)............................
145
Cintica de imobilizao de lipase CALB por adsoro fsica

em suportes hidrofbicos (A) octadecil-sepabeads, (B) hexiltoyopearl e (C) octil-agarose. () atividade hidroltica do
branco, () suspenso e () sobrenadante. Imobilizaes
realizadas em tampo fosfato pH 7,0 5 mM a 25 C com
carregamento de protena de 1 mg.g-1 de gel)............................
147
Estabilidade trmica de CALB (A), LTL (B) e BTL2 (C)

solvel () e imobilizadas em octadecil-sepabeads (), hexiltoyopearl () e octil-agarose () a 70 C..................................
148
Rendimento de transesterificao do leo de palma em

biodiesel (smbolos vazios) e reduo da viscosidade
(smbolos cheios) por etanlise do leo de babau catalisada
por LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativada
por glicidol (quadrado), epicloridrina (tringulo) e
glutaraldedo (crculo)................................................................
167
Rendimento de transesterificao (quadrados) e reduo da

viscosidade (crculos) por etanlise do leo de babau
catalisada por lipases (A) CALB, (B) LPF, (C) Lipex 100L e
(D) LTL imobilizadas por adsoro hidrofbica em PHB em
p (cheio) e granular (vazio)......................................................
168
Sntese de steres catalisadas por BTL2 imobilizada em PHB

em p..........................................................................................
171
xvi
LISTA DE TABELA
Mercado mundial de enzimas e aplicao (milhes de

dlares).......................................................................................
Concentrao de protena imobilizada em diferentes resinas

acrlicas comercializadas pela empresa Tosoh Bioscience........
16
Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas

enzimas imobilizadas multipontualmente em glioxil-agarose...
32
Parmetros de imobilizao de enzimas em Sepabeads

monofuncional (epxi) e heterofuncional (epxi-amino)..........
37
Exemplos de produo de biodiesel por transesterificao

enzimtica de leos e gorduras...................................................
48
Principais caractersticas das preparaes de lipases

empregadas.................................................................................
51
TABELA 3.2.
Propriedades dos leos de palma e babau................................
53
TABELA 3.3.
Composio em cidos graxos e massa molecular dos leos de

palma e babau...........................................................................
53
Condies de preparao dos derivados de LTL, LPF, Lipex

100L, LPP, BTL2 e CALB imobilizados por diferentes
protocolos...................................................................................
70
Condies para determinao dos mono-steres de etila

produzidos..................................................................................
77
Influncia do tempo de imobilizao sobre as propriedades

catalticas de CALB, LTL, LPF e Lipex 100L imobilizadas
em gel de agarose 6BCL ativada por diferentes protocolos.
Carga oferecida de 5 mg de protena.g-1 de gel. Atividade
oferecida: LTL (1256 U.g-1 de gel); LPF (1087,5 U.g-1 de gel);
CALB (398,0 U.g-1 de gel); Lipex 100L (1592,5 U.g-1 de
gel)..............................................................................................
86
TABELA 2.1.
TABELA 2.2.
TABELA 2.3.
TABELA 2.4.
TABELA 2.5.
TABELA 3.1.
TABELA 3.4.
TABELA 3.5.
TABELA 4.1.
xvii
TABELA 4.2.
TABELA 4.3.
TABELA 4.4.
TABELA 4.5.
TABELA 4.6.
TABELA 4.7.
TABELA 4.8.
TABELA 4.9.
TABELA 4.10.
TABELA 4.11.
Parmetros de imobilizao da LTL em agarose ativada por

diferentes protocolos, para diferentes cargas enzimticas
oferecidas...................................................................................
93
Parmetros de imobilizao da LPF em agarose ativada por

oferecidas...................................................................................
93
Parmetros de imobilizao da Lipex 100L em agarose

ativada por diferentes protocolos, para diferentes cargas
enzimticas oferecidas................................................................
95
Parmetros de imobilizao da CALB em agarose ativada por

oferecidas...................................................................................
96
Sntese de butirato de butila catalisada por LTL e LPF

imobilizadas em agarose 6 BCL ativada por diferentes
protocolos...................................................................................
98
Parmetros de imobilizao de CALB e BTL2 imobilizadas

em glioxil-agarose e glioxil-sepabeads......................................
104
Influncia do tipo de CPE e da modificao qumica com

TNBS sobre os parmetros de imobilizao da lipase LTL
imobilizada em hidrogis hbridos de quitosana.
Carregamento oferecido de 5 mg protena.g-1de gel (956 U. g-1
de gel).........................................................................................
110
Adsoro de corante hidrofbico Rosa de Bengala e

porcentagem de hidratao (PH) de quitosana-alginato no
modificado e modificado quimicamente com TNBS.................
117
Influncia do tempo de imobilizao e da reduo com

borohidreto de sdio sobre os parmetros de imobilizao de
LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativado por
diferentes protocolos. Carga enzimtica oferecida de 5 mg
protena.g-1 de gel (956 U. g-1 de gel)........................................
121
Influncia da concentrao de laurinaldedo sobre os

parmetros de imobilizao da lipase LTL imobilizada em
quitosana-alginato ativado com glicidol. Carga enzimtica
oferecida de 5 mg de protena.g-1gel (956 U. g-1de gel).............
123
xviii
TABELA 4.12.
TABELA 4.13.
TABELA 4.14.
TABELA 4.15.
TABELA 4.16.
TABELA 4.17.
TABELA 4.18.
TABELA 4.19.
TABELA 4.20.
TABELA 4.21.
Parmetros de imobilizao obtidos para diferentes cargas de

protena oferecida para quitosana-alginato-TNBS ativada por
diferentes protocolos. Atividade enzimtica de LTL de 191,2
U.mg-1 de protena......................................................................
124
Sntese de butirato de butila catalisada por LTL imobilizada

em quitosana-alginato-TNBS ativada por diferentes
protocolos...................................................................................
128
Imobilizao de lipase microbiana LTL em PHB ativado por

protena.g-1 de suporte (atividade oferecida = 956 U.g-1 de
suporte).......................................................................................
128
Imobilizao de LTL em bagao de cana ativado por

protena.g-1 de suporte (atividade oferecida = 956 U.g-1 de
suporte).......................................................................................
130
Parmetros de imobilizao da LTL e LPF em toyopearl

ativado por diferentes protocolos. Carga oferecida de 5 mg de
protena.g-1 de gel. Atividade oferecida: LTL (956 U.g-1 de
gel) e LPF (1087,5 U.g-1 de gel).................................................
131
Parmetros de imobilizao da LTL em amino-toyopearl

ativada por diferentes protocolos, para diferentes cargas
enzimticas oferecidas................................................................
133
Sntese de butirato de butila catalisada por LTL e LPF

imobilizadas em amino-toyopearl ativada por diferentes
protocolos...................................................................................
134
Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxiquitosana-alginato. Carga oferecida de 5 mg de protena.g-1 de

gel. Atividade hidroltica oferecida de 956 U.g-1 de gel............
138
Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxitiol-quitosana-alginato. Atividade hidroltica oferecida de 956
U.g-1 de gel.................................................................................
138
Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxiquitosana-alginato. Atividade hidroltica oferecida de 191,2
U.mg-1 de protena......................................................................
139
xix
TABELA 4.22.
TABELA 4.23.
TABELA 4.24.
TABELA 4.25.
TABELA 4.26.
TABELA 4.27.
TABELA 4.28.
TABELA 4.29.
TABELA 4.30.
Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxitiol-quitosana-alginato. Atividade hidroltica de 191,2 U.mg-1
de protena..................................................................................
140
Parmetros de imobilizao da lipase LPF em hidrogel epxiquitosana-alginato. Atividade hidroltica de 217,5 U.mg-1 de
protena.......................................................................................
141
Parmetros de imobilizao da lipase Lipex 100L em

hidrogel epxi-quitosana-alginato. Atividade hidroltica de
175,6 U.mg-1 de protena............................................................
142
Estimativa do tempo de meia-vida (t1/2) e fator de estabilidade

(FE) de lipases nas formas solvel e imobilizadas em suportes
hidrofbicos................................................................................
149
Parmetros de imobilizao de lipases de diferentes fontes em

PHB em p e granular................................................................
151
Sntese de butirato de butila catalisada por lipases

imobilizadas por adsoro fsica em PHB em p e granular......
153
Rendimento de transesterificao de leo de palma e etanol

por lipases microbianas de Thermomyces lanuginosus (LTL) e
Pseudomonas fluorescens (LPF) imobilizadas covalentemente
em gis glioxil-agarose e glioxil-toyopearl ativados por
diferentes protocolos..................................................................
164
Rendimento de transesterificao de leo de babau e etanol

por lipases microbianas de Thermomyces lanuginosus (LTL) e
Pseudomonas fluorescens (LPF) imobilizadas covalentemente
em gis glioxil-agarose e glioxil-toyopearl ativados por
diferentes protocolos..................................................................
165
Protena imobilizada oferecida na etanlise do leo de babau

e produtividade...........................................................................
170
xx
LISTA DE ABREVIATURA
LTL
Lipase de Thermomyces lanuginosus
CALB
Lipase de Candida antarctica
LPP
Lipase de pncreas de porco
BTL2
Lipase de Bacillus thermocatenulatus
LPF
Lipase de Pseudomonas fluorescens
PVA
lcool poli-vinlico
TNBS
cido 2,4,6 trinitro-benzenossulfnico
LAU
Laurinaldedo
GLI
Glicidol
EPI
Epicloridrina
GLU
Glutaraldedo
EDA
Etilenodiamina
EDAC
1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida
DTT
Ditiotreitol
BSA
Albumina srica bovina
PHB
Poli-(hidrxibutirato)
p-NPB
p-nitrofenilbutirato
AHder
Atividade hidroltica do derivado
PI
Protena imobilizada
AR
Atividade recuperada
RI
Rendimento de imobilizao
t1/2
Tempo de meia-vida
FE
Fator de estabilidade
ANP
Agncia Nacional do Petrleo

xxi
SUMRIO
p
1
INTRODUO..
REVISO BIBLIOGRFICA.........................................................
2.1
Enzimas como Biocatalisadores e suas Aplicaes.........................
2.2
Lipases................................................................................................
2.2.1
Fontes e Propriedades.......................................................................
2.2.2
Reaes Catalisadas pelas Lipases...................................................
2.2.3
Mecanismo de Atuao......................................................................
10
2.3
Imobilizao de Enzimas: Suportes.................................................
13
2.3.1
Resina de Afinidade Toyopearl AF-Amino-650M.........................
14
2.3.2
Poli-Hidrxibutirato (PHB)..............................................................
17
2.3.3
Bagao de Cana-de-Acar...............................................................
18
2.3.4
Quitosana............................................................................................
19
2.3.4.1
Princpio de Formao de Complexos Polieletrolticos de

Quitosana............................................................................................
22
xxii
2.3.4.2
Modificaes Qumicas na Estrutura da Quitosana.......................
24
2.3.5
Agarose...............................................................................................
28
2.4
Protocolos de Imobilizao de Enzimas...........................................
29
2.4.1
Imobilizao por Adsoro Fsica....................................................
29
2.4.2
Imobilizao Covalente Multipontual de Enzimas em Ges

Glioxil.................................................................................................
2.4.2.1
Principais
Fatores
que
Interferem
na
31
Imobilizao
Multipontual de Enzimas..................................................................
32
2.4.3
Imobilizao Multipontual de Enzimas em Suportes Epxi.........
35
2.5
Biocatlise em Meios No-Convencionais.......................................
38
2.6
Sntese de Biodiesel a partir de leos e Gorduras..........................
40
2.6.1
Transesterificao de leos e Gorduras..........................................
43
MATERIAIS E MTODOS.............................................................
51
3.1
Materiais.............................................................................................
51
3.1.1
Enzimas...............................................................................................
51
3.1.2
Suportes e Ativadores........................................................................
52
3.1.3
Substratos...........................................................................................
52
xxiii
3.1.3.1
Atividade Hidroltica e Sntese de steres.......................................
52
3.1.3.2
Materiais de Partida para Sntese de Biodiesel...............................
53
3.2
Metodologia Experimental................................................................
54
3.2.1
Determinao da Concentrao de Protena..................................
54
3.2.2
Determinao das Atividades Hidrolticas......................................
54
3.2.2.1
Hidrlise do p-Nitrofenilbutirato.....................................................
54
3.2.2.2
Hidrlise do Azeite de Oliva Emulsificado......................................
54
3.2.3
Sntese de steres Catalisada por Lipases......................................
55
3.2.4
Estabilidade Trmica (Estimativa do tempo de meia-vida)..........
56
3.2.5
Preparao de Polieletrlitos de Quitosana....................................
56
3.2.5.1
Sntese dos Complexos Polieletrolticos...........................................
56
3.2.5.2
Hidrofobizao dos Polieletrlitos com TNBS................................
57
3.2.5.3
Hidrofobizao
do
Complexo
Polieletroltico
Quitosana-
Alginato com Laurinaldedo.............................................................
58
3.2.6
Protocolos de Ativao dos Suportes...............................................
58
3.2.6.1
Preparao do Gel Gliceril-Suporte Ativado com Glicidol...........
58
xxiv
3.2.6.2
Preparao
do
Gel
Gliceril-Suporte
Ativado
com
Epicloridrina......................................................................................
59
3.2.6.3
Preparao dos Gis Glioxil-Suporte...............................................
59
3.2.6.4
Preparao do Gel Glioxil-Amino-Glutaraldedo...........................
60
3.2.6.5
Ativao
dos
Polieletrlitos
de
Quitosana
com
Glutaraldedo.....................................................................................
3.2.6.6
61
Oxidao do Hidrogel Quitosana-Alginato-TNBS com Periodato

de Sdio...............................................................................................
61
3.2.6.7
Preparao de Epxi-Quitosana-Alginato.......................................
61
3.2.6.8
Preparao de Epxi-Tiol-Quitosana-Alginato..............................
62
3.2.6.9
Quantificao de Grupos Glioxil em Agarose.................................
62
3.2.6.10
Quantificao de Grupos Epxi.......................................................
63
3.2.7
Caracterizao
Morfolgica
dos
Polieletrlitos
de
Quitosana...........................................................................................
63
3.2.7.1
Adsoro de Corante Hidrofbico Rosa de Bengala......................
63
3.2.7.2
Estimativa da Porcentagem de Hidratao.....................................
64
3.2.7.3
Estimativa da Porcentagem de Reticulao no Complexo

Polieletroltico Quitosana-Alginato..................................................
64
xxv
3.2.8
Imobilizao de Lipases por Diferentes Protocolos.......................
3.2.8.1
Adsoro Fsica de Lipases em Suportes Hidrofbicos Octil-
65
Agarose, Hexil-Toyopearl e Octadecil-Sepabeads..........................
65
3.2.8.2
Adsoro Fsica de Lipases em PHB................................................
66
3.2.8.3
Aminao de Lipases Imobilizadas em Octil-Agarose...................
66
3.2.8.4
Protocolo de Imobilizao Multipontual das Lipases Aminadas

CALB e BTL2 em Glioxil-Agarose 10 BCL e GlioxilSepabeads...........................................................................................
3.2.8.5
Imobilizao
Multipontual
de
LPP
em
Glioxil-Agarose
6BCL...................................................................................................
3.2.8.6
68
Imobilizao Multipontual das Lipases em Suportes Glioxil e

Ativados com Glutaraldedo.............................................................
3.2.8.7
67
68
Imobilizao Multipontual das Lipases em Epxi-QuitosanaAlginato...............................................................................................
69
3.2.9
Clculo dos Parmetros de Imobilizao........................................
73
3.2.9.1
Clculo da Concentrao de Protena Imobilizada........................
73
3.2.9.2
Clculo da Atividade Recuperada....................................................
73
3.2.9.3
Clculo do Fator de Estabilidade.....................................................
74
3.2.9.4
Clculo do Rendimento de Imobilizao.........................................
74
xxvi
3.2.10
Caracterizao das Propriedades Bioqumicas da Lipase LTL

Solvel e Imobilizada em Quitosana-Alginato-TNBS....................
74
3.2.10.1
Influncia da Temperatura...............................................................
74
3.2.10.2
Influncia do pH................................................................................
75
3.2.11
Sntese de Biodiesel por Transesterificao Enzimtica................
75
3.2.11.1
Etanlise
do
leo
de
Palma
Catalisada
por
Lipases
Imobilizadas por Ligao Covalente Multipontual........................

3.2.11.2
Etanlise do leo de Babau Catalisada por Lipases

Imobilizadas por Ligao Covalente Multipontual........................
3.2.11.3
75
75
Etanlise do leo de Babau Catalisada por Lipases

Imobilizadas em PHB........................................................................
76
3.2.12
Purificao do Biodiesel....................................................................
76
3.2.13
Quantificao dos Mono-steres de Etila (Biodiesel) Formados

por Cromatografia de Fase Gasosa..................................................
77
3.2.14
Anlise de Viscosidade das Amostras de Biodiesel........................
77
3.2.15
Clculo do Rendimento de Transesterificao...............................
78
3.2.16
Clculo da Produtividade.................................................................
78
RESULTADOS E DISCUSSO.......................................................
79
xxvii
4.1
Imobilizao Covalente Multipontual de Lipases em Suportes

previamente Ativados........................................................................
4.1.1
Suporte Agarose 6BCL: Imobilizao de Lipase de Pncreas de

Porco (LPP) em Gel de Agarose 6BCL...........................................
4.1.2
81
Cintica de Imobilizao e Influncia do Tempo de Imobilizao

de Lipases Microbianas em Gel de Agarose....................................
4.1.2.2
80
Suporte Agarose 6BCL: Imobilizao de Lipases Microbianas

(LTL, LPF, Lipex 100L e CALB)..................................................
4.1.2.1
80
82
Efeito da Concentrao de Protena oferecida sobre as

Propriedades Catalticas dos Derivados de Agarose Ativados
por Diferentes Protocolos..................................................................
4.1.2.3
91
Agarose 6BCL: Influncia do Protocolo de Ativao na

Converso em Butirato de Butila Catalisada por LTL e
LPF......................................................................................................
4.1.3
Suportes Agarose 10BCL e Sepabeads: Influncia da Aminao

Qumica
sobre
as
Propriedades
Catalticas
de
Lipases
Microbianas Imobilizadas.................................................................
4.1.3.1
98
100
Estabilidade Trmica de Derivados de BTL2 e CALB

Imobilizadas em Glioxil-Agarose e Glioxil-Sepabeads: Efeito da
Aminao Qumica Sobre a Estabilizao Trmica dos
Derivados............................................................................................
105
xxviii
4.1.3.2
Estabilidade de Derivados de BTL2 e CALB Imobilizadas em

Glioxil-Agarose Incubados em Solventes Orgnicos: Efeito da
Aminao Qumica e do Tipo de Solvente Sobre a Atividade
Cataltica dos Derivados....................................................................
4.1.4
Imobilizao de Lipase LTL em Complexos Polieletrolticos

(CPE)
de
Quitosana
Hidrofobizados
por
TNBS
Laurinaldedo....................................................................................
4.1.4.1
107
108
Efeito do Tipo de Complexo Polieletroltico, da Modificao

Qumica com TNBS e do Agente de Ativao Sobre os
Parmetros de Imobilizao.............................................................
4.1.4.2
Influncia do Tempo de Imobilizao e Reduo com

Borohidreto de Sdio.........................................................................
4.1.4.3
120
Modificao Qumica do Hidrogel Quitosana-Alginato com

Laurinaldedo....................................................................................
4.1.4.4
108
122
Efeito de Carga Mxima de Protena sobre os Parmetros de

Imobilizao de LTL Imobilizada em Quitosana-AlginatoTNBS...................................................................................................
4.1.4.5
Influncia da Temperatura sobre a Atividade Hidroltica de

LTL
Solvel
Imobilizada
em
Quitosana-Alginato-
TNBS...................................................................................................
4.1.4.6
125
Influncia do pH sobre a Atividade Hidroltica de LTL Solvel e

Imobilizada em Quitosana-Alginato-TNBS....................................
4.1.4.7
123
126
Sntese de Butirato de Butila por LTL Imobilizada em

Quitosana-Alginato-TNBS................................................................
127
xxix
4.1.5
Imobilizao de LTL em Poli-(hidrxibutirato) (PHB) Ativado

por Diferentes Agentes......................................................................
4.1.6
128
Imobilizao de Lipase em Bagao de Cana-de-Acar Ativado

por Diferentes Agentes......................................................................
129
4.1.7
Imobilizao de Lipases em Gel Amino-Toyopearl.......................
131
4.1.8
Imobilizao de Lipases em Suporte Hbrido Epxi-QuitosanaAlginato...............................................................................................
4.1.8.1
135
Influncia do Tempo de Imobilizao Sobre as Propriedades

Catalticas de LTL Imobilizada Covalentemente em Suportes
Monofuncional e Heterofuncional....................................................
4.1.8.2
135
Influncia do Carregamento de Protena sobre as Propriedades

Catalticas dos Derivados de LTL, LPF e Lipex 100L
Imobilizados em Matrizes Epxi......................................................
4.2
Imobilizao de Lipases por Adsoro Fsica em Matrizes

Hidrofbicas.......................................................................................
4.2.1
139
144
Imobilizao de Lipases em Matrizes Hidrofbicas HexilToyopearl, Octil-Agarose e Octadecil-Sepabeads..........................
144
4.2.2
Imobilizao de Lipases por Adsoro Fsica em PHB.................
150
4.3
Seleo
dos
Derivados
Preparados
para
Sntese
de
Biodiesel..............................................................................................
153
xxx
4.4
Etanlise de leos Vegetais Catalisada por Derivados de

Lipases Selecionados..........................................................................
4.4.1
163
Sntese de Biodiesel Catalisadas por Lipases LTL e LPF

Imobilizadas em Matrizes Comerciais Agarose e AminoToyopearl...........................................................................................
4.4.2
Sntese de Biodiesel Catalisada por LTL Imobilizada em

Polieletrlito
Quitosana-Alginato
Hidrofobizado
por
TNBS...................................................................................................
4.4.3
163
166
Sntese de Biodiesel Catalisada por Lipases Microbianas

Imobilizadas em Diferentes Configuraes de PHB......................
167
CONCLUSES.................................................................................
173
RECOMENDAES PARA TRABALHOS FUTUROS.............
177
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
179
xxxi
1. INTRODUO
A crise do petrleo que se instaurou nas ltimas dcadas, aliada ao aumento da

demanda por combustveis e crescente preocupao com o meio ambiente, preconizou a
busca por fontes alternativas de energia no Brasil e no mundo. As pesquisas tm se
concentrado no desenvolvimento de novos insumos bsicos, de carter renovvel, para a
produo de combustveis que possam substituir os derivados de petrleo, o que coloca a
biomassa em uma posio de destaque, em razo da sua natureza renovvel, ampla
disponibilidade, biodegradabilidade e baixo custo (Suarez et al., 2009). A utilizao da
biomassa vegetal fonte de energia renovvel contribui para a reduo da emisso de dixido
de carbono no ar atmosfrico (Antczak et al., 2009).
leos vegetais foram utilizados como combustvel em automveis no incio do
sculo 19 por Rudolph Diesel (Akoh et al., 2007; Antczak et al., 2009). No entanto, a
utilizao direta de leos vegetais como combustvel insatisfatria e impraticvel para uso
em longo prazo devido alta viscosidade e a formao de goma de oxidao, polimerizao e
deposio de carbono (Ranganathan et al., 2008). Os leos vegetais so processados de modo
a adquirir propriedades, tais como viscosidade semelhante aos combustveis fsseis (Ma e
Hanna, 1999).
O mtodo tradicional de produo de energia a partir de leos e gorduras a
transesterificao de leos vegetais com alcois de cadeia curta e o produto obtido, uma
mistura de mono-alquil steres (Akoh et al., 2007) denominado biodiesel (Ranganathan et
al., 2008; Vasudesan e Briggs, 2008; Antczak et al., 2009). Alm dos leos vegetais, o
biodiesel tambm pode ser produzido a partir de outras fontes como gordura animal (sebo
bovino, banha de porco), resduos de leos das indstrias de extrao e restaurantes e leo
microalgal (Vasudesan e Briggs, 2008; Antczak et al., 2009). Os mono-alquil steres
formados apresentam propriedades similares ao diesel convencional e podem ser empregados
eficientemente como substitutos dos combustveis fsseis (Antczak et al., 2009).
As reaes de transesterificao podem ser realizadas por diferentes rotas,
empregando diferentes catalisadores como lcalis, cidos e enzimas, mais especificamente
lipases (Ma e Hanna, 1999; Ranganathan et al., 2008; Vasudesan e Briggs, 2008; Antczak et
al., 2009). A via qumica utiliza preferencialmente catalisadores alcalinos como os hidrxidos
1
de sdio (NaOH) ou potssio (KOH) (Ma e Hanna, 1999). Apesar da excelente produtividade,
a produo global de biodiesel relativamente limitada, principalmente devido aos
inconvenientes tais como a necessidade de aplicao de leos vegetais refinados, problemas
relacionados com a recuperao de puro glicerol e formao de sabes e pigmentos
(Ranganathan et al., 2008). A produo de biodiesel catalisada por lipases, algumas das
desvantagens acima referidas podem ser eliminadas e, portanto, processos enzimticos so
uma promissora alternativa rota qumica (Urioste et al., 2008; Ranganathan et al., 2008).
A sntese de biodiesel um processo em grande escala. Para que a aplicao de
enzimas no setor industrial seja vivel necessrio obter biocatalisadores termoestveis
(Antczak et al., 2009). A imobilizao de enzimas em suportes slidos uma importante
ferramenta para a estabilizao da enzima, pois permite a sua reutilizao e reduz a inativao
por influncia da temperatura e solventes orgnicos, o que pode ser atrativo para o setor
industrial (Lpez-Gallego et al., 2005; Guisn, 2006; Rodrigues et al., 2008). Uma etapa
importante para a obteno destes biocatalisadores a seleo de um suporte e mtodos de
imobilizao que permita obter biocatalisadores ativos e com elevada estabilizao trmica
(Mendes et al., 2008a).
Lipases tm sido imobilizadas em diferentes suportes de natureza orgnica e
inorgnica empregando alguns mtodos de imobilizao tais como adsoro fsica,
encapsulao, ligao covalente ou por reticulao (Dalla-Vecchia et al., 2004). O mtodo de
imobilizao de lipases mais empregado no setor industrial a adsoro fsica em suportes
hidrofbicos (Bornscheuer et al., 2002; Christensen et al., 2003). Este mtodo de imobilizao
de baixo custo, pois no necessria a ativao do suporte e permite fcil reso do suporte
aps vrios reciclos (Secundo et al., 2008).
Durante a ltima dcada, vrios suportes para imobilizao de enzimas por
ligao covalente tambm tm sido investigados com o objetivo de obter derivados
termoestveis e com elevada atividade cataltica, como gis glioxil e resinas epxi (Mateo et
al., 2000; Mateo et al., 2002; Lpez-Gallego et al., 2005; Tardioli et al., 2003a,b; Mendes et
al., 2006; Mateo et al., 2006; Rodrigues et al., 2008; Mendes et al., 2008a,b,c; Adriano et al.,
2008). Estes suportes proporcionam condies ideais para a estabilizao da enzima. Grupos
epxi so muito estveis em pH neutro, mesmo em condies midas, podendo ser
armazenados por longo perodo. Alm disso, estes suportes so capazes de reagir com
diferentes grupos nucleoflicos da enzima tais como amino, hidroxil ou tiol, com mnima
2
modificao qumica da protena (Mateo et al., 2000; Mateo et al., 2003; Torres et al., 2003).
Estes suportes tm sido extensivamente empregados para a estabilizao de enzimas via
ligao covalente multipontual (Mateo et al., 2000; Mateo et al., 2003; Torres et al., 2003;
Mateo et al., 2007a). Imobilizao em suportes glioxil permite tambm obter derivados
termoestveis, decorrente da intensa interao dos resduos lisina da enzima com os grupos
glioxil do suporte (Tardioli et al., 2003a,b; Lpez-Gallego et al., 2005; Mateo et al., 2006;
Adriano et al., 2008). Muitas enzimas tm sido altamente estabilizadas termicamente em gis
glioxil (Mateo et al., 2006).
O objetivo principal deste trabalho foi preparar e selecionar derivados de
lipases termoestveis para aplicao em reaes de transesterificao de leos vegetais de
baixo custo (leos de babau e palma) visando a sntese de biodiesel pela tota etlica. O
enfoque foi baseado no uso de preparaes de lipases oriundas de fontes microbiana de
Thermomyces lanuginosus (LTL), Candida antarctica (CALB), Bacillus thermocatenulatus
(BTL2), Pseudomonas fluorescens e Lipex 100L e animal de pnceras de porco (LPP)
imobilizadas em gis de agarose 6BCL e 10BCL, amino-toyopearl, bagao de cana, poli(hidrxibutirato), sepabeads e epxi-quitosana-alginato monofuncional e heterofuncional por
ligao covalente e em matrizes hidrofbicas octadecil-sepabeads, octil-agarose, hexiltoyopearl e poli-(hidrxibutirato) por adsoro fsica. Levando em considerao estes
aspectos, o objetivo geral do projeto foi alcanado mediante a execuo das seguintes etapas:
Imobilizao das preparaes de lipases por diferentes protocolos e a
determinao dos parmetros de imobilizao (protena imobilizada, atividade hidroltica,
atividade recuperada, fator de estabilizao das enzimas e sntese em meio aquo-restrito de
butirato de butila);
Seleo dos derivados preparados com elevada atividade cataltica em meio
aquoso e orgnico e termicamente estveis;
Sntese de biodiesel por etanlise dos leos de palma e babau catalisada pelos
derivados imobilizados de lipases selecionados.
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1. Enzimas como Biocatalisadores e suas Aplicaes
As limitaes existentes na obteno de produtos e intermedirios de interesse

comercial podem ser associadas aos tipos de catalisadores qumicos empregados, que so
pouco versteis e exigem altas temperaturas para atingir razovel velocidade de reao. Alm
disso, possuindo baixa especificidade, geralmente fornecem produtos de composio qumica
mista, ou produtos contaminados, que requerem uma etapa posterior de purificao (Marchetti
et al., 2007; Ranganathan et al., 2008; Antczak et al., 2009). As enzimas atuam em condies
suaves de temperatura, pH e presso atingindo velocidades de reao bastante superior aos
catalisadores qumicos convencionais, que normalmente so utilizados em condies
extremas de reaes (Krajewska, 2004; Hasan et al., 2006). Este comportamento das enzimas
permite uma reduo no custo final do processo, com a reduo no consumo de energia e
formao de subprodutos indesejveis, devido sua elevada especificidade que resulta em um
maior rendimento do processo, obteno de produtos biodegradveis e reduo da quantidade
de resduos (de Castro et al., 2004).
Nesse contexto, o enfoque biotecnolgico, vem se apresentando como uma
opo interessante para sua explorao em diversos tipos de reaes (de Castro et al., 2004;
Hasan et al., 2006; Marchetti et al., 2007; Ranganathan et al., 2008; Antczak et al., 2009). As
enzimas utilizadas nos setores industriais so quase em sua totalidade produzidas por microorganismos (Sharma et al., 2001; Hasan et al., 2006). A tecnologia enzimtica apareceu como
rea de investigao durante a dcada de 1960, com a imobilizao de enzimas para utilizao
em processos qumicos (Krajewska, 2004). Desde ento, os processos enzimticos tem sido
aplicados em diversos setores, incluindo construo de biossensores, terapia enzimtica,
sntese enzimtica de compostos bioativos, obteno de novos biopolmeros, processos em
indstrias tradicionais como curtumes, papel e celulose, txtil, cosmticos e dentre outras
aplicaes (Hasan et al., 2006).
Para a crescente competitividade da tecnologia enzimtica, a seleo de novas
enzimas e a produo de enzimas recombinantes por tecnologia do DNA recombinante e da
4
engenharia de protenas, permitiram a modificao de propriedades cinticas e de

estabilidade, o desenvolvimento de novas solues ao nvel da tecnologia de reatores
enzimticos e das tcnicas de imobilizao (Guisn, 2006). A utilizao de enzimas vem de
encontro aos pressupostos da chamada Qumica Verde.
De acordo com a reportagem da Business Communications Company Inc. o
mercado global de enzimas para interesse industrial foi estimado em U$ 2 bilhes de dlares
em 2004 (Rajan, 2004). O crescimento no mercado de enzimas de aproximadamente 4-5%
ao ano, acompanhada pela reduo de preo devido ao grande nmero de empresas que vem
comercializando enzimas com preos mais competitivos. O crescimento para os prximos 4
anos tambm est estimado em torno de 3%, com estimativa para este ano de U$ 2,4 bilhes
de dlares para 2009 (Rajan, 2004). A Tabela 2.1. ilustra os principais consumidores de
enzimas e o valor agregado gasto anualmente por estes setores.
Tabela 2.1. Mercado mundial de enzimas e aplicao (milhes de dlares).
Aplicaes
2002
2003
2004
2009
(estimativa)
Crescimento
anual (%)
Tcnicas
978,2
1009,2
1040,0
1222,0
3,3
Alimentos
701,0
720,0
740,0
863,0
3,1
210,8
Rao animal
1890,0
Total
Fonte: Rajan (2004).
215,6
1945,0
220,0
2000,0
267,0
2352,0
3,9
3,3
Este mercado se divide em trs segmentos de aplicao como (i) enzimas

tcnicas, (ii) enzimas utilizadas por indstrias de alimentos e (iii) para alimentao animal. O
mercado consumidor que mais cresce aquele destinado alimentao de animais, em torno
de 4% ao ano. As enzimas destinadas aos setores de alimentos so utilizadas na produo de
xarope de acar invertido e para a produo de compostos aromatizantes (Hasan et al.,
2006). Enzimas tcnicas so utilizadas na formulao de detergentes, produo de papel e
celulose, manufatura de couros e produo de frmacos. Este o principal mercado
consumidor de enzimas, aproximadamente 50% do total de enzimas comercializadas no
mercado. As enzimas mais utilizadas no setor industrial so as proteases, 40% do mercado
enzimas, seguido de carboidrases e lipases (Sharma et al., 2001).
5
2.2. Lipases
Lipases (glicerol ster hidrolases, E.C.3.1.1.3) compreendem um grupo de

enzimas hidrolticas que atuam na interface orgnica aquosa, catalisando a hidrlise de
ligaes ster- carboxlicas de acilgliceris para liberar cidos orgnicos e glicerol, podendo a
reao inversa (sntese) ocorrer em ambientes com baixa concentrao de gua (de Castro et
al., 2004).
A principal aplicao das lipases est relacionada sua atuao como
componente funcional de misturas enzimticas na formulao de detergentes (Sharma et al.,
2001; de Castro et al., 2004; Hasan et al., 2006). A idia da utilizao de lipases neste campo
no nova, mas o grande marco da utilizao de lipases na formulao de sabo em p
ocorreu em 1988, quando a empresa Novozymes lanou no mercado um produto contendo
lipase fngica de Thermomyces lanuginosus denominado comercialmente de Lipolase.
Outros produtos, como o Lumafast (Genencor) e o Lipomax (Gist Brocades), contm
lipases extracelulares de Pseudomonas com estabilidade e atividade adequadas sob as
condies de lavagem (Jaeger et al., 1994).
Na indstria de couro, lipases podem ser empregadas em conjunto com outras
hidrolases para a remoo de gordura subcutnea e pelos (Hasan et al., 2006). Na indstria de
polpa e papel, triglicerdeos e ceras contidas na madeira na remoo do pitch que dificultam
o processo de produo de papel podem ser removidos pelo emprego de lipases (Jaeger e
Reetz, 1998). Alm disso, as lipases podem ser empregadas na produo de frmacos,
cosmticos, alimentos, perfumaria, diagnsticos mdicos, sntese de compostos opticamente
ativos, resoluo de racematos, produo de aromas e fragrncias e modificaes de lipdeos
para a produo de biodiesel (Sharma et al., 2001). Atualmente, a utilizao de lipases para a
produo de biodiesel tambm representa um campo de vasta aplicao para estas enzimas,
sendo essa aplicao objeto do presente projeto.
2.2.1. Fontes e Propriedades
As lipases so comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a

partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Inicialmente, eram obtidas a partir do
pncreas de animais e usadas como auxiliar digestivo para consumo humano (Kazlauskas e
Bornscheuer, 1998; de Castro et al., 2004). Em funo do baixo rendimento do processo
fermentativo, as lipases microbianas tinham tambm um custo bem mais elevado quando
comparado com outras hidrolases, como proteases e carboxilases. Entretanto, os recentes
avanos registrados na tecnologia do DNA, tm permitido aos fabricantes de enzimas colocar
no mercado lipases microbianas com uma alta atividade a um custo acessvel, empregadas
principalmente na formulao de detergentes, indstrias de papel e celulose, alimentos e
qumica (Hasan et al., 2006).
As enzimas produzidas por fermentao microbiana so em sua maioria
extracelulares, fato que facilita os processos de extrao e purificao e conferindo maior
estabilidade. A produo de enzimas por via microbiana permite fcil controle das condies
de cultivo e pode ser realizada em escala industrial com baixos custos. O rpido crescimento
celular um outro fator importante na produo de enzimas dessa fonte (Jaeger et al., 1999).
As lipases microbianas so produzidas por diversas indstrias, como Novozymes, Amano,
Gist Brocades, entre outras. Uma publicao de 1998 sobre a disponibilidade comercial de
lipases listou enzimas de 34 diferentes fontes microbianas, incluindo 18 a partir de fungos e 7
de bactrias (Jaeger e Reetz, 1998).
Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20
a 75 KDa, atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a ambiente
at 70 oC. Lipases so usualmente estveis em solues aquosas neutras temperatura
ambiente, apresentando, em sua maioria, uma atividade tima na faixa de temperatura entre
30 e 40 C (Vulfson, 1994).
2.2.2. Reaes Catalisadas pelas Lipases
As lipases catalisam uma srie de diferentes reaes, como ilustrado na Figura

2.1 (de Castro et al., 2004). Alm de clivar as ligaes ster de triacilgliceris com o consumo
de molculas de gua (hidrlise), as lipases so tambm capazes de catalisar a reao reversa
sob condies microaquosas, como por exemplo, a formao de ligaes ster, a partir de um
lcool e cido carboxlico (Yahya et al., 1998; de Castro et al., 2004). Estes dois processos
bsicos podem ser combinados numa seqncia lgica para resultar em reaes de
interesterificao (acidlise, alcolise e transesterificao), dependendo dos reagentes de
partida empregados (Hasan et al., 2006). Lipases de diferentes fontes so capazes de catalisar
a mesma reao, embora possam diferir no desempenho sob as mesmas condies reacionais
(Yahya et al., 1998).
A modificao enzimtica de lipdeos foi dramaticamente desenvolvida nos
ltimos 30 anos, a partir de uma simples idia de laboratrio, no incio, e atualmente uma
realidade industrial. Vrias empresas tm organizado seus esforos para explorar a utilizao
de enzimas em diferentes setores da indstria. At agora, mais de 10 empresas internacionais
empregam a tecnologia enzimtica para o desenvolvimento de produtos e da produo
industrial (Xu, 2003). Importantes indstrias do setor qumico como a BASF, com sede em
Ludwigshafen na Alemanha e com vrias filiais em diversos pases do mundo, inclusive no
Brasil, empregam lipases, especificamente de Candida antarctica, em processos de largaescala na resoluo de aminas e lcoois quirais para a sntese de intermedirios de frmacos e
agrotxicos, com produo anual superior a 2000 toneladas/ano (Bornscheuer et al., 2002).
Figura 2.1. Reaes catalisadas pelas lipases.

Fonte: de Castro et al. (2004).
Outros produtos como substitutos da gordura do leite materno (HMFS),
anlogos da manteiga de cacau (CBE), compostos aromatizantes, di- (DAG) e
monoacilgliceris (MAG), cidos graxos poliinsaturados concentrados e precursores de
frmacos tambm so produzidos em escala industrial empregando lipases como
biocatalisador (Xu, 2003; Bickerstaff, 2009). Estes avanos so atribudos, em grande parte,
ao estudo da aplicao de lipases em meios no-convencionais. Tradicionalmente, este tipo de
enzima (hidrolase) empregado na hidrlise de triacilgliceris. Sob estas condies, ocorre
somente a hidrlise, que pode ser aplicada para um nmero reduzido de biotransformaes de
lipdeos. Embora a hidrlise de lipdeos seja conhecida h dcadas, antes da descoberta de
possveis utilizaes de enzimas em meios no-convencionais, nenhuma aplicao industrial
tinha sido realmente empregada. Em 1984, Zaks e Klibanov publicaram um artigo, relatando
9
que lipases poderiam ser utilizadas em meios aquo-restritos. Este trabalho foi importante na
histria das enzimas, pois permitiu investigar uma grande variedade de aplicaes potenciais
de lipases em meios no aquosos.
A aplicao de lipases nestas reaes pode ser realizada devido (i) elucidao
das estruturas tridimensionais das enzimas pela engenharia de protenas; (ii) estudo do
mecanismo de reao de lipases (ativao interfacial); (iii) utilizao da engenharia gentica
na produo de enzimas recombinantes e (iv) adoo de mtodos de imobilizao da enzima
(de Castro et al., 2004).
2.2.3. Mecanismo de Atuao
As lipases so definidas como glicerol ster hidrolases (EC 3.1.1.3) que

hidrolisam acilgliceris de cadeia longa, ou seja, com cadeia acila com mais de 10 tomos de
carbono. Enzimas que apresentam a capacidade de hidrolisar apenas acilgliceris de cadeia
com menos de 10 carbonos so classificadas, genericamente, como esterases (Verger, 1997).
A diferena entre lipases e esterases tambm tem sido feita pela especifidade
preferencial dessas duas enzimas. Os substratos naturais para lipases so triacilgliceris
constitudos de cidos graxos de cadeia longa (ligaes steres trplices), enquanto esterases
atuam sobre mono-steres, liberando cidos graxos de baixa massa molecular (Brockman,
1984). Deve-se enfatizar, que a maioria das lipases podem hidrolisar os substratos de
esterases, enquanto o inverso no verdadeiro (Jaeger et al., 1999).
As reaes lipolticas ocorrem na interface gua-lipdeo, podendo em alguns
casos impedir que as cinticas das reaes enzimticas sejam descritas pelas equaes do tipo
Michaelis-Menten, as quais s so vlidas se a reao cataltica ocorrer em fase homognea
(Sharma et al., 2001). Substratos lipolticos usualmente formam um equilbrio entre os
estados monomricos, micelares e emulsificados, resultando na necessidade de um modelo de
sistema adequado ao estudo da cintica de lipase. Nos estados monomricos, as lipases so
incapazes de agir, pois os lipdeos se encontram solveis no meio aquoso. O fenmeno mais
conhecido nos estudos cinticos recentes de reaes lipolticas a ativao interfacial, a
qual relaciona o aumento da atividade da lipase em funo de substratos insolveis
10
emulsificados (Verger, 1997; Jaeger e Reetz, 1998; Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002).
A determinao da estrutura tridimensional das lipases de Mucor miehei e da
lipase pancretica humana, propiciou uma explicao para o fenmeno da ativao interfacial:
o stio ativo destas enzimas encontra-se sob uma tampa hidrofbica ou lid que ao interagir
com a interface lipdeo/gua sofreria uma mudana conformacional, expondo o stio ativo. A
presena dessa tampa na estrutura da enzima e a propriedade de ativao interfacial passaram
a ser fatores determinantes para a caracterizao de lipases (Verger, 1997; Bastida et al.,
1998; Palomo et al., 2002). Recentemente, revelou-se que a presena da tampa no est
necessariamente correlacionada com a ativao interfacial. Lipases de origem microbiana
(Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Candida antarctica B) e a lipase
pancretica humana no mostraram ativao interfacial, embora apresentem uma tampa
anfiflica sobre seus stios ativos. Esta observao sugere que a presena de uma tampa
hidrofbica sobre o stio ativo e a ativao interfacial no so critrios adequados para
classificar uma enzima como a lipase. Portanto, a definio atual bastante simples: uma
lipase uma carboxil-esterase que catalisa a hidrlise de acilglicerol de cadeia longa (Jaeger e
Reetz, 1998).
Uma das principais dificuldades na compreenso do mecanismo de hidrlise
a dependncia da atividade das lipases das propriedades fsicas da emulso, ou seja, a
disposio de substratos lipolticos lipase (Brockman, 1984). O uso de substratos solveis
em gua, tais como o p-nitrofenilpalmitato (p-NPP), cuja hidrlise rpida e pode ser
acompanhada espectrofotometricamente, no , contudo, o mais adequado para a
determinao da atividade da lipase, devido interferncia de esterases (Erdmann et al.,
1990). O mtodo mais utilizado para determinar a atividade das lipases a titulao dos
cidos graxos formados pela hidrlise do triglicerdeo, em geral, a triolena, produzidos numa
emulso estabilizada com um agente tensoativo (Soares et al., 1999; Foresti e Ferreira, 2007;
Andrewes et al., 2007). Apesar do efeito dos agentes emulsificantes em lipases no ter sido
extensivamente estudado, a goma arbica o agente tensoativo mais utilizado, conduzindo
elevada atividade lipoltica (Verger, 1997). Os tensoativos inicos no so empregados em
hidrlises de lipdeos, quando se utiliza o mtodo titrimtrico como mtodo analtico, pois
podem deslocar o equilbrio inico.
Entre os tensoativos no inicos, o Triton X-100 o mais empregado em
ensaios de hidrlise de triglicridios (Palomo et al., 2005; Fernndez-Lorente et al., 2007). O
11
uso de tensoativo para estabilizar emulses na determinao de atividade lipoltica, deve ter
em conta que a atividade da lipase varia tanto em funo do tipo de tensoativo, como da sua
concentrao (Fernndez-Lorente et al., 2007). A lipase na ausncia de tensoativos ou
interface orgnica se encontra na conformao fechada, como ilustrado na Figura 2.2
(Fernndez-Lorente et al., 2007).
Figura 2.2. Mecanismo da influncia de tensoativos sobre a atividade cataltica de lipases.

Fonte: Fernndez-Lorente et al. (2007).
Com a adio de tensoativo, o equilbrio deslocado para a conformao
aberta, atingindo mxima atividade cataltica. No entanto, o aumento da concentrao de
tensoativo, acima da sua concentrao micelar crtica (CMC), pode inibir a atividade da
enzima decorrente da forte interao do tensoativo com o stio ativo da enzima, podendo
distorcer a sua estrutura ativa (Fernndez-Lorente et al., 2007). A adio de tensoativos pode
alterar as propriedades catalticas da lipase por dois mecanismos: o primeiro a interao do
tensoativo com o stio cataltico da enzima que pode inibir competitivamente e reduzindo a
afinidade da enzima pelo substrato (aumento do valor de Km) e o outro o deslocamento do
equilbrio para a sua conformao aberta que promove um aumento da velocidade mxima
(Vmx) da enzima (Fernndez-Lorente et al., 2007). O efeito dos tensoativos sobre a atividade
hidroltica das lipases (ativao ou inibio) particularmente importante na indstria de
detergentes, onde as lipases so usadas na remoo de lipdeos (Xia et al.,1996).
12
2.3. Imobilizao de Enzimas: Suportes
Nos ltimos anos, a utilizao de enzimas na indstria cresce sensivelmente

devido s vantagens frente aos catalisadores qumicos como elevada atividade cataltica,
especificidade por determinado substrato e elevada atividade em condies brandas de
temperatura e presso (Sharma et al., 2001; Hasan et al., 2006). A grande desvantagem da
utilizao de enzimas na forma solvel a sua separao para posterior aplicao, assim como
a contaminao do produto desejado, pois enzimas so compostos solveis em gua (LpezGallego et al., 2005; Guisn, 2006). A imobilizao consiste no confinamento da enzima em
um suporte slido para posterior reutilizao do biocatalisador, tornando o processo menos
oneroso (Guisn, 2006). As principais vantagens obtidas pelo processo de imobilizao so: o
aumento da estabilidade trmica do biocatalisador, aplicao em reatores com maior controle
do processo, podendo ser usadas elevadas concentraes de enzimas, permitindo a sua
reutilizao sem perda significativa da sua atividade cataltica (Lpez-Gallego et al., 2005;
Guisn, 2006). As principais desvantagens deste processo so: alterao da conformao
nativa da enzima, custo do suporte e perda de atividade durante o processo de imobilizao
(Arroyo, 1998).
Enzimas podem ser imobilizadas de muitas maneiras, isto , podem ser imersas
em gel ou microcpsulas; podem ser adsorvidas em materiais insolveis como resinas de troca
inica; podem ser copolimerizadas com algum monmero; podem se ligar a uma matriz
polimrica insolvel e ainda por ligaes covalentes (Villeneuve et al., 2000; Dalla-Vecchia
et al., 2004).
A seleo do mtodo de imobilizao deve ser baseada em parmetros como
atividade global do derivado, caractersticas de regenerao e inativao, custo do
procedimento de imobilizao, toxicidade dos reagentes de imobilizao e propriedades finais
desejadas para a enzima imobilizada (Malcata et al., 1990).
As principais caractersticas a serem observadas na seleo de um suporte para
uma determinada aplicao so: rea superficial, permeabilidade, insolubilidade, capacidade
de regenerao, morfologia e composio, natureza hidroflica ou hidrofbica, resistncia ao
ataque microbiano, resistncia mecnica, custo e outras. Eles podem ser classificados como
orgnicos e inorgnicos e tambm podem ser classificados conforme sua morfologia como
13
materiais porosos, no-porosos e de estrutura de gel (Dalla-Vecchia et al., 2004).

Os materiais porosos tm grande rea superficial interna disponvel para a
imobilizao de enzimas, onde a enzima fica protegida dos efeitos de turbulncia externa.
Como a maior parte da rea disponvel para a imobilizao est na estrutura interna, deve-se
atentar para que o dimetro do poro seja suficientemente grande para acomodar a enzima e
permitir o acesso do substrato (Dalla-Vecchia et al., 2004).
Os materiais no-porosos eliminam a resistncia de massa interna, mas
apresentam baixa rea superficial disponvel ligao da enzima. Este problema pode ser
parcialmente superado pela utilizao de partculas finas ou fibras, porm, outras dificuldades
surgem quando se utilizam partculas muito finas, como por exemplo, alta queda de presso e
baixas vazes para operao em reatores contnuos.
Os polmeros naturais e sintticos so uma classe de suportes muito
importantes no campo da imobilizao de biocatalisadores (Mateo et al., 2000; Mateo et al.,
2002; Mateo et al., 2006; Mateo et al., 2007). Os polmeros sintticos exibem variedades de
formas fsicas e estruturas qumicas que podem ser combinadas para formar um suporte ideal,
porm os polmeros naturais levam algumas vantagens quando comparados aos sintticos,
pois geralmente apresentam baixo custo e so facilmente degradveis no causando danos ao
meio ambiente (Dalla-Vecchia et al, 2004). Dentre os diferentes suportes empregados na
imobilizao de enzimas podem ser destacados os suportes orgnicos naturais agarose e
hidrogis de quitosana ou polieletrlitos de quitosana com biopolmeros naturais e resinas
acrlicas comerciais (polmeros sintticos) Toyopearl e Sepabeads visto pelo grande nmero
de trabalhos publicados (Mateo et al., 2000; Palomo et al., 2002; Mateo et al., 2002; LpezGallego et al., 2005; Tardioli et al., 2003a,b; Torres et al., 2003; Mendes et al., 2006; Mateo et
al., 2007a,b; Mendes et al., 2008a,b,c; Rodrigues et al., 2008; Adriano et al., 2008).
2.3.1. Resina de Afinidade Toyopearl AF-Amino-650M
A empresa Tosoh Bioscience com sede no Japo e com filiais na Alemanha e

Estados Unidos comercializam resinas acrlicas de afinidade chamadas Toyopearl com
diferentes propriedades para processos de separao e purificao de compostos orgnicos,
14
normalmente protenas (www.tosohbioscience.com). Estas resinas apresentam diferentes

grupos qumicos em sua estrutura com o objetivo de se ligarem em diferentes grupos reativos.
Estas resinas so hidroflicas, com alta porosidade para que possa acomodar protenas de alta
massa molecular, aproximadamente 1000 de dimetro de poros, e dimetros de partculas
da ordem de 40-90 m, com aplicaes em escalas laboratorial e industrial. Elas podem ser
empregadas na sntese de peptdeos e oligonucleotdeos devido sua excelente estabilidade
em diferentes solventes orgnicos e em condies extremas de pH. De acordo com o catlogo
informativo fornecido pela Tosoh Bioscience, estas resinas so divididas em trs classes;
resinas ativadas que no necessitam de reagentes qumicos para a estabilizao do complexo
resina/ protena; resinas especficas que possuem mecanismos de ligao distintos (quelao e
adsoro) e resinas reativas que necessitam destes agentes na estabilizao do complexo.
Resinas ativadas Toyopearl AF-Tresil-650M e Toyopearl AF-Epxi-650M
possuem em sua estrutura cerca de 20 moles de grupos tresil e 100 moles de grupos
epxi.mL-1 de resina mida. Estas resinas sofrem ataque nucleoflico de grupos amino e tiol
de protenas ideais na imobilizao de protenas, carboidratos e glicoprotenas. Resinas
especficas Toyopearl AF-Quelato-650M, Toyopearl AF-Blue HC-650M e Toyopearl AFRed-650M so bastante empregadas na purificao de polimerases, ciclases, transferases e
albumina. Resinas reativas so representadas por Toyopearl AF-Carbxi-650M, Toyopearl
AF-Formil-650M e Toyopearl AF-Amino-650M. Estas resinas possuem alta densidade de
grupos reativos em sua estrutura e tambm so empregadas em processos de purificao e
separao de diferentes protenas, conforme mostrado na Tabela 2.2.
Estas resinas se ligam covalentemente aos grupos reativos da enzima e
requerem agentes qumicos para estabilizar as ligaes AF-Formil-650M e AF-Amino-650M
que necessitam de cianoborohidreto de sdio para reduzir as bases de Schiff (ligaes iminas)
aps reao covalente com a protena para a obteno de um derivado inerte e AF-Amino650M e AF-Carbxi-650M necessitam de carbodi-imida.
15
Tabela 2.2. Concentrao de protena imobilizada em diferentes resinas acrlicas

comercializadas pela empresa Tosoh Bioscience.
PI
AF-Tresil- AF-Formil- AF-Amino- AF-Carbxi(mg.mL-1 de gel)
650M
650M
650M
650M
Inibidor de Tripsina de Soja
16,0
3,50
5,80
15,0
Concanavalina A
13,0
-Quimotripsina
12,5
Mioglobina
12,4
Ovalbumina
2,50
6,70
0,80
Albumina de Soro Bovina
12,4
14,0
19,2
3,30
Imunoglobulina Humana
10,0
15,0
6,70
11,7
Lisozima
60,0
20,0
5,80
17,5
PI: Protena Imobilizada (mg.mL-1 de gel).
Fonte: www.tosohbioscience.com
A resina AF-Amino-650M possui cerca de 90 moles de grupos amino.mL-1 de
resina mida e dimetro de partcula e poro de 6500 e 1000 , respectivamente, e estabilidade
em uma ampla faixa de pH (2-13), condies ideais em processos de imobilizao de enzimas
(www.separations.us.tosohbioscience.com). Este suporte apresenta tambm grupos hidroxilas
que podem ser importantes no processo de imobilizao, como mostrado na Figura 2.3.
Figura 2.3. Estrutura qumica da resina acrlica Toyopearl AF-Amino-650M.

Diferentes agentes de ativao como glicidol e epicloridrina reagem
preferencialmente com os grupos hidroxila, produzindo gis glioxil e os grupos amino podem
reagir com glutaraldedo, um agente bifuncional bastante empregado em tcnicas de
imobilizao, o que torna interessante o uso desta resina como matriz de imobilizao de
enzimas. Outra importante caracterstica a sua elevada capacidade de adsorver corantes
hidrofbicos (rosa de bengala), mostrando ter carter hidrofbico (Mendes et al., 2008a). De
acordo com a literatura, o uso desta resina no processo de imobilizao de lipases no
relatado. Apesar de suas excelentes propriedades, este suporte apresenta um custo bastante
elevado, US$ 530,00 o frasco contendo 100 mL de resina, tornando invivel a sua aplicao
em biotransformaes em escala industrial.
16
2.3.2. Poli-Hidrxibutirato (PHB)
Poli-hidrxibutirato (PHB), um derivado da famlia dos poli-hidrxialcanoatos

(PHA) so polisteres estruturalmente simples, sintetizados por muitos micro-organismos
como substncias naturais de reserva de carbono e de energia (Squio e Arago, 2004). So
acumulados pela clula microbiana em forma de grnulos, podendo chegar at 90% em massa
seca (Kai et al., 2003). Estes biopolmeros so produzidos em condies de crescimento no
balanceadas proporcionadas pela limitao de um nutriente, entre outros, como fonte de
nitrognio e fsforo e excesso da fonte de carbono (Squio e Arago, 2004). Mais de 100
monmeros diferentes j foram identificados como constituintes de PHA sintetizados por
organismos naturais ou recombinantes, o que demonstra a grande diversidade de PHA que
podem ser produzidos (Kai et al., 2003; Squio e Arago, 2004). Entre os PHA mais estudados
e produzidos industrialmente, esto o poli-hidrxibutirato (PHB) e o poli-hidrxibutirato-cohidrxivalerato (PHB-co-HV) (Kai et al., 2003).
Na literatura so reportadas diversas linhagens empregadas na produo de
poli-hidrxialcanoatos, especialmente PHB, tais como Ralstonia eutropha que tem sido
utilizada na produo industrial, por apresentar elevada produo e em alto rendimento do
biopolmero. Entretanto, a linhagem original (Alcaligenes eutrophus H16) s utiliza alguns
tipos de acares e, embora espcies mutantes (R. eutropha DSM 545, Alcaligenes eutrophus
NCIMB 11599) possam crescer em glicose, no podem hidrolisar sacarose. Outro
microorganismo com grande potencial para a produo industrial Burkholderia sacchari,
isolado de solo de canavial brasileiro (Squio e Arago, 2004).
O PHB pode ser utilizado como matria-prima em um amplo campo de
aplicaes, como embalagens para produtos de limpeza, higiene, cosmticos e alimentos
(Squio e Arago, 2004). Tambm servem para produzir sacos descartveis, vasos para
crescimento de mudas, brinquedos e material escolar. Alm disso, por serem biocompatveis
podem ser empregados na rea mdico-farmacutica em fabricao de fios de sutura, prteses
sseas, suportes de culturas de tecidos para implantes e encapsulao de frmacos para
liberao controlada (Kai et al., 2003; Squio e Arago, 2004). Este material apresenta alta
cristalinidade e hidrofobicidade (Kai et al., 2003). Por se tratar de um material biodegradvel
e de carter hidrofbico, torna-se um material promissor na imobilizao de enzimas,
17
especificamente lipases (Mendes et al., 2008d). Porm a sua aplicao como matriz para a
imobilizao de enzimas ainda no relatada na literatura.
2.3.3. Bagao de Cana-de-Acar
Os lignocelulsicos so os materiais orgnicos mais abundantes da biosfera,

representando aproximadamente 50% da biomassa vegetal (Cunha et al., 2005) e podem ser
usados como matria-prima em processos industriais para a produo de alimentos,
combustveis, insumos qumicos e bens de consumo diversos (Latif e Rajoca, 2001). O Brasil,
com sua grande extenso territorial, apresenta alto potencial de explorao de recursos
renovveis para a gerao de diversos insumos. Um resduo abundante no pas e proveniente
de material renovvel o bagao de cana-de-acar, pois o Brasil o maior produtor mundial
de cana-de-acar com uma produo estimada de aproximadamente 570 milhes de
toneladas no ano de 2008, segundo dados do Ministrio da Agricultura (Ministrio da
Agricultura - Brasil, 2008).
A indstria sucroalcooleira produz cerca de 250-280 kg de bagao por tonelada
de cana moda o que correspondeu a uma produo de bagao de aproximadamente 140
milhes de toneladas no ano de 2008 (Ministrio da Agricultura - Brasil, 2008). Grande parte
deste resduo utilizado pela prpria usina como fonte de energia (Cunha et al., 2005).
Embora o bagao possa ser utilizado para a gerao de energia ou como suplemento em rao
animal, ainda h um grande excedente que pode ser empregado para a produo de diversos
bens sociedade. Algumas alternativas para sua utilizao como matria-prima so a
produo de etanol, hidroximetilfurfural, papel e celulose, revestimentos acsticos, madeira
prensada, enzimas e xilitol (Cunha et al., 2005). Outra aplicao do bagao a sua utilizao
como matriz no processo de imobilizao de enzimas. Na literatura relatada a aplicao de
vrios resduos lignocelulsicos tais como fibra de coco verde (Brgida et al., 2007), palha de
arroz (Freitas et al., 2003) e celulignina (Prez et al., 2007) na imobilizao de lipases. Porm,
o uso de bagao de cana-de-acar ainda pouco explorado.
18
2.3.4. Quitosana
A quitosana a forma desacetilada da quitina, o segundo polmero mais

abundante na natureza, depois da celulose (George e Abraham, 2006). um produto natural,
de baixo custo, renovvel e biodegradvel, de grande importncia econmica e ambiental. As
carapaas de crustceos so resduos abundantes e rejeitados pela indstria pesqueira, que em
muitos casos as consideram poluentes. Sua utilizao reduz o impacto ambiental causado
pelo acmulo nos locais onde gerado ou estocado. Este biopolmero possui uma estrutura
molecular quimicamente similar celulose, diferenciando-se somente nos grupos funcionais
(Krajewska, 2004). Grupos hidroxil (OH) esto dispostos na estrutura geral dos
biopolmeros, mas a principal diferena entre eles a presena de grupos amino (NH2) na
estrutura da quitosana. Este biopolmero solvel em meio cido diludo, formando um
polmero catinico, com a protonao do grupo amino (NH3+), que confere propriedades
especiais diferenciadas em relao s fibras vegetais (Berger et al., 2004). A Figura 2.4
mostra a estrutura qumica dos biopolmeros celulose, quitina e quitosana.
Figura 2.4. Estrutura dos biopolmeros quitina, quitosana e celulose.

A quitina frequentemente obtida de exo-esqueletos de crustceos como, por
exemplo, de caranguejo e camaro. O biopolmero adicionado em uma soluo aquosa fria
de HCl 2% para a remoo de compostos minerais como carbonato de clcio. Em seguida,
realizada a hidrlise alcalina a quente em soluo aquosa de NaOH 5% (m/m) para a
remoo de protenas. Aps esta etapa, obtm-se a quitina com um grau de acetilao
superior a 50% (Gupta e Jabrail, 2006). Para a obteno da quitosana, a quitina desacetilada
com soluo de NaOH a 50% (m/m) a 60 C (Krajewska, 2004). O grau de desacetilao da
19
quitosana controlado por esta etapa, podendo atingir total desacetilao empregando
hidrlise alcalina em etapas consecutivas.
Na etapa de desacetilao alcalina, parte das ligaes N-acetil da quitina
rompida com formao de unidades de D-glucosamina que contm um grupo amino livre.
Entretanto, a quitosana no uma macromolcula quimicamente uniforme, apresentando
diferentes graus de desacetilao. Acima de 30% de desacetilao, o material j pode ser
considerado quitosana, sendo que as aplicaes e caractersticas dessa macromolcula
dependem fundamentalmente do grau de desacetilao e tamanho da cadeia polimrica
(Berger et al., 2004). Este biopolmero tem trs tipos de grupos reativos funcionais, um grupo
amino na posio C-2 e duas hidroxilas, uma primria e outra secundria, nas posies C-3 e
C-6, respectivamente (Li e Bai, 2005). solvel em diversos cidos orgnicos e inorgnicos
diludos (Kumar, 2000).
A maioria das indstrias que produzem quitina e quitosana em escala comercial
est localizada no Japo, onde mais de 100 bilhes de toneladas de quitosana so
manufaturadas por ano, a partir de carapaas de caranguejo e camaro (Tsigos et al., 2000).
Nestas indstrias, a quitosana produzida a partir da quitina via processo termoqumico por
hidrlise alcalina que promove a desacetilao da quitina, normalmente com NaOH (40-50%
m/m) a 110-115 C. Entretanto, os principais fatores que afetam o grau de desacetilao e,
consequentemente, as caractersticas da quitosana obtida so a temperatura e tempo de reao
e concentrao da soluo de lcali, razo quitina/lcali, tamanho das partculas da quitina e
presena de agentes que evitem a despolimerizao (Campagna-Filho e Signini, 2001).
Para produzir 1 kg de quitosana 70% desacetilada a partir de carapaas de
caranguejo, so necessrios 6,3 kg de HCl, 1,8 kg de NaOH, 0,5 t de gua para o processo e
0,9 t de gua de resfriamento (Kumar, 2000).
So diversas as aplicaes da quitosana, entretanto verifica-se uma
centralizao para uso na purificao de gua, no processamento de alimentos e na quelao
de ons metlicos (Kumar, 2000; Krajewska, 2004). A quitosana atua como floculante e
coagulante nos processos de tratamento de efluentes industriais e tambm pode ser utilizada
na remoo de petrleo proveniente de derramamentos no mar, contribuindo na soluo de
um dos grandes problemas ambientais (Kumar, 2000). No tratamento de efluentes industriais
com elevados teores de metais pesados, a quitosana age como agente quelante na remoo de
metais pesados e resduos, devido presena de diferentes grupos funcionais, que podem ser
20
usados para aumentar a eficincia de remoo de ons metlicos. O grupo funcional NH2 da
quitosana de grande interesse devido habilidade de formar ligaes coordenadas
covalentes com ons metlicos. Trabalhos tm sido realizados na remoo de metais pesados,
como cobre, chumbo, cdmio e mercrio (Li e Bai, 2005).
Tambm tem sido utilizada para a obteno de produtos de alto valor agregado,
como cosmticos, agentes de liberao controlada de frmacos no organismo, aditivos
alimentares, membranas semipermeveis e produtos farmacuticos (Kumar, 2000; Krajewska,
2004; Altun e Cetinus, 2007).
Na indstria qumica, a quitosana largamente utilizada para aplicaes em
cosmticos, por sua natureza fungicida (Krajewska, 2004), na produo de filmes
fotogrficos, por sua resistncia abraso, caractersticas pticas e facilidade de obteno de
filmes (Kumar, 2000), na indstria papeleira, aumentando a resistncia mecnica e a
impermeabilidade do papel e tambm na curtio e acabamento de artefatos de couros
(Krajewska, 2004).
Outra importante aplicao de quitosana sua aplicao em imobilizao de
enzimas (Krajewska, 2004; Berger et al., 2004; Chiou e Wu, 2004; de Oliveira et al., 2006;
Altun e Cetinus, 2007). De acordo com a literatura, diversas enzimas de diferentes fontes so
imobilizadas para diferentes aplicaes (Chiou e Wu, 2004; de Oliveira et al., 2006; Altun e
Cetinus, 2007). Sua aplicao como suporte para a imobilizao de enzimas se deve s suas
diferentes configuraes geomtricas como p, escamas, hidrogis, membranas, fibras e
outras. Os biopolmeros quitina e quitosana so comercializados pela empresa Sigma-Aldrich
nas formas em p e escamas e em forma de hidrogel (Chitopearl), comercializada pela
empresa japonesa Fuji Spinning Co. Ltda (Krajewska, 2004). Na literatura, so relatados
tambm diferentes tipos preparao de quitosana, nas formas de membranas, capsulas, fibras e
esponjas sintetizadas por diferentes procedimentos, alterando as propriedades fsicas do
polissacardeo para aumentar a sua estabilidade e durabilidade (Krajewska, 2004). Esta
estratgia permite obter um suporte apropriado para os diferentes procedimentos de
imobilizao. Uma outra propriedade importante a presena de diferentes grupos funcionais,
grupos hidroxila e amino, que permitem a utilizao de diferentes mtodos de imobilizao
(Chiou e Wu, 2004).
Devido sua baixa estabilidade em pH cido, diversas alternativas so
propostas para aumentar sua estabilidade como reticulao com agentes bifuncionais para a
21
formao de gis mais resistentes ou a aplicao de outros biopolmeros como carragenina,

gelatina e alginato. Estas tcnicas tm sido utilizadas para diversas aplicaes como liberao
controlada de frmacos e como suporte para a imobilizao de enzimas (Berger et al., 2004;
Adriano et al., 2008).
2.3.4.1. Princpio de Formao de Complexos Polieletrolticos de Quitosana
Hidrogis so estruturas polimricas tridimensionais, hidroflicas, capazes de

adsorverem grandes quantidades de gua ou fluidos biolgicos. Estas matrizes so insolveis
em gua devido presena de pontos de reticulao qumica ou fsica (Berger et al., 2004).
Este fato se deve aos grupos ionizveis presentes na estrutura dos biopolmeros como grupos
amino, carboxlicos e hidroxilas que possuem afinidade com a molcula de gua. Os hidrogis
tm uma vasta aplicao no campo biomdico e farmacutico como sistemas de liberao
controlada de frmacos (Berger et al., 2004; Gonalves et al., 2005). Uma vez que os
hidrogis podem ser preparados com uma vasta gama de tamanhos de poros eles podem ser
utilizados tanto na liberao de frmacos de pequena massa molecular como, por exemplo,
agentes anti-inflamatrios, antisspticos e solutos de elevada massa molecular, como
protenas, fatores de crescimento, entre outros (Kumar, 2000). Os hidrogis podem ser
constitudos de um ou mais biopolmeros (Berger et al., 2004).
De acordo com a literatura, a quitosana um dos principais compostos
empregados na sntese de hidrogis, como tambm alginato, carragenina, gelatina e outros
(George e Abraham, 2006). Os complexos polieletrlitos de quitosana so formados com o
objetivo de obter hidrogis mais versteis, com diferentes estruturas qumica e fsica, o que
pode melhorar sua atuao em uma determinada aplicao (Berger et al., 2004). Uma outra
importante aplicao dos hidrogis na imobilizao de enzimas para diversas aplicaes,
principalmente no desenvolvimento de biossensores (de Oliveira et al., 2006). Sua estrutura
mantida por interaes inicas ou covalentes. As ligaes inicas so fortemente
influenciadas pelo pH do meio reacional, influenciando tambm na capacidade de reteno de
gua no hidrogel. A Figura 2.5 mostra a influncia do pH sobre a estrutura do hidrogel
(Berger et al., 2004).
22
Figura 2.5. Influncia do pH sobre a estrutura do hidrogel.

Fonte: Berger et al. (2004).
Se o pH decresce, ocorre a protonao dos grupos amino da quitosana,
resultando na repulso eletrosttica e enfraquecimento da resistncia mecnica e qumica do
hidrogel. A concentrao de gua no hidrogel aumentada consideravelmente porque em
meio cido o grau de inchamento favorecido (Berger et al., 2004). Em sistemas de liberao
controlada de frmacos foi observado que, em meio cido esta liberao facilitada devido
maior difuso dos frmacos nos poros do hidrogel (Gonalves et al., 2005). Em meio
fortemente cido ocorre total dissoluo do hidrogel. Com o aumento do pH do meio
reacional, a protonao da quitosana decresce e tambm reduz a interao entre os polmeros
que formam a estrutura do hidrogel. Neste meio, os grupos carregados negativamente como,
por exemplo, grupos carboxlicos, se encontram na forma inica e os grupos amino da
quitosana se encontram desprotonados. Em altos valores de pH, a liberao controlada de
frmacos menor se comparada com o meio cido porque o grau de inchamento do hidrogel
23
inferior. A molcula de gua interage mais facilmente com os grupos amino protonados para a
formao de ons hidroxnio. Em pH prximo da neutralidade, h equilbrio entre as cargas
do hidrogel que promove interao mxima entre os grupos ionizveis, proporcionando maior
estabilidade ao gel.
Diferentes compostos so utilizados, juntamente com a quitosana, para a
formao de hidrogis de complexos polieletrolticos tais como gelatina, alginato,
carragenina, entre outros. Alginato um polissacardeo extrado de algas marrons. A estrutura
qumica do alginato constituda por polmero linear do cido L-gulurnico e do cido Dmanurnico (George e Abraham, 2006). Este polissacardeo tem sido utilizado como veculo
para a liberao de frmacos e protenas, juntamente com a quitosana, complexo quitosanaalginato. O complexo quitosana-alginato formado por interaes inicas entre os grupos
carboxlicos do alginato e os grupos amino da quitosana (Tapia et al., 2004). A elevada
solubilidade da quitosana minimizada na presena de alginato, pois este biopolmero
insoluvel em pH cido e em pH alcalino facilmente solubilizado, o que no observado para
a quitosana. Deste modo, o complexo polieletroltico quitosana-alginato pode ser utilizado em
uma ampla faixa de pH (George e Abraham, 2006).
No intuito de aumentar a estabilidade qumica e fsica dos hidrogis de
quitosana e de complexos polieletrolticos, diversas alternativas tm sido utilizadas. Dentre
elas, a modificao qumica do hidrogel empregando agentes bifuncionais a mais utilizada
(Li e Bai, 2005; de Oliveira et al., 2006; Mendes et al., 2006; Altun e Cetinus, 2007). Esta
modificao apresenta diversas vantagens, vantagens estas estudadas no presente trabalho,
objetivando aumentar o grau de hidrofobicidade de complexos polieletrolticos para a
imobilizao de lipases para posterior aplicao em meio orgnico.
2.3.4.2. Modificaes Qumicas na Estrutura da Quitosana
Diferentes mtodos de tratamento so utilizados para modificar quimicamente

a quitosana e um dos principais mtodos a reticulao. Este processo tem como objetivo
melhorar a resistncia mecnica, alterar a hidrofobicidade, biocompatibilidade e estabilidade
qumica para diversas finalidades (Li e Bai, 2005; Mendes et al., 2006).
24
A modificao da estrutura qumica da quitosana necessria para a obteno

de quitosana quimicamente mais resistente ao meio cido e reduo da capacidade de reteno
de gua. As principais reaes envolvidas por meio dos grupos amino ou as hidroxilas da
quitosana so aquelas que empregam agentes bifuncionais. Esta reao pode ser realizada
homogeneamente, adicionando-se o agente bifuncional soluo de quitosana, ou
heterogeneamente, com a adio do agente quitosana nas formas de membranas e esferas
(Monteiro e Airoldi, 1999; Desai et al., 2006).
Esta modificao pode ser realizada com diferentes espcies qumicas, tais
como epicloridrina, glutaraldedo, glioxal, formaldedo e outros, formando uma estrutura
bastante complexa, estruturas estas relatadas na literatura (Li e Bai, 2005; de Oliveira et al.,
2006; Mendes et al., 2006; Altun e Cetinus, 2007). A Figura 2.6 mostra uma representao
esquemtica da quitosana reticulada com glutaraldedo (A) e epicloridrina (B). A reao
ocorre por meio do ataque nucleoflico dos grupos amino da quitosana ao grupo carbonila do
glutaraldedo, tambm observado quando se utiliza glioxal e formaldedo (Altun e Cetinus,
2007). A reao da epicloridrina (1-cloro-2,3-epxipropano) ocorre nos grupos hidroxila da
quitosana com a clivagem da ligao epxido presente na estrutura da epicloridrina e
liberao de um tomo de cloro (Fangkangwanwong et al., 2006).
A ligao covalente entre os grupos amino e aldedo terminal do glutaraldedo
irreversvel e resiste a valores extremos de pH e temperatura. Diferentes mecanismos so
propostos para explicar a reao de glutaraldedo com a quitosana. Monteiro e Airoldi (1999)
propuseram o mecanismo como sendo uma interao dos grupos amino livres da quitosana
com o grupo aldedo do glutaraldedo formando Base de Schiff (ligao imina). Reaes
paralelas podem ocorrer entre quitosana e o glutaraldedo. Para interpretar este
comportamento, trs hipteses so consideradas: (i) formao de uma base de Schiff entre o
grupo aldedo com o grupo amino da quitosana. O outro grupo aldedo livre seria utilizado
para a uma determinada reao de interesse (grupo reativo); (ii) a reticulao formada entre
uma molcula de glutaraldedo e duas unidades de grupo amino, resultando na formao de
duas bases de Schiff e (iii) a reticulao formada tambm por mais de uma molcula de
glutaraldedo, devido sua polimerizao em determinadas condies, por exemplo, em altos
valores de pH. Aps a polimerizao, ocorre a reticulao dos grupos amino da quitosana.
25
Figura 2.6. Estrutura qumica de quitosana reticulada com glutaraldedo (A) e epicloridrina
(B).
O mecanismo de reao da epicloridrina com quitosana tambm bastante
similar ao glutaraldedo, no entanto, este agente de reticulao reage preferencialmente com
os grupos hidroxilas da quitosana (Fangkangwanwong et al., 2006). Estas reaes podem ser
efetuadas entre grupos hidroxilas de duas molculas de quitosana (reticulao intermolecular)
ou reagir somente com um grupo hidroxila e o grupo epxido livre seria utilizado para a uma
determinada reao de interesse (grupo reativo).
importante caracterizar as condies de reticulao porque a eficincia desta
reticulao diretamente proporcional s variveis: concentrao e tipo de agente de
reticulao, tempo de contato, temperatura, pH, massa molecular da quitosana e o seu grau de
desacetilao (Berger et al., 2004). O tempo de contato e a concentrao de agente de
reticulao so importantes para a determinao da natureza da estrutura produzida porque o
aumento do tempo de reao e o uso de altas concentraes geram extensas reticulaes. O
grau de desacetilao e a massa molecular so importantes parmetros porque os aumentos da
massa molecular e do grau de desacetilao tambm resultam em um maior rendimento de
reticulao. Este efeito tambm pode prejudicar a difuso de macromolculas como protenas
nos interstcios do hidrogel devido formao de poros de pequenos dimetros (Gupta e
Jabrail, 2006). O processo de reticulao reduz reaes paralelas sobre a estrutura da
quitosana como, por exemplo, a reao de ruptura do anel glicosdico por ao de agentes
26
oxidantes como o on periodato (Vold e Christensen, 2005). Os grupos amino acetilados da

quitosana impedem a reao de clivagem do biopolmero, reduzindo a solubilidade do
hidrogel. Em suma, a reao de reticulao importante porque impede a ruptura na molcula
da quitosana permitindo a obteno de um hidrogel mais estvel fsica e quimicamente.
Os hidrogis formados por quitosana e os complexos polieletrolticos
reticulados, como discutidos anteriormente, so caracterizados por serem molculas estveis,
devido s ligaes covalentes serem irreversveis. Eles exibem maior resistncia mecnica por
reduo de efeito de dissoluo em extremas condies de pH, comportamento este no
observado para hidrogis sem reticulao. Entretanto, muito dos agentes de reticulao
utilizados so prejudiciais sade, devido sua alta toxicidade. Os hidrogis formados por
reticulao devem ser isentos de agentes de reticulao no reagidos e requerem diversas
etapas de lavagem. Por exemplo, glutaraldedo um composto neurotxico e o glioxal um
agente mutagnico. Outro agente de reticulao bastante utilizado o cido oxlico, mas
estudos mostram toxicidade em ratos (Berger et al., 2004). Novos agentes de reticulao vm
sendo utilizados na sntese de hidrogis com melhores propriedades, dentre eles a genipina.
Este composto um agente bifuncional extrado do jenipapo e bastante utilizado na
medicina chinesa e tambm como corante de alimentos. Estudos mostram a sua
biocompatibilidade com o organismo humano e ratos (Mi et al., 2002).
Mesmo com estas desvantagens, alguns trabalhos mostram a aplicao de
hidrogis reticulados com glutaraldedo e epicloridrina na sntese de biossensores (de Oliveira
et al., 2006) e na produo de blendas que podem ser utilizadas como bandagem na
regenerao de tecido epitelial e liberao controlada de frmacos em ambientes cidos
(Berger et al., 2004). Os hidrogis sem reticulao no possuem toxicidade, ideais para estas
finalidades, mas a sua baixa estabilidade restringe em algumas vezes a sua aplicao. A
utilizao de hidrogis reticulados como suporte de imobilizao de lipases para processos de
biotransformao de leos e gorduras uma importante alternativa porque as reaes de
biotransformao so realizadas em meio aquo-restrito e o controle de gua no gel um
importante parmetro para esta finalidade. A aplicao destes hidrogis como suporte para a
imobilizao de enzimas vem sendo desenvolvida no Laboratrio de Tecnologia Enzimtica
da Universidade Federal de So Carlos como suporte alternativo aos disponveis
comercialmente como agarose e resinas epxi (Mendes et al., 2006; Rodrigues et al., 2008;
27
Adriano et al., 2008). O seu custo reduzido e a disponibilidade de seus grupos funcionais
tornam a quitosana um suporte promissor para a imobilizao de enzimas.
2.3.5. Agarose
A agarose uma mistura de molculas de gar com um contedo menor de

cargas e, portanto com maior capacidade de gelificao e com as seguintes propriedades: (i)
pouca quantidade de grupos eletronegativos (fundamentalmente sulfatos e cido pirvico)
resultando num polissacardeo bastante inerte e adequado para tcnicas cromatogrficas; (ii)
fcil dissoluo aquosa; (iii) excelente transparncia ptica tanto nas regies de espectro
visvel quanto na regio do ultravioleta, que permite uma melhor quantificao por tcnicas
espectrofotomtricas; (iv) estrutura macroporosa, na qual possvel variar o tamanho do poro;
(v) fcil ativao e derivatizao do suporte e (vi) ausncia de toxicidade (Mateo et al., 2006).
A agarose um biopolmero bastante utilizado na separao de molculas de cidos nucleicos
de diferentes tamanhos (Adkins et al., 2006). A eletroforese em gel de agarose uma das
ferramentas mais utilizadas para a verificao da qualidade (pureza e quantidade) de DNA ou
RNA de uma amostra, assim como para a purificao destes cidos nucleicos. Nesta, o DNA
de interesse separado dos demais contaminantes (outras molculas de DNA de diferente
tamanho). A baixa resistncia a altas temperaturas pode ser superada pelo entrecruzamento
entre as molculas do polmero com epicloridrina. Altos graus de entrecruzamento implicam
maior resistncia mecnica e reduo do tamanho dos poros. um dos suportes mais
utilizados na imobilizao de enzimas. Diversas publicaes relatadas na literatura mostram a
aplicao deste suporte para a imobilizao multipontual de enzimas de diversas procedncias
(Guisn, 1988; Blanco e Guisn, 1988; Alvaro et al., 1990; Fernndez-Lafuente et al., 1995;
Tardioli et al., 2003a,b; Palomo et al., 2004; Mateo et al., 2006; Mendes et al., 2008a,b,c;
Rodrigues et al., 2008; Fernndez-Lorente et al., 2008).
28
2.4. Protocolos de Imobilizao de Enzimas
O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tem sido importante para

proporcionar a reutilizao das enzimas, facilitar a separao dos produtos e aumentar a
estabilidade de enzimas na presena de solventes orgnicos. Na literatura, muitos mtodos so
descritos e utilizados para contornar os possveis problemas de instabilidade e otimizar as
vrias aplicaes (Villeneuve et al., 2000; Dalla-Vecchia et al., 2004). Em reaes qumicas e
bioqumicas, o uso de enzimas pode ser dispendioso e seu descarte aps o uso
economicamente invivel. Lipases tm sido imobilizadas em diferentes suportes de natureza
orgnica e inorgnica empregando diferentes mtodos de imobilizao tais como adsoro
fsica ou hidrofbica, confinamento em matrizes polimricas ou encapsulao em membranas
polimricas, ligao covalente pelo uso de agentes multifuncionais ou por reticulao (DallaVecchia et al., 2004). No presente trabalho, os mtodos de adsoro hidrofbica e ligao
covalente foram empregados na imobilizao de lipases e as principais caractersticas destes
mtodos so relatadas.
2.4.1. Imobilizao por Adsoro Fsica
Nas reaes conduzidas em meio orgnico no so requeridas fortes interaes

entre a enzima e o suporte (Secundo et al., 2008). Nestas condies, a enzima insolvel no
meio apolar e a adsoro fsica pode ser um mtodo bastante vantajoso (Secundo et al., 2008).
Este mtodo de imobilizao de baixo custo, pois no necessria a ativao do suporte e
permite fcil reuso do suporte aps vrios reciclos (Secundo et al., 2008).
A imobilizao de lipases por adsoro fsica normalmente realizada em
suportes hidrofbicos devido ao seu carter hidrofbico, como mostrado na Figura 2.7 (Mateo
et al., 2007b). Esta enzima sofre ativao interfacial na presena de interface hidrofbica e a
regio do stio ativo interage por adsoro hidrofbica com o suporte. Lipases possuem uma
cadeia polipeptdica chamada de lid ou tampa hidrofbica que cobre seu stio ativo e em
meio aquoso o seu stio ativo inacessvel ao substrato (conformao fechada) (Verger, 1997;
29
Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002; Palomo et al., 2003). Na presena de uma superfcie
hidrofbica, o equilbrio deslocado para a conformao aberta. Neste caso, a lipase
fortemente adsorvida matriz hidrofbica e reconhece esta matriz similarmente aos seus
substratos naturais (gota de leo) imobilizando a enzima sob a conformao aberta.
Figura 2.7. Imobilizao de lipases por adsoro fsica em suportes hidrofbicos.

Fonte: Mateo et al. (2007b).
Lipases imobilizadas em matrizes hidrofbicas so disponveis comercialmente
e normalmente em matrizes orgnicas. Dentre estes derivados destacam-se a lipase de
Candida antarctica tipo B (CALB) imobilizada em resina poliacrlica com o nome comercial
de Novozym 435, o biocatalisador mais empregado em reaes de biotransformao de
lipases em meios aquo-restritos, lipase de Mucor miehei imobilizada em resina de troca
aninica macroporosa (Lipozyme-IM) comercializada pela Novozymes e a empresa Roche
tambm comercializa esta preparao de lipase com o nome comercial de Chirazyme
(Christensen et al., 2003). Entretanto, estes biocatalisadores so de alto custo, associado ao
preo das matrizes hidrofbicas. O uso de matrizes de baixo custo para a imobilizao de
lipases tem sido extensivamente empregado e demonstra ser uma alternativa bastante
promissora na insero de lipases em processos em escala industrial. Suportes hidrofbicos
mais utilizados em imobilizao de lipases so casca de ovo (Vemuri et al., 1998),
filossilicatos (Iso et al., 2001), bentonita (Yesiloglu, 2005) e polipropileno (Bosley e Peilow,
1997). Outros suportes hidrofbicos de baixo custo como poli-(hidrxi-butirato) tem
apresentado resultados promissores em reaes de biotransformao em meio aquo-restrito na
sntese de biodiesel (Mendes et al., 2008d).
30
2.4.2. Imobilizao Covalente Multipontual de Enzimas em Ges Glioxil
A imobilizao covalente multipontual em glioxil-suporte consiste na formao

de vrias ligaes covalentes entre grupos aminos desprotonados de resduos de lisina de uma
molcula de enzima, como aminas desprotonadas de resduos lisina, grupos carboxlicos e
grupos aldedos alifticos lineares moderadamente afastados da superfcie do suporte (grupos
glioxil), como ilustrado na Figura 2.8.
Segundo Guisn (1988) a utilizao de gis glioxil-agarose possibilita uma
intensa multi-interao enzima-suporte, sem distoro da estrutura da enzima, devido
ausncia de impedimentos estricos para a reao qumica amino-aldedo. Desta forma, as
bases instveis de Schiff, por reduo com borohidreto de sdio so convertidas em aminas
secundrias estveis, produzindo-se derivados com alta reteno de atividade, alta rigidez e,
por conseguinte, alta estabilidade trmica.
Figura 2.8. Esquema representativo de imobilizao de enzimas em suportes glioxil.

A Tabela 2.3 apresenta a atividade recuperada e o fator de estabilidade de
diversas enzimas imobilizadas em gel glioxil-agarose (Mateo et al., 2006). A atividade
recuperada variou entre 60 a 100% e a estabilizao, de acordo com o tempo de meia-vida do
biocatalisador, em muitos casos foi 1000 a 100000 vezes mais estvel que a enzima
imobilizada unipontualmente.
31
Tabela 2.3. Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas enzimas imobilizadas
multipontualmente em glioxil-agarose.
Enzimas
AR
FE
(fontes)
(%)
Tripsina
75
10000a
Quimotripsina
70
60000a
Penicilina G acilase (E. coli)
70
8000a
Penicilina G acilase (K. citrophila)
70
7000a
Ferrodoxina NADP redutase (Anabaema sp.)
60
1000a
Lipase (C. rugosa)
50
150a
Lipase (B. thermocatenulatus)
75
500a
Esterase (B. stearothermophilus)
70
1000a
Termolisina (B. thermoproteolyticus)
100
100a
Glutamato racemase
70
1000a
Alcalase
54
500
Uroquinase
80
10
AR: Atividade recuperada (%); FE: Fator de Estabilidade (relao entre os tempos de meia-vida da enzima
imobilizada e a enzima solvel).
a: comparada com enzimas imobilizadas unipontualmente.
Fonte: Mateo et al. (2006).
2.4.2.1. Principais Fatores que Interferem na Imobilizao Multipontual de Enzimas

(a) Efeito do Suporte
Um parmetro bastante relevante possibilidade de interao multipontual

enzima-suporte o grau de ativao do suporte, ou seja, a densidade de grupos reativos
(aldedo) na superfcie do suporte. No caso especfico da agarose, o nmero de grupos
aldedos por unidade de massa ou volume de suporte, depende da porcentagem de agarose
usada na preparao das partculas (Mateo et al., 2006). Elevada porcentagem de agarose
presente nas partculas responsvel pela formao de suporte com elevada porosidade
porque o nmero de entrelaados entre as fibras maior, sendo mais favorvel para uma
efetiva imobilizao de enzimas pela tcnica multipontual. Para cada mL de gel de agarose
10% reticulado pode ser imobilizado aproximadamente 100-120 mg de uma enzima de baixamdia massa molecular, como penicilina G acilase, e o suporte pode ser ativado com uma
concentrao de 220 moles de grupos glioxil.mL-1 de suporte. Empregando gel de agarose
32
4% de reticulao, o carregamento mximo de protena de 20-30 mg.mL-1 e a ativao

mxima de 40 moles de grupos glioxil.mL-1 de suporte. Entretanto, a densidade superficial
de grupos glioxil na superfcie do gel de agarose de aproximadamente 17 grupos/ 1000
(Guisn, 1988).
Alm disso, a estabilidade da enzima imobilizada aumenta consideravelmente
com o aumento da concentrao de agarose. Para agarose a 10%, o fator de estabilidade 10
vezes superior ao da agarose com 4% de reticulao, dependendo do tamanho da enzima
utilizada. A razo a geometria da enzima, pois quanto maior o tamanho da enzima, maior
ser o contato com os grupos reativos do suporte e assim a multi-interao do sistema enzimasuporte mais efetiva conferindo maior nmero de ligaes e menor mobilidade da enzima,
reduzindo a inativao (Mateo et al., 2006).
O controle da ativao do suporte permite controlar a intensidade das reaes
da enzima com o suporte e possvel tambm reduzir o grau de ativao para nveis
desejados, pois elevada ativao pode acarretar distoro da enzima na imobilizao. O
controle muito simples porque a oxidao do gliceril suporte com periodato de sdio uma
reao estequiomtrica. O decrscimo da concentrao de grupos aldedo no suporte promove
uma reduo da estabilidade do derivado e na velocidade de imobilizao (Blanco e Guisn,
1988). Se a concentrao de grupos glioxil baixa, o rendimento de imobilizao tambm
ser baixo e, portanto, o perodo de contato da enzima com o suporte deve ser prolongado
para a obteno de derivados mais estveis. Para tempos de imobilizao curtos, a
estabilidade da enzima imobilizada ter um comportamento similar da enzima solvel.
(b) Efeito das Condies de Imobilizao
O processo de imobilizao multipontual requer temperatura ambiente (20-25

C) e elevado valor de pH, cerca de pH 10,0 para possibilitar que os grupos lisina da enzima
encontram-se desprotonados para se ligar efetivamente com os grupos aldedo do suporte
(Blanco e Guisn, 1988). Um outro fator importante no processo de imobilizao
multipontual o tempo de contato da enzima com o suporte. Imobilizao em pH alcalino e
com suporte altamente ativado pode ser extremamente rpido, podendo atingir curtos perodos
33
de imobilizao, na ordem de minutos. Neste curto perodo de contato da enzima com o

suporte, pelo menos 2 ligaes podem ter sido efetuadas, mas a estabilizao das ligaes
entre enzima e o suporte leva um tempo maior para a sua estabilizao completa.
O tampo a ser empregado tambm um outro fator bastante importante no
processo de imobilizao. necessria a utilizao de uma soluo-tampo capaz de facilitar
a interao dos grupos lisina da enzima com os grupos glioxil do suporte e o tampo mais
utilizado neste processo o tampo bicarbonato (Guisn, 1988). Estudos relatados na
literatura mostram que a imobilizao de enzimas na presena de tampo borato atingiu nveis
poucos satisfatrios de fixao da enzima penicilina G acilase de E. coli em glioxil-agarose
devido formao de complexos com os grupos aldedo (lvaro et al., 1990). A utilizao de
tampo de compostos aminados, como as solues de tampo tris-HCl, etilenodiamina e
etanolamina tambm reduziram a eficincia de imobilizao devido competio entre os
grupos amino da enzima e do tampo, obtendo-se derivados imobilizados com baixa
estabilidade trmica (Fernndez-Lafuente et al., 1995).
(c) Efeito da Modificao Qumica de Enzimas
Recentemente, foi demonstrado que o enriquecimento de grupos reativos na

superfcie da protena por tecnologia do DNA recombinante ou rotas qumicas permite
aumentar
consideravelmente
estabilizao
trmica
de
enzimas
imobilizadas
multipontualmente (Lopez-Gallego et al., 2005; Fernndez-Lorente et al., 2008). Entretanto,

estas tcnicas no influenciam na estabilizao da enzima solvel. A modificao qumica da
superfcie da protena tem sido utilizada na estabilizao de derivados imobilizados por
ligao covalente multipontual (Lopez-Gallego et al., 2005; Fernndez-Lorente et al., 2008).
Uma das tcnicas de modificao qumica empregada a modificao dos grupos
carboxlicos presentes na superfcie da enzima pela reao com etilenodiamina (EDA)
catalisada por N-etil-N-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDAC), de acordo com a
reao mostrada na Figura 2.9 (Lopez-Gallego et al., 2005).
Na imobilizao covalente multipontual, os resduos lisina desprotonados
atacam nucleofilicamente os grupos glioxil do suporte. A modificao qumica da enzima
34
permite maior interao da protena com o suporte, o que influencia na estabilizao trmica
dos derivados. O valor de pKa dos novos grupos amino introduzidos de 9,0, e o valor de
pKa dos grupos amino da lisina, presente naturalmente na superfcie da enzima de 10,5. O
processo de aminao permite imobilizar enzimas multipontualmente em condies mais
brandas de pH (Lopez-Gallego et al., 2005). De acordo com Lopez-Gallego et al. (2005),
enzimas aminadas quimicamente so imobilizadas multipontualmente em pH 9,0, enquanto
enzimas no-modificadas s podem ser imobilizadas em pH acima de 10,05.
Figura 2.9. Mecanismo de aminao dos grupos carboxlicos da lipase ativados com EDAC
na presena de EDA.
Fonte: Lopez-Gallego et al. 2005).
2.4.3. Imobilizao Multipontual de Enzimas em Suportes Epxi
Os protocolos de imobilizao de enzimas em resinas epxi so bastante

simples. Estas resinas so muito estveis em pH neutro, mesmo em condies midas e
podem ser armazenados por um longo perodo. Alm disso, estes suportes podem estabilizar a
enzima por ligao covalente multipontual, conferindo alta estabilizao aos derivados. Alm
disso, enquanto outros protocolos de imobilizao promovem grandes alteraes na superfcie
da protena, a imobilizao em suportes epxi permite pequena modificao qumica da
protena. Os grupos epxi sofrem ataque nucleoflico de diferentes grupos da superfcie da
enzima como, amino, tiol e hidrxi, permitindo intensas interaes entre a enzima e o suporte.
No entanto, os grupos epxi so fracamente reativos sob condies suaves
como pH neutro e baixa fora inica (Mateo et al., 2003; Graz et al., 2003; Mateo et al.,
2007). Assim, a imobilizao empregando esse tipo de suporte deve ser realizada em duas
35
etapas: na primeira, a enzima adsorvida sobre a superfcie do suporte. Por esta razo, a
maioria dos suportes comerciais projetados para a imobilizao de enzimas via epxi deve ter
um carter altamente hidrofbico. Alta fora inica requerida nesta etapa para forar a
adsoro hidrofbica das protenas sobre o suporte (Mateo et al., 2000). Na segunda etapa, a
protena previamente adsorvida ligada covalentemente aos grupos epxi do suporte. Aps
um longo tempo de incubao da enzima adsorvida em pH 7,0, o derivado incubado em pH
alcalino (10,05) para efetuar multi-interaes entre a enzima e o suporte, conferindo maior
rigidez ao derivado e, assim, possibilitando obter derivados com elevada estabilidade trmica
(etapa de estabilizao da enzima). A proximidade da enzima com o suporte favorece a maior
rigidificao da enzima, pois os suportes epxi apresentam pequenos braos espaadores. O
esquema representativo de imobilizao de enzimas em resinas epxi representado na
Figura 2.10 (Mateo et al., 2000).
Figura 2.10. Esquema representativo de imobilizao de enzimas em suportes epxi.

Devido a estas caractersticas, estes suportes tm sido extensivamente
empregados para a estabilizao de enzimas via ligao covalente multipontual (Mateo et al.,
2000; Mateo et al., 2002; Mateo et al., 2003; Graz et al., 2003; Mateo et al., 2007). Em geral,
a imobilizao de enzimas em suportes epxi deve apresentar dois tipos de grupos funcionais
para promover (i) adsoro fsica de protenas e (ii) grupos capazes de imobilizar
covalentemente a enzima (grupos epxi).
36
Os grupos epxi so susceptveis modificao qumica com insero de

outros grupos funcionais na obteno de suportes heterofuncionais que possam melhorar as
propriedades qumicas do suporte em relao sua forma monofuncional (grupos epxi).
Estes suportes heterofuncionais so disponveis comercialmente ou podem ser produzidos em
escala laboratorial. Epxi-amino-Sepabeads, comercializado pela Mitsubishi Chemical Corp.,
um suporte heterofuncional no qual alguns grupos epxi foram modificados quimicamente
com etilenodiamina (Torres et al., 2003). Tiol-epxi-Sepabeads, um outro suporte
heterofuncional, pode ser sintetizado a partir da insero de grupos sulfidrilas por compostos
tiolados como ditiotreitol, ligando-se a enzima por pontes de dissulfeto com resduos cistena
presentes na superfcie da enzima (Graz et al., 2003; Mateo et al., 2007a,b). A adoo de
suportes heterofuncionais permite que outros grupos reativos do suporte possam interagir com
a enzima. Permite ainda uma maior velocidade de adsoro da enzima, reduzindo o tempo de
imobilizao, no sendo necessria a utilizao de suportes altamente hidrofbicos para forar
a adsoro fsica da enzima (Torres et al., 2003; Mateo et al., 2003; Mateo et al., 2007a,b).
Outra vantagem na utilizao desses suportes que pode ser empregada soluo de baixa
fora inica na etapa de adsoro fsica. A imobilizao de enzimas sobre matrizes
heterofuncionais no ocorre em elevada fora inica, enquanto que em epxi-Sepabeads
monofuncional requer no mnimo fora inica de 250 mM. Diferentes enzimas tm sido
imobilizadas em Sepabeads nas formas mono e heterofunconal e os parmetros cinticos dos
derivados esto sumarizados na Tabela 2.4 (Mateo et al., 2003).
Tabela 2.4. Parmetros de imobilizao de enzimas em Sepabeads monofuncional (epxi) e
heterofuncional (epxi-amino).
Enzimas
Suportes
(fontes)
Epxi-Sepabeads
Epxi-amino-Sepabeads
AR
RI
AR
RI
(%)
(%)
(%)
(%)
-galactosidase (A. oryzae)
15
36
100
100
-galactosidase (Thermus sp.)
50
58
100
100
Invertase (fermento de po)
90
60
70
100
Glucoamilase (A. niger)
87
85
75
100
Lipase (C. rugosa)
5
85
65
88
Glutaril acilase
100
75
100
100
AR: Atividade recuperada (%) e RI: Rendimento de imobilizao.
A imobilizao das enzimas foi realizada em tampo fosfato pH 7,0 a 20 C por 24 h em fora inica de 5 mM
(suporte heterofuncinal) e 1 M (suporte monofuncinal).

37
Verifica-se na Tabela 2.4, que as enzimas imobilizadas em epxi-aminoSepabeads apresentaram rendimento de imobilizao bastante superior aos derivados
imobilizados em epxi-sepabeads. A atividade recuperada tambm foi influenciada pela
natureza do suporte, principalmente para a lipase de Candida rugosa, mostrando que a
utilizao de suportes heterofuncionais permite obter derivados mais ativos.
2.5. Biocatlise em Meios No-Convencionais
A bioconverso inclui a seleo de um meio reacional, que pode ser um meio

convencional (meio aquoso) ou meios no-convencionais. Entretanto, o uso de gua como
solvente em reaes de biotransformao restringe a uma gama de aplicaes da biocatlise,
bem como limitada produtividade de diversos processos, principalmente os que envolvem
substratos hidrofbicos. Por outro lado, a constatao de que muitas enzimas operam in vivo
em ambientes hidrofbicos, levou concluso de que estes meios predominantemente noaquosos so igualmente adequados expresso de atividade biocataltica (Aires-Barros,
2002).
A principal razo para a utilizao de meios no-convencionais a
possibilidade
de
solubilizar
substratos
e/ou
produtos
hidrofbicos,
levando
ao
desenvolvimento de processos com produtividade volumtrica elevada; a reduo de possveis

efeitos inibitrios e/ou txicos pelo substrato e/ou produto. A seleo de solventes orgnicos
(caso presente no meio reacional) deve ser efetuada modo a permitir que o solvente atue como
diluente, reduzindo a concentrao interfacial e na fase aquosa (por partio) de substratos
e/ou produtos e o deslocamento do equilbrio qumico, sem interferir negativamente na
atividade cataltica da enzima (Aires-Barros, 2002).
Os meios no-convencionais para biocatlise podem ser solventes orgnicos,
fludos supercrticos e lquidos inicos (Aires-Barros, 2002). Por outro lado, estes sistemas
tambm apresentam algumas desvantagens como: desnaturao e/ou inibio do catalisador
na presena de solvente orgnico, aumento da complexidade do sistema de reao e o
aumento de custos adicionais com os solventes e tensoativos.
38
O uso de biocatalisadores em meios no-convencionais tende a aumentar a

estabilidade da enzima (Klibanov, 2001; Mendes et al., 2007). A inativao trmica de
enzimas ocorre por dois mecanismos de inativao: o primeiro tempo-dependente, gradual e
irreversvel (perda de atividade enzimtica sobre a exposio em temperaturas elevadas) e o
segundo induzidao por calor, com desdobramento, geralmente quase instantneo e reversvel
da molcula de enzima (Klibanov, 2001). A gua influencia diretamente na mobilidade
conformacional das enzimas e tambm em reaes de desaminao de resduos
asparagina/glutamina e na hidrlise de ligaes peptdicas (protelise) (Klibanov, 2001). Por
isso que as enzimas so mais termoestveis quando incubadas em meios orgnicos.
A estabilidade mais elevada de enzimas em meios aquo-restritos bastante
documentada (Volkin et al., 1991; Klibanov, 2001). Por exemplo, lipase, ribonuclease e
quimotripsina de pncreas de porco a 100 C, apresentaram tempo de meia-vida de vrias
horas em condies anidras enquanto que em meio aquoso estas enzimas foram totalmente
inativadas em segundos quando expostas mesma temperatura (Klibanov, 2001). A
temperatura de desdobramento trmico (fuso da enzima) de ribonuclease de pncreas de
porco suspensa em nonano de 124 C, enquanto em gua de apenas 61 C (Volkin et al.,
1991). A resistncia trmica de desdobramento diminui medida que reduz a concentrao de
gua. A enzima no interage com o solvente orgnico, o que permite maior rigidez estrutura
conformacional e reduzindo, assim, a inativao da enzima. Em soluo aquosa, normalmente
ocorre contaminao microbiana que pode produzir enzimas proteolticas que so
responsveis pela hidrlise de enzimas (protelise). Em meio orgnico, estas enzimas
proteolticas so insolveis e, portanto, no podem interagir com a enzima de interesse.
O desenvolvimento da catlise em meio orgnico evidenciou que a quantidade
de gua realmente necessria para propiciar a atividade enzimtica muito pequena. Portanto,
a existncia de uma fase aquosa definida, mesmo que em pequena proporo, no um prrequisito para a eficincia da catlise, ou seja, a concentrao de gua requerida somente
para a atividade cataltica da enzima (Dalla-Vecchia et al., 2004). Sendo assim, seria
tecnologicamente mais atrativo dispensar o uso de solventes orgnicos e realizar a reao
enzimtica apenas com a mistura dos materiais de partida. Esta possibilidade, se vivel,
combina a preciso da catlise biolgica com os altos nveis de produtividade alcanados nos
melhores mtodos convencionais. Entre algumas das vantagens deste sistema cita-se a
ausncia de toxicidade e de inflamabilidade dos solventes orgnicos, reduo do custo inicial
39
do produto e fcil recuperao do produto sem as etapas de purificao ou evaporao (Selmi

et al., 1997). Geralmente, pode-se prever algumas dificuldades imediatas para a
implementao de um sistema isento de solvente, como a minimizao de transferncia de
massa; homogeneidade do meio reacional; a mistura reacional deve ser e permanecer lquida
durante o processo e devem ser adotadas estratgias que desloquem o equilbrio no sentido da
sntese.
2.6. Sntese de Biodiesel a partir de leos e Gorduras
O esgotamento dos recursos fsseis e a crescente conscientizao ecolgica da

sociedade tm conduzido procura de combustveis a partir de fontes renovveis como a
biomassa vegetal. Tambm outras fontes alternativas de energia como solar, elica e energia
obtida por clivagem de radioistopos tem sido intensamente estudadas (Antczak et al., 2009).
Todas estas fontes de energia renovveis contribuem para a reduo da emisso de dixido de
carbono no ar atmosfrico.
leos vegetais foram utilizados como combustvel em automveis no incio do
sculo 19 por Rudolph Diesel (Akoh et al., 2007; Antczak et al., 2009). No entanto, a
utilizao direta de leos vegetais como combustvel insatisfatria e impraticvel para uso
em longo prazo devido alta viscosidade e formao de cidos graxos livres que resultam na
formao de goma de oxidao, polimerizao e deposio de carbono (Ranganathan et al.,
2008).
Os leos vegetais so processados de modo a adquirir propriedades tais como
viscosidade semelhante aos combustveis fsseis e os principais mtodos empregados so a
pirlise, micro-emulsificao e transesterificao. Pirlise consiste na modificao qumica de
leos vegetais por craqueamento em altas temperaturas. Os leos vegetais so craqueados
para reduzir a viscosidade e melhorar o ndice de cetano. Os produtos do craqueamento
incluem alcanos, alcenos, e cidos carboxlicos. leos de soja, algodo, colza e outros foram
craqueados eficientemente com catalisadores qumicos para a obteno de um combustvel de
baixa viscosidade. As principais desvantagens deste processo incluem o alto custo dos
equipamentos e a necessidade de separar por destilao os subprodutos formados.
40
Microemulsificao outra tcnica relatada para reduzir a viscosidade de leos vegetais e os

componentes desta micro-emulso, incluem leo diesel e outros derivados do petrleo, alcois
e surfatante em propores adequadas. lcoois como metanol, propanol e etanol so
utilizados como aditivos para a reduo da viscosidade, lcoois superiores so utilizados
como tensoativos e alquil nitratos so usados para aumentar o ndice de cetano. Apesar da
reduo da viscosidade e aumento do ndice de cetano, a utilizao de micro-emulses
provoca alguns problemas como entupimento do injetor, depsito de carbono por combusto
incompleta (Ma e Hanna, 1999).
O mtodo tradicional de produo de energia a partir de leos e gorduras a
transesterificao com alcois de cadeia curta e o produto obtido, uma mistura de mono-alquil
steres, denominado biodiesel (Akoh et al., 2007; Ranganathan et al., 2008; Vasudesan e
Briggs, 2008; Antczak et al., 2009).
Alm dos leos vegetais, o biodiesel tambm pode ser produzido a partir de
outras fontes como gordura animal (sebo bovino, banha de porco), resduos de leos das
indstrias de extrao e restaurantes e leo microalgal (Vasudesan e Briggs, 2008; Antczak et
al., 2009). Este processo tambm chamado de alcolise que resulta na formao de uma
mistura de mono-alquil steres e glicerol, como mostrado na Figura 2.11. Os mono-alquil
steres formados apresentam propriedades similares ao diesel convencional e podem ser
empregados eficientemente como substitutos dos combustveis fsseis.
Figura 2.11. Equao geral de transesterificao de leos e gorduras com alcois de cadeia
curta na sntese de biodiesel.
Fonte: Da Rs, 2009.
No aspecto ambiental, as vantagens da utilizao do biodiesel so muito
significativas. O biodiesel apresenta baixa toxicidade, biodegradvel, no contm enxofre e
compostos aromticos e ainda reduz significativamente a emisso de gases, como o monxido
41
e dixido de carbono (Ranganathan et al., 2008; Vasudesan e Briggs, 2008). A ausncia total
de enxofre em sua composio qumica confere ao biodiesel uma grande vantagem, pois no
h emisses de gases sulfurados (SOx), caractersticos em motores movidos a derivados de
petrleo. Dessa forma, h uma contribuio efetiva para a minimizao do fenmeno da
chuva cida. Alm disso, diferentemente do combustvel fssil, o CO2 liberado na queima do
biodiesel reciclado por absoro durante o crescimento da massa vegetal (fotossntese).
Assim, a produo do biodiesel est inserida em um processo cclico que auxilia na
minimizao do efeito estufa, pois h um equilbrio entre a massa de carbono fixada e aquela
liberada. Combustveis oriundos de fontes fsseis podem conter at 20% hidrocarbonetos
aromticos policclicos. Para um equivalente nmero de tomos de carbono, os
hidrocarbonetos policclicos aromticos so at trs vezes mais solveis em gua do que os de
cadeia aliftica. O fato de biodiesel no conter hidrocarbonetos aromticos policclicos o torna
uma alternativa segura para armazenamento e transporte (Vasudesan e Briggs, 2008).
O biodiesel misturado ao diesel convencional em propores de 2% (B2), 5%
(B5), ou 20% (B20) e tambm pode ser empregado puro (B100). Este biocombustvel pode
ser utilizado regularmente em veculos com motor diesel sem fazer quaisquer alteraes nos
motores (Ma e Hanna, 1999; Ranganathan et al., 2008). Tambm pode ser armazenado e
transportado utilizando tanques e equipamentos similares ao diesel proveniente do petrleo. O
biodiesel atua tambm como lubrificante e esta propriedade confere aumento na vida til de
motores de combusto. Muitos pases vm introduzindo o biodiesel em misturas com o diesel
de petrleo para aumentar a lubricidade, pois o principal fator relacionado lubricidade o
teor de enxofre presente no combustvel. O maior ponto de fulgor do biodiesel torna um
combustvel mais seguro para usar, manusear e armazenar (Vasudesan e Briggs, 2008). O seu
uso ideal em ambientes sensveis, tais como cidades fortemente poludas pela emisso de
CO2 e outros gases.
Pases como o Brasil, Estados Unidos e Europa incentivam a produo de
biodiesel em larga escala, uma alternativa economicamente vivel de substituio dos
combustveis fsseis, alm de minimizar problemas ambientais. Porm, alguns pases como
Cuba e Venezuela questionam se o aumento da produo de biocombustveis no deslocaria a
produo de reas cultivveis para a produo de alimentos, aumentando problemas sociais
como a fome em pases pobres. Portanto, um dos grandes desafios dos processos de produo
de biodiesel a disposio de matrias-primas capazes de atender a demanda dos programas
42
energticos sem impactar de forma significativa a produo de alimentos (Suarez et al, 2009).
H vrios desafios tcnicos que precisam ser avaliados para tornar o biodiesel uma fonte de
energia rentvel. Para reduzir o custo da produo e torn-lo competitivo como o diesel de
petrleo, matrias-primas de baixo custo, tais como leos no-comestveis, resduos de leos e
gorduras animais devem ser priorizados (Vasudesan e Briggs, 2008).
A soja, por exemplo, possui uma produtividade muito baixa em lipdeos,
demandando enormes quantidades de terra para suprir o mercado de biocombustvel. No
entanto, a soja corresponde hoje a aproximadamente 90% da produo brasileira de leos, o
que faz com que seja a matria-prima preferencial da indstria de biodiesel. No entanto, o
aumento na demanda por leos para a produo de biocombustveis dificilmente poder ser
atendido pela soja ou outros cereais como milho ou canola, uma vez que demandaria uma
larga extenso de terra agriculturvel. Uma melhor produtividade em leos pode ser alcanada
com o uso de palmceas, tais como leos de palma, coco e babau, tidas por muitos
especialistas em produo agrcola como as nicas viveis hoje para atender programas de
biodiesel em larga escala com baixo impacto na produo de alimentos (Suarez et al., 2009).
Outras oleaginosas que tem merecido destaque na produo de biodiesel so
aquelas pertencentes famlia Jatropha, especialmente do gnero Curcas, conhecido no
Brasil como pinho-manso. Esta planta, assim como outras espcies da famlia Jatropha,
ainda pouco cultivada no Brasil, mas pelo fato de ser perene e de se adaptar muito bem em
regies semi-ridas tem sido apontada como ideal para a produo de leos no nordeste
brasileiro, utilizando a agricultura familiar. Apesar de ser ainda bastante controversa a
produtividade destas espcies devido ao pouco estudo em campo, vrios pesquisadores
garantem que podem ser obtidos por hectare at 2200 litros de leo/ por ano (Suarez et al.,
2009).
2.6.1. Transesterificao de leos e Gorduras
As reaes de transesterificao podem ser realizadas por diferentes rotas,

empregando diferentes catalisadores como lcalis, cidos e enzimas, mais especificamente
lipases (Ma e Hanna, 1999; Nassreddine et al., 2008). A via qumica utiliza preferencialmente
43
catalisadores alcalinos como os hidrxidos de sdio (NaOH) ou potssio (KOH) e lcoois de

cadeia curta como metanol e etanol (Ma e Hanna, 1999; Ranganathan et al., 2008; Chen et al.,
2009). Inicialmente, durante o processo, o alcxido formado pela reao do catalisador com
o lcool e este alcxido reage com qualquer tipo de leo vegetal ou gordura para formar
biodiesel e glicerol. Glicerol, mais denso, deposita na parte inferior do reator por decantao e
o biodiesel permanece na fase superior (Ranganathan et al., 2008). Este processo o mais
eficiente, o rendimento de reao de transesterificao prximo a 99%, mesmo em baixas
temperaturas, da ordem de 60 oC (Nassareddine et al., 2008). Apesar desta excelente
produtividade, a produo global de biodiesel relativamente limitada, principalmente devido
a alguns inconvenientes como a necessidade de aplicao de leos vegetais refinados,
problemas relacionados com a recuperao de glicerol puro (o principal subproduto) e
formao de sabes, mono- e diacilgliceris, e pigmentos (Marchetti et al., 2007;
Ranganathan et al., 2008; Antczak et al., 2009). Os resduos de todos esses subprodutos
podem agravar a qualidade do biodiesel. A purificao do produto transesterificado inclui
etapas de neutralizao do catalisador, desodorizao e remoo de pigmentos formados com
o aumento da temperatura, normalmente superiores a 60 oC (Ranganathan et al., 2008). Alm
disso, a concentrao de cidos graxos livres (AGL) nos leos vegetais utilizados na produo
de biodiesel tem que ser inferior a 0,5%, caso contrrio, o rendimento de transesterificao
comprometido devido formao de sabo que compromete a qualidade do produto final
(Meher et al., 2006). Na via qumica, outra importante classe de catalisadores empregados na
produo de biodiesel so os cidos (Ma e Hanna, 1999; Meher et al., 2006; Vasudesan e
Briggs, 2008). Qualquer cido mineral pode ser empregado para catalisar o processo, porm,
os mais comumente utilizados so os cidos sulfrico e sulfnico (Ma e Hanna, 1999; Meher
et al., 2006; Marchetti et al., 2007). Apesar da elevada produtividade, os cidos, altamente
corrosivos, podem causar danos ao equipamento e a produtividade da reao relativamente
inferior aos catalisadores alcalinos (Ma e Hanna, 1999).
De todos os mtodos acima mencionados para a produo de biodiesel, apenas
o processo alcalino realizada em um escala industrial por ser altamente eficiente e vivel
economicamente. Mas os problemas surgem em operaes jusante, incluindo a separao do
catalisador e do lcool que no reagiu. A remoo do catalisador envolve muitas
complicaes e para a obteno do biodiesel so requeridas repetidas lavagens para atingir o
44
grau de pureza necessrio, como pode ser verificado na Figura 2.12A (Ranganathan et al.,
2008).
(A)
(B)
Figura 2.12. Produo de biodiesel por transesterificao alcalina (A) e enzimtica (B) de
leos e gorduras.
Fonte: Ranganathan et al. (2008).
45
Na produo de biodiesel catalisada por enzimas, especificamente lipases,

algumas das desvantagens acima referidas podem ser eliminadas e, portanto, processos
enzimticos so uma promissora alternativa rota qumica (Figura 2.12B). Estas lipases so
obtidas principalmente a partir de diferentes fontes, porm as lipase microbianas so mais
empregadas devido aos baixos custos de produo e de fcil modificao das propriedades (de
Castro et al., 2004). A sntese enzimtica de biodiesel ocorre geralmente em temperaturas
amenas, na faixa de 20 a 60 oC (Marchetti et al., 2007). Aps o final do processo, a fase
inferior (glicerol) simplesmente separada da fase superior (biocombustvel) por simples
decantao e a desodorizao e a neutralizao do produto final no necessria
(Ranganathan et al., 2008).
Um pequeno excesso de lcool proporciona alto rendimento de sntese do
biodiesel e o biocatalisador pode ser usado vrias vezes, especialmente na forma imobilizada.
A transesterificao catalisada por lipases aplicvel aos leos vegetais refinados e brutos
contendo cidos graxos livres (AGL), resduos de gorduras de fritura, sebo e outros resduos
de gorduras, e diversos lcoois, como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol e
isobutanol, como mostrado na Tabela 2.5. Mnima concentrao de gua no meio reacional
pode ter um impacto positivo sobre a produtividade de biodiesel, pois a camada de hidratao
necessria atividade enzimtica mantida (Salis et al., 2008; Dizge et al., 2009). A
concentrao de AGL no leo pode ser muito maior do que a rota qumica catalisada por
lcalis (Ranganathan et al., 2008). Gorduras contendo triacilgliceris (TAG) e AGL so
facilmente convertidos em biodiesel porque a enzima catalisa as reaes de transesterificao
e esterificao (Marchetti et al., 2007).
A sntese enzimtica de biodiesel pode ser efetuada na presena ou em meios
isentos de solventes orgnicos, como mostrado na Tabela 2.5. Normalmente, em sistemas
contendo solvente orgnico, as lipases catalisam a converso de leo em biodiesel quando a
alquota global de lcool adicionada no incio do processo (Ranganathan et al., 2008). Em
sistemas isentos de solventes, o lcool pode ser adicionado em vrias pequenas pores para
manter a sua concentrao em nveis mais baixos para evitar a inativao da enzima
(Ranganathan et al., 2008). Esta estratgia amplamente empregada quando se utiliza
metanol como doador de grupo acila, o que no observado para os outros tipos de alcois
(Lu et al., 2007; Qin et al., 2008; Winayanuwattikun et al., 2008; Dizge et al., 2009). Porm, em
meios isentos de solventes orgnicos, a adio de todo lcool requerido no incio da reao
46
tambm utilizada (Moreira et al., 2007; Paula et al., 2007). Reaes de biotransformao
catalisadas em meios isentos de solventes so mais utilizadas em sntese de biodiesel, pois a
elevada toxicidade, inflamabilidade e recuperao final do solvente so as suas principais
desvantagens (Moreira et al., 2007).
Os custos da produo de biodiesel pela rota qumica ainda so inferiores aos
processos enzimticos, porm, se a poluio ambiental tambm considerada, estas despesas
so comparveis (Ranganathan et al., 2008). De acordo com a Tabela 2.5, as lipases so
empregadas em reaes de transesterificao de leos e gorduras preferencialmente na forma
imobilizada, pois permitem a reutilizao do biocatalisador e reduz o efeito de inativao da
enzima na presena de lcoois de cadeia curta, o que pode baratear o processo. Neste caso, a
produo de biocatalisadores na forma imobilizada com elevada atividade cataltica e
estabilidade trmica torna-se vivel tcnica e economicamente e podem substituir os
processos qumicos.
47
Tabela 2.5. Exemplos de produo de biodiesel por transesterificao enzimtica de leos e gorduras.
Lipase
Suporte
Candida
antarctica
(Novozym 435)
Candida
antarctica
(Novozym 435)
Pncreas de
porco suno
Pseudomonas
fluorescens
Candida sp. 99125
Candida
antarctica
(Novozym 435)
Clulas ntegras
de Rhizopus
chinensis
Thermomyces
lanuginosus
leo
lcool
Reator
Solvente
Resina
acrlica
Mtodo de
Imobilizao
Adsoro
hidrofbica
Converso e
Tempo
92%
(8 h)
Pinho-manso,
karanj e girassol
Propanodiol
Batelada
Isento
Resina
acrlica
Adsoro
hidrofbica
Pinho-manso,
karanj e girassol
Acetato de
etila
Batelada
POS-PVA
ativado com
glutaraldedo
Covalente
Babau
Etanol
Propanol
Butanol
POS-PVA
ativado com
epicloridrina
Tecido
Covalente
Palma
Adsoro
Resina
acrlica
Referncia
Kumar Modi et
al., (2006)
Isento
90%
(12 h)
Kumar Modi et
al., (2007)
Batelada
Isento
Paula et al.,
(2007)
Etanol
Batelada
Isento
75%
80%
95%
(48 h)
98%
(24 h)
Banha
animal
Metanol
Batelada
alimentada
Hexano
87,4%
(30 h)
Lu et al., (2007)
Adsoro
hidrofbica
Algodo
Metanol
Batelada
t-butanol
97%
(24 h)
Royon et al.,
(2007)
Soja
Metanol
Batelada
alimentada
Hexano
86%
(72 h)
Qin et al.,
(2008)
Poliuretano
ativada com
GLU
Covalente
Canola
Metanol
Batelada
Isento
90%
(24 h)
Dizge e
Keslinler
(2008)
Moreira et al.,
(2007)
48
Tabela 2.5. Exemplos de produo de biodiesel por transesterificao enzimtica de leos e gorduras (continuao).
Lipase
Candida
rugosa
C.
antarctica
Lipozyme
TL-IM (T.
lanuginosus)
Candida
rugosa
P.
fluorescens
(Lipase AK)
Candida
cylindracea
Novozym
435 e
Lipozyme
RM-IM)
Candida sp.
99-125
T.
lanuginosus
Suporte
Quitosana
ativada com
GLU
Aerogis de
slica reforados
com quartzo
Resina acrlica
Mtodo de
Imobilizao
Covalente
leo
lcool
Reator
Solvente
Colza
Metanol
Batelada
Isento
Encapsulao
Girassol
Metanol
Batelada
Adsoro
hidrofbica
Milho e rejeito
de indstrias de
extrao de leo
Soja
Metanol
Covalente
Converso e
Tempo
63,3%
Referncia
Isento
90%
(50 h)
Nassreddine et
al., (2008)
Batelada
alimentada
t-butanol
92%
(12 h)
Wang et al.,
(2008)
Metanol
Batelada
Isento
99%
(12 h)
Ting et al.,
(2008)
Shao et al.,
(2008)
Quitosana
ativada com
EDAC e GLU
Polipropileno
macroporoso
Adsoro
hidrofbica
Soja
Metanol
Batelada
Isento
98%
(72 h)
Salis et al.,
(2008)
Metanol
Batelada
Diesel ou
querosene
97%
(12 h)
Park et al.,
(2008)
Resinas acrlicas
Adsoro
hidrofbica
Resduo de leo
de palma e colza
em argilas
Palma, mamo,
rambutan e
pinho-manso
Metanol
Batelada
alimentada
Isento
~80%
(16 h)
Winayanuwattikun et al.,
(2009)
Tecido
Adsoro
Metanol
91,08%
Covalente
Reator de leito
fixo
Batelada
alimentada
Hexano
STY-DVB
funcionalizada
com PGA
Resduos de
restaurantes
Girassol
Isento
63,8%
(5 h)
Chen et al.,
(2009)
Dizge et al.,
(2009)
Metanol
49
Tabela 2.5. Exemplos de produo de biodiesel por transesterificao enzimtica de leos e gorduras (continuao).
Lipase
R. miehei
(Palatase
2000L)
Clulas
ntegras de
E. coli
contendo
gene de
Proteus sp.
Pncreas de
porco suno
Candida
antarctica
(Novozym
435)
Candida
antarctica
(Novozym
435)
Suporte
SiMCM-41
(TMOS)
Mtodo de
Imobilizao
Encapsulao
leo
lcool
Reator
Solvente
Triolena
Metanol
Batelada
Isento
Soja, colza,
palma, oliva,
mamona,
amendoim,
girassol e milho
Metanol
Batelada
Metanol,
etanol,
propanol,
butanol e
pentanol
Metanol
Silicato
(sepiolite)
Adsoro
hidrofbica
Girassol
Resina acrlica
Adsoro
hidrofbica
Soja
Resina acrlica
Adsoro
hidrofbica
leo de palma
(rejeito)
Metanol
Converso e
Tempo
77%
(96 h)
Macario et al.,
(2009)
Iso-octano
~ 100%
(12 h)
Gao et al.,
(2009)
Batelada
Isento
Metanol: 100%
(24 h) outros
lcoois: 100%
em 10-12 h
Caballero et al.,
(2009)
Batelada
Isento
97%
(15 h)
Zheng et al.,
(2009)
Reator de leito
fixo
t-butanol
80,3%
(3 h)
Halim et al.,
(2009)
POS-PVA: Tetra-etilortossilicato-lcool polivinlico; STY-DVB: Poliestireno-divinilbenzeno; PGA: Poliglutaraldedo;

Polihidrxibutirato; GLU: Glutaraldedo; EDAC: 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida; GLI: glicidol; EPI: epicloridrina.
TMOS:
Referncia
Tetrametilortossilicato;
PHB:
50
3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Enzimas
Foram utilizadas preparaes de lipases comerciais de C. antarctica tipo B

(CALB), T. lanuginosus (LTL), comercialmente chamada de Lipolase, e Lipex 100L,
gentilmente fornecidas pela empresa Novozymes S.A. (Araucria, Paran). Lipase de B.
thermocatenulatus (BTL2) clonada em E. coli foi produzida por fermentao pelos grupos de
Engenharia de Processos Enzimticos e Laboratrio de Desenvolvimento e Automao de
Bioprocessos (DEQ-UFSCar), conforme metodologia descrita por Ra et al. (1997). Lipase de
P. fluorescens (LPF) foi adquirida comercialmente da Amano Pharmaceutical (Nagia, Japo)
e a lipase de pncreas de porco Tipo II (LPP) foi adquirida da Sigma-Aldrich (St. Louis,
EUA). As principais caractersticas dessas preparaes so apresentadas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1. Principais caractersticas das preparaes de lipases empregadas.
Lipase
LTL(1)
CALB(1)
Lipex
100L(1)
LPF(2)
BTL2(2)
LPP(1)
Fonte
Massa
Molecular
(kDa)
Resduos
lisina
Protena
(mg)
AH
(U.g-1)
t1/2 a
70C
(min)
1760,06705,8
278,6
AE
(U.mg-1
de
protena)
195,6358,6
79,6
Thermomyces
lanuginosus
Candida
antarctica
-
30-35
33
9,0018,7
3,50
25,8
8217,3
318,5
5,4
Pseudomonas
fluorescens
Bacillus
termocatenulatus
Pncreas de
porco
33
20,0
4350,0
217,5
2,5
33
12
0,67
109,1
73,1
5,0
52
12,2
1849,5
151,6
0,8
4,8
4,2
(1): Preparaes de lipases disponveis em soluo; (2): Preparaes de lipases disponveis na forma em p; AH:
Atividade Hidroltica da enzima solvel (U.g-1); AE: Atividade especfica (U.mg-1 de protena); t1/2 o tempo de
meia-vida das enzimas solveis a 70 C (min).
51
3.1.2. Suportes e Ativadores
Foram utilizados como suportes para a imobilizao gis de agarose 6%

(SepharoseTM CL-6B), agarose 10% (SepharoseTM CL-10B) e octil-Sepharose 4BCL
adquiridos da Pharmacia Biotech (Uppsala, Sucia); quitosana 85% de desacetilao
adquirida da Polymar S. A. (Cear, Brasil); octadecil-sepabeads e sepabeads EC-EP doados
pela Mitsubishi Chemical Corporation (Milo, Itlia); Toyopearl AF-Amino-650M e HexilToyopearl comprados da Tosoh Bioscience (Montgommery, Estados Unidos). Polihidrxibutirato (PHB) nas formas granular e em p foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co.
(St. Louis, EUA). Alginato de sdio e lcool polivinlico foram adquiridos da Vetec (So
Paulo, Brasil) e J.T. Baker (New Jersey, USA), respectivamente. -carragenina foi adquirida
da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA). Gelatina em p marca Oetker foi adquirida no
mercado local. Bagao de cana-de-acar foi gentilmente doado pela Usina Zanin Acar e
lcool (Araraquara, SP).
Os agentes de ativao empregados foram glicidol (Sigma-Aldrich),
epicloridrina (Sigma-Aldrich) e glutaraldedo 25% (Vetec/SP). Triton X-100; N-etil-N-(3dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDAC); cido 2,4,6 trinitro-benzenossulfnico (TNBS);
etilenodiamina (EDA); ditiotreitol (DTT) e laurinaldedo (LAU) foram adquiridos da SigmaAldrich Co. (St. Louis, EUA). Todos os outros reagentes empregados foram de grau analtico.
3.1.3. Substratos
3.1.3.1. Atividade Hidroltica e Sntese de steres
Foram utilizados como substratos para a dosagem da atividade hidroltica das

lipases azeite de oliva de baixa acidez adquirido no comrcio local (Carbonell) e pnitrofenilbutirato (p-NPB) adquirido da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA). Para a sntese
de steres foram empregados os cidos butrico, lurico e oleico e os lcoois etanol e butanol
adquiridos da J.T. Baker (Xalostoc, Mxico).
52
3.1.3.2. Materiais de Partida para Sntese de Biodiesel
Na sntese de biodiesel foram empregados leos vegetais de baixo custo, como

leo de babau adquirido da Cognis (Jacare/SP) e leo de palma adquirido da Agropalma
(Belm/PA) e etanol anidro da Cromoline (SP). Tomando por base nos dados experimentais
reportados por Da Rs (2009), nas Tabelas 3.2 e 3.3 so apresentadas as propriedades de
interesse desses leos para a sntese de biodiesel.
Tabela 3.2 Propriedades dos leos de palma e babau.

Caractersticas
ndice de acidez (mg KOH/g)
ndice de perxido (mEq/kg)
ndice de iodo (g I2/g)
ndice de saponificao (mgKOH/g)
Massa especfica (g/cm3)
cidos graxos livres (%)
pH
Viscosidade cinemtica (cSt)
leos Vegetais
Palma
Babau
0,33
2,05
98,04
198,39
0,80
0,18
5,80
36,87
0,65
1,82
25,38
238,20
0,85
0,33
5,00
29,51
Tabela 3.3. Composio em cidos graxos e massa molecular dos leos de palma e babau.
cidos Graxos
Composio dos leos Vegetais
(%)
Palma
Babau
cido Caprico (C8:0)
3,50
cido Cprico (C10:0)
4,50
cido Lurico (C12:0)
0,10
44,7
cido Mirstico (C14:0)
1,20
17,5
cido Palmtico (C16:0)
46,8
9,70
cido Esterico (C18:0)
3,80
3,10
cido Oleico (C18:1)
37,6
15,2
cido Linoleico (C18:2)
10,5
1,80
-1
Massa Molecular (g.mol )
709,9
849,0
53
3.2. Metodologia Experimental

3.2.1. Determinao da Concentrao de Protena
A concentrao de protena das preparaes enzimticas comerciais foi

quantificada pelo mtodo de Bradford (Bradford, 1976), baseado na ligao do corante
Coomassie Brilliant Blue G-250 protena. Albumina bovina cristalina (BSA) foi usada como
padro para construir a curva de calibrao na faixa de 0 a 0,6 mg.mL-1.
3.2.2. Determinao das Atividades Hidrolticas

3.2.2.1. Hidrlise do p-Nitrofenilbutirato
A determinao da atividade hidroltica foi realizada pela quantificao de pnitrofenol a 348 nm liberado pela hidrlise de 0,4 mM de p-nitrofenilbutirato (p-NPB) em
tampo fosfato 25 mM a pH 7 e 25 C (Palomo et al., 2005). Aproximadamente, 0,1 mL de
soluo enzimtica ou suspenso foi adicionada em 2,5 mL de substrato. Uma unidade
internacional de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessria para
hidrolizar 1 mol de p-NPB.min-1 (U) sob as condies de ensaio.
3.2.2.2. Hidrlise do Azeite de Oliva Emulsificado
A atividade lipoltica das preparaes enzimticas foi determinada pelo mtodo

de hidrlise da emulso de azeite de oliva, conforme metodologia adaptada de Soares et al.
(1999). O substrato foi preparado pela emulso de 25 g de azeite de oliva e 75 g de soluo de
goma arbica a 3% (m.m-1). Em frascos Erlenmeyer de 125 mL foram adicionados: 5 mL de
substrato, 5 mL de soluo tampo fosfato de sdio (100 mM, pH 8,0) e adicionados 0,1 g de
derivado ou 0,1 mg de enzima nas formas imobilizada e solvel, respectivamente. Os frascos
54
foram incubados a 37 C por 5 min, em banho termostatizado com agitao de 150 rpm. Aps
o perodo de incubao, a reao foi paralisada pela adio de 10 mL de uma soluo de
etanol a 92,5% v.v-1. Os cidos graxos liberados foram titulados com soluo de NaOH 30
mM, utilizando fenolftalena como indicador. O clculo da atividade hidroltica foi realizado
de acordo com a equao 3.1. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1mol de cido graxo por minuto de reao, nas condies do ensaio (37
C, pH 8,0 e 150 rpm). Em paralelo, foi realizado um controle empregando azeite de oliva
emulsificado sem a adio de enzimas, para a enzima solvel e suporte ativado para a lipase
imobilizada. As atividades foram expressas em moles.mg-1.min-1 (U).
U (umoles / mg. min) =
(Va Vb ) . M .10 3
(3.1)
t .m
Em que: M a concentrao molar da soluo de NaOH; m a massa de enzima solvel (mg

de protena) ou imobilizada (grama de derivado); t o tempo de reao (min); Va o volume
de NaOH gasto na titulao da amostra (mL) e Vb o volume do NaOH gasto na titulao do
controle (mL).
3.2.3. Sntese de steres Catalisada por Lipases
A sntese de ster foi realizada pela esterificao de butanol (100 mM) com
cido butrico em heptano a 37 C com concentrao de enzima imobilizada de 0,5 g de
derivado, conforme metodologia adaptada de Soares et al. (1999). A reao foi iniciada pela
adio da lipase imobilizada ao meio reacional (20 mL), em frasco fechado de 100 mL, em
banho termostatizado (shaker) com agitao de 200 rpm. Alquota de 2 mL foi retirada ao
tempo final (24 h) e diluda em acetona para a quantificao do cido butrico por titulao
com NaOH 30 mM, empregando fenolftalena como indicador. Sntese de steres catalisada
por derivados de BTL2 adsorvida em PHB em p foi avaliada na esterificao dos cidos
butrico, lurico e oleico (100 mM) com alcois de cadeia curta (etanol e butanol), variando a
concentrao de lcool de 100 e 900 mM nas condies descritas acima.
55
3.2.4. Estabilidade Trmica (Estimativa do tempo de meia-vida)
O efeito da temperatura sobre a estabilidade das lipases solvel e imobilizada

foi determinado por meio da incubao de 0,1 mg de protena da enzima livre e 0,1 g do
derivado a 70 C em tampo fosfato pH 8,0 100 mM. Em intervalos definidos, as amostras
foram retiradas e imediatamente resfriadas em banho de gelo para interromper a reao de
inativao. A determinao da estabilidade trmica dos derivados preparados foi realizada
somente para carregamento de 5 mg.g-1 de suporte at inativao total da enzima. As
atividades residuais foram determinadas a 37 C, pela adio de 5 mL de substrato preparado
como descrito no item 3.2.2.2. A constante de inativao trmica foi calculada pela equao
3.2, utilizando o mtodo de ajuste exponencial no-linear de Sadana e Henley (1987).
AR = (1 ) . e kd .t +
(3.2)
Em que: AR a atividade relativa (A/A0); a razo entre a atividade enzimtica do estado

final (A) e a atividade enzimtica do estado inicial (A0); Kd a constante de inativao
trmica de primeira ordem (h-1) e t o tempo de incubao da soluo enzimtica (h).
O tempo de meia-vida da enzima, definido como o tempo necessrio para que
ocorra uma reduo de 50% da atividade inicial, foi calculado pela equao 3.3.
t1 / 2 =
ln (0,5 )
kd . (1 )
(3.3)
Em que: t1/2 o tempo de meia-vida da enzima (h).
3.2.5. Preparao de Polieletrlitos de Quitosana

3.2.5.1. Sntese dos Complexos Polieletrolticos
56
Quitosana controle (4% m.m-1) e os complexos polieletrolticos: (i) quitosana

(4% m.m-1)-gelatina (3% m.m-1); (ii) quitosana (2,5% m.m-1)-alginato (2,5% m.m-1); (iii)
quitosana (2,5% m.m-1)-PVA (2,5% m.m-1); (iv) quitosana (2,5% m.m-1)--carragenina (2,5%
m.m-1) e (v) quitosana pura (4 m.m-1) foram dissolvidos completamente em soluo de cido
actico 5% (v/v) e mantidos sob agitao mecnica por 12 h at completa solubilizao,
conforme metodologia descrita por Adriano et al. (2008). Aps esta etapa, a soluo
polieletroltica obtida foi aspergida em uma soluo coagulante de NaOH 0,1 M na razo 1:10
(v.v-1) para a formao dos hidrogis, mantidos sob baixa agitao mecnica (50 rpm) por 24
h. O hidrogel preparado foi lavado exaustivamente com gua destilada para a remoo de sais
e filtrado a vcuo e estocados sob refrigerao para posterior aplicao. O esquema de
preparao dos polieletrlitos de quitosana mostrado na Figura 3.1.
Figura 3.1. Esquema representativo de preparao dos polieletrlitos de quitosana.

Fonte: Galvo (2004).
3.2.5.2. Hidrofobizao dos Polieletrlitos com TNBS
Foram adicionados 40 g de polieletrlito em 110 mL de tampo bicarbonato

pH 10,05 (100 mM) para total desprotonao dos grupos amino do suporte e adicionado 1 mL
de
soluo 5% (m.m-1) do cido 2,4,6 trinitro-benzenossulfnico (TNBS). O sistema

57
reacional foi mantido em incubadora refrigerada sob agitao (150 rpm) por 24 h a 25 C. Ao
final, o gel foi lavado com gua destilada, filtrado e estocado sob refrigerao. A reao de
hidrofobizao dos polieletrlitos de quitosana com TNBS mostrada na Figura 3.2.
Figura 3.2. Mecanismo de reao entre TNBS e os grupos amino de hidrogis de quitosana.
3.2.5.3. Hidrofobizao
Laurinaldedo
do
Complexo
Polieletroltico
Quitosana-Alginato
com
O complexo polieletroltico quitosana-alginato reticulado com laurinaldedo foi

preparado em diferentes concentraes (1, 3 e 5% m.m-1) a 25 C. A reao de reticulao foi
realizada em tampo fosfato pH 7,0 (200 mM) por um perodo de 1 h. Ao final, o gel foi
lavado com gua destilada, filtrado e estocado sob refrigerao.
3.2.6. Protocolos de Ativao dos Suportes

3.2.6.1. Preparao do Gel Gliceril-Suporte Ativado com Glicidol
Inicialmente, o suporte (10 g) foi lavado com gua destilada em abundncia e

seco a vcuo. Em seguida, 3 mL de gua destilada foram adicionadas e a suspenso foi
mantida sob suave agitao em banho de gelo. Numa soluo de NaOH 1,7 M (5 mL) foram
58
adicionados 0,15 g de borohidreto de sdio (NaBH4), em banho de gelo, para evitar perda do
agente redutor por liberao de H2. A soluo bsica de NaBH4 foi acrescentada suspenso
do suporte, sob agitao. Em seguida, foram adicionados lentamente, 3,43 mL de glicidol em
excesso, para no provocar aumento da temperatura no meio reacional (Guisn, 1988). A
suspenso foi mantida, sob agitao mecnica, em recipiente aberto por 15 h temperatura
ambiente para a liberao de H2 formado no meio reacional. O suporte ativado foi lavado com
gua destilada at pH neutro e seco a vcuo.
3.2.6.2. Preparao do Gel Gliceril-Suporte Ativado com Epicloridrina
Uma massa de 10 g de suporte foi lavada com gua destilada em abundncia e

seca vcuo. Foi preparada uma soluo de NaOH 2 M (100 mL) e adicionada 0,6 g de
borohidreto de sdio (NaBH4), em banho de gelo. suspenso de suporte, foi acrescentada a
soluo bsica de NaBH4 sob agitao em banho de gelo. Adicionou-se lentamente, em
seguida, 10 mL de epicloridrina, sempre verificando se no h aumento na temperatura
(Beppu et al., 2004). A suspenso foi mantida sob suave agitao em recipiente aberto por 15
h temperatura ambiente para liberao de H2 formado no meio reacional. O suporte ativado
foi lavado com gua destilada at pH neutro e seco vcuo.
3.2.6.3. Preparao dos Gis Glioxil-Suporte
10 g do gel gliceril-suporte, obtido pelos dois diferentes mtodos citados

anteriormente (itens 3.2.6.1 e 3.2.6.2), foi suspenso em 100 mL de gua destilada e
adicionados 100 moles de periodato de sdio por grama de suporte para agarose 6BCL,
sepabeads, amino-Toyopearl, PHB e bagao de cana-de-acar e 300 moles.g-1 de suporte,
para os complexos polieletrolticos de quitosana hidrofobizados e no hidrofobizados com
TNBS e agarose 10BCL. Um mol de NaIO4 oxida um mol de OH do gel, portanto,
dependendo do grau de ativao desejado (quantidade de grupos aldedos.mL-1 de gel gerados
59
na superfcie da agarose) a quantidade de periodato necessria foi calculada utilizando a

equao 3.4. A oxidao foi mantida em suave agitao (agitador mecnico) por 2 h. O
suporte oxidado foi lavado exaustivamente com gua destilada, para eliminar formaldedo
produzido e o gel foi estocado a 4 oC.
NaIO
(g) =
( moles aldedo / mL de gel ) .Vgel . PM
NaIO
(3.4)
1 .10 6
Em que: MNaIO4 a massa de periodato de sdio utilizada (g); PMNaIO4 a massa molecular do
periodato de sdio (g.mol-1); Vgel o volume de gel utilizado (mL) e a relao moles
aldedo.mL-1 de gel a concentrao de grupos aldedo presentes por unidade de volume de
gel.
3.2.6.4. Preparao do Gel Glioxil-Amino-Glutaraldedo
Inicialmente, 40 mL de soluo de etilenodiamina (EDA) 2 M a pH 10,0 foi

adicionado a 10 g do gel glioxil-suporte ativado com glicidol (glioxil-agarose, glioxiltoyopearl, glioxil-bagao e glioxil-PHB), conforme metodologia descrita por FernndezLafuente et al. (1993). Este sistema foi mantido sob agitao por 2 h temperatura ambiente.
Aps a aminao, foi adicionado ao gel glioxil-amino aproximadamente 0,57 g de borohidreto
de sdio (NaBH4). O sistema foi mantido por mais 2 h sob agitao branda (Shaker) e em
frasco aberto temperatura ambiente. Aps este perodo, o gel foi lavado com 1 L de soluo
tampo acetato 100 mM (pH 4,0) em abundncia para remoo do NaBH4 residual e
posteriormente lavado com 1 L de soluo tampo borato 100 mM (pH 9,0) para a
desprotonao dos grupos amino do suporte. Para finalizar, o suporte glioxil-amino foi lavado
exaustivamente com gua destilada e secado a vcuo. Foram adicionados ao gel glioxil-amino
obtido uma soluo de glutaraldedo a 25% (16,8 mL) diluda em tampo fosfato 200 mM pH
7,0 (11,2 mL). O recipiente contendo o gel foi coberto com papel alumnio e mantido sob
agitao em incubadora refrigerada temperatura ambiente por 18 h. Ao final deste tempo, o
gel foi lavado com gua em abundncia para a remoo do glutaraldedo residual.
60
3.2.6.5. Ativao dos Polieletrlitos de Quitosana com Glutaraldedo
Foram adicionados aos gis de quitosana controle e complexos polieletrolticos

nas formas hidrofobizada e no hidrofobizada com TNBS, 11,2 mL de soluo tampo fosfato
0,2 M (pH 7,0) e 16,8 mL de glutaraldedo a 25%. O recipiente contendo o gel foi coberto
com papel alumnio e colocado sob agitao em shaker (150 rpm) temperatura ambiente por
1 h. Ao final, o gel foi lavado com gua em abundncia para a remoo do glutaraldedo
residual.
3.2.6.6. Oxidao do Hidrogel Quitosana-Alginato-TNBS com Periodato de Sdio
10 g do gel quitosana-alginato-TNBS no ativado foi suspenso em 100 mL de

gua bidestilada e adicionados 300 moles de periodato de sdio por grama de suporte. A
oxidao foi mantida em suave agitao (agitador mecnico) por 2 h. O suporte oxidado foi
lavado exaustivamente com gua destilada, para eliminar formaldedo produzido e o gel foi
estocado a 4 oC.
3.2.6.7. Preparao de Epxi-Quitosana-Alginato
10 g de quitosana foram dissolvidas em 400 mL de soluo de cido actico

5% (v.v-1) sob agitao mecnica por 2 h. Em seguida, foram adicionados 40 mL de metanol e
4 mL de anidrido actico. Aps 1 h, foram adicionados 10 g de alginato ao sistema e mantido
sob agitao por 12 h. esta soluo foi adicionado 3,6 L de soluo de NaOH 110 mM para
a formao do hidrogel e mantidos sob baixa agitao mecnica (50 rpm) por 12 h. O hidrogel
foi lavado exaustivamente com gua destilada, filtrado a vcuo e estocado sob refrigerao.
Para cada 10 g do hidrogel obtido, foram adicionados 100 mL de N-N-dimetilformamida e a
mistura mantida por 30 min a 60 C. Em seguida, foram adicionados 0,8 g de KOH
61
dissolvidos em 3 mL de isopropanol e, ao final, 10 mL de epicloridrina, conforme

metodologia adaptada de Fangkangwanwong et al. (2006). O sistema foi mantido sob agitao
a 60 C por 12 h. Aps a epoxilao, o gel foi lavado e filtrado a vcuo e estocado sob
refrigerao.
3.2.6.8. Preparao de Epxi-Tiol-Quitosana-Alginato
Aps a obteno do gel epxi-quitosana-alginato, 10 g deste suporte foi

suspenso em 200 mL de tampo bicarbonato 200 mM pH 8,5 e, em seguida, foi dicionado 200
mL de soluo de EDTA 1 mM. A suspenso foi mantida em agitao e foi adicionado 0,68 g
de DTT (ditiotreitol), com concentrao final de 11 mM, conforme metodologia descrita por
Grazu et al. (2003). O suporte foi mantido em agitao mecnica por 1 h a 25 C. Ao final, o
gel tiolado foi lavado com tampo bicarbonato 200 mM pH 8,5 e tampo acetato 100 mM pH
5,0 e finalmente com gua bidestilada. O gel tiolado foi filtrado a vcuo e estocado a 4 C em
tampo fosfato 50 mM pH 7,0.
3.2.6.9. Quantificao de Grupos Glioxil em Agarose
A quantificao de grupos aldedos presentes na superfcie do gel de agarose

ativado foi determinada pela concentrao de periodato de sdio no consumido na reao de
oxidao dos grupos gliceril. O periodato (IO4-) no consumido na reao de oxidao dos
grupos gliceril (lcoois) reage com o iodeto (I-) em excesso, gerando iodo na forma do on triiodeto (I3-), o qual quantificado por colorimetria. necessrio iodeto em excesso para gerar
este on, pois o iodo na forma I2 muito voltil.
Em soluo cida h perda de iodo, por volatilizao, devido oxidao de
iodeto por oxignio atmosfrico. Assim, a quantificao de periodato de sdio no consumido
foi realizada em meio contendo bicarbonato de sdio, pois a oxidao atmosfrica de iodeto
desprezvel em soluo neutra ou bsica (Vogel, 1981). Em uma cubeta de vidro contendo 3
62
mL de uma soluo 1:1 (v.v-1) de iodeto de potssio (10% m.m-1) e bicarbonato de sdio
saturado (10% m.m-1) foram adicionados 75 L de uma soluo aquosa de periodato,
preparada nas mesmas condies da suspenso do gel de gliceril-agarose. Em um
espectrofotmetro fez-se uma varredura de comprimentos de onda, escolhendo-se aquela que
fornecesse uma absorvncia entre 0,7 e 0,8, na faixa de comprimento de onda () prxima a
430 nm. Uma amostra de 75 L do sobrenadante final da oxidao foi posteriormente
adicionada a 3 mL da soluo 1:1 descrita acima, correspondendo o decrscimo na
absorbncia porcentagem de grupos aldedos formados. A absorvncia inicial medida da
soluo aquosa de periodato, preparada nas mesmas condies de suspenso de oxidao do
gel gliceril-agarose, correspondia a 100% do periodato no consumido. Como a reao de
oxidao de grupos gliceril (lcoois) a aldedos equimolar, o total de periodato consumido
igual a concentrao de grupos glioxil formado na superfcie do suporte.
3.2.6.10. Quantificao de Grupos Epxi
Anlise dos grupos oxirano (epxi) foi realizada de acordo com metodologia
descrita por Sundberg e Porath (1974) com pequenas modificaes. A formao de grupos
hidroxila formado pela hidrlise dos grupos oxirano foi quantificada por titulao com
soluo 100 mM de HCl. Inicialmente, 15 mL de soluo de Na2S2O3 1,3 M foi ajustada a pH
7,0 pela adio de cido clordrico. Em seguida, foram adicionados 100 mg do gel epxi e o
pH do meio reacional foi mantido em 7,0 com a adio de HCl. A quantidade de grupos
oxirano presente nos hidrogis foi, ento, calculada a partir da quantidade de cido clordrico
necessria para manter a neutralidade da suspenso.
3.2.7. Caracterizao Morfolgica dos Polieletrlitos de Quitosana

3.2.7.1. Adsoro de Corante Hidrofbico Rosa de Bengala
63
A hidrofobizao do polieletrlito quitosana-alginato com TNBS produz uma

superfcie hidrofbica que pode ser determinada pela concentrao de corante hidrofbico
(Rosa de Bengala) adsorvida por massa de gel. Para determinar a hidrofobicidade, uma massa
fixa de hidrogel (0,15 g) foi adicionada em frascos contendo 20 mL de soluo aquosa de
corante (20 g/mL) por 1 h temperatura ambiente, sob agitao. Em intervalos de 15 min,
alquotas do sobrenadante foram retiradas para a quantificao da concentrao de corante
adsorvida, analisada por absorvncia a 549 nm (Gupta e Jabrail, 2006). Estes ensaios foram
realizados em triplicata. A eficincia de adsoro do corante foi determinada pela relao
entre a concentrao de corante adsorvido pela massa de gel empregada nestes experimentos.
3.2.7.2. Estimativa da Porcentagem de Hidratao
A porcentagem de hidratao dos hidrogis modificado e no modificado

quimicamente foi estimada, de acordo com a metodologia estabelecida por Gupta e Jabrail
(2006). Os hidrogis (0,15 g) foram incubados em 20 mL de tampo fosfato pH 7,0 (100 mM)
por 24 h. Aps este perodo, o excesso de gua adsorvido pelo gel foi removido com papel de
filtro e, em seguida, o hidrogel foi pesado em uma balana analtica e determinada a
porcentagem de hidratao, conforme mostrada na equao 3.5.
PH (%) =
M f Mi
Mi
.100
(3.5)
Em que: PH a porcentagem de hidratao (%); Mf a massa de gel aps a hidratao (g) e

Mi a massa de gel no tempo inicial (g).
3.2.7.3. Estimativa da Porcentagem de Reticulao no Complexo Polieletroltico

Quitosana-Alginato
5 mg do complexo polieletroltico quitosana-alginato hidrofobizado por TNBS

e ativado por glicidol, epicloridrina e glutaraldedo foram adicionados em uma cubeta
64
contendo 1 mL de soluo de NaHCO3 4% (m.v-1) pH 8,5 e em seguida foi adicionado 1 mL

de soluo de TNBS 0,5% (v.v-1), conforme metodologia adaptada de Kathuria et al. (2009).
O sistema foi mantido sob repouso a 40 C por 2h. Aps esta etapa, foram adicionados 3 mL
de soluo de HCl 6M e as amostras foram incubadas a 60 C por 1,5 h e, ao final, a
absorvncia da soluo final resultante foi lida a 345 nm. Como controle foi empregado o
polieletrlito quitosana-alginato no hidrofobizado e no ativado pelos agentes e a adio de
soluo HCl foi anterior soluo de NaHCO3 e TNBS. A equao de estimativa da
porcentagem de reticulao dos suportes mostrada na equao 3.6.
Absamostra / mamostra
PR (%) = 1
Abs
/
m
controle
controle
(3.6)
Em que: PR a porcentagem de reticulao (%); Absamostra a absorvncia da soluo da

amostra hidrofobizada ou ativada; mamostra a massa das amotras (mg); Abscontrole a
absorvncia da soluo da amostra controle e mamostra a massa do controle (mg).
3.2.8. Imobilizao de Lipases por Diferentes Protocolos

3.2.8.1. Adsoro Fsica de Lipases em Suportes Hidrofbicos Octil-Agarose, HexilToyopearl e Octadecil-Sepabeads
Lipases BTL2, CALB e LTL foram adsorvidas em suportes hidrofbicos octilagarose, hexil-toyopearl e octadecil-sepabeads na relao 1:60 (suporte:soluo enzimtica)
em tampo fosfato pH 7,0 5 mM por 30 min, conforme metodologia descrita por Bastida et al.
(1998). Nestes ensaios foram empregados carregamentos de 1 mg protena.g-1 de gel. A
atividade hidroltica da suspenso e do sobrenadante foram medidas periodicamente durante a
imobilizao pela hidrlise do p-NPB. Ao final, o derivado foi lavado com gua bidestilada,
seco a vcuo e estocado a 4 C.
65
3.2.8.2. Adsoro Fsica de Lipases em PHB
Inicialmente, 10 g de PHB em p e granular foram embebidos em 15 mL de

etanol anidro e mantidos sob baixa agitao por 6 h a 25 C, conforme metodologia descrita
por Adlercreutz (2006). Aps esta etapa, foram adicionadas as solues de lipases BTL2,
CALB, LTL, Lipex 100L ou LPF na relao 1:60 (suporte:soluo enzimtica) em tampo
fosfato pH 7,0 5 mM por 12 e 18 h, empregando PHB nas formas em p e granular, conforme
metodologia descrita por Bastida et al. (1998). Nestes ensaios foram empregados
carregamentos de 5 mg protena.g-1 de suporte para as lipases disponveis comercialmente
(CALB, LTL, Lipex 100L e LPF) e de 10 mg protena.g-1 de suporte para a lipase BTL2. Ao
final, os derivados foram filtrados a vcuo e estocados a 4 C.
3.2.8.3. Aminao de Lipases Imobilizadas em Octil-Agarose
4 g de lipases CALB e BTL2 adsorvidas em octil-agarose foram adicionados

em 36 mL de soluo de EDA 1 M pH 4,75 e, em seguida, foi adicionado EDAC slido
suspenso, com uma concentrao final de 102 M, conforme metodologia descrita por LpezGallego et al. (2005). O sistema foi mantido em suave agitao por 2 h a 25 C. Ao final, o
derivado aminado foi lavado exaustivamente com gua destilada e estocado a 4 C. A
dessoro das enzimas aminadas quimicamente foi realizada em tampo fosfato pH 10,05 50
mM na presena de Triton X-100 1% (relao 1:5). O procedimento experimental de
aminao qumica mostrado na Figura 3.3 (Fernandez-Lorente et al., 2008).
66
Figura 3.3. Esquema representativo do processo de aminao qumica de enzimas em fase

slida por EDA na presena de EDAC.
Fonte: Fernandez-Lorente et al. (2008).
3.2.8.4. Protocolo de Imobilizao Multipontual das Lipases Aminadas CALB e BTL2

em Glioxil-Agarose 10 BCL e Glioxil-Sepabeads
Aps a etapa de dessoro das lipases aminada e no aminada quimicamente,

conforme metodologia descrita acima no item 3.2.8.3, a soluo foi diluda em uma relao de
1:2 com tampo bicarbonato 50 mM pH 10,05 e imobilizada a 25 C por 24 h, mantido sob
suave agitao com o auxlio de um hibridizador. Alquotas de 0,1 mL do meio reacional
contendo tampo de imobilizao e lipase foram retiradas para a quantificao da atividade
sobre a hidrlise do p-NPB a pH 7,0 tampo fosfato 25 mM. Aps a imobilizao, foi
quantificada no sobrenadante a atividade hidroltica residual. Em seguida, os derivados foram
reduzidos com borohidreto de sdio (1 mg.mL-1 de suspenso) por 30 min. Ao final, o gel foi
lavado com gua destilada em abundncia para a remoo de enzima residual e borohidreto de
sdio.
67
3.2.8.5. Imobilizao Multipontual de LPP em Glioxil-Agarose 6BCL
A imobilizao da lipase LPP foi realizada em tampo bicarbonato 100 mM pH

10,05 na ausncia e presena de estabilizantes como cloreto de clcio (10 mM),
polietilenoglicol-1500 (20 g.mL-1 de soluo enzimtica), Triton-X-100 (0,10%), cidos
butrico e oleico (100 mM) e em tampo borato 50 mM pH 10,05 empregando carregamento
de protena de 5 mg.g-1 de gel. A soluo enzimtica foi adicionada ao suporte na relao 10:1
e alquotas do meio reacional foram retiradas, inicialmente, para a quantificao da
concentrao de protena e atividade hidroltica sobre a hidrlise do azeite de oliva
emulsificado. A suspenso contendo soluo enzimtica e suporte foi mantida a 25 C por 24
h sob suave agitao, com o auxlio de um hibridizador. Aps a imobilizao, foram
quantificadas, no sobrenadante, a concentrao de protena e atividade hidroltica residual.
Em seguida, foi adicionada suspenso 1 mg.mL-1 de borohidreto de sdio para a reduo das
bases de Schiff para a formao de aminas secundrias estveis por 30 min. Os derivados
preparados e reduzidos com NaBH4 foram lavados exaustivamente com gua bidestilada e
estocados a 4 C. Em seguida, foi quantificada a atividade hidroltica aparente do derivado
conforme metodologia descrita no item 3.2.2.2.
3.2.8.6. Imobilizao Multipontual das Lipases em Suportes Glioxil e Ativados com

Glutaraldedo
A imobilizao das lipases LTL, CALB, Lipex 100L ou LPF foi realizada em
tampo bicarbonato 100 mM pH 10,05 na presena de Triton X-100 (0,15%), empregando
diferentes carregamentos de protena (5, 10, 30, 60 e 80 mg.g-1 de gel). Foram empregados
como suportes agarose 6BCL, polieletrlitos de quitosana hidrofobizados e no
hidrofobizados com TNBS, quitosana-alginato hidrofobizado com laurinaldedo, aminotoyopearl, PHB e bagao de cana-de-acar ativados por diferentes protocolos. A soluo
enzimtica foi adicionada ao suporte na relao 10:1 e alquotas do meio reacional foram
retiradas, inicialmente, para a quantificao da concentrao de protena e atividade
68
hidroltica sobre a hidrlise do azeite de oliva emulsificado. A suspenso contendo soluo

enzimtica e suporte foi mantida em suave agitao, com o auxlio de um hibridizador, a 25
C por um perodo de 4-72 h. Aps a imobilizao, foram quantificadas, no sobrenadante, a
concentrao de protena e atividade hidroltica residual. Em seguida, foi adicionada
suspenso 1 mg.mL-1 de borohidreto de sdio para a reduo das bases de Schiff para a
formao de aminas secundrias estveis por 30 min. Os derivados preparados e reduzidos
com NaBH4 foram lavados exaustivamente com gua bidestilada e estocados a 4 C. Em
seguida, foi quantificada a atividade hidroltica aparente do derivado conforme metodologia
descrita no item 3.2.2.2.
3.2.8.7. Imobilizao Multipontual das Lipases em Epxi-Quitosana-Alginato
A imobilizao das lipases microbianas LTL, Lipex 100L ou LPF em matriz

epxi foi realizada em tampo bicarbonato 100 mM pH 10,05 na presena de Triton X-100
(0,15%), empregando diferentes carregamentos de protena (5, 10, 30, 60 e 80 mg.g-1 de gel).
A soluo enzimtica foi adicionada ao suporte na relao 10:1 e alquotas do meio reacional
foram retiradas, inicialmente, para a quantificao da concentrao de protena e atividade
hidroltica pela hidrlise do azeite de oliva emulsificado. A suspenso contendo soluo
enzimtica e suporte foi mantida em suave agitao com o auxlio de um hibridizador a 25 C
por um perodo de 24-72 h. Aps a imobilizao, foram quantificadas, no sobrenadante, as
concentraes de protena e atividades hidrolticas residuais. O gel foi lavado com gua
bidestilada em abundncia para a remoo de enzima residual e em seguida foi quantificada a
atividade hidroltica aparente do derivado conforme metodologia descrita no item 3.2.2.2. Ao
final da imobilizao, os derivados foram incubados em soluo 3M de glicina pH 8,0 para
bloquear os grupos epxi remanescentes aps a imobilizao por 24 h e, ao final, os derivados
foram lavados exaustivamente com gua bidestilada e estocados a 4 C.
Na Tabela 3.4 esto sumarizadas as condies de preparo dos derivados de
LTL, LPF, CALB, BTL2, Lipex 100L e LPP e os mtodos de imobilizao empregados,
bem como as variveis testadas nos diferentes protocolos de imobilizao.
69
Tabela 3.4. Condies de preparao dos derivados de LTL, LPF, Lipex 100L, LPP, BTL2 e CALB imobilizados por diferentes protocolos.
Lipase
Tipo de Ligao
Suporte
Agente de
(Condies experimentais)
Ativao
Variveis na Imobilizao
Thermomyces
lanuginosus
(LTL)
Adsoro fsica
Covalente
Octil-agarose, hexil-toyopearl, octadecil-sepabeads

(item 3.2.8.1)
PHB em p e granular
(item 3.2.8.2)
Agarose 6BCL
(item 3.2.8.6)
Quitosana pura, Quitosana-gelatina

Quitosana- carragenina
Quitosana-PVA, Quitosana-alginato
(Modificados ou no quimicamente com TNBS)
(item 3.2.8.6)
Bagao de cana-de-acar
(item 3.2.8.6)
Poli-hidrxibutirato (PHB)
(item 3.2.8.6)
Epxi-quitosana-alginato
(item 3.2.8.7)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Glicidol
Glutaraldedo
Epicloridrina
Epxi-tiol-quitosana-alginato
(item 3.2.8.7)
Epicloridrina
Amino-toyopearl
(item 3.2.8.6)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00 a 25 C com

carregamento de 1 mg protena.g-1 gel por 1 h
(Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00, 25 C, 5 mg
protena.g-1 gel, 12 h,Triton X-100
(Tampo bicarbonato 100 mM, pH 10,05,
25 C, 0,15% de Triton X-100)
- Carga (5 80 mg protena.g-1 gel)
-Tempo de imobilizao (4 72 h)
(Tampo bicarbonato 100 mM,
pH 10,05 a 25 C)
- Carga (5 50 mg protena.g-1 gel)
- Reduo de bases de Schiff
(Tampo bicarbonato 100 mM, pH 10,05 a
25 C, carregamento de 5 mg protena.g-1
gel)
(Tampo bicarbonato 100 mM, pH 10,05 a 25
C carregamento de 5 mg protena.g-1 gel)
25 C, 0,15% de Triton X-100)
-Carga mxima (5 80 mg protena.g-1 gel)
25 C, 0,15% de Triton X-100)
--Tempo de imobilizao (12 72 h)
25 C, 0,15% de Triton X-100)
70
Tabela 3.4. Condies de preparao dos derivados de LTL, LPF, Lipex 100L, LPP, BTL2 e CALB imobilizados por diferentes protocolos
(continuao).
Lipase
Tipo de Ligao
Suporte
Agente de
Ativao
Pseudomonas
fluorescens
(LPF)
Adsoro fsica
Covalente
PHB em p e granular
(item 3.2.8.2)
Agarose 6BCL
(item 3.2.8.6)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Amino-toyopearl
(item 3.2.8.6)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Epicloridrina
(item 3.2.8.7)
Candida
antarctica
(CALB)
Adsoro fsica
Covalente
Octil-agarose, hexil-toyopearl, octadecil-sepabeads

(item 3.2.8.1)
PHB em p e granular
(item 3.2.8.2)
Agarose 10BCL
(item 3.2.8.4)
Glicidol
Sepabeads
(item 3.2.8.4)
Glicidol
Agarose 6BCL
(item 3.2.8.6)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00 a 25 C

com carregamento de
5 mg protena.g-1 de gel por 12 h
(Tampo bicarbonato 100 Mm, pH 10,05 a
25C, na presena de 0,15% de Triton X-100)
- Carga mxima (5 80 mg protena.g-1 de gel)
Tampo bicarbonato 100 mM, pH 10,05 a
25C, na presena de 0,15% de Triton X-100
- Carga mxima (5 80 mg protena.g-1 de gel)
25C, na presena de 0,15% de Triton X-100
-Carga mxima (5 80 mg protena.g-1 de gel)
(Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00 a 25 C com
carregamento de 1 mg protena.g-1 gel por 1 h
com carregamento
de 5 mg protena.g-1 de gel por 12 h
25 C, na presena de 1% de Triton X-100
-Efeito da aminao qumica da enzima na
estabilidade trmica e em solventes
25 C, na presena de 1% de Triton X-100)
-Efeito da aminao qumica da enzima na
estabilidades trmica e em solventes
25 C, na presena de 0,15% de Triton X-100
71
Tabela 3.4. Condies de preparao dos derivados de LTL, LPF, Lipex 100L, LPP, BTL2 e CALB imobilizados por diferentes protocolos
(continuao).
Lipase
Tipo de Ligao
Suporte
Agente de
Ativao
Bacillus
thermocatenulatu
s
(BTL2)
Adsoro fsica
Covalente
Lipex 100L
Pncreas de porco
(LPP)
Octil-agarose
(item 3.2.8.1)
PHB em p e granular
(3.2.8.2)
Agarose 10BCL
(item 3.2.8.4)
Glicidol
Adsoro fsica
PHB em p e granular
(item 3.2.8.2)
Covalente
Agarose 6BCL
(item 3.2.8.6)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(item 3.2.8.7)
Epicloridrina
Agarose 6BCL
(item 3.2.8.5)
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
Covalente
Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00 a 25 C com

carregamento de 10 mg protena.g-1 de gel por
12 h
Tampo fosfato 5 mM, pH 7,00 a 25 C com
carregamento de 10 mg protena.g-1 de gel por
12 h
25 C, na presena de 1% de Triton X-100
-Efeito da aminao qumica da enzima sobre a
estabilidade trmica e estabilidade em
solventes orgnicos
com carregamento
de 5 mg protena.g-1 de gel por 12 h
(Tampo bicarbonato 100 mM, pH 10,05 e
tampo borato 50 mM pH 10,05 a 25 C, na
presena de Triton X-100, ons clcio,
polietilenoglicol (PEG 1500), cido oleico,
glicerol)
72
3.2.9. Clculo dos Parmetros de Imobilizao

3.2.9.1. Clculo da Concentrao de Protena Imobilizada
A concentrao de protena imobilizada (PI) foi quantificada com base na

concentrao de protena oferecida e a concentrao de protena presente no meio reacional
aps o processo de imobilizao, como mostrada na equao 3.7.
PI (%) =
P0 Pf
P0
.100
(3.7)
Em que: PI a porcentagem de protena imobilizada (%); P0 e Pf so as concentraes de

protenas no tempo inicial e final no sobrenadante (mg.mL-1), respectivamente.
3.2.9.2. Clculo da Atividade Recuperada
O clculo da atividade recuperada (AR) foi determinado pela relao entre a

atividade hidroltica aparente do derivado e o produto da atividade inicial oferecida e a
concentrao de enzima imobilizada, conforme mostrado na equao 3.8.
AR (%) =
U gel
PI .U 0
.100
(3.8)
Em que: AR a atividade recuperada (%); Ugel a atividade hidroltica aparente do derivado

(U.g-1 de suporte); Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao (U.mg-1 de protena) e
PI a concentrao de protena imobilizada por grama de gel (mg.g-1 de gel).
73
3.2.9.3. Clculo do Fator de Estabilidade
O fator de estabilidade (FE) foi calculado pela relao entre o tempo de meiavida da lipase imobilizada e a lipase solvel medidos a 70 C, determinado no item 3.2.4,
como mostrado na equao 3.9.
FE =
t 1 / 2 imobilizada
t 1 / 2 solvel
(3.9)
Em que: FE o fator de estabilidade; t1/2 solvel o tempo de meia-vida para a lipase solvel
e t1/2 imobilizada o tempo de meia-vida para a lipase imobilizada.
3.2.9.4. Clculo do Rendimento de Imobilizao
O rendimento de imobilizao (RI) foi calculado pela relao entre a atividade

enzimtica imobilizada pela atividade inicialmente oferecida determinada no item 3.2.4, como
mostrado na equao 3.10.
RI (%) =
U imobilizad a
U0
(3.10)
Em que: RI o rendimento de imobilizao; Uimobilizada a atividade enzimtica imobilizada e

Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao (U.mg-1 de protena).
3.2.10. Caracterizao das Propriedades Bioqumicas da Lipase LTL Solvel e

Imobilizada em Quitosana-Alginato-TNBS
3.2.10.1. Influncia da Temperatura
Foi verificada a influncia da temperatura sobre a atividade das lipases solvel

74
e imobilizada empregando a reao de hidrlise do azeite de oliva, conforme metodologia

descrita no item 3.2.2.2, na faixa de temperatura entre 30 a 90 C (Soares et al., 1999).
3.2.10.2. Influncia do pH
A influnca do pH foi avaliada, empregando a reao de hidrlise do azeite de

oliva 25% (m.m-1) emulsificado com soluo aquosa de goma arbica 3% (m.m-1) e
temperatura tima para cada preparao em tampo fosfato 0,1 M na faixa de pH de 5,0 a 9,0
para as lipases nas formas imobilizada e solvel, respectivamente, conforme metodologia
descrita por Soares et al. (1999).
3.2.11. Sntese de Biodiesel por Transesterificao Enzimtica

3.2.11.1. Etanlise do leo de Palma Catalisada por Lipases Imobilizadas por Ligao
Covalente Multipontual
As reaes de transesterificao catalisadas por lipases LTL e LPF

imobilizadas em gis de agarose, amino-toyopearl e quitosana-alginato-TNBS ativados por
diferentes protocolos foram realizadas em frascos fechados contendo 20 g da mistura leo de
babau e etanol anidro na relao molar 1:18 em meio isento de solventes, conforme
metodologia descrita por Moreira et al. (2007). Os derivados foram adicionados na proporo
de 2 mg protena imobilizada.g-1 de leo. As reaes foram conduzidas a 45 C em
incubadora rotativa com agitao de 180 rpm por um perodo mximo de 48 h.
3.2.11.2. Etanlise do leo de Babau Catalisada por Lipases Imobilizadas por Ligao
Covalente Multipontual
75
As reaes de transesterificao catalisadas por lipases LTL e LPF

imobilizadas em gis glioxil-agarose e amino-toyopearl ativados por glicidol e epicloridrina
foram realizadas em frascos fechados contendo 20 g de leo de babau e etanol anidro na
relao molar 1:9 em meio isento de solventes. Os derivados foram adicionados na proporo
de 2 mg protena imoblizada.g-1 de leo. As reaes foram conduzidas a 45 C em incubadora
rotativa com agitao de 180 rpm por um perodo mximo de 48 h.
3.2.11.3. Etanlise do leo de Babau Catalisada por Lipases Imobilizadas em PHB.
As reaes de transesterificao catalisadas por lipases imobilizadas por

adsoro em PHB granular e em p foram realizadas em frascos fechados contendo 20 g de
leo de babau e etanol anidro na relao molar 1:9 em meio isento de solventes. Os
derivados foram adicionados na proporo de 10% em massa em relao aos materiais de
partida envolvidos na reao. As reaes foram conduzidas a 45 C em incubadora rotativa
com agitao de 180 rpm por um perodo mximo de 96 h.
3.2.12. Purificao do Biodiesel
Para a purificao do biodiesel formado, o meio reacional foi submetido a uma

etapa de purificao, constituda basicamente de lavagens com gua destilada a quente (80
C) na relao biodiesel:gua de 1:2. O volume da amostra recolhido foi medido e em seguida
adicionado o mesmo volume de gua destilada. A mistura foi transferida para um funil de
decantao, efetuando-se uma agitao e deixando a mistura em repouso por 30 min para a
separao das fases por 6 ciclos. A fase superior era composta pelos steres de etila
(biodiesel) e a fase inferior por glicerol e gua de lavagem. A fase inferior foi descartada e a
fase superior submetida evaporao em rota-evaporador (Da Rs, 2009).
76
3.2.13. Quantificao dos Mono-steres

Cromatografia de Fase Gasosa
de
Etila
(Biodiesel)
Formados
por
Os mono-steres de etila formados foram quantificados por cromatografia de

fase gasosa (Cromatgrafo a gs, Varian 3800), com detector de ionizao de chama e uma
coluna de ao inoxidvel 5% DEGS em Chromosorb WHP, 80/100 mesh - Hewlett Packard,
Palo Alto, CA, USA, de acordo com metodologia descrita por Urioste et al.(2008). Na Tabela
3.5 so apresentadas as condies para a quantificao dos mono-steres de etila produzidos.
Tabela 3.5. Condies para determinao dos mono-steres de etila produzidos.

Hexanol (16,26 g.L-1)
Padro interno
Temperaturas
Coluna: 120 C por 10 min e 170 C por 13 min a uma

taxa de 25 C.min-1, totalizando 25 min de anlise.
Ionizador e detector: 190 C
Gs de arraste
Tempos de reteno dos

Monosteres de etila (min)
Nitrognio (30 mL.min-1)

Padro interno (hexanol)
C8
C10
C12
C14
C16
C18
C18:1
C18:2
1,17
4,13
8,26
10,77
12,31
15,04
20,96
23,57
26,83
3.2.14. Anlise de Viscosidade das Amostras de Biodiesel
Os valores da viscosidade absoluta em funo da taxa de deformao foram

medidos em viscosmetro Brookfield Modelo LVDVII (Brookfield Viscometers Ltd,
Inglaterra) empregando o cone CP 42. As medidas foram feitas a 25 C, empregando 0,5 mL
de fluido. Os dados obtidos (viscosidade, taxa de deformao e tenso de cisalhamento) foram
ajustados de acordo com a lei de potncia (equao 3.11), conforme descrito por Freitas et al.
(1998).
77
= K n
(3.11)
Em que: T a tenso de cisalhamento, a taxa de deformao aplicada, n o valor do

coeficiente angular e K o ndice de consistncia.
3.2.15. Clculo do Rendimento de Transesterificao
O rendimento de transesterificao foi definido como o valor que expressa a

massa total obtida de steres de etila (Mt) em relao a massa terica esperada de steres de
etila (Me). Me foi determinada a partir da massa de cidos graxos presente na massa inicial do
leo vegetal (babau ou palma) (M0), da massa molecular correspondente a cada cido (MMa)
e do ster correspondente (MMe). Este clculo representado pela Equao 3.12a, em que M0
corresponde ao produto da concentrao mssica de cada cido graxo (Ca), com a massa
inicial de leo utilizada (Mi) (Equao 3.12b). O rendimento foi calculado utilizando a massa
total de steres obtida pela anlise por cromatografia gasosa (Mt) pela massa terica de
steres de etila (Me), conforme mostrado na Equao 3.12c.
Me =
( Mo.MMe)
(a)
MMa
Mo = Ca.Mi
(b)
(c) R =
Mt
.100
Me
(3.12)
3.2.16. Clculo da Produtividade
O clculo da produtividade foi realizado pela relao da massa de biodiesel

produzido pelo tempo de reao e a massa de enzima imobilizada empregada na
transesterificao, conforme mostrado pela equao 3.13.
P=
mbiodiesel
t . mPI
(3.13)
Em que: P a produtividade (mgbiodiesel.h-1.mgPI); mbiodiesel a massa de biodiesel produzida na

reao (mg); t o tempo de reao (h) e mPI a massa de protena imobilizada empregada na
reao de transesterificao (mg).
78
4. RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo sero apresentados e discutidos os resultados experimentais

obtidos neste trabalho. Conforme proposto inicialmente, foram preparados diferentes
derivados imobilizados de lipases, variando-se a fonte da enzima, o procedimento de
imobilizao (covalente ou adsoro fsica), o tipo de suporte, a ativao destes suportes e as
condies de imobilizao, visando obter derivados estveis e ativos para mediar a sntese de
biodiesel a partir dos leos de babau e de palma pela rota etlica. Estes derivados foram
inicialmente caracterizados quanto concentrao de lipase imobilizada, atividade da enzima
imobilizada, converso em butirato de butila, atividade recuperada medida na hidrlise de
azeite de oliva e estabilidade trmica.
Foram estudados seis tipos de preparaes de lipases oriundas de fonte
microbiana, incluindo Thermomyces lanuginosus (LTL), Pseudomonas fluorescens (LPF),
Candida antarctica do tipo B (CALB), Lipex 100L (fonte no informada) e Bacillus
thermocatenulatus (BTL2) e de tecido de clulas animais como lipase de pncreas de porco
(LPP).
Essas enzimas foram imobilizadas covalentemente nos suportes orgnicos
agarose 6BCL, agarose 10BCL, sepabeads, complexos polieletrolticos de quitosana:
quitosana pura, quitosana-alginato, quitosana-PVA, quitosana--carragenina e quitosanagelatina, modificados ou no quimicamente com TNBS, quitosana-alginato modificada com
laurinaldedo e amino-toyopearl, ativados com glicidol, epicloridrina e glutaraldedo.
Alm da imobilizao covalente multipontual em suportes macroporosos, foi
tambm testada a imobilizao das lipases por adsoro fsica nas matrizes hidrofbicas octilagarose 4BCL, hexil-toyopearl, octadecil-sepabeads e poli-hidrxibutirato (PHB), este ltimo
nas formas em p e granular. Os resultados dos testes de imobilizao covalente so
apresentados no item 4.1 e os da imobilizao por adsoro apresentados no item 4.2. No item
4.3 apresentado um quadro comparativo das propriedades de todos os derivados enzimticos
preparados, destacando as possveis aplicaes para os diferentes derivados. Baseando-se
nessa discusso, foram selecionados os derivados mais estveis termicamente para serem
testados na etanlise de leos vegetais. Finalmente, no item 4.4 so apresentados e discutidos
os resultados obtidos na sntese de biodiesel com os derivados selecionados.
79
4.1. Imobilizao Covalente Multipontual de Lipases em Suportes previamente Ativados

4.1.1. Suporte Agarose 6BCL: Imobilizao de Lipase de Pncreas de Porco (LPP) em
Gel de Agarose 6BCL
A literatura indica que agarose o suporte que fornece o maior aumento na

estabilidade trmica do derivado imobilizado devido sua grande rea superficial,
regularidade dos poros e excelente congruncia geomtrica com a protena (Tardioli, 2003
a,b). Contudo, isso somente ocorre se a imobilizao for realizada em pH superior a 10, pois a
formao de vrias ligaes entre a enzima e o suporte requer que vrios grupos amino da
protena estejam desprotonados e, portanto, disponveis para reagir com os grupos aldedos do
suporte. Resduos lisina, normalmente abundantes na superfcie da enzima, so responsveis
pela formao de enlaces com o suporte, mas como possuem pKa em torno de 10,5, s estaro
disponvies para a reao em pH superior a 10.
A primeira preparao enzimtica testada foi a lipase de pncreas de porco
(LPP). Essa preparao enzimtica possui um custo relativamente inferior s outras lipases
por conter em sua formulao enzimas contaminantes tais como colesterol esterase, proteases
(tripsina e quimotripsina) e outras hidrolases (Kazlauskas e Bornscheuer, 1998).
A imobilizao da LPP em agarose ativada foi conduzida em tampo
bicarbonato pH 10,05, oferecendo-se 5,00 mg de protena.g-1 de gel (item 3.2.8.5). A ativao
do suporte com glutaraldedo promoveu maior rendimento de imobilizao (4,4 mg protena
desaparecida do sobrenadante) do que as ativaes glioxil, com glicidol e epicloridrina (~2,00
mg de protena). Entretanto, os derivados obtidos no apresentaram atividade hidroltica
devido baixa estabilidade da enzima no pH de imobilizao. A enzima incubada em tampo
bicarbonato pH 10,05 foi totalmente inativada aps 5 h de incubao, mostrando que essa
preparao enzimtica possui baixa estabilidade em pH de imobilizao (10,05), como
mostrado na Figura 4.1. Algumas estratgias foram empregadas para proteger o stio ativo da
enzima, reduzindo a inativao pelo pH altamente alcalimo, tais como adio soluo de
enzima de ons clcio, polietilenoglicol (PEG-1500), cido butrico, glicerol, Triton X-100 e
ons clcio com estabilizante PEG-1500, segundo indicaes descritas nos trabalhos
publicados por Sharma et al. (2001) e Soares et al. (2003). Contudo, o perfil de inativao da
LPP na presena ou ausncia desses agentes estabiilizantes foi bastante similar.
80
Desta forma, foi testada outra estratgia, verificando, o tipo de tampo, sendo
utilizado o tampo borato em pH 10,05 (50 mM). A enzima incubada neste tampo mostrouse mais estvel, inativando-se completamente somente aps 10 h de incubao. Entretanto,
trabalhos relatados na literatura mostram que esse tampo tambm no indicado para
imobilizar multipontualmente enzimas em gis glioxil, pois os ons borato podem formar
complexos com os grupos glioxil do suporte, o que impede as multi-interaes entre enzima e
suporte (lvaro et al., 1990).
Atividade Relativa
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
Tempo (h)
Figura 4.1. Estabilidade alcalina da lipase LPP em tampo bicarbonato pH 10,05 () e em

tampo borato ().
Desta forma, no foi possvel obter derivados de LPP com atividade cataltica
imobilizada em gel glioxil-agarose devido sua baixa estabilidade em pH alcalino. A
imobilizao de LPP por ligao covalente somente pode ser realizada sem perda significativa
de atividade em pH prximo neutralidade (Desai et al., 2006; Paula et al., 2007).
4.1.2. Suporte Agarose 6BCL: Imobilizao de Lipases Microbianas (LTL, LPF, Lipex
100L e CALB)
Na impossibilidade da imobilizao covalente multipontual da LPP em gel

glioxil-agarose, na seqncia, foram testadas lipases de fonte microbiana tais como T.
lanuginosus (LTL), P. fluorescens (LPF), Lipex 100L e C. antarctica (CALB).
81
De acordo com o catlogo informativo fornecido pela Novozymes, as

preparaes de lipases LTL e Lipex 100L so utilizadas industrialmente na formulao de
detergentes por possurem elevada estabilidade nas condies de lavagem (meio alcalino).
Lipases CALB e LPF so tambm enzimas de elevada estabilidade alcalina e que j vinham
por isso sendo empregadas para a imobilizao multipontual em gis glioxil (Palomo et al.,
2004; Palomo et al., 2005; Brgida et al., 2007; Rodrigues et al., 2008). No item 4.1.2.1 so
apresentados os resultados da cintica de imobilizao das lipases microbianas em agarose
ativada com glicidol, epicloridrina e glutaraldedo e a influncia do tempo de imobilizao
nas propriedades dos derivados enzimticos obtidos, preparados de acordo com o protocolo
descrito no item 3.2.8.6.
4.1.2.1. Cintica de Imobilizao e Influncia do Tempo de Imobilizao de Lipases

Microbianas em Gel de Agarose
Na imobilizao covalente multipontual de protenas o tempo de imobilizao

uma varivel importante, pois os enlaces entre grupos reativos da enzima e grupos reativos
do suporte um processo lento, j que a enzima tem que se realinhar para que seus grupos
reativos se aproximem do suporte (Pedroche et al., 2007; Rodrigues et al., 2008). Assim, era
importante no apenas acompanhar o desaparecimento da enzima do sobrenadante ao longo
do tempo determinando o tempo mnimo para ocorrer a imobilizao da mxima quantidade
possvel de protena por grama de suporte ativado (cintica de imobilizao), mas tambm
investigar o efeito do tempo de incubao adicional nas propriedades catalticas dos
derivados de LTL, LPF, CALB e Lipex 100L obtidos pela imobilizao em gel de agarose
6BCL ativado com glicidol, epicloridrina e glutaraldedo.
As imobilizaes foram conduzidas em tampo bicarbonato pH 10,05 (100
mM) na presena de Triton X-100 (0,15%), conforme descrito no item 3.2.8.5. A estratgia de
utilizar Triton X-100 durante a imobilizao foi para clivar agregados de lipase, pois essa
classe de enzima tende a agregar-se por interao hidrofbica entre as regies do stio ativo
(tampa hidrofbica) (Palomo et al., 2003). Na ausncia de Triton X-100, duas molculas de
lipase podem ser imobilizadas, porm apenas 1 molcula interage covalentemente com o
82
suporte e a outra se encontra adsorvida ao stio ativo da lipase imobilizada covalentemente

(Palomo et al., 2005). Entretanto, para a CALB, no esperado esse benefcio adicional pela
presena de Triton X-100, tendo em vista que essa particular preparao de lipase no sofre
agregao bimolecular por no possuir esta tampa hidrofbica que cobre o stio ativo (Palomo
et al., 2003; Palomo et al., 2005). Para efeito de comparao, contudo, todas as preparaes de
lipases microbianas foram imobilizadas empregando as mesmas condies.
A concentrao de grupos aldedo glioxil presente na superfcie da agarose
aps a etapa de ativao com glicidol e epicloridrina foi de 84,0 5,0 e 79,0 4,0 moles.g-1
de suporte, respectivamente, conforme determinado pelo mtodo descrito no item 3.2.6.7.
Nas Figuras 4.2 (A, B, C e D) so mostradas as cinticas de imobilizao das lipases
LTL (A), LPF (B), Lipex 100L (C) e CALB (D) em agarose ativada com glicidol (GLI),
epicloridrina (EPI) e glutaraldedo (GLU), bem como a atividade do controle (enzima
solvel). A atividade enzimtica desaparecida foi fortemente influenciada pelo tipo de agente
de ativao empregado.
Em 30 min de imobilizao, aproximadamente 80% da atividade enzimtica
oferecida, havia desaparecido do meio de imobilizao, atingindo 100% aps 1 h de reao. A
imobilizao de enzimas em matrizes ativadas por glutaraldedo mais rpida se comparada
com outros agentes devido sua elevada reatividade em pH alcalino.
Na ativao via glicidol e epicloridrina, os aldedos gerados na etapa de
ativao (grupos glioxil) so menos reativos que os aldedos de glutaraldedo. Esses grupos
glioxil s reagem com os grupos amino dos resduos lisina da enzima (Guisan, 1988; Palomo
et al., 2005), enquanto o glutaraldedo pode reagir tambm com outros grupos reativos da
enzima, como grupos hidroxilas e sulfetos (Manrich et al., 2008). Esses fatores explicam a
maior velocidade de imobilizao na ativao glutaraldedo que a ativao glioxil. A
velocidade de imobilizao com suportes glioxil tambm uma indicao do nmero de
lisinas disponveis na superfcie da protena, quanto maior o nmero de resduos lisina maior
a velocidade de imobilizao.
83
(B)
1,0
1,0
0,8
0,8
Atividade Residual
Atividade Residual
(A)
0,6
LTL
0,4
0,2
LPF
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
0,0
80
10
Tempo de Imobilizao (h)
20
30
50
60
70
80
(D)
1,0
1,0
0,8
0,8
Atividade Residual
Atividade Residual
(C)
0,6
40
Lipex 100L
0,4
0,2
CALB
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Figura 4.2. Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes das suspenses de

imobilizao das lipases LTL (A), LPF (B), Lipex 100L (C) e CALB (D) empregando como
suporte gel de agarose ativado por glicidol (), epicloridrina () e glutaraldedo () em
tampo bicarbonato 100 mM pH 10,05 na presena de 0,15% de Triton X-100 a 25 C. Carga
de protena oferecida de 5 mg.g-1 de gel e a atividade da soluo enzimtica nas condies de
imobilizao (soluo controle ()).
Alm disso, na imobilizao das lipases em glioxil-agarose ativada com

glicidol e epicloridrina verifica-se que no sobrenadante, uma atividade residual constante ao
longo do tempo, sendo que Lipex 100L, apresentou a maior velocidade de desaparecimento
de protena no sobrenadante, revelando atividades residuais prximas de zero (cerca de 90%
desaparece). Uma vez que todas as enzimas solveis so estveis nas condies de
84
imobilizao (apenas LPF mostrou ligeira queda para longos tempos de incubao), toda a
protena desaparecida deve estar imobilizada no gel.
Todas as outras trs lipases testadas possuem baixa concentrao de resduos
lisina, como por exemplo, lipase CALB possui nove resduos lisina (Rodrigues et al., 2008),
seguido de LPF (sete resduos) (Palomo et al., 2005) e LTL (sete resduos) (Derewenda et al.,
2005). A concentrao de resduos lisina na estrutura de Lipex 100L no relatada em
nenhuma das bases de dados consultadas. Uma vez que essa enzima apresentou a maior
velocidade de imobilizao em agarose glioxil, com desaparecimento de toda a protena
oferecida, supe-se que deva ter um nmero maior de resduos lisina.
Aps a imobilizao, as propriedades catalticas dos derivados foram
determinadas, conforme mostrado na Tabela 4.1. Os menores valores de atividade hidroltica
(AH) foram obtidos para as lipases LPF e CALB. Sabe-se que a enzima CALB possui baixa
especificidade na hidrlise de triacilgliceris por se tratar de uma falsa lipase, ou seja, esta
enzima considerada por alguns autores uma esterase e possui maior atividade cataltica na
hidrlise de monosteres (Salis et al., 2003). Lipase LPF possui alta atividade cataltica na
hidrlise de triacilgliceris (Moreira et al., 2007). No entanto, os seus derivados apresentaram
baixa atividade enzimtica quando imobilizados em gel de agarose. Essa lipase
comercializada na forma de p e a concentrao de protena contida na formulao enzimtica
de 20 mg.g-1 de p. Normalmente, as preparaes enzimticas comercializadas na forma de
p contm agentes protetores, tais como lactose e outros veculos que protegem a enzima
durante o processo de liofilizao (Klibanov, 2001). Possivelmente, aps a imobilizao, a
concentrao destes agentes protetores no microambiente da enzima menor, o que pode ter
reduzido a atividade cataltica do derivado. A atividade da enzima solvel medida na
presena dessas substncias, as quais no estaro presentes para proteger a enzima
imobilizada, pois o derivado submetido a sucessivas lavagens e por este motivo a atividade
hidroltica dos derivados de LPF foi baixa.
A estabilidade trmica da enzima tambm influenciada pela presena de
agentes protetores: na forma solvel ela se encontra na presena de protetores e na forma
imobilizada na ausncia deles. Assim, embora o fator de estabilidade obtido seja em torno de
10, em realidade talvez deva ser muito maior, empregando como base de comparao a
enzima imobilizada com a enzima solvel dialisada, na ausncia de protetores.
85
Tabela 4.1. Influncia do tempo de imobilizao sobre as propriedades catalticas de CALB,

LTL, LPF e Lipex 100L imobilizadas em gel de agarose 6BCL ativada por diferentes
protocolos. Carga oferecida de 5 mg de protena.g-1 de gel. Atividade oferecida: LTL (1256
U.g-1 de gel); LPF (1087,5 U.g-1 de gel); CALB (398,0 U.g-1 de gel); Lipex 100L (1592,5
U.g-1 de gel).
Lipase
(fonte)
Agente de
Ativao
GLI
CALB
EPI
GLU
GLI
LTL
EPI
GLU
GLI
LPF
EPI
GLU
GLI
Lipex
100L
EPI
GLU
Tempo de
imobilizao
(h)
24
48
72
24
48
72
24
48
72
4
12
24
48
72
4
12
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
AHder.
(U.g-1)
PI
(mg.g-1)
AR
(%)
t1/2
(h)
FE
64,7
52,9
41,2
58,8
52,9
41,2
35,3
35,3
29,4
238,6
321,5
319,5
290,8
271,3
228,6
273,8
297,6
279,5
270,2
117,0
129,3
105,8
66,0
64,6
58,8
59,0
58,8
52,9
40,0
40,0
42,4
253,0
235,2
211,7
244,0
231,1
217,0
92,0
75,0
77,5
2,03
2,27
2,17
2,15
2,05
2,28
5,00
5,00
5,00
0,95
1,28
1,34
1,32
1,35
0,91
1,09
1,25
1,25
1,32
5,00
5,00
5,00
3,53
3,34
3,40
3,25
3,00
3,15
5,00
5,00
5,00
4,84
4,78
4,80
4,50
4,44
4,47
5,00
5,00
5,00
40,0
30,0
23,8
34,4
22,5
19,0
8,90
8,90
7,40
100
100
95,4
87,7
81,8
100
100
96,0
89,0
81,5
10,2
10,3
8,42
8,60
6,33
5,70
8,30
6,43
5,51
5,20
5,20
5,60
16,4
15,5
13,9
17,0
15,7
14,6
5,80
4,71
4,30
1,61
1,50
1,54
1,26
1,40
1,57
1,05
1,19
1,40
12,1
19,4
23,4
26,3
19,4
11,5
18,6
22,1
23,6
21,7
16,5
17,7
16,6
0,33
0,31
0,29
0,31
0,37
0,35
0,29
0,27
0,30
0,55
0,60
0,67
0,58
0,58
0,81
0,42
0,38
0,36
23,0
21,4
22,0
18,0
20,0
22,5
15,0
17,0
20,0
151,0
242,0
291,0
329,0
277,0
144,0
232,0
276,0
295,0
271,0
206,0
221,0
208,0
7,80
7,40
6,90
7,40
8,70
8,40
6,80
6,50
7,00
6,10
6,70
7,50
6,50
6,40
9,00
4,70
4,20
4,00
86
Com relao baixa atividade recuperada, que durante a incubao na

ausncia das altas concentraes desses protetores, a enzima fica sujeita formao de grande
nmero de ligaes com o suporte no processo de multi-interao, resultando em graves
distores do stio ativo para a maioria das molculas de enzima imobilizada. As baixas
atividades recuperadas de todas as lipases imobilizadas no suporte ativado com glutaraldedo
corroboram essa hiptese, j que a grande reatividade de glutaraldedo normalmente resulta
em nmero excessivo de ligaes, com distoro de stio ativo. Diferentes aminocidos
presentes na superfcie da enzima podem reagir com os grupos aldedo do glutaraldedo,
acarretando uma m orientao da enzima durante a imobilizao (imobilizao randmica) e
que pode distorcer a enzima (Manrich et al., 2008). Tal reatividade tambm pode gerar uma
superfcie interna com menor dimetro de poros durante a ativao se comparada com os
agentes epxidos (glicidol e epicloridrina).
Dentre os derivados preparados, LTL imobilizada em gel glioxil-agarose
ativados por glicidol e epicloridrina apresentaram os valores mais elevados de atividade
hidroltica, da ordem de 319,5 e 297,6 U.g-1 de gel, respectivamente, seguidos dos derivados
de Lipex 100L ativados por estes mesmos agentes (253,0 e 244,0 U.g-1 de gel), imobilizados
em 24 h.
Os derivados glioxil de LTL apresentaram atividades recuperadas superiores a
95%, ou seja, quase toda a atividade desaparecida durante a imobilizao foi medida no
derivado, enquanto na ativao do suporte com glutaraldedo apenas 10,2% da atividade
desaparecida foi medida no derivado.
A grande reativadade do glutaraldedo permitiu imobilizar toda a protena
oferecida, para as quatro lipases testadas. Para os derivados preparados em suporte
modificados por ativao glioxil (glicidol e epicloridrina), Lipex 100L foi quase totalmente
imobilizada, acima de 90%, lipase LPF em torno de 70%, CALB apenas 40% e o menor
rendimento de imobilizao foi observado para a lipase LTL, cerca de 20% (1,03-1,30 mg
protena.g-1 de gel). Os resultados obtidos para CALB imobilizada em gel glioxil-agarose
confirmam os dados anteriormente publicados (Rodrigues et al., 2008). Uma possvel
explicao para as diferentes porcentagens de protena imobilizada pode ser creditada s
diferentes estruturas e massas moleculares das lipases testadas. CALB, LTL e LPF so
preparaes de lipases conhecidas e empregadas em processos de imobilizao. Porm dados
referentes preparao Lipex 100L no so encontrados na literatura e a empresa que
87
comercializa esta enzima (Novozymes) no disponibilizou nenhuma informao sobre esta

preparao enzimtica, o que dificulta a comparao com os dados obtidos para as outras
enzimas.
Em termos de estabilizao trmica, os derivados de Lipex 100L e LPF foram
pouco estveis, apenas de 4,0 a 9,0 vezes mais estveis que a enzima solvel. Uma vez que
essa enzima possui em sua estrutura qumica sete resduos lisina, possvel que o problema
seja a comparao da estabilidade da enzima imobilizada na ausncia de protetores e da
solvel na presena, conforme discutido anteriormente. O processo de imobilizao da
preparao enzimtica Lipex 100L em gel glioxil-agarose tambm no forneceu derivados
termoestveis. Informaes sobre a origem e a elucidao de estrutura qumica, bem como a
concentrao de resduos lisina, no relatada na literatura. Lipase de Candida antarctica
(CALB) foi estabilizada entre 15 a 23 vezes e os resultados obtidos no presente trabalho esto
de acordo com dados anteriores obtidos no grupo (Rodrigues et al., 2008). Esta enzima possui
em sua estrutura nove resduos lisina, o que deve ter favorecido interaes multipontuais entre
a enzima e o suporte. A imobilizao de LTL em glioxil-agarose forneceu derivados com
mxima estabilizao trmica. Para os derivados preparados em suportes ativados com
glicidol e epicloridrina, o fator de estabilizao obtido para a LTL imobilizada em 24 h foi de
291,0 e 276,0, respectivamente, valores ligeiramente superiores ao derivado preparado em
suporte ativado com glutaraldedo, com um fator de estabilizao da enzima da ordem de
206,0 vezes. Essa enzima possui sete resduos lisina em sua estrutura qumica e apesar da
similar concentrao em relao LPF e CALB foi possvel obter derivados mais
termoestveis, o que pode ser atribudo a uma distribuio mais favorvel dos resduos lisina
na superfcie desta lipase, que favoreceu a formao de uma estrutura rgida e ativa.
Neste estudo tambm foi avaliado o efeito do tempo de imobilizao sobre as
propriedades catalticas das lipases microbianas imobilizadas em gel de agarose ativado por
diferentes protocolos. O tempo de imobilizao variou de 4 a 72 h, para os derivados de LTL
preparados por ativao glioxil (glicidol e epicloridrina) e de 24 a 72 h para os demais
derivados. Sabe-se que o aumento do tempo de imobilizao favorece novas interaes entre
o complexo enzima-suporte, reduzindo a flexibilidade da enzima e, consequentemente,
aumentando a estabilidade trmica dos derivados (Pedroche et al., 2007; Rodrigues et al.,
2008). Em conseqncia, perda da atividade cataltica da enzima pode ser verificada devido
s mudanas conformacionais de sua estrutura ativa durante o processo de regidificao do
88
complexo enzima/suporte (Pedroche et al., 2007; Rodrigues et al., 2008). Esse fenmeno foi
claramente observado na imobilizao de LTL em agarose glioxil e em menor proporo para
CALB, essas duas enzimas tiveram os maiores fatores de estabilizao. No suporte ativado
com glutaraldedo a reao foi muito rpida, no sendo notada a influncia do tempo de
incubao para nenhuma preaparo de lipase testada.
Para as lipases Lipex 100L e LPF a perda de atividade aps longo perodo de
incubao no foi significativa porque no ocorreu aumento da estabilidade dos derivados,
visto que a estabilizao trmica destes derivados foi inferior a 10 vezes.
Os perfis de inativao dos vrios derivados LTL obtidos so mostrados na
Figura 4.3 (A-C). Ajustou-se aos dados experimentais um modelo de decaimento no-linear
de primeira ordem visando-se determinar os tempos de meia-vida da enzima solvel e dos
biocatalisadores preparados e, assim, determinar o fator de estabilidade em relao enzima
solvel (Sadana e Henley, 1987).
Dentre os agentes de ativao testados, glicidol permitiu maior estabilizao,
entre 151,0 e 329,0 em relao enzima solvel (Figura 4.3A). O tempo de meia-vida da
enzima aumentou de 12,1 para 23,4 h (FE=291), com o aumento do tempo de imobilizao de
4 para 24 h. Aumentando o tempo de imobilizao para 48 h, o tempo de meia-vida do
biocatalisador aumentou para 26,3 h (FE=329). No entanto, aumentando o tempo de
imobilizao para 72 h, a estabilizao foi reduzida para 277,0 vezes, valor inferior enzima
imobilizada em 24 h. Este comportamento de decaimento da estabilizao trmica de
derivados imobilizados por longo perodo de incubao tambm relatado na literatura para
outras enzimas (Tardioli et al., 2003a; Becaro, 2008).
Tardioli et al. (2003a) relataram que a carboxipeptidase A (CPA) imobilizada
em gel glioxil-agarose ativado por glicidol apresentou mxima estabilizao trmica em 48 h,
260 vezes mais estvel que a enzima solvel, e em 72 h, sua estabilizao foi inferior a 160,0.
Esses autores creditaram esse comportamento a rigidificao da enzima para tempos
superiores a 48 h, acarretando uma forte distoro da enzima e inativao por influncia da
temperatura. Similar comportamento foi verificado para D-hidantoinase imobilizada em gel
gioxil-agarose em 72 h (Becaro, 2008).
89
(A)
(B)
Solvel
4h
12 h
24 h
48 h
72 h
0,8
Solvel
4h
12 h
24 h
48 h
72 h
1,0
Atividade Residual
Atividade Residual
1,0
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
10
15
20
25
30
Tempo (h)
(C)
Solvel
24 h
48 h
72 h
Atividade Residual
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
Figura 4.3. Perfil de inativao trmica de LTL imobilizada em gel glioxil-agarose ativado
por glicidol (A), epicloridrina (B) e glutaraldedo (C) a 70 C em tampo fosfato pH 8,0 100
mM.
Na Figura 4.3B so mostrados os perfis de inativao trmica da LTL

imobilizada em agarose ativada por epicloridrina. Os fatores de estabilidade obtidos para estes
derivados foram ligeiramente inferiores aos obtidos em suporte ativados com glicidol. A
mxima estabilizao trmica foi obtida em 48 h (FE=295). O aumento do tempo de
imobilizao para 72 h tambm reduziu a estabilidade trmica de LTL imobilizada em glioxil90
agarose ativada com epicloridrina. Para os derivados imobilizados em gel glioxil-aminoglutaraldedo, os fatores de estabilidade oscilaram entre 208,0 a 221,0 e os tempos de meiavida foram prximos a 17 h, como mostrado na Figura 4.3C. O aumento do tempo de
imobilizao de 24 h para 48 h no aumentou a estabilizao da enzima (FE = 221,0). Para a
enzima imobilizada em 72 h, a estabilizao do derivado sofreu uma pequena reduo (FE=
208,0). Derivados preparados em suportes ativados com gluataraldedo so menos estveis
termicamente quando comparados com suportes ativados por outros agentes de ativao
(Adriano et al., 2008). Quimotripsina foi imobilizada em ges de quitosana e em complexos
polieletrolticos de quitosana e a estabilizao da enzima foi maior para os suportes glioxil
ativados com glicidol e epicloridrina, corroborando com os resultados obtidos neste trabalho.
De acordo com os perfis de inativao apresentados, o aumento do tempo de
imobilizao de 24 h para 48 h no promoveu um aumento significativo na estabilizao dos
derivados de LTL preparados em suporte ativado com glicidol e epicloridrina. O derivado
obtido em suporte ativado com gluataraldedo tambm no sofreu influncia do tempo de
imobilizao. Para as outras lipases testadas o mesmo efeito foi verificado. Por este motivo,
as imobilizaes para a estimativa da capacidade mxima de protena imobilizada foram
realizadas em 24 h para todas as lipases testadas no presente trabalho tais como LTL, Lipex
100L, LPF e CALB.
Diante desses resultados, o tempo ideal de imobilizao de LTL foi de 24 h,
tendo em vista que no houve aumento significativo do fator de estabilidade aps 24 h. Alm
disso, para as quatro lipases testadas no foi observado melhoria significativa em nenhum dos
parmetros de imobilizao para tempos de imobilizao superiores a 24 h e por esse motivo,
foi estabelecido o tempo de imobilizao de 24 h para todas as lipases testadas.
4.1.2.2. Efeito da Concentrao de Protena oferecida sobre as Propriedades Catalticas

dos Derivados de Agarose Ativados por Diferentes Protocolos
A principal varivel investigada neste item foi a carga mxima de protena que
pode ser imobilizada por grama de suporte, utilizando diferentes protocolos de ativao. O
protocolo de ativao pode alterar tanto a estrutura interna do gel quanto a concentrao de
91
grupos reativos no suporte, afetando, consequentemente, o rendimento de imobilizao e as

propriedades bioqumicas e cinticas da enzima imobilizada. A concentrao de enzima na
soluo de imobilizao (carga enzimtica oferecida) tambm pode afetar a distribuio da
enzima imobilizada no suporte. Estudos reportados na literatura concluram que quanto mais
concentrada a soluo de imobilizao mais heterognea a distribuio interna da enzima
imobilizada, que tende a se acumular nas camadas mais superficiais da partcula de suporte
ativado, o que interfere tanto na quantidade de enzima imobilizada quanto na atividade
imobilizada medida (Rodrigues et al., 2008). Evidentemente, as propriedades da enzima tais
como massa molecular, quantidade e distribuio de regies hidrofbicas na superfcie da
enzima, nmero de resduos da enzima que podem reagir com o suporte e o protocolo de
ativao utilizado tambm podem influenciar nesses parmetros.
Dentre as preparaes de lipases empregadas, LTL foi a preparao que
forneceu derivados com maiores valores de atividade hidroltica e atividade recuperada
(Tabela 4.2). Nos ensaios conduzidos com o menor carregamento de protena (5 mg.g-1 de
gel), a recuperao de atividade com os derivados preparados com suportes ativados via
glicidol e epicloridrina foi superior a 95%, ou seja, praticamente toda a enzima desparecida do
sobrenandante estava ativa no suporte de imobilizao. O derivado preparado em agarose
ativado com glutaraldedo apresentou atividade hidroltica quase trs vezes menor (117,0 U.g1
de gel). Para os ensaios conduzidos com o carregamento de 80 mg de protena.g-1 de gel, a
atividade hidroltica dos derivados obtidos em suportes ativados com glicidol e epicloridrina
foram aproximadamente duas vezes maior que os derivados preparados em suporte ativado
com glutaraldedo. Entretanto, os derivados preparados por ativao glutaradedo
apresentarem maior porcentagem de protena imobilizada. Para suportes ativados com
glutaraldedo, carregamentos de at 10 mg.g-1 de gel, forneceram valores de 100% de
imobilizao da protena oferecida. A mxima concentrao de enzima imobilizada em
agarose foi de 27,8 mg.g-1 de gel. Quanto aos derivados em suportes ativados com glicidol e
epicloridrina, a mxima concentrao de enzima imobilizada foi de 21,2 e 19,4 mg.g-1 de gel,
respectivamente, oferecendo 80 mg de protena.g-1 de gel.
92
Tabela 4.2. Parmetros de imobilizao da LTL em agarose ativada por diferentes protocolos,
para diferentes cargas enzimticas oferecidas.
CP
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1)
AHder.
PI
AR
AHder.
PI
AR
AHder.
PI
AR
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
319,5
1,34
95,5
297,6
1,25
96,0
117,0
5,00
10,2
10
703,4
4,14
67,6
560,6
3,89
57,4
227,5
10,0
9,05
30
1246,6
12,7
39,1
1113,9
12,1
36,6
611,5
25,1
9,70
60
1390,4
17,9
30,9
1335,5
17,0
31,3
640,8
26,3
9,70
80
1347,3
21,2
25,4
1470,0
19,4
30,2
703,7
27,8
10,1
CP: Carregamento de protena oferecida (mg de protena.g-1 de gel); Ader.: Atividade hidroltica do derivado (U.gde gel); PI: Concentrao de protena imobilizada (mg de protena.g-1 de gel) e AR: Atividade recuperada (%).
importante ressaltar que ao final de 72 h de incubao em tampo

bicarbonato pH 10,05 no houve perda da atividade enzimtica e, consequentemente, a
enzima que no foi imobilizada, presente no sobrenadante aps a imobilizao, pode ser
reutilizada para uma nova imobilizao ou ser utilizada para outros fins, pois elas se
mostraram estveis nas condies de imobilizao.
A Tabela 4.3 mostra os resultados obtidos para a LPF imobilizada em agarose
ativada por diferentes protocolos. Observa-se que foram obtidos derivados com baixa
atividade de hidrlise se comparados com os derivados de LTL imobilizados nesta mesma
matriz. A mxima atividade hidroltica obtida para esta lipase foi de aproximadamente 200
U.g-1 de gel, com carregamento de 80 mg.g-1 de gel, empregando glicidol como agente de
ativao (Tabela 4.3).
Tabela 4.3. Parmetros de imobilizao da LPF em agarose ativada por diferentes
protocolos, para diferentes cargas enzimticas oferecidas.
CP
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1)
AHder.
PI
AR AHder.
PI
AR
AHder.
PI
AR
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
66,0
3,53
8,60
59,0
3,25
8,30
40,0
3,81
5,20
10
96,0
7,49
5,90
101,0
6,00
7,80
68,1
7,91
4,50
30
138,0
11,0
5,70
128,0
9,42
6,20
83,4
11,9
4,00
60
177,0
13,3
6,10
164,7
11,1
6,20
100,1
16,0
3,30
80
198,0
12,2
7,40
180,1
11,0
7,50
130,2
17,2
4,00
-1
CP: Carregamento de protena oferecida (mg de protena.g de gel); Ader.: Atividade hidroltica do derivado (U.gde gel); PI: Concentrao de protena imobilizada (mg de protena.g-1 de gel) e AR: Atividade recuperada (%).
93
As atividades hidrolticas dos derivados de LTL foram aproximadamente 6-7

vezes superiores aos derivados de LPF. Do ponto de vista de rendimento de imobilizao e
atividade recuperada, a influncia do protocolo de ativao foi similar ao observado para a
LTL. O gel ativado por glutaraldedo favoreceu a imobilizao de uma maior concentrao de
protena, da ordem de 17,2 mg.g-1 de gel. Nos gis glioxil ativados via glicidol e epicloridrina,
a mxima concentrao de protena imobilizada foi de 12,2 e 11,1 mg.g-1 de gel,
respectivamente, para um carregamento de 80 mg.g-1 de gel. A atividade recuperada e
atividade hidroltica dos derivados de LPF foram bastante inferiores aos da LTL, decorrente
da presena de possveis contaminantes presentes na formulao enzimtica, conforme j
discutido no item 4.1.2.1.
Os resultados da Tabela 4.3 indicam que para a LPF, com o oferecimento de 60
mg de protena.g-1de gel a matriz j se mostrava perto da saturao (relao volume de
soluo/massa de suporte de 10:1, valor fixado para todos os testes de imobilizao).
Verifica-se ainda um pequeno incremento da atividade medida no gel quando o carga de
protena oferecida foi aumentada de 60 mg para 80 mg.g-1 de gel, embora a concentrao de
protena imobilizada no tenha aumentado, ocorrendo at reduo dependendo do agente de
ativao empregado. A repetio desse padro indica que as maiores atividades imobilizadas
medidas para 80 mg podem ser devidas a uma distribuio heterognea, com maior
concentrao de enzima na superfcie do gel e, consequentmente, efeitos difusivos internos
menos severos. Assim, para LPF, os resultados sugerem no haver vantagem em se oferecer
cargas maiores que 60 mg de protena.g-1 de gel.
Os resultados obtidos para a Lipex 100L indicam que h um aumento
significante na massa de protena imobilizada quando se aumenta a carga oferecida de 30 para
80 mg de protena (aumento em cerca de 70%), observando-se tambm aumento de cerca de
30% na atividade hidroltica da enzima imobilizada, para a carga de 80 mg imobilizada em
agarose ativada por diferentes protocolos. A mxima atividade hidroltica obtida para esta
lipase foi de 936,0 U.g-1 de gel, com carregamento de 80 mg.g-1 de gel, empregando glicidol
como agente de ativao (Tabela 4.4). O derivado preparado em suporte ativado com
epicloridrina mostrou atividade hidroltica mxima de 792,0 U.g-1 de gel, empregando o
mesmo carregamento. Para o suporte ativado com glutaraldedo, a atividade mxima do
derivado imobilizado foi de apenas 240,0 U.g-1 de gel. Esse valor de atividade foi inferior aos
obtidos para derivados preparados me suportes ativados com glicidol e epicloridrina
94
imobilizados com carregamento de 5 mg de protena.g-1 de gel. Nota-se que para

carregamentos a partir de 30 mg.g-1 de gel, os valores de atividade recuperada foram
inferiores a 2%. Conforme anteriormente discutido, a alta reatividade de glutaraldedo explica
esses resultados. Esse reagente no s provoca elevado entrecruzamento no suporte,
reduzindo o dimetro dos poros, como tambm reage excessivamente com os grupos reativos
da enzima, causando distoro na protena.
Nos ensaios conduzidos com carregamento a 10 mg.g-1 de gel, quase toda a
lipase oferecida foi imobilizada covalentemente, para os trs tipos de agentes empregados. De
todas as enzimas testadas, a mxima concentrao de protena imobilizada foi obtida por
Lipex 100L imobilizada em gel glioxil-amino-glutaraldedo, 54,1 mg.g-1 de gel para o
carregamento de 80 mg de protena.g-1 de gel. Para os derivados preparados em suportes
ativados via glicidol e epicloridrina, a concentrao mxima de protena imobilizada foi de
30,0 e 27,5 mg.g-1 de gel. Contudo, os fatores de estabilizao para essa protena foram muito
inferiores aos obtidos para LTL (Tabela 4.1). Conforme j discutido, a possvel explicao o
elevado nmero de enlaces em um curto perodo de tempo ou a presena de resduos lisina
prximos ao stio ativo ou em posies cuja ligao com o suporte gera configuraes
enzimticas tensionadas que no resistam por longo tempo de incubao em altas
temperaturas.
Tabela 4.4. Parmetros de imobilizao da Lipex 100L em agarose ativada por diferentes
CP
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1)
AHder.
PI
AR AHder.
PI
AR
AHder.
PI
AR
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
253,0
4,84
16,4
244,0
4,50
17,0
92,0
5,00
5,80
10
528,0
9,88
16,8
416,0
8,12
16,1
108,0
10,0
3,40
30
744,0
18,2
12,8
529,4
16,7
10,0
168,0
30,0
1,76
60
816,0
26,8
9,57
696,0
24,0
9,10
216,0
42,4
1,60
80
936,0
30,0
9,81
792,0
27,5
9,00
240,0
54,1
1,40
-1
CP: Carregamento de protena oferecida (mg de protena.g de gel); AHder.: Atividade hidroltica do derivado
(U.g-1 de gel); PI: Concentrao de protena imobilizada (mg de protena.g-1 de gel) e AR: Atividade recuperada
(%).
95
A Tabela 4.5 mostra que derivados de CALB tiveram valores de atividade

hidroltica imobilizada inferiores s outras enzimas, para condies similares de imobilizao.
Isso pode ser atribudo ao uso de azeite de oliva emulsificado como substrato, pois a enzima
possui baixa especificidade por triacilgliceris (Salis et al., 2003; Moreira et al., 2007).
Contudo, visando apenas comparao dos protocolos de ativao e da influncia da carga
oferecida, foi adotado esse substrato. Os resultados da Tabela 4.5 mostram que a concentrao
de protena imobilizada de CALB (protena imobilizada/protena oferecida equao 3.6)
foram muito inferiores as obtidas para as outras lipases, para cargas enzimticas oferecidas
iguais. Os derivados obtidos com ativao epxi apresentaram carga de protena imobilizada
inferior a 6 mg.g-1 de gel, mesmo quando eram oferecidos carregamentos iguais ou maiores
que 30 mg.g-1 de gel. A ativao com glutaraldedo conduziu mxima carga de CALB
imobilizada, 14,8 mg.g-1 de gel, alm de ter permitido 100% de imobilizao para
carregamentos inferiores a 10 mg. Esses resultados confirmam estudos anteriores realizados
para a imobilizao de CALB em gel de agarose ativado por diferentes protocolos (Rodrigues
et al., 2008).
Tabela 4.5. Parmetros de imobilizao da CALB em agarose ativada por diferentes
CP
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1)
AHder.
PI
AR AHder.
PI
AR
AHder.
PI
AR
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
66,0
1,23
67,4
62,0
1,06
73,5
35,3
5,00
8,86
10
84,0
2,40
44,0
90,5
2,80
40,6
47,8
10,0
6,00
30
108,0
5,12
26,5
108,0
4,12
32,9
57,4
14,8
4,87
60
126,0
5,86
27,0
120,0
4,35
34,6
65,4
14,4
5,71
80
144,0
5,80
31,1
156,0
5,40
36,2
69,6
14,7
5,94
CP: Carregamento de protena oferecida (mg de protena.g-1 de gel); AHder.: Atividade hidroltica do derivado
(%).
A mxima atividade hidroltica obtida para esta lipase foi de 156,0 U.g-1 de gel,
com carregamento de 80 mg.g-1 de gel, empregando epicloridrina como agente de ativao
(Tabela 4.5). O derivado preparado em gel ativado com glicidol apresentou atividade
hidroltica mxima de 144,0 U.g-1 de gel, empregando o mesmo carregamento. Para o gel
ativado com glutaraldedo, a atividade mxima do derivado imobilizado foi inferior a 70,0
96
U.g-1 de gel. Dentre todos os derivados preparados, os de CALB imobilizados em glioxilagarose foram os que apresentaram menor concentrao de protena imobilizada quando se
ofereceu altos carregamentos, porm com elevada atividade recuperada.
Na presena de efeitos difusivos, a reduo da atividade recuperada com o
aumento da atividade enzimtica desaparecida (quantidade de protena ativa teoricamente
imobilizada), um comportamento esperado, pois h aumento da velocidade de reao por
volume de catalisador. Alm disso, uma maior quantidade de protena imobilizada pode
aumentar a limitao difusional pela reduo do dimetro do poro (Salis et al., 2003; Gomes
et al., 2004; Rodrigues et al., 2008). A difuso do substrato nos poros do suporte descrita
pelo Mdulo de Thiele ( ) e pela efetividade () - relao entre a atividade aparente do
derivado e a atividade teoricamente imobilizada (Salis et al., 2003). O Mdulo de Thiele
proporcional a velocidade de reao e inversamente proporcional a difuso e com o aumento
do carregamento da enzima h um aumento da velocidade da reao e reduo da difusividade
do substrato nos poros do gel, aumentando o valor do Mdulo de Thiele e reduzidno a
efetividade (efetividade = atividade recuperada quando a reduo na atividade aparente em
relao terica ocorre somente por que h efeitos difusivos no sistema reacional). A
atividade recuperada pode tambm ser inferior a 100% devido distoro do stio ativo da
enzima pela imobilizao e/ou efeitos de partio do substrato/produtos e efeitos do
microambiente onde se encontra a enzima imobilizada: concentrao de gua, pH, interaes
hidrofbicas, etc.
Para a LTL, verifica-se que o gel ativado com glicidol e epicloridrina fornece
aproximadamente 100% de atividade recuperada no derivado imobilizado para 5 mg protena
imobilizada.g-1 de gel (Tabela 4.2). Esse resultado indica que at atividade hidroltica da
ordem de 300 U.g-1 de gel, no h efeitos difusivos na hidrlise de azeite de oliva. Indica
tambm que no ocorreu distoro da enzima e nem efeitos de microambiente do suporte na
atividade cataltica da enzima imobilizada. Portanto, a queda na atividade recuperada
verificada com o aumento na quantidade de protena imobilizada pode ser totalmente
atribuda a efeitos difusivos e, nesse caso, atividade recuperada = efetividade. Desta forma,
para os suportes ativados com glioxil, apenas quando a atividade hidroltica de azeite de oliva
for superior a 300 U.g-1 de gel esperado queda na efetividade. Na ativao do suporte com
glutaraldedo, no entanto, ocorre expressiva queda na atividade recuperada, mesmo para
baixos valores de atividade hidroltica por grama de gel, sem grande variao com o aumento
97
da quantidade de protena imobilizada. Isso indica que os baixos valores de atividade

recuperada em suportes ativados com glutaraldedo so devidos principalmente s distores.
Para as demais lipases, podem ter ocorrido distores mesmo para os suportes
glioxil, pois no foram alcanados 100% de recuperao de atividade mesmo para baixas
quantidades de protena imobilizada e, consequentemente, baixas velocidade de reao por
volume de gel. Na ativao glutaraldedo, a atividade recuperada foi sempre mais baixa,
devido alta reatividade desse reagente, ocasionando mais distoro na enzima e a formao
de uma estrutura mais fechada no gel, o que por sua vez diminui a velocidade de difuso do
substrato.
4.1.2.3. Agarose 6BCL: Influncia do Protocolo de Ativao na Converso em Butirato

de Butila Catalisada por LTL e LPF
Outra caractertica importante de um derivado de lipase que se pretende utilizar

na sntese de bodiesel o seu comportamento em meio aquo-restrito. Os resultados mostrados
at agora indicam que os derivados com maior atividade hidroltica e mais termoestveis
foram os obtidos na imobilizao de LTL em agarose 6BCL. Esses derivados foram ento
empregados em reaes em meio orgnico na sntese do ster aromatizante butirato de butila.
A reao foi conduzida em meio de heptano por 24 h e os resultados obtidos esto
sumarizados na Tabela 4.6. Visando uma comparao, foram tambm testados os derivados
de LPF preparados por imobilizao em agarose, que apresentaram os menores valores de
atividade hidroltica e fatores de estabilizao.
Tabela 4.6. Sntese de butirato de butila catalisada por LTL e LPF imobilizadas em agarose 6
BCL ativada por diferentes protocolos.
Lipases
Agente de Ativao
Butirato de Butila
(mM)24 h
86,7
GLI
LTL
85,5
EPI
57,3
GLU
88,8
GLI
LPF
85,5
EPI
60,2
GLU
98
Os derivados preparados em suportes ativados por glioxil (glicidol e

epicloridrina) foram mais ativos em meio orgnico que os derivados preparados em suportes
ativados com glutaraldedo, apresentando comportamento similar aos resultados obtidos na
reao de hidrlise de azeite de oliva. Estes derivados converteram acima de 85% os materiais
de partida empregados (butanol e cido butrico) em produto, enquanto os derivados de
glutaraldedo converteram cerca de 60%. Os derivados de LPF mostraram os menores valores
de atividade hidroltica, entretanto, em sntese orgnica apresentaram um desempenho similar
LTL. Estes resultados indicam que ao menos algumas das substncias protetoras presentes
na soluo de LPF possam ter sido imobilizadas tambm dificultando o acesso de substratos
de alta massa molecular, como azeite de oliva, e em reaes na presena de substratos de
cadeia curta o acesso do substrato aos stios ativos da enzima foi favorecido. A anlise de
efeitos difusivos realizada anteriormente mostrou que para a LPF deve estar ocorrendo efeitos
difusivos mesmo para baixa carga imobilizada. De todo modo, os derivados glioxil de LTL,
os mais estveis, mostraram bom desempenho em meio orgnico e seguem sendo os melhores
derivados de agarose preparados.
Os derivados preparados por ativao glioxil (glicidol e epicloridrina) foram
mais ativos em meio orgnico que os derivados preparados em suportes ativados com
glutaraldedo, apresentando comportamento similar aos resultados obtidos na reao de
hidrlise de azeite de oliva. Estes derivados converteram acima de 85% os materiais de
partida empregados (butanol e cido butrico) em produto, enquanto os derivados de
glutaraldedo converteram cerca de 60%. Os derivados de LPF mostraram os menores valores
LTL. Estes resultados indicam que ao menos algumas das substncias protetoras presentes
na soluo de LPF possam ter sido imobilizadas tambm dificultando o acesso de substratos
de alta massa molecular, como azeite de oliva, e em reaes na presena de substratos de
cadeia curta o acesso do substrato aos stios ativos da enzima foi favorecido. A anlise de
efeitos difusivos realizada anteriormente mostrou que para a LPF deve estar ocorrendo efeitos
difusivos mesmo para baixa carga imobilizada. De todo modo, os derivados glioxil de LTL,
os mais estveis, mostraram bom desempenho em meio orgnico e seguem sendo os melhores
derivados de agarose preparados.
99
4.1.3. Suportes Agarose 10BCL e Sepabeads: Influncia da Aminao Qumica sobre as

Propriedades Catalticas de Lipases Microbianas Imobilizadas
Os suportes glioxil-agarose 10 BCL e glioxil-sepabeads tm sido amplamente

empregados na imobilizao de vrias enzimas de interesse industrial. Eles vm sendo
estudados no grupo de pesquisa liderado pelo Dr. Jos Manuel Guisan do Instituto de
Catlisis y Petroleoqumica da Universidad Autnoma de Madrid-Espanha (ICP-CSIC), razo
pela qual esta etapa do trabalho foi desenvolvida no referido instituto em parceria com o
Grupo de Tecnologia Enzimtica liderado pela Profa. Dra. Raquel de Lima Camargo
Giordano (DEQ-UFSCar). Nesse estudo foram empregadas duas preparaes de lipases
oriundas de fonte microbiana de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) no disponvel
comercialmente e obtida por fermentao em escala laboratorial e a lipase de Candida
antarctica (CALB) comercializada pela Novozymes.
As
duas
preparaes
enzimticas
foram
imobilizadas
nos
suportes
anteriormente mencionados com a finalidade de obter derivados altamente termoestveis.

Uma vez que o maior nmero de grupos amino na superfcie da enzima, mais alto fator de
estabilizao esperado, foi realizada a aminao qumica das lipases em fase slida e
analisados os efeitos desta modificao qumica sobre as propriedades catalticas dos
derivados. A atividade enzimtica das lipases foi determinada para a hidrlise do ster pnitrofenilbutirato (p-NPB) em pH 7,0, conforme metodologia descrita no item 3. 2.2.1.
Ambas as lipases foram imobilizadas por ligao covalente multipontual em
gis glioxil. CALB foi imobilizada em gis glioxil-sepabeads e agarose e BTL2 somente em
glioxil-agarose oferecendo-se um carregamento de 1 mg de protena.g-1 de gel. A aminao
qumica foi realizada empregando as duas preparaes de lipases adsorvidas em octil-agarose,
com posterior dessoro em tampo bicarbonato pH 10,05 50 mM na presena de Triton X100 (1%) para a imobilizao covalente das lipases. O enriquecimento de grupos amino na
superfcie da enzima foi realizada por modificao qumica de grupos carboxlicos presentes
na regio oposta ao stio ativo (regio altamente hidroflica), via etilenodiamina (EDA)
(Lpez-Gallego et al., 2005; Fernandez-Lorente et al., 2008). A metodologia empregada foi
descrita no item 3.2.8.4.
100
A imobilizao de lipases aminadas em gis glioxil foi mais rpida se

comparada com a enzima no modificada quimicamente, como ilustrado nas Figuras 4.4
(CALB) e 4.5 (BTL2).
(A)
CALB-Sepabeads
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
10
15
20
CALB-aminada-Sepabeads
1,0
Atividade Relativa
Atividade Relativa
(B)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
25
10
(C)
CALB-Agarose
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
10
15
Tempo (h)
20
25
CALB-aminada-Agarose
1,0
Atividade Relativa
Atividade Relativa
0,6
25
(D)
0,8
0,0
20
Tempo (h)
Tempo (h)
1,0
15
10
15
20
25
Tempo (h)

imobilizao de lipase CALB em gel glioxil sepabeads sem aminao qumica (A) e aminada
quimicamente (B) e em gel glioxil agarose sem aminao qumica (C) e aminada
quimicamente (D) na presena de 1% de Triton X-100. A imobilizao foi realizada por 24 h
em tampo bicarbonato 50 mM pH 10,05 a 25 C. Atividade da suspenso () e do
sobrenadante ().
101
Os novos grupos amino inseridos na estrutura superficial da enzima foram mais

reativos que os grupos lisina pr-existentes e, por isso, maior velocidade de imobilizao.
Aps 4 h de contato enzima-suporte, CALB aminada foi totalmente imobilizada em glioxilsepabeads (Fig. 4.4A) e a lipase no-aminada s foi totalmente imobilizada aps 20 h de
incubao (Figura 4.4B).
Durante a imobilizao de CALB em gel glioxil-sepabeads, verifica-se
significativa perda da atividade hidroltica na suspenso da ordem de 87%. Este
comportamento pode ser atribudo inativao da enzima imobilizada por distoro em
contato com o suporte (distoro do stio ativo) ou por efeitos difusivos. A imobilizao de
CALB em glioxil-agarose tambm foi realizada e a cintica de imobilizao das enzimas
aminada e no aminada mostrada nas Figuras 4.4C e 4.4D. A velocidade de imobilizao da
lipase em glioxil-agarose foi inferior ao gel glioxil-sepabeads, no sendo alcanada total
imobilizao. Cerca de 90% da atividade oferecida foi imobilizada empregando CALB
aminada, ligeiramente superior lipase no modificada. Durante a imobilizao em gel
glioxil-agarose apenas 22 e 31% da atividade inicial foi inativada, quantificada pela atividade
enzimtica na suspenso (suporte + enzima), mostrando que durante a imobilizao desta
lipase em gel glioxil-agarose o efeito de distoro da enzima menor que a imobilizao em
glioxil-sepabeads. Outro fato relevante que a inativao da lipase durante a imobilizao em
glioxil-agarose nas formas aminada e no-aminada foi similar, mostrando que a modificao
qumica no alterou significativamente a atividade cataltica da enzima.
Lipase BTL2 foi imobilizada multipontualmente em gel glioxil-agarose e a
cintica de imobilizao mostrada na Figura 4.5. A lipase no-modificada e modificada
quimicamente tambm apresentou reduo da atividade durante a imobilizao de 70 e 78%,
respectivamente. Verifica-se que a perda de atividade hidroltica durante a imobilizao para
a lipase no-aminada foi constatada at 4 h e aps este perodo, ao final de 24 h, a atividade
da suspenso permaneceu constante. Entretanto, na imobilizao da lipase aminada, em 4 h
toda a lipase havia sido imobilizada, mas as multi-interaes entre enzima-suporte resultaram
na perda de atividade na suspenso devido ao processo de rigidificao da enzima.
102
(A)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
10
15
20
BTL2-aminada-Agarose
1,0
BTL2-Agarose
Atividade Relativa
Atividade Relativa
1,0
(B)
25
Tempo (h)
10
15
20
25
Tempo (h)

imobilizao de lipase BTL2 em gel glioxil-agarose sem aminao qumica (A) e aminada
quimicamente (B) na presena de 1% de Triton X-100. A imobilizao foi realizada por 24 h
em tampo bicarbonato 50 mM pH 10,05 a 25 C. Atividade da suspenso () e do
sobrenadante ().
Na Tabela 4.7 esto sumarizados os parmetros de imobilizao (rendimento

de imobilizao e atividade recuperada) das lipases CALB e BTL2 imobilizadas
multipontualmente em gis glioxil-agarose e glioxil-sepabeads. A natureza do suporte e o
protocolo de modificao qumica influenciaram significativamente sobre os parmetros de
imobilizao das duas lipases.
CALB
imobilizada
em
glioxil-sepabeads
apresentou
rendimento
de
imobilizao de 100% nas duas formas (aminada e no-aminada) e os derivados preparados

apresentaram valores similares de atividade recuperada, da ordem de 13-15%. Este baixo
valor de atividade recuperada decorrente das interaes entre a enzima e o suporte durante o
procedimento de imobilizao que podem ter distorcido a enzima. Observa-se tambm que o
processo de aminao qumica no alterou as propriedades catalticas de CALB imobilizada
neste suporte.
Na imobilizao de CALB imobilizada em glioxil-agarose no foi alcanado
100% de rendimento de imobilizao. A lipase na forma aminada apresentou rendimento de
imobilizao de 88%, 11% a mais que a lipase no-aminada. Os valores de atividade
recuperada tambm foram bastante similares, da ordem de 56 e 61% nas formas no-aminada
103
e aminada, respectivamente. Esses valores mostram que a aminao qumica de lipase CALB
influenciou somente no rendimento de imobilizao. Maior nmero de grupos reativos
(amino) foi inserido na enzima, facilitando o processo de imobilizao. A principal razo na
obteno de derivados de CALB mais ativos foi a utilizao do suporte glioxil-agarose como
matriz de imobilizao. A estrutura interna da resina acrlica sepabeads permite maior
rendimento de imobilizao, no entanto, a agarose permitiu obter derivados com maior
atividade recuperada, como mostrado na Tabela 4.7. Lipase BTL2 aminada foi totalmente
imobilizada ao final de 24 h, o que no foi verificado para a lipase sem modificao, que
apresentou 87% de rendimento de imobilizao. A aminao da enzima forneceu derivado
com maior atividade recuperada (22%), se comparada com a lipase no modificada
quimicamente (17%).
Tabela 4.7. Parmetros de imobilizao de CALB e BTL2 imobilizadas em glioxil-agarose e
glioxil-sepabeads.
Derivados
Rendimento de imobilizao
Atividade Recuperada
(%)
(%)
CALB-sepabeads
100
15
CALB-agarose
77
56
CALB-sepabeads aminada
100
13
CALB-agarose aminada
88
61
BTL2-agarose
87
17
BTL2-agarose aminada
100
22
Os diferentes valores de atividade recuperada encontrados para as duas

preparaes de lipases so funo da estrutura qumica de cada enzima. Como foi mencionado
anteriormente, lipase CALB possui em sua estrutura qumica apenas nove resduos lisina
(Rodrigues et al., 2008) e na estrutura da BTL2 h 12 resduos (Fernandez-Lorente et al.,
2008), mostrando que na imobilizao de BTL2 h maior interao da enzima com o suporte
e, consequentemente, maior distoro da estrutura ativa da enzima. No entanto, o maior
nmero de enlaces entre a enzima e o suporte tende a estabilizar termicamente o
biocatalisador preparado, como mostrado a seguir.
104
4.1.3.1. Estabilidade Trmica de Derivados de BTL2 e CALB Imobilizadas em GlioxilAgarose e Glioxil-Sepabeads: Efeito da Aminao Qumica Sobre a Estabilizao
Trmica dos Derivados
Lipases CALB e BTL2 foram imobilizadas em glioxil-suportes nas formas no

modificada e modificada quimicamente, no intuito de aumentar o nmero de enlaces da
enzima com o suporte. A inativao das lipases foi conduzida a 70 C e as cinticas de
inativao so mostradas na Figura 4.6. Os ensaios de inativao trmica foram realizados de
acordo com metodologia descrita no item 3.2.4. Lipase CALB foi imobilizada em gis glioxilagarose e sepabeads e a lipase BTL2 foi imobilizada somente em glioxil-agarose. Um modelo
de decaimento no-linear de primeira ordem foi ajustado aos dados experimentais visando-se
determinar os tempos de meia-vida da enzima solvel e dos biocatalisadores preparados e,
assim, determinar o fator de estabilidade em relao enzima solvel (Sadana e Henley,
1987).
De acordo com a cintica de inativao, em ambos os casos, a imobilizao das
lipases modificadas quimicamente melhorou a estabilidade trmica dos derivados, se
comparado com as lipases no-aminadas. Esta melhora na estabilidade trmica dos derivados
foi decorrente do maior nmero de ligaes covalentes envolvendo os grupos amino dos
resduos lisina e os novos grupos amino inseridos aps a aminao. O tempo de meia-vida
estimado para as lipases CALB e BTL2 nas formas solveis a 70 C foi de aproximadamente
5 min.
Os derivados de CALB imobilizados em glioxil-sepabeads foram pouco
estveis termicamente, com valores respectivos de tempo de meia-vida de 0,38 e 0,71 h para a
lipase no-modificada e modificada quimicamente. Em 2 h, foi observada total inativao
tanto nas formas aminada e no-aminada. De acordo com os resultados obtidos, a
imobilizao de CALB em glioxil-sepabeads causa distores da estrutura ativa da enzima
devido m congruncia geomtrica do suporte, ou seja, a enzima sofre distoro para formar
enlaces com os grupos glioxil do suporte. Por este motivo, a lipase BTL2 no foi imobilizada
neste suporte.
105
(A)
(B)
CALB
1,0
0,8
Atividade Residual
0,8
Atividade Residual
BTL2
1,0
0,6
0,4
0,2
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0
10
20
30
40
Tempo (h)
50
50
100
150
200
250
300
Tempo (h)
Figura 4.6. Estabilidade trmica de CALB (A) e BTL2 (B) solveis () e imobilizadas em
glioxil-sepabeads na forma aminada () e no aminada () e em glioxil-agarose na forma
aminada () e no aminada ().
A utilizao de gis glioxil-agarose na imobilizao de lipases microbianas

forneceu derivados mais estveis termicamente. Em relao lipase solvel, a lipase BTL2
aminada em glioxil-agarose estabilizou 4360 vezes e a lipase BTL2 no aminada estabilizou
2648 vezes em relao enzima solvel, com valores de tempo de meia-vida de 65 e 108 h,
respectivamente. Para a CALB aminada e no-aminada imobilizadas em glioxil-agarose, a
estabilizao trmica da enzima foi 287 e 211 vezes em relao enzima solvel e os tempos
de meia-vida estimados foram de 8,13 e 5,89 h, respectivamente. Em suma, a estratgia de
aminao qumica das lipases foi importante para a obteno de derivados mais estveis
termicamente. Resultados semelhantes, em termos de aumento da estabilidade trmica de
enzimas aps aminao qumica, so relatados na literatura (Lopez-Gallego et al., 2005).
Glutaril acilase (GA) e Penicilina G acilase (PGA) foram aminadas quimicamente e
imobilizadas em gel glioxil-agarose. GA aminada, a estabilizao trmica foi melhorada em
um fator de quatro vezes, se comparada com a enzima imobilizada no-aminada e para a
PGA, este fator foi de 20 vezes.
Neste trabalho, lipase CALB foi inicialmente imobilizada em glioxil-agarose 6
BCL ativado com glicidol e o fator de estabilizao estimado foi de 23,0 (Tabela 4.1). A
imobilizao dessa mesma enzima sem modificao qumica em glioxil-agarose 10 BCL
elevou o fator de estabilidade para 211,0 vezes. Esta drstica diferena entre os fatores de
106
estabilizao decorre da concentrao de agarose que constitui os suportes. Gel de agarose 6

BCL sintetizado a partir de uma soluo de agarose 6%, com dimetro de poros interno
superior ao gel de agarose 10 BCL (matriz mais compacta). O aumento da concentrao de
agarose permite aumento tambm do grau de ativao do suporte e, consequentemente, do
nmero de enlaces possveis entre a enzima e o suporte, aumentando o grau de rigidificao
da enzima e consequentemente a sua estabilidade trmica.
4.1.3.2. Estabilidade de Derivados de BTL2 e CALB Imobilizadas em Glioxil-Agarose

Incubados em Solventes Orgnicos: Efeito da Aminao Qumica e do Tipo de Solvente
Sobre a Atividade Cataltica dos Derivados
Derivados de CALB e BTL2 imobilizadas em glioxil-agarose 10 BCL foram

incubados em pH 7,0 a 37 C na presena de solventes orgnicos dioxano e etanol a 75%
(v/v). Estes dois solventes so bastante empregados em sntese orgnica e por isso foi
avaliada a influncia dos solventes sobre a atividade das lipases, conforme mostrado nas
Figuras 4.7A e B.
Derivados de CALB foram mais estveis que os de BTL2 quando incubados
em solventes orgnicos. O processo de aminao da enzima tambm permitiu obter derivados
mais estveis na presena de solventes. Dentre os dois solventes avaliados, os derivados
preparados foram mais estveis em etanol. Aps 188 h de incubao na presena de dioxano a
37 C, a atividade dos derivados de CALB aminada e no-aminada apresentou uma reduo
da atividade cataltica de 23 e 47%, respectivamente, e quando incubados em etanol, a
atividade permaneceu inalterada. BTL2 no-aminada na presena de dioxano foi totalmente
inativada aps 180 h de incubao, enquanto o derivado de BTL2 aminado reteve 22% da
atividade inicial. BTL2 aminada na presena de etanol no sofreu perda de atividade. Dentre
os biocatalisadores testados e incubados na presena de etanol, somente BTL2 sem
modificao qumica apresentou reduo da atividade cataltica, da ordem de 38%.
107
(A)
(B)
Dioxano
0,8
Atividade Relativa
1,0
Atividade Relativa (%)
1,0
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
Etanol
0,2
0,0
0
50
100
150
200
Tempo (h)
0,0
0
50
100
150
200
Tempo (h)
Figura 4.7. Estabilidade em dioxano (A) e etanol (B) dos derivados de CALB aminada () e
no-aminada () e de BTL2 aminada () e no-aminada () imobilizada em glioxil-agarose.
Os derivados na presena de etanol foram mais estveis em relao ao dioxano.

Estes resultados so interessantes no que se refere sua utilizao em reaes de sntese
orgnica na presena desse solvente, como por ex., nas reaes de sntese de biodiesel por
etanlise de leos vegetais, alvo de interesse do presente trabalho. A aminao das outras
preparaes de lipases tais como LTL, LPF e Lipex 100L tambm foi realizada, de acordo
com o protocolo de aminao adotado. Entretanto, as lipases foram inativadas durante a
aminao qumica devido baixa estabilidade nas condies de ensaio (pH 4,75),
inviabilizando a aminao dessas enzimas.
4.1.4. Imobilizao de Lipase LTL em Complexos Polieletrolticos (CPE) de Quitosana

Hidrofobizados por TNBS e Laurinaldedo
4.1.4.1. Efeito do Tipo de Complexo Polieletroltico, da Modificao Qumica com TNBS
e do Agente de Ativao Sobre os Parmetros de Imobilizao.
Os complexos polieletrlitos so formados com o objetivo de obter hidrogis

mais versteis, com diferentes estruturas qumica e fsica, o que pode melhorar sua atuao
em uma determinada aplicao, como a originalmente testada com sucesso para liberao
108
controlada de frmacos (Berger et al., 2004).

Desta forma, no Laboratrio de Tecnologia Enzimtica do Departamento de
Engenharia Qumica da UFSCar, foram tambm estabelecidos protocolos de obteno de
complexos polieletrolticos empregando diferentes tipos de biopolmeros como alginato de
sdio, carragenina e gelatina visando melhorar a estrutura interna dos hidrogis de quitosana
para utilizao como suporte de imobilizao de enzimas de interesse industrial como
quimotripsina, carboxipeptidase A (CPA) e celulases (Adriano, 2008; Adriano et al., 2008). A
utilizao destes complexos polieletrolticos como matriz de imobilizao de enzimas
aumentou significativamente a estabilizao trmica dos derivados imobilizados e por esta
razo foram empregados, neste trabalho, especificamente para imobilizao da lipase de
Thermomyces lanuginosus (LTL).
LTL foi imobilizada em complexos polieletrolticos (CPE) de quitosana
ativados por diferentes protocolos e avaliada a influncia do tipo de matriz sobre os
parmetros de imobilizao tais como protena imobilizada, atividade hidroltica, atividade
recuperada e fator de estabilizao. Hidrogel de quitosana foi empregado como controle. As
concentraes de quitosana e de outros biopolmeros (alginato, PVA, gelatina e carragenina) foram estabelecidas por Adriano et al. (2008) na imobilizao de quimotripsina
em complexos polieletrolticos ativados por diferentes protocolos. O efeito da modificao
qumica dos CPE com TNBS teve como objetivo aumentar a hidrofobicidade destes suportes,
estimada pela adsoro de corante hidrofbico Rosa de Bengala e procentagem de adsoro
de gua. Este composto bloqueia os grupos amino da quitosana, reduzindo o carter
hidroflico das matrizes e, consequentemente, aumentando a hidrofobicidde dos suportes. O
uso de TNBS na hidrofobizao de suportes para a imobilizao de enzimas no relatado na
literatura. A presena do anel aromtico em sua estrutura pode alterar o microambiente do
suporte, favorecendo a partio dos substratos de lipases (triacilgliceris) para os intertcios
da matriz, e aumentando, assim, a eficincia cataltica de derivados de lipases. Os ensaios
foram conduzidos de acordo com metodologia descrita no item 3.2.8.6.
A influncia dos CPE testados e a modificao qumica com TNBS sobre os
parmetros de imobilizao da lipase LTL imobilizada em hidrogis hbridos de quitosana so
mostradas na Tabela 4.8.
109
Tabela 4.8. Influncia do tipo de CPE e da modificao qumica com TNBS sobre os
parmetros de imobilizao da lipase LTL imobilizada em hidrogis hbridos de quitosana.
Carregamento oferecido de 5 mg protena.g-1de gel (956 U. g-1 de gel).
Suporte
TNBS
Agente de
AHder
PI
AR
t1/2
FE
Ativao (U.g-1 de (mg.g-1
(%)
(h)
gel)
gel)
GLI
109,1
1,42
40,0 1,34 15,2
Ausncia
EPI
97,6
1,20
42,5 1,10 12,5
Quitosana
GLU
95,3
2,99
13,1 0,59 7,10
GLI
108,9
0,87
65,5 1,22 13,9
Presena
EPI
97,6
0,98
47,1 1,56 17,7
GLU
90,8
1,98
16,0 0,77 8,75
GLI
99,9
1,08
48,5 1,00 12,5
QuitosanaAusncia
Gelatina
EPI
99,9
1,31
40,0 0,90 11,2
GLU
95,3
3,05
16,3 0,72 8,62
GLI
118,1
1,18
52,4 2,07 23,5
Presena
EPI
121,6
1,16
74,2 2,19 27,3
GLU
113,6
3,20
16,4 0,92 11,0
GLI
74,0
0,95
25,1 0,66 7,45
Ausncia
EPI
50,0
1,08
16,1 0,46 5,24
QuitosanaGLU
36,3
1,98
5,80 0,20 2,31
-carragenina
GLI
104,4
1,06
38,7 0,83 9,44
Presena
EPI
140,7
1,22
50,2 1,45 16,5
GLU
95,7
1,87
14,3 0,93 10,6
GLI
131,5
1,44
44,6 1,24 14,3
Ausncia
EPI
115,1
1,55
38,9 1,27 14,6
Quitosana-PVA
GLU
104,1
2,88
15,3 1,07 12,3
GLI
160,5
1,36
51,3 2,61 30,1
Presena
EPI
178,7
1,39
54,9 2,72 31,4
GLU
148,9
2,72
23,1 1,92 22,1
GLI
163,5
1,82
51,4 0,70 7,89
Ausncia
EPI
201,7
1,70
58,9 1,07 12,3
QuitosanaGLU
194,9
2,97
28,3 0,82 9,29
Alginato
GLI
234,6
1,24
67,8 3,93 45,3
Presena
EPI
217,0
1,11
61,7 3,99 45,2
GLU
213,7
3,54
31,7 3,89 44,2
AHder.: atividade hidroltica do derivado (U.g-1 de gel); PI: Protena imobilizada (mg.g-1 de suporte); AR:
Atividade recuperada (%); t1/2: tempo de meia-vida (h) e FE: Fator de estabilidade.
A adio de alginato quitosana melhorou a estrutura interna do hidrogel em

relao ao hidrogel de quitosana controle. Similar concentrao de protena foi imobilizada
nesses dois suportes, porm, a atividade hidroltica do complexo polieletroltico foi
110
aproximadamente duas vezes superior ao hidrogel controle.

A modificao qumica da quitosana pura com TNBS no melhorou
significativamente os parmetros de imobilizao, inclusive o fator de estabilidade.
provvel que a modificao qumica com TNBS tenha melhorado o microambiente interno do
suporte para a imobilizao da enzima, conforme esperado, mas a pobre congruncia
geomtrica entre o gel de quitosana pura e a enzima no permitiu melhoria dos parmetros de
imobilizao.
Entretanto, os resultados mostram que quando matrizes hbridas de quitosana
eram hidrofobizadas com TNBS foi possvel verificar a formao de um microambiente
favorvel ao processo de imobilizao da lipase microbiana sendo constatado um aumento da
atividade de hidrlise e aumento na estabilizao trmica da enzima. Pode-se dizer que a
utilizao de polieletrlitos melhorou a congruncia geomtrica do suporte e proporcionou a
formao de um microambiente favorvel imobilizao e estabilizao de enzimas.
Dos agentes de ativao testados, glutaraldedo foi o composto que forneceu a
maior porcentagem de protena imobilizada devido sua elevada reatividade em pH alcalino.
Tal reatividade tambm implica formao de um microambiente com dimetro de poros
menor do que a superfcie interna obtida para os hidrogis ativados por epxidos (glicidol e
epicloridrina), conforme constatado anteriormente para a lipase LTL imobilizada em gel
glioxil-amino-glutaraldedo-agarose (Tabela 4.1). A formao de ligaes entre os grupos
ativos do suporte ativado com esse agente e outros grupos ativos da enzima, no somente
grupos amino, mas tambm hidroxilas, sulfetos e outros, causam distoro na estrutura da
enzima. Elevada concentrao de protena foi imobilizada em hidrogis ativados com
glutaraldedo, porm a atividade hidroltica dos derivados foi inferior aos derivados obtidos
com ativao epxi, comportamento similar s lipases imobilizadas em gel de agarose. Dentre
os quatro biopolmeros testados (gelatina, PVA, carragenina e alginato), os biocatalisadores
que apresentaram melhores parmetros de imobilizao foram obtidos para a lipase
imobilizada em complexo polieletroltico quitosana-alginato hidrofobizado com TNBS. Para
o carregamento de 5 mg de protena.g-1 de gel, os trs agentes de ativao produziram
atividade hidroltica superior a 200 U.g-1 de gel, porm o derivado obtido com ativao
glicidol apresentou atividade hidroltica ligeiramente superior aos demais agentes (234 U.g-1
de gel). Valores similares de fator de estabilidade foram obtidos para os trs agentes de
ativao, da ordem de 45 vezes mais estveis que a enzima solvel.
111
A modificao qumica de quitosana aumentou a concentrao de protena

imobilizada em 16% quando ativada com glutaraldedo, enquanto na quitosana controle
verificou-se uma reduo de 33% na imobilizao da protena. Provavelmente, o agente de
hidrofobizao TNBS gerou um menor nmero de grupos ativos para a imobilizao da
enzima em quitosana controle se comparado com o gel hbrido e o decrscimo de grupos
amino disponveis aps a reao com TNBS foi maior para o hidrogel de quitosana controle.
Glutaraldedo reage preferencialmente com os grupos amino do suporte, mas tambm pode
sofrer ataque nucleoflico de outros grupos reativos presentes no suporte como grupos
hidroxilas. De acordo com a literatura, hidrogis de alginato de sdio foram reticulados com
glutaraldedo na encapsulao de pesticidas para a liberao controlada em solos (Kulkarni et
al., 2000). De acordo com a anlise de infravermelho, os autores observaram que os grupos
hidroxilas do suporte desapareceram e ligaes ter foram formadas aps a reao dos grupos
hidroxila do suporte com os grupos aldedo do glutaraldedo. Provavelmente, esse agente
reage preferencialmente com os grupos hidroxila do alginato do que com os grupos hidroxila
da quitosana e dos outros biopolmeros testados. Para os hidrogis hbridos de PVA, gelatina
e -carragenina ativados com glutaraldedo, no foi observada influncia significativa da
modificao qumica sobre a imobilizao de protena.
O complexo polieletroltico quitosana-alginato sem modificao qumica
ativado por agentes epxidos (glicidol e epicloridrina) apresentou maior porcentagem de
protena imobilizada se comparado com a matriz modificada quimicamente com TNBS. Os
resultados evidenciam que a reao do TNBS com esta matriz reduz o nmero de grupos
reativos no suporte. Possivelmente, os grupos glioxil dessa matriz tambm reagem com o
TNBS. Para o hidrogel de quitosana controle e os polieletrlitos quitosana-gelatina, carragenina e PVA tambm no foi observada influncia significante da modificao qumica
na quantidade de protena imobilizada.
Na Figura 4.8 so mostradas as curvas de desaparecimento da atividade
hidroltica dos sobrenadantes das suspenses preparadas, bem como a atividade do controle
(enzima solvel). A atividade enzimtica desaparecida tambm foi fortemente influenciada
pelo tipo de agente de ativao empregado, comportamento semelhante da mesma enzima
imobilizada em agarose.
A imobilizao de LTL em gel quitosana-alginato-TNBS ativado com
glutaraldedo foi finalizada aps 7 h de incubao em pH alcalino, imobilizando cerca de 70%
112
da atividade enzimtica oferecida inicialmente, que corresponde aproximadamente a 3,5 mg

de protena.g-1 de gel. A imobilizao desta lipase na matriz ativada por glutaraldedo mais
rpida devido elevada reatividade deste agente em pH alcalino. A imobilizao da enzima
em glioxil-quitosana-alginato-TNBS tambm foi mais lenta em consequncia da baixa
concentrao de resduos lisina presentes em LTL (apenas sete resduos). Em termos de
concentrao de protena imobilizada, os derivados preparados com glioxil-quitosanaalginato-TNBS so similares aos obtidos em agarose (~1,2 mg de protena.g-1 de gel). Estes
derivados s diferem drasticamente nos valores de atividade hidroltica e atividade
recuperada, mostrando que o suporte quitosana-alginato-TNBS possui menor dimetro de
poros em relao agarose (Tabela 4.8).
1,0
Atividade Residual
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
12

imobilizao de lipase LTL imobilizada em gel quitosana-alginato-TNBS ativado por glicidol
(), epicloridrina () e glutaraldedo () em tampo bicarbonato 100 mM pH 10,05 na
presena de 0,15% de Triton X-100 a 25 C. Carga de protena oferecida de 5 mg.g-1 de gel e
a atividade enzimtica nas condies de imobilizao do controle ().
Quitosana--carragenina foi o polieletrlito que resultou nos menores valores

de atividade hidroltica (Tabela 4.2). Este hidrogel possui alta hidrofilicidade, alta reteno de
gua, e mesmo com a modificao qumica com TNBS a concentrao de gua na matriz foi
superior aos outros hidrogis testados. Similares resultados, quanto hidrofilicidade de
113
hidrogis de -carragenina, so mostrados na literatura (Tapia et al., 2004). Esses autores

testaram complexos polieletrolticos de quitosana-alginato e quitosana--carragenina na
liberao controlada de princpios ativos e verificaram que o complexo quitosana-alginato
possui propriedades fsicas mais favorveis liberao controlada de frmacos que o
complexo quitosana--carragenina devido alta hidrofilicidade deste complexo. Os autores
relataram a formao de uma estrutura interna mais favorvel liberao de frmacos quando
foi usado o complexo quitosana-alginato, corroborando os resultados experimentais obtidos
no presente trabalho.
Os derivados de quitosana-alginato-TNBS ativados por diferentes protocolos
obtiveram apresentaram maiores valores de fator de estabilizao entre os derivados testados
e a cintica de inativao dos derivados a 70 C mostrada na Figura 4.9. Os dados
experimentais tambm foram ajustados a um modelo exponencial de decaimento no linear de
primeira ordem para a estimativa dos tempos de meia-vida e do fator de estabilidade (Sadana
e Henley, 1987).
Os valores do tempo de meia-vida (t1/2) para os trs derivados obtidos foram
prximos a 4 h e os valores de fator de estabilidade foram prximos a 45, ou seja, a lipase
imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativada por diferentes protocolos foi 45 vezes mais
estvel que a enzima na forma solvel. Quitosana-alginato sem modificao qumica foi 4-5
vezes menos estvel que o suporte hidrofobizado. Pode-se afirmar que o processo de
hidrofobizao ocasionou a formao de um microambiente favorvel para a estabilizao da
enzima, ou seja, a geometria interna do suporte favoreceu multi-interaes entre a enzima e os
grupos reativos do suporte que melhorou a estabilizao trmica desses derivados (boa
congruncia geomtrica desta matriz aps o processo de modificao qumica). A segunda
matriz hbrida com maior estabilizao trmica da LTL foi quitosana-PVA ativada com
glicidol e epicloridrina, com fatores de estabilizao de 30,1 e 31,4, respectivamente. Com
respeito estabilizao trmica, a influncia do tipo de biopolmero empregado para a
obteno de matrizes hbridas foi na seguinte ordem: alginato > PVA > gelatina > quitosana
controle > -carragenina. Hidrogis quitosana controle e quitosana--carragenina modificada
com TNBS apresentaram valores de fator de estabilidade semelhantes a 70 C.
Todos os hidrogis hbridos apresentaram aumento na estabilizao trmica da
enzima com a modificao qumica do suporte com TNBS, principalmente o hidrogel
quitosana-alginato, exceto para a quitosana controle e quitosana--carragenina. O complexo
114
polieletroltico quitosana-alginato formado por interaes inicas entre os grupos amino da

quitosana e os grupos carboxilatos do alginato. Essas interaes so controladas pelo pH do
meio, de acordo com relatos sumarizados no item 2.3.4.1. Aps a modificao qumica,
seguido da ativao com glicidol, epicloridrina e glutaraldedo, ocorre a reticulao entre os
biopolmeros dos complexos polieletrolticos que confere maior resistncia mecnica e
qumica s matrizes. Ocorrida a reticulao, o pH do meio no influencia mais na integridade
do polieletrlito.
1,0
Atividade Residual
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
10
Tempo (h)
Figura 4.9. Estabilidade trmica da lipase LTL solvel () e imobilizada em quitosanaalginato-TNBS ativado com glicidol (), epicloridrina () e glutaraldedo (). A inativao
trmica foi realizada a 70 C em tampo fosfato 100 mM pH 8,0.
Os efeitos mais importantes da modificao qumica com TNBS foram os

aumentos da atividade cataltica e da estabilizao trmica da lipase LTL imobilizada,
decorrente da formao de microambiente que favoreceu a interao da enzima com o
suporte. Na estabilizao de enzimas por imobilizao, necessrio um alinhamento entre os
grupos reativos do suporte com os grupos da enzima para que ocorram multi-interaes e na
hidrofobizao das matrizes hbridas, ocorreu uma maior proximidade entre os biopolmeros
que constituam estas matrizes. Para as lipases, a hidrofobicidade da matriz um parmetro
muito importante para que o acesso do substrato (leo) aos interstcios da matriz seja
favorecido. O efeito da modificao qumica com TNBS sobre a hidrofobicidade do suporte
115
selecionado quitosana-alginato pode ser estimada por adsoro de corante hidrofbico Rosa
de Bengala e a cintica de adsoro do corante mostrada na Figura 4.10. Como controle foi
empregado o polieletrlito no modificado quimicamente, conforme metodologia descrita no
item 3.2.7.1.
Os resultados mostrados na Figura 4.10 indicam que aps 15 min a matriz
quitosana-alginato-TNBS adsorveu trs vezes mais corante Rosa de Bengala que o suporte
no modificado quimicamente. Aps 60 min de incubao, o hidrogel no modificado
adsorveu 771,0 9,8 e o hidrogel modificado quimicamente adsorveu 973,3 21 g de
corante.g-1 de gel. Gupta e Jabrail (2006) avaliaram o efeito da reticulao de quitosana de
diferentes graus de desacetilao e reticulados com diferentes concentraes de glutaraldedo
sobre a hidrofobizao do gel na adsoro de rosa de bengala. O gel obtido a partir de
quitosana com grau de desacetilao de 62% e reticulado com glutaraldedo a 12% adsorveu
0,22 mL de corante por m2 de gel, bastante superior ao mesmo gel sem reticulao com
glutaraldedo (0,029 mL.m-2), mostrando que os resultados apresentados no presente
trabalho esto de acordo com os apresentados na literatura.
-1
Adsorao (g.g de gel)
1000
800
600
400
200
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de Adsoro (m in)
Figura 4.10. Cintica de adsoro do corante hidrofbico Rosa de Bengala em hidrogis

hbridos de quitosana-alginato () e quitosana-alginato-TNBS ().
116
A porcentagem de hidratao (PH) outro parmetro empregado para a

estimativa da hidrofobicidade de um material. Como a hidrofobicidade e hidrofilicidade so
caractersticas opostas, a determinao da porcentagem de hidratao de um hidrogel tambm
pode ser usada para avaliar a hidrofobicidade de um suporte (Gupta e Jabrail, 2006).
Quitosana hidroflica em meio cido devido presena de grupos aminos livres, no entanto,
aps a modificao qumica por reticulao dos grupos amino, o biomaterial apresenta carter
hidrofbico, reduzindo a capacidade de reteno de gua em sua molcula (Gonalves et al.,
2005). Por isso, a porcentagem de hidratao de quitosana-alginato no modificada e
modificada quimicamente com TNBS, estimado conforme descrito no item 3.2.7.2, tambm
foi avaliada por incubao das matrizes em soluo aquosa pH 7,0 por 24 h e os resultados
esto sumarizados na Tabela 4.9. O hidrogel modificado quimicamente reteve 68,8 5,0% de
gua, duas vezes inferior ao comportamento verificado no hidrogel no modificado (161,9
14,4%). Em pH 3,0 foi verificada total dissoluo do polieletrlito no modificado
quimicamente enquanto o suporte modificado quimicamente manteve sua total integridade
(dados no mostrados). Resultados similares foram obtidos por Gupta e Jabrail (2006).
Hidrogel de quitosana com grau de desacetilao de 62% e reticulado com glutaraldedo a
12% apresentou menor porcentagem de hidratao (150%) em comparao com quitosana
no reticulada (320%).
Tabela 4.9. Adsoro de corante hidrofbico Rosa de Bengala e porcentagem de hidratao
(PH) de quitosana-alginato no modificado e modificado quimicamente com TNBS.
CPE
Adsoro de Rosa de
PH
(%)
Bengala (g.g-1 de gel)
Quitosana-Alginato
771,0 9,8
161,9 14,4
Quitosana-Alginato-TNBS
973,3 21
68,8 5,0
Ainda visando melhor caracterizao do efeito da modificao qumica com

TNBS, foi tambm estimada a porcentagem de grupos amino que reagiram com TNBS (item
3.2.7.3), bem como o efeito da etapa de ativao do suporte com glicidol, epicloridrina e
glutaraldedo ps-modificao qumica sobre este parmetro. De acordo com a literatura, um
dos agentes de ativao empregado no presente trabalho, glutaraldedo, extensivamente
empregado na reticulao de hidrogis de quitosana (Berger et al., 2004; Gonalves et al.,
117
2005; Gupta e Jabrail, 2006), o mesmo pode ser verficado para a epicloridrina (Gonalves et
al., 2005; de Oliveira et al., 2006). A aplicao de glicidol na reticulao de hidrogis no
relatada. Os resultados de porcentagem de reticulao de grupos amino na modificao
qumica com TNBS e na ativao ps-modificao qumica com glicidol, epicloridrina e
glutaraldedo so mostrados na Figura 4.11.
100
Porcentagem de Reticulao (%)
80
60
40
20
0
QA-TNBS
QA-TNBS-GLI
QA-TNBS-EPI
QA-TNBS-GLU
Figura 4.11. Porcentagem de reticulao de hidrogis de quitosana-alginato-TNBS e ativados

por diferentes protocolos.
A porcentagem de reticulao dos grupos amino presentes na quitosana com o

processo de hidrofobizao com TNBS foi de 54 %, estimado conforme descrito no item
3.2.7.3. Com a ativao com glicidol, no foi verificada alterao da concentrao de grupos
amino remanescentes, mostrando que o glicidol no sofre ataque nucleoflico dos grupos
amino do suporte nas condies empregadas na etapa de ativao do suporte. A ativao com
epicloridrina reduziu a concentrao de grupos amino do suporte, com porcentagem de
reticulao prxima a 80%. O protocolo de ativao adotado (Beppu et al., 2004) utiliza
excesso do agente de ativao, em comparao metodologia adotada para a ativao com
glicidol (Guisn, 1988) o que auxiliou na reticulao do suporte. A ativao com
glutaraldedo elevou a porcentagem de reticulao para valores superiores a 90%. Contudo,
118
mesmo ativando o suporte com excesso de glutaraldedo, ainda permanecem sem reagir 9%
dos grupos aminos.
Esta elevada porcentagem de reticulao pelo glutaraldedo decorrente da sua
elevada reatividade e afinidade na reticulao de grupos amino que pode reduzir o tamanho de
poros do suporte e, consequentemente, a eficincia cataltica da enzima. De acordo com os
valores de protena imobilizada e atividade hidroltica da LTL imobilizada em quitosanaalginato-TNBS (Tabela 4.8), o derivado de glutaraldedo imobilizou trs vezes mais protena
que os derivados ativados com epxidos. No entanto, os valores de atividade hidroltica dos
derivados foram similares, mostrando que a ativao com glutaraldedo reduz o tamanho do
dimetro de poro do suporte.
Estes resultados mostram claramente que a modificao da quitosana com
TNBS aumentou a hidrofobicidade do polieletrlito selecionado quitosana-alginato, tornando
atrativa a sua aplicao como suporte para a imobilizao de lipases e posterior aplicao do
biocatalisador em reaes em meios anidros.
Tambm foi realizado um ensaio controle empregando hidrogel hbrido
quitosana-alginato-TNBS submetido oxidao com periodato de sdio (item 3.2.6.6), sem
etapa de ativao com os agentes glicidol, epicloridrina e glutaraldedo, como suporte
alternativo na imobilizao de LTL. A imobilizao de LTL foi realizada conforme
metodologia descrita no item 3.2.8.6. ons periodato (IO4-) atacam diis vicinais presentes na
estrutura de alguns biopolmeros de natureza glicosdica tais como alginato, quitosana,
carragenina. A clivagem do anel glicosdico resulta na formao de um dialdedo que pode ser
utilizado como matriz para a imobilizao de enzimas (Vold e Christensen, 2005). Esses
biopolmeros funcionalizados com ons periodato como quitosana tem sido empregados na
imobilizao de enzimas. Entretanto, a oxidao com ons periodato aumenta a flexibilidade
do biopolmero e a sua solubilidade devido despolimerizao do material. A reticulao de
grupos hidroxila e amino desses materiais por agentes bifuncionais impede o ataque dos ons
periodato sobre estes grupos presentes no anel glicosdico do suporte e, consequentemente a
solubilizao da matriz (Vold e Christensen, 2005). O suporte quitosana-alginato-TNBS no
ativado foi submetido oxidao com soluo de periodato de sdio na concentrao de 300
moles de periodato.g-1 de suporte e empregado na imobilizao de LTL, porm quase todo o
hidrogel hbrido oxidado com periodato foi solubilizado nas condies adotadas de
imobilizao (pH 10,05). A solubilizao do suporte no ocorreu quando foi submetido
119
etapa de ativao com agentes bifuncionais como glicidol, epicloridrina e glutaraldedo. A

ativao de quitosana-alginato-TNBS com estes agentes confere maior estabilidade qumica e
mecnica ao suporte, atendendo, assim, um dos mais importantes pr-requisitos para a
aplicao de um suporte como matriz de imobilizao de enzimas, a sua insolubilidade.
De acordo com a estimativa da porcentagem de grupos amino reticulados,
nota-se que a epicloridrina, um agente bifuncional com grupo epxido e amplamente
empregado na reticulao de grupos hidroxila de suportes orgnicos (Gonalves et al., 2005;
Fangkangwanwong al., 2006) reagiu com grupos amino do suporte, mostrando que a reao
da epicloridrina no ocorre somente com os grupos hidroxila. Glutaraldedo reage
preferencialmente com grupos amino da quitosana na formao de bases de Schiff (-C=N) e
glicidol mostrou ter reagido somente com os grupos hidroxila do suporte.
importante salientar que a utilizao desses agentes na etapa de ativao,
alm de inserir grupos reativos com a enzima no suporte, tambm tem a funo de reticular o
suporte, conferindo maior resistncia ao suporte. Os resultados obtidos mostram que a
reticulao e/ou ativao com agentes bifuncionais uma importante ferramenta para o
emprego de matrizes hbridas de quitosana na imobilizao de enzimas por ligao covalente
multipontual.
4.1.4.2. Influncia do Tempo de Imobilizao e Reduo com Borohidreto de Sdio
Foi investigado o efeito do tempo de imobilizao para LTL imobilizada no

suporte selecionado quitosana-alginato modificado quimicamente com TNBS e ativado por
diferentes protocolos. Os ensaios foram realizados como descrito no item 3.2.8.6. Os
resultados obtidos quando se variou o tempo de imobilizao de 12 para 24 h esto
sumarizados na Tabela 4.10.
Observa-se que, embora a concentrao de protena imobilizada tenha sido
similar em 12 e 24 h, as atividades hidrolticas dos derivados imobilizados em 24 h foram
24% (ativado com glutaraldedo) e 40% (ativado com glicidol e epicloridrina) menores que os
derivados imobilizados em 12 h e sem reduo com borohidreto de sdio. Por outro lado,
esperava-se que com o aumento do tempo de imobilizao houvesse aumento da estabilizao
120
dos derivados, porm isso no ocorreu. A distribuio das lisinas na superfcie de LTL deve
ser responsvel por esse comportamento, j ocorrido e explicado na produo de outros
derivados. Assim, tempo de imobilizao de 12 h foi selecionado.
Verificou-se tambm a influncia da reduo das bases de Schiff com NaBH4
sobre a atividade hidroltica e estabilidade trmica dos derivados e os resultados obtidos
tambm so apresentados na Tabela 4.10. Bases de Schiff (ligao dupla C = N) so formadas
entre o grupo aldedo do suporte e os grupos amino da enzima (Palomo et al., 2005). A
reduo das bases de Schiff para transform-las em ligaes covalentes estveis, bem como a
reduo dos grupos aldedo remanescentes no suporte aps a imobilizao, que voltam a ser
grupos hidroxilas inertes uma etapa importante no processo de imobilizao (Palomo et al.,
2005).
Tabela 4.10. Influncia do tempo de imobilizao e da reduo com borohidreto de sdio
sobre os parmetros de imobilizao de LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS
ativado por diferentes protocolos. Carga enzimtica oferecida de 5 mg protena.g-1 de gel (956
U. g-1 de gel).
Tempo de
Agente de Reduo
PI
AR
t1/2
FE
AHder
Imobilizao
Ativao
com
(U.g-1
(mg.g-1
(%)
(h)
NaBH4
de gel)
gel)
No
234,6
1,81
67,8
3,93
45,3
GLI
12 h
24 h
EPI
No
217,0
1,84
61,7
3,99
45,2
GLU
No
213,7
3,54
32,6
3,89
44,2
GLI
Reduzido
207,9
1,91
56,9
3,22
37,1
EPI
Reduzido
178,6
1,87
49,9
3,33
38,4
GLU
Reduzido
164,9
3,61
23,9
3,01
34,7
GLI
No
147,9
1,74
47,7
3,90
43,3
EPI
No
126,0
1,73
44,5
4,09
48,7
GLU
No
164,4
3,69
29,2
3,80
42,2
GLI
Reduzido
121,9
1,81
35,2
3,37
38,9
EPI
Reduzido
111,4
1,84
31,7
3,42
39,4
GLU
Reduzido
137,9
3,78
19,1
2,78
32,1
-1
AHder.: atividade hidroltica do derivado (U.g de gel); PI: Protena imobilizada (mg.g
-1
de suporte); AR:
121
As atividades determinadas para os derivados foram de 11 a 23% menores aps

a etapa de reduo, para todos os agentes de ativao empregados. No entanto, para os
derivados ativados com glutaraldedo esta reduo foi mais significativa, mostrando que
maior nmero de bases de Schiff foi alcanado com esse agente de ativao. De acordo com a
literatura, a perda de atividade dos derivados aps reduo com NaBH4 tem sido relacionada
com a reduo das pontes de dissulfeto na estrutura da enzima (Brgida et al., 2007;
Rodrigues et al., 2008). Rodrigues et al. (2008) avaliaram as influncias da temperatura (4 e
25 C) e da concentrao de NaBH4 (0,5 e 1,0 mg.mL-1 de suspenso) sobre a atividade
hidroltica de CALB imobilizada em glioxil-agarose. Esses autores observaram que a
atividade hidroltica dos derivados no foi afetada aps a reduo realizada a baixa
temperatura e baixa concentrao de NaBH4, mas observaram perda de atividade quando a
etapa foi realizada nas mesmas condies experimentais utilizadas neste trabalho (25 C, 1,0
mg.mL-1 de suspenso). Recomenda-se assim que a reduo seja realizada a 4 C utilizando
0,5 mg.mL-1 de NaBH4. A estabilidade trmica dos derivados obtidos neste trabalho tambm
foi menor aps reduo com NaBH4 e os resultados esto de acordo com os relatados na
literatura para CALB imobilizada em glioxil-fibra de coco verde (Brgida et al., 2007).
4.1.4.3. Modificao Qumica do Hidrogel Quitosana-Alginato com Laurinaldedo
As lipases mostram elevada afinidade por suportes modificados quimicamente

por agentes hidrofbicos (Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002; Mendes et al., 2006). A
reao dos grupos amino da quitosana com laurinaldedo responsvel pela insero de
cadeias alifticas com 12 tomos de carbono na superfcie do suporte, alterando a
hidrofobicidade do suporte. Objetivou-se, com a utilizao de laurinaldedo como agente de
modificao qumica, alterar o microambiente do suporte para favorecer o processo de
imobilizao da enzima como agente alternativo ao TNBS. Para avaliar este efeito, variou-se
a concentrao de laurinaldedo de 1 a 5% empregando o complexo polieletroltico
selecionado quitosana-alginato e ativado com glicidol e os resultados obtidos so mostrados
na Tabela 4.11.
122
Tabela 4.11. Influncia da concentrao de laurinaldedo sobre os parmetros de

imobilizao da lipase LTL imobilizada em quitosana-alginato ativado com glicidol. Carga
enzimtica oferecida de 5 mg de protena.g-1gel (956 U. g-1de gel).
Porcentagem
Parmetros de Imobilizao
(% m.m-1)
AHder
PI
AR
t1/2
FE
(U.g-1 de gel)
(mg.g-1 gel)
(%)
(h)
54,8
1,06
22,7
1,18
18,0
1
3
71,2
1,18
29,1
1,58
24,2
87,7
1,36
36,4
1,59
24,5
Como esperado, o aumento da concentrao de laurinaldedo aumentou

tambm a atividade hidroltica e, consequentemente, a atividade recuperada de LTL
imobilizada. O aumento de 1 para 5% no aumentou consideravelmente a concentrao de
protena imobilizada, indicando que um novo aumento na concentrao do aldedo no
conduziria a uma melhoria significativa na imobilizao de protena. O valor de protena
imobilizada obtida utilizando quitosana-alginato modificada com laurinaldedo na
concentrao de 5% foi semelhante ao hidrogel quitosana-alginato-TNBS, mas a atividade
hidroltica dos derivados obtidos com este agente, bem como o fator de estabilidade, foram
inferiores aos obtidos com TNBS (Tabela 4.8). Portanto, neste caso, a lipase mostrou ter mais
afinidade pelo complexo eletroltico modificado quimicamente com TNBS, sendo mais eficaz
para promover a formao de um microambiente mais favorvel enzima.
4.1.4.4. Efeito de Carga Mxima de Protena sobre os Parmetros de Imobilizao de

LTL Imobilizada em Quitosana-Alginato-TNBS
Para a determinao da carga mxima de protena que poderia ser utilizado na

imobilizao de LTL em quitosana-alginato-TNBS ativado por diferentes protocolos, a carga
de protena oferecida variou de 5 a 50 mg.g-1 de gel e os resultados so apresentados na
Tabela 4.12. Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia apresentada no item
3.2.8.6.
123
Tabela 4.12. Parmetros de imobilizao obtidos para diferentes cargas de protena oferecida
para quitosana-alginato-TNBS ativada por diferentes protocolos. Atividade enzimtica de
LTL de 191,2 U.mg-1 de protena.
Protena
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1) AHder
PI
AR AHder
PI
AR
AHder
PI
AR
(U.g-1 (mg.g-1 (%) (U.g-1 (mg.g-1 (%) (U.g-1 de (mg.g-1
(%)
de gel) gel)
de gel)
gel)
gel)
gel)
234,6
1,81
67,8 217,0
1,84
61,7
213,7
3,55
31,0
5
10
243,2
3,79
33,5
220,8
3,80
30,4
243,2
6,40
20,7
30
307,0
6,08
26,4
310,4
6,34
25,6
288,0
15,4
10,1
50
352,2
7,76
18,5
364,8
7,65
19,1
297,6
17,5
9,17
Atividade recuperada (%).
Para a carga mxima de protena oferecida (50 mg.g-1 de gel), o hidrogel

ativado com glutaraldedo imobilizou 17,5 mg de protena.g-1 de gel, para o polieletrlito
ativado por agentes epxidos (glicidol e epicloridrina) a mxima concentrao de protena
imobilizada foi de 7,76 e 7,65 mg.g-1 de gel, respectivamente. No entanto, a maior atividade
da enzima imobilizada foi obtida para o hidrogel ativado com epicloridrina (364,8 U.g-1 de
gel). A alta reatividade do glutaraldedo pode ser responsvel por este resultado, com
comportamento similar enzima imobilizada em gel de agarose. possvel que, nestas
condies, o suporte ativado com este agente provocou distores na estrutura tridimensional
da enzima, levando a uma conformao inativa de muitas molculas da enzima ou uma m
orientao da protena imobilizada impedindo o acesso do substrato ao stio cataltico da
enzima. Efeitos difusivos tambm podem ser responsveis pela menor atividade da enzima
imobilizada.
A atividade recuperada diminuiu com o aumento da carga de protena para
todos os derivados, observando-se redues maiores para os derivados ativados com
glutaraldedo. O valor deste parmetro diminuiu de quase 31% para o ensaio de menor carga
de enzima oferecida (5 mg.g-1 de gel) para menos de 10% com o carregamento mximo
oferecido (50 mg.g-1 de gel). A atividade enzimtica do derivado aumenta com o aumento da
carga de protena e a velocidade de difuso do substrato nos intertcios do gel pode diminuir
com a presena de mais molculas de protena imobilizada por reduo do dimetro de poro
da matriz (Gomes et al., 2004; Rodrigues et al., 2008). De acordo com os resultados (Tabela
124
4.12), observa-se que oferecimento acima de 50 mg de protena.g-1de gel no deve conduzir a

melhorias significativas dos parmetros de imobilizao.
Para a lipase LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS, a mxima
atividade hidroltica e a estabilidade trmica dos derivados foram similares para os trs tipos
de agentes de ativao testados. Conforme j constatado para os outros suportes, a maior
quantidade de protena imobilizada foi obtida quando o suporte foi ativado com glutaraldedo,
mas com menor atividade recuperada.
4.1.4.5. Influncia da Temperatura sobre a Atividade Hidroltica de LTL Solvel e

Imobilizada em Quitosana-Alginato-TNBS
A influncia da temperatura na atividade hidroltica das lipases imobilizadas e

solveis foi determinada na faixa de 30-90 C (item 3.2.10.1). Os resultados so mostrados na
Figura 4.12. Como se pode observar, a temperatura mxima de atividade hidroltica para a
enzima solvel foi de 60 e de 65 C quando a lipase foi imobilizada em quitosana-alginatoTNBS-glutaraldedo e de 70 C para os derivados obtidos por ativao com glicidol e
epicloridrina. Esses resultados confirmam que a imobilizao conduziu a um aumento na
rigidez da estrutura proteica da enzima, que normalmente observado devido ao aumento da
estabilidade trmica da enzima. Quitosana-alginato-TNBS ativado por compostos glicidol e
epicloridrina permitiu maior estabilidade temperatura elevada do que o derivado ativado
com glutaraldedo.
125
Atividade Relativa
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
30
40
50
60
70
80
90
T e m peratura ( o C )
Figura 4.12. Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL solvel () e

imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativada com glicidol (), epicloridrina () e
glutaraldedo ().
4.1.4.6. Influncia do pH sobre a Atividade Hidroltica de LTL Solvel e Imobilizada em

Quitosana-Alginato-TNBS
O pH do meio pode afetar a estrutura tridimensional da enzima, bem como as

cargas inicas dos resduos da enzima que catalizam a reao e o carter inico dos
substratos. A imobilizao pode alterar o microambiente da enzima e, consequentemente,
alterar a atividade hidroltica do biocatalisador. O efeito do pH sobre a atividade de hidrlise
da lipase solvel e imobilizada em quitosana-alginato-TNBS foi analisado na faixa de pH de
5,0-9,0 na temperatura tima previamente determinada para cada sistema, 60 C para a lipase
solvel, 65 C para o derivado ativado com glutaraldedo e a 70 C para os derivados ativados
com glicidol e epicloridrina. On ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia
descrita no item 3.2.10.2. Os resultados so apresentados na Figura 4.13.
Conforme apresentado na Figura 4.13, a lipase solvel e imobilizadas
revelaram atividades mximas em pH 8,0. Lipase imobilizada em hidrogel ativado com
126
glutaraldedo foi muito mais estvel na regio cida do que na regio alcalina. Lipase solvel
e imobilizada em suporte ativado com agentes epxidos foram mais estveis na regio
alcalina. Para valores de pH superior a 9,0, a lipase solvel foi mais estvel que os derivados.
Esperava-se que a imobilizao de uma enzima em um suporte de carter inico iria causar
mudanas do pH timo da enzima. Geralmente, a imobilizao de uma enzima em suporte
inico resulta na mudana no pH timo da enzima (Pereira et al., 2003). No entanto, este
comportamento no foi observado, provavelmente devido modificao qumica pelo TNBS.
1,0
Atividade Relativa
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
5
pH
Figura 4.13. Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL solvel () e

imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativada com glicidol (), epicloridrina () e
glutaraldedo ().
4.1.4.7. Sntese de Butirato de Butila por LTL Imobilizada em Quitosana-AlginatoTNBS
Os derivados selecionados de LTL imobilizados em quitosana-alginato-TNBS

foram empregados em reaes em meio orgnico na sntese do ster aromatizante butirato de
butila. A reao foi conduzida em meio de heptano, conforme metodologia descrita no item
3.2.3, por 24 h e os resultados obtidos esto sumarizados na Tabela 4.13.
127
Os maiores valores de converso em butirato de butila foram alcanados para

LTL imobilizada em glioxil-quitosana-alginato-TNBS (ativao via glicidol e epicloridrina),
entre 55,8 e 57,4 mM. A converso em butirato de butila para o derivado preparado por
ativao com glutaraldedo tambm foi inferior aos derivados glioxil, resultados similares aos
obtidos para LTL imobilizada em agarose. Esses resultados mostram que LTL imobilizada em
quitosana-alginato-TNBS apresentou um bom desempenho em reaes em meio orgnico,
sendo tambm promissor para a sntee de bodiesel.
Tabela 4.13. Sntese de butirato de butila catalisada por LTL imobilizada em quitosanaalginato-TNBS ativada por diferentes protocolos.
Agente de Ativao
Butirato de Butila
(mM)24 h
57,4
GLI
55,8
EPI
42,9
GLU
4.1.5. Imobilizao de LTL em Poli-(hidrxibutirato) (PHB) Ativado por Diferentes

Agentes
PHB foi utilizado como matriz de imobilizao covalente da lipase LTL

ativado por diferentes protocolos. Sua aplicao na imobilizao de enzimas no relatada na
literatura e por se tratar de um suporte de baixo custo foi empregado na preparao de
derivados de LTL e os parmetros de imobilizao destes derivados esto sumarizados na
Tabela 4.14. Os ensaios foram realizados como descrito no item 3.2.8.6.
Tabela 4.14. Imobilizao de lipase microbiana LTL em PHB ativado por diferentes
protocolos. Carga enzimtica oferecida de 5 mg protena.g-1 de suporte (atividade oferecida =
956 U.g-1 de suporte).
Ativao
AHder.
FE
PI
AR
t1/2
-1
-1
(h)
(U.g de suporte) (mg.g de suporte)
(%)
76,7
0,99
40,7
1,47
22,5
GLI
GLU
76,8
1,74
-1
23,1
1,06
-1
16,2
de suporte); AR:
128
A ativao do PHB com epicloridrina no foi possvel porque o PHB bastante

solvel em epicloridrina. De acordo com os dados apresentados, os valores de atividade
enzimtica dos derivados preparados empregando glioxil-PHB ativado com glicidol e glioxilamino-PHB ativado com glutaraldedo foram bastante similares, da ordem de 77,0 U.g-1 de
suporte. Apesar dos valores de atividade hidroltica terem sido similares, a atividade
recuperada do derivado glioxil foi quase duas vezes superior ao derivado preparado por
ativao com glutaraldedo (23,1%), em razo da maior limitao difusional do derivado
ativado com glutaraldedo que imobilizou maior concentrao de protena. A concentrao de
protena imobilizada em suporte glioxil-PHB foi similar aos valores obtidos para a LTL
imobilizada
em
glioxil-agarose
6BCL
em
glioxil-quitosana-alginato-TNBS,
aproximadamente 30% da atividade oferecida inicialmente foi imobilizada. O tempo de meiavida do derivado preparado em glioxil-amino-PHB ativado com glutaraldedo foi de 1,06 h,
ligeiramente inferior ao derivado preparado por ativao com glicidol (1,47 h). Os valores de
atividade hidroltica obtidos com a imobilizao covalente em PHB so inferiores aos obtidos
com agarose e quitosana.
4.1.6. Imobilizao de Lipase em Bagao de Cana-de-Acar Ativado por Diferentes

Agentes
O uso de materiais lignocelulsicos como matriz de imobilizao de lipases

bastante relatado na literatura (Freitas et al., 2003; Perez et al., 2007). A principal
caracterstica destes compostos o grande nmero de grupos hidroxila que so importantes no
processo de ativao da matriz via glioxil, por agentes bifuncionais como glicidol e
epicloridrina, que reagem preferencialmente com grupos hidroxila do suporte. Os materiais
lignocelulsicos possuem estrutura qumica bastante similar quitina e quitosana, o que
difere entre eles a presena de grupos amino presentes na estrutura da quitina e quitosana.
No presente trabalho foi utilizado o bagao de cana como matriz para a imobilizao de LTL,
um suporte de baixo custo proveniente do setor sucro-alcooleiro alternativo quitosana, e os
parmetros de imobilizao dos derivados preparados esto sumarizados na Tabela 4.15.
129
A utilizao do bagao de cana como matriz de imobilizao da lipase em

estudo permitiu obter derivados com elevada atividade hidroltica. O suporte ativado com
glicidol e epicloridrina apresentou atividade hidroltica ligeiramente inferior quitosanaalginato-TNBS (Tabela 4.8). O suporte ativado com glicidol e epicloridrina obteve atividade
hidroltica de 183,6 e 191,8 U.g-1 de gel, respectivamente. O suporte ativado com
glutaraldedo apresentou baixa atividade hidroltica (79,5 U.g-1 de gel) devido alta
reatividade deste agente em pH alcalino que provocou menor acesso do substrato aos stios
ativos da enzima causado por efeitos difusivos ou distoro da estrutura ativa da enzima aps
a imobilizao.
Tabela 4.15. Imobilizao de LTL em bagao de cana ativado por diferentes protocolos.
Carga enzimtica oferecida de 5 mg protena.g-1 de suporte (atividade oferecida = 956 U.g-1
de suporte).
Ativao
AHder.
FE
PI
AR
t1/2
-1
-1
(h)
(U.g de suporte) (mg.g de suporte)
(%)
183,6
1,27
75,5
1,16
17,7
GLI
EPI
191,8
GLU
79,5
-1
1,27
78,8
1,25
19,1
1,97
21,1
0,87
13,2
-1
de suporte); AR:
A concentrao de protena imobilizada em derivados glioxil-bagao tambm

foi similar aos derivados de LTL imobilizados em agarose e em quitosana-alginato-TNBS,
prximo a 30% da protena inicialmente oferecida. Para o suporte ativado com glutaraldedo,
a concentrao de lipase imobilizada foi de apenas 40% da enzima inicialmente oferecida,
inferior aos resultados obtidos para a LTL imobilizada em glioxil-amino-agaroseglutaraldedo (100%) e quitosana-alginato-TNBS-glutaraldedo (70%), conforme mostrado na
Tabela 4.8.
A imobilizao de LTL em quitosana-alginato-TNBS estabilizou termicamente
os derivados preparados 45 vezes em relao enzima solvel a 70 C. Com os derivados
imobilizados em bagao de cana, esta estabilizao foi cerca de 50% menor. Os maiores
fatores de estabilidade obtidos para o bagao de cana foram obtidos para os derivados
130
ativados com epicloridrina e glicidol, entre 17 e 19 vezes, respectivamente. Resultados

similares foram relatados na literatura (Freitas et al., 2003).
4.1.7. Imobilizao de Lipases em Gel Amino-Toyopearl
Lipases LTL e LPF foram imobilizadas em amino-toyopearl, uma resina

acrlica disponvel comercialmente com excelentes propriedades qumicas e mecnicas,
bastante apropriada para a obteno de biocatalisadores de interesse industrial. A
imobilizao de enzimas em gis glioxil-amino-toyopearl foi realizada na presena de
tensoativo Triton X-100 (Palomo et al., 2005). O suporte foi ativado por glicidol,
epicloridrina e glutaraldedo. Para este suporte no foi realizada a etapa de aminao por
etilenodiamina para posterior ativao com glutaraldedo devido presena de grupos amino
no suporte. As propriedades catalticas destes derivados preparados so mostradas na Tabela
4.16. Os ensaios foram conduzidos conforme descrito no item 3.2.8.6.
Tabela 4.16. Parmetros de imobilizao da LTL e LPF em toyopearl ativado por diferentes
protocolos. Carga oferecida de 5 mg de protena.g-1 de gel. Atividade oferecida: LTL (956
U.g-1 de gel) e LPF (1087,5 U.g-1 de gel).
Lipase
Agente
AHder.
PI
AR
t1/2
FE
-1
-1
(U.g )
(mg.g )
(%)
(h)
188,4
1,62
60,9
1,92
27,0
GLI
LTL
LPF
EPI
244,9
1,84
69,7
1,93
31,0
GLU
169,6
5,00
17,7
1,77
21,0
GLI
44,0
1,89
10,7
0,39
5,20
EPI
58,7
2,20
12,3
0,43
5,70
GLU
33,4
5,00
3,07
0,31
4,00
-1
AHder.: Atividade hidroltica do derivado (U.g de gel); PI: Concentrao de protena imobilizada (mg de
protena.g-1 de gel) e AR: Atividade recuperada (%), t1/2 o tempo de meia-vida e FE: fator de estabilidade.
Os derivados preparados de LTL tambm foram mais ativos que os preparados

por LPF, comportamento semelhante agarose. O maior valor de atividade hidroltica de LTL
foi para a enzima imobilizada em glioxil-amino-toyopearl ativado com epicloridrina (244,9
131
U.g-1 de gel), seguido de ativao glicidol (188,4 U.g-1 de gel) e glutaraldedo (169,6 U.g-1 de
gel). Os valores de atividade hidroltica de LPF dos derivados preparados por imobilizao
em glioxil-amino-toyopearl foram similares aos obtidos em glioxil-agarose, inferiores a 60
U.g-1 de gel. A concentrao de protena imobilizada de LTL tambm apresentou valores
semelhantes aos outros suportes testados, quando se utilizou imobilizao via glioxil (glicidol
e epicloridrina). Para a ativao glutaraldedo, segue o mesmo comportamento dos outros
suportes testados. A imobilizao de LPF em amino-toyopearl mostrou menor concentrao
de enzima imobilizada em comparao agarose que foi de aproximadamente 3,5 mg de
protena.g-1 de gel (Tabela 4.1), enquanto em amino-toyopearl oscilou entre 2 mg.g-1 de gel
(Tabela 4.16). A atividade recuperada dos derivados preparados via glioxil foi da ordem de
70%. Derivado de glutaraldedo apresentou forte limitao difusional devido sua alta
reatividade que reduz o dimetro de poro da matriz ou tambm por distoro da estrutura
ativa da enzima. Na imobilizao de LPF, os valores de atividade recuperada tambm foram
muito baixos, similar aos valores encontrados em agarose (Tabela 4.1).
Os dados experimentais de inativao trmica dos derivados de LTL e LPF
preparados por amino-toyopearl tambm foram ajustados a um modelo de decaimento
exponencial para a estimativa dos tempos de meia-vida e fator de estabilidade, como
mostrados na Figura 4.14.
Derivados de LTL preparados com agarose foram mais estveis que os obtidos
empregando amino-toyopearl como suporte (Tabela 4.1). Derivados de LTL imobilizada em
amino-toyopearl foram aproximadamente 10 vezes menos estveis que os derivados de
agarose, estabilizando entre 21 (glutaraldedo) a 31 vezes (epicloridrina) a lipase em relao
sua forma solvel. Derivados ativados por glicidol (FE=27) e epicloridrina (FE=31) so
ligeiramente mais estveis que os ativados por glutaraldedo, com tempo de meia-vida
prxima a 2,5 h (Figura 4.14A). Os valores de estabilizao trmica dos derivados de aminotoyopearl foram semelhantes aos resultados de parmetros de imobilizao de LTL
imobilizada em bagao de cana (Tabela 4.15). Em relao ao custo do suporte, bagao de
cana mostra ser mais vivel economicamente para a obteno de derivados de LTL. Os
derivados de LPF foram tambm pouco termoestveis com resultado similar ao obtido para os
derivados de LPF em agarose.
132
(A)
(B)
LTL
1,0
0,8
0,8
Atividade Residual
Atividade Residual
LPF
1,0
0,6
0,4
0,2
0,6
0,4
0,2
0,0
0
100
200
300
400
0,0
500
Tempo (min)
10
20
30
40
Tempo (min)
Figura 4.14. Inativao trmica das enzimas solveis () e dos derivados preparados de LTL
(A) e LPF (B) imobilizados em glioxil-toyopearl ativados por glicidol (), epicloridrina () e
glutaraldedo () incubados a 70 C na presena de tampo fosfato pH 8,0 100 mM.
LTL foi imobilizada em toyopearl na presena de Triton X-100, oferecendo

diferentes carregamentos de protena (5-80 mg.g-1 de suporte) e os parmetros de
imobilizao esto sumarizados na Tabela 4.17. A influncia do carregamento de enzima
sobre as propriedades catalticas de LPF imobilizada neste suporte no foi testada.
Tabela 4.17. Parmetros de imobilizao da LTL em amino-toyopearl ativada por diferentes
CP
Glicidol
Epicloridrina
Glutaraldedo
(mg.g-1)
AHder
PI
AR
AHder
PI
AR
AHder
PI
AR
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
188,4
1,62
60,9
244,9
1,84
69,7
169,6
5,00
18,0
10
247,5
3,81
34,0
279,8
4,76
30,8
207,8
8,44
12,8
30
345,8
8,46
21,4
378,4
7,11
27,8
245,6
11,7
11,0
60
397,5
15,7
13,2
405,7
12,7
16,7
294,1
19,3
7,9
80
421,4
16,6
13,3
437,8
15,8
14,5
321,2
21,9
7,5
(%).
133
Para o carregamento de 5 mg.g-1 de gel, empregado neste estudo, a recuperao

de atividade e a atividade hidroltica para o derivado ativado com epicloridrina foi
ligeiramente superior ao gel ativado via glicidol. No entanto, para os derivados obtidos com
mximo carregamento, a atividade hidroltica e a atividade recuperada foram semelhantes,
com mxima atividade hidroltica acima de 400 U.g-1 de gel. Observa-se tambm que a
imobilizao da lipase microbiana LTL em glioxil-amino-toyopearl gerou derivados menos
ativos em relao aos de agarose (Tabela 4.2). Como verificado para os outros suportes,
tambm para o amino-toyopearl a maior quantidade de protena imobilizada foi obtida quando
o suporte foi ativado com glutaraldedo, como sempre (21,9 mg.g-1 de gel) e as maiores
atividades hidrolticas foram obtidas para os gis ativados com glicidol e epicloridrina.
Uma vez que no se obteve 100% de atividade recuperada para nenhuma
concentrao de enzima oferecida, no possvel afirmar que o nico fenmeno que ocorre
seja limitao difusional, especialmente para a ativao com glutaraldedo. Nas ativaes
glioxil, observa-se a reduo da atividade aparente com o aumento da carga imobilizada, o
que costuma ocorrer na catlise heterognea. Quando o catalisador est presente em fase
diferente do substrato a efetividade da reao diminui com o aumento do mdulo de Thiele.
Esse por sua vez aumenta com o aumento da concentrao de enzima por volume de suporte,
pois medida que a carga enzimtica imobilizada aumenta h aumento da velocidade da
reao e a difusividade permanece constante ou at diminui devido ao aumento da restrio
difusional nos poros do suporte. Possivelmente, a reduo da atividade recuperada para
ativaes glioxil se deve ao aumento da limitao difusional. Foi a seguir avaliado o
desempenho desses derivados na sntese de butirato de butila. Os valores de concentrao de
butirato de butila atingidos em 24 h de reao so mostrados na Tabela 4.18.
Tabela 4.18. Sntese de butirato de butila catalisada por LTL e LPF imobilizadas em aminotoyopearl ativada por diferentes protocolos.
Lipases
Agente de Ativao
Butirato de Butila
(mM)24 h
66,6
GLI
LTL
60,0
EPI
46,2
GLU
62,2
GLI
LPF
65,5
EPI
49,7
GLU
134
Os derivados preparados por ativao glioxil (glicidol e epicloridrina) tambm

foram mais ativos em meio orgnico que os derivados preparados por ativao glutaraldedo,
apresentando comportamento similar aos resultados obtidos na reao de hidrlise de azeite
de oliva. Esses derivados converteram os reagentes entre 60,0 e 66,6% em butirato de butila,
valores inferiores aos obtidos por derivados de agarose, converso prxima a 85-90%, para a
mesma concentrao de enzima imobilizada no meio reacional (Tabela 4.6). Derivados de
glutaraldedo converteram abaixo de 50%. Derivados de LPF mostraram os menores valores
LTL, comportamento semelhante verificado para os derivados em agarose (Tabela 4.6).
Assim, embora os derivados de toyopearl tambm tenham se mostrado viveis para uso em
meio orgnico, seu custo ainda maior que o de agarose e como foram obtidas melhores
propriedades catalticas com agarose, no recomendvel o uso de toyopearl como suporte
para a imobilizao de lipases.
4.1.8. Imobilizao de Lipases em Suporte Hbrido Epxi-Quitosana-Alginato
4.1.8.1. Influncia do Tempo de Imobilizao Sobre as Propriedades Catalticas de LTL

Imobilizada Covalentemente em Suportes Monofuncional e Heterofuncional
Outra classe de suportes amplamente empregados na imobilizao covalente de

enzimas de interesse industrial so as resinas epxi (Mateo et al., 2000; Torres et al., 2003;
Mateo et al., 2007a,b). Entretanto estas resinas, disponveis comercialmente com os nomes
Eudragit e Sepabeads so de custo elevado, o que permite investigar outros suportes epxi
alternativos aos comerciais por um custo relativamente inferior. No Laboratrio de
Tecnologia Enzimtica da UFSCar, vem se investigando, nos ltimos anos, a imobilizao de
enzimas de interesse industrial em suportes alternativos aos disponveis comercialmente como
hidrogis de quitosana em substituio agarose. Neste sentido, hidrogis hbridos de
quitosana-alginato, selecionado anteriormente como melhor suporte para a imobilizao de
LTL, tambm foi empregado na sntese de matriz epxi. O mecanismo de imobilizao de
enzimas em suportes epxi diferente da imobilizao de enzimas em gis glioxil. Uma
135
grande diferena que na imobilizao via glioxil os suportes apresentam carter hidroflico,
enquanto na imobilizao de enzimas em matrizes epxi necessria a utilizao de matrizes
hidrofbicas para forar a adsoro hidrofbica da enzima. Aps longos perodos de
imobilizao, so efetuados enlaces entre a enzima e o suporte. Na imobilizao via epxi,
vrios grupos reativos da enzima tais como hidroxila, sulfeto e amino atacam
nucleofilicamente os grupos epxi do suporte, ao contrrio da imobilizao via glioxil, na
qual os enlaces entre a enzima e o suporte so efetuados apenas pelos grupos amino (Mateo et
al., 2007a,b).
Por estas razes, Lipase LTL foi imobilizada em suporte monofuncional epxiquitosana-alginato e em suporte heterofuncional epxi-tiol-quitosana-alginato em diferentes
tempos de imobilizao (12, 24, 48 e 72 h), empregando carregamento de protena de 5 mg.g-1
de gel com o objetivo de verificar a influncia do tempo de imobilizao sobre a estabilidade
trmica dos derivados incubados a 70 C (item 3.2.4). Os perfis de inativao so mostrados
na Figura 4.15.
(A)
(B)
Suporte Monofuncional
1,0
0,8
Atividade Relativa
0,8
Atividade Residual
Suporte Heterofuncional
1,0
0,6
0,4
0,2
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
T em po (h)
2,0
2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Tem po (h)
Figura 4.15. Estabilidade trmica de derivados de LTL imobilizados em suporte epxi-(A) e

tiol-epxi-(B) por 12 (), 24 (), 48 () e 72 h () e da lipase solvel ().
Vale ressaltar que durante a sntese do suporte monofuncional epxi-quitosanaalginato os grupos amino da quitosana foram reticulados com anidrido actico e os grupos
hidroxila da matriz hbrida foram reticulados com epicloridrina em meio de N,Ndimetilformida (Fangkangwanwong et al., 2006). Na reao de epicloridrina com os grupos
hidroxila da matriz ocorre a reticulao intra e intermolecular desses grupos e a insero de
136
grupos epxi, necessrios para a imobilizao de enzimas. Na sntese de suporte

heterofuncional epxi-tiol-quitosana-alginato alguns grupos epxi do suporte foram
modificados quimicamente com agente tiolado, DTT (ditiotreitol), para a insero de grupos
sulfidrilas no suporte e verificar o efeito dessa modificao qumica sobre os parmetros de
imobilizao de LTL nesta nova matriz de imobilizao sintetizada pelo grupo. A
concentrao de grupos epxi, tambm chamado de grupos oxirano, na matriz monofuncional
foi de 220 moles.g-1 de suporte em base mida e aps a modificao qumica com DTT, a
concentrao de grupos epxi foi reduzida para 160 moles.g-1 de suporte.
Aps a etapa de imobilizao da enzima, os derivados preparados foram
incubados em soluo de glicina 3M pH 8,0 por 24 h. Essa incubao foi realizada para todos
os derivados de lipases em epxi-quitosana-alginato, visando tornar inertes todos os grupos
epxi reativos do suporte que no efetuaram enlaces com os grupos reativos da enzima. Desta
forma, durante o perodo de estocagem, possveis interaes enzima/suporte capazes de
promover efeitos prejudiciais aos derivados, como por exemplo, a distoro do stio ativo da
enzima que poderia causar diminuio de sua estabilidade ou at mesmo sua inativao,
seriam evitadas.
Para a LTL imobilizada em epxi-quitosana-alginato, a inativao total foi
observada aps 2,5 h de incubao a 70 C. Os derivados imobilizados em suporte tiolado, a
inativao ocorreu aps 2 h de incubao. De acordo com a Figura 4.15, o aumento do tempo
de contato enzima-suporte no influenciou fortemente a estabilizao dos biocatalisadores, o
que mostra que no ocorreu aumento da multi-interao entre enzima e suporte.
O fator de estabilidade, relao entre o tempo de meia-vida da enzima
imobilizada com a enzima livre, obtido para os derivados imobilizados em epxi-quitosanaalginato foi de 6,0 a 7,8, aproximadamente o dobro dos derivados imobilizados em suporte
tiolado, como mostrado nas Tabelas 4.19 e 4.20. Enzima imobilizada em resinas epxi
apresenta baixa estabilidade, se comparados com gis glioxil-agarose (Mateo et al., 2000).
Penicilina G acilase (PGA) imobilizada em epxi-Sepabeads e bloqueada com glicina foi
apenas cerca de nove vezes mais estvel que a PGA solvel (Mateo et al., 2000), mostrando
que os resultados obtidos esto de acordo com a literatura.
137
Tabela 4.19. Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxi-quitosanaalginato. Carga oferecida de 5 mg de protena.g-1 de gel. Atividade hidroltica oferecida de
956 U.g-1 de gel.
TI
AHder.
FE
PI
AR
t1/2
(h)
(min)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
380,8
2,71
73,5
30,0
6,0
12
24
305,8
2,60
61,5
29,5
6,0
48
278,2
2,74
53,1
36,8
7,8
72
266,3
2,77
50,3
31,0
6,4
-1
TI: Tempo de imobilizao (h); AHder.: Atividade hidroltica do derivado (U.g de gel); PI: Concentrao de
protena imobilizada (mg de protena.g-1 de gel); AR: Atividade recuperada (%) e FE: Fator de estabilidade.
Tabela 4.20. Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxi-tiol-quitosanaalginato. Atividade hidroltica oferecida de 956 U.g-1 de gel.
TI
AHder.
PI
AR
t1/2
FE
(h)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
(min)
170,2
2,24
39,8
17,8
3,7
12
24
175,1
2,20
41,6
16,3
3,4
48
150,7
2,21
35,4
22,5
4,7
72
143,2
2,27
33,0
17,9
3,7
TI: Tempo de imobilizao (h); AHder.: Atividade hidroltica do derivado (U.g-1 de gel); PI: Concentrao de
protena imobilizada (mg de protena.g-1 de gel); AR: Atividade recuperada (%) e FE: Fator de estabilidade.
O aumento do tempo de imobilizao de 12 para 72 h tambm no influenciou

na concentrao de protena imobilizada. Entretanto, pode-se observar a influncia do tipo de
suporte sobre a imobilizao da protena. Epxi-quitosana-alginato foi ligeiramente superior
em relao ao suporte tiolado na fixao de enzima. Uma possvel explicao para este
comportamento a reduo do nmero de grupos epxi no suporte aps a modificao com
DTT.
Foi observada uma pequena reduo da atividade hidroltica dos derivados com
o aumento do tempo de imobilizao (Tabelas 4.19 e 4.20). Este aumento do tempo de
incubao implica maior interao da enzima com o suporte, ou seja, maior nmero de
enlaces entre enzima e suporte. Os resultados obtidos mostram que apesar do maior nmero
de enlaces entre a enzima e o suporte com o aumento do tempo de imobilizao no foi
possvel melhorar a estabilidade trmica dos derivados e por esta razo o tempo de
imobilizao adotado foi de 24 h.
138
4.1.8.2. Influncia do Carregamento de Protena sobre as Propriedades Catalticas dos

Derivados de LTL, LPF e Lipex 100L Imobilizados em Matrizes Epxi
A preparao enzimtica LTL foi imobilizada em gis epxi-quitosanaalginato e epxi-tiol-quitosana-alginato oferecendo diferentes carregamentos de protena (580 mg.g-1 de suporte) e os resultados referentes aos parmetros de imobilizao esto
sumarizados nas Tabelas 4.21 e 4.22.
Tabela 4.21. Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxi-quitosanaalginato. Atividade hidroltica oferecida de 191,2 U.mg-1 de protena.
CP
AHder.
PI
AR
(mg.g-1)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
305,8
2,60
61,5
5
10
427,1
4,45
50,2
30
760,0
13,7
29,2
60
1092,7
22,4
25,5
80
1257,4
25,4
26,0
(%).
Dentre os suportes epoxilados estudados, epxi-quitosana-alginato forneceu

derivados com maior atividade hidroltica e maior atividade recuperada (Tabela 4.21). Para o
ensaio conduzido com o menor carregamento de protena (5 mg.g-1 de gel), a recuperao de
atividade foi de 61,9% e a atividade hidroltica do derivado foi de 305,8 U.g-1 de gel. Para os
ensaios conduzidos com o carregamento de 80 mg.g-1 de gel, a atividade hidroltica para o gel
epxi-quitosana-alginato foi de 1257,4 U.g-1 de gel, com atividade recuperada de 26,0%. A
concentrao mxima de protena imobilizada foi de 25,4 mg.g-1 de gel, quando foram
oferecidos 80 mg de protena.g-1 de gel.
Para o menor carregamento de protena (5 mg.g-1 de gel), a recuperao de
atividade para o suporte tiolado foi de 41,7% e a atividade hidroltica do derivado foi de 175,1
U.g-1 de gel, duas vezes menor que a atividade hidroltica do derivado imobilizado em epxiquitosana-alginato, como mostrado na Tabela 4.22.
139
Tabela 4.22. Parmetros de imobilizao da lipase LTL em hidrogel epxi-tiol-quitosanaalginato. Atividade hidroltica de 191,2 U.mg-1 de protena.
CP
AHder.
PI
AR
(mg.g-1)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
175,1
2,20
39,8
5
10
308,5
4,01
40,3
30
426,8
7,71
29,0
60
479,0
11,1
22,6
80
531,7
13,5
20,6
(%).
A mxima atividade hidroltica foi obtida com o derivado imobilizado no

carregamento de 80 mg.g-1 de gel, da ordem de duas vezes inferior ao alcanado no suporte
epxi-quitosana-alginato. A concentrao mxima de protena imobilizada neste suporte foi
de 13,5 mg.g-1 de gel, quando foram oferecidos 80 mg.g-1 de gel. Este suporte forneceu menor
concentrao de protena imobilizada, quase duas vezes inferior ao suporte monofuncional
(no tiolado). Possivelmente, a etapa de tiolao reduziu a afinidade do suporte com a enzima,
lembrando que a concentrao de grupos epxido (grupos oxirano) em epxi-quitosanaalginato foi de 220 moles.g-1 de gel e aps a tiolao, a concentrao de grupos epxido foi
de 160 moles.g-1 de gel.
Dentre os tipos de suportes avaliados, monofuncional e heterofuncional,
selecionou-se o suporte monofuncional devido s melhores propriedades catalticas obtidas
com a lipase LTL.
Aps a seleo do tipo de suporte epxi empregado, outras duas preparaes
enzimticas Lipex 100L e de Pseudomonas fluorescens, comercialmente conhecida como
Lipase AK (LPF), comercializada pela Amano, foram imobilizadas em epxi-quitosanaalginato, variando o carregamento de protena (5-80 mg protena.g-1 de gel) para verificar a
mxima concentrao de protena imobilizada e atividade mxima de hidrlise, como
mostrado nas Tabelas 4.23 (LPF) e 4.24 (Lipex 100L).
140
Tabela 4.23. Parmetros de imobilizao da lipase LPF em hidrogel epxi-quitosanaalginato. Atividade hidroltica de 217,5 U.mg-1 de protena.
CP
AHder.
PI
AR
(mg.g-1)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
150,7
3,14
22,1
5
10
180,6
5,48
15,2
30
223,8
11,4
9,10
60
242,1
14,4
7,70
80
272,4
15,5
9,20
(%).
Os derivados de LPF apresentaram baixa atividade hidroltica mesmo

imobilizando em epxi-quitosana-alginato. Verifica-se na Tabela 4.6, que os derivados de
LPF imobilizados em glioxil-agarose tambm apresentaram baixa atividade de hidrlise. A
mxima concentrao de protena imobilizada foi de 15,5 mg.g-1 de gel, oferecendo 80 mg de
protena.g-1 de gel. A atividade hidroltica para o derivado imobilizado em mximo
carregamento, 80 mg de protena.g-1 de gel, foi quase duas vezes superior ao derivado
imobilizado em baixa carga, com atividade hidroltica mxima de 272,4 U.g-1 de gel. No
entanto, a atividade hidroltica mxima obtida para a Lipex 100L foi aproximadamente cinco
vezes superior LPF, como pode ser visto na Tabela 4.24.
Lipase Lipex 100L imobilizada apresentou atividades de hidrlises similares
preparao lipsica LTL (Tabela 4.21). A mxima concentrao de protena imobilizada foi
de 20,5 mg.g-1 de gel, oferecendo 80 mg de protena.g-1 de gel, ligeiramente inferior LTL
(25,4 mg.g-1 de gel). Os valores de atividade hidrolticas foram similares para ambas as
enzimas. A mxima atividade hidroltica obtida para esta lipase foi de 1293,6 U.g-1 de gel. No
entanto, a atividade recuperada para os derivados de Lipex 100L foram superiores aos
derivados de LTL. Para os derivados de carga mxima (80 mg de protena.g-1 de gel), a
atividade recuperada para a LTL e Lipex 100L foi de 26 e 36,1%, respectivamente.
141
Tabela 4.24. Parmetros de imobilizao da lipase Lipex 100L em hidrogel epxiquitosana-alginato. Atividade hidroltica de 175,6 U.mg-1 de protena.
CP
AHder.
PI
AR
(mg.g-1)
(U.g-1)
(mg.g-1)
(%)
235,2
2,10
63,8
5
10
411,6
3,38
69,4
30
787,9
8,64
51,9
60
1034,9
19,3
30,5
80
1293,6
20,5
36,1
(%).
Os resultados obtidos com os suportes epxi mostram que as atividades dos

derivados de LTL foram similares s obtidas com agarose (Tabela 4.2) e para os derivados
preparados Lipex 100L e LPF em epxi-quitosana-alginato, os valores e atividade hidroltica
foi superior aos derivados preparados por agarose (Tabelas 4.3 e 4.4). Enquanto se obteve
fatores de estabilizao superiores a 250 para a agarose, com epxi-quitosana-alginato
atingiu-se valores inferiores a oito, como mostrado nas Tabelas 4.19 (suporte monofuncional)
e 4.20 (suporte heterofuncional).
Os derivados preparados de LTL em suporte monofuncional foram mais ativos
que aqueles preparados em suporte heterofuncional. Talvez a modificao qumica de epxiquitosana-alginato tenha alterado o microambiente do suporte, como a hidrofobicidade,
reduo de dimetro de poros ou distoro da enzima aps a insero de grupos sulfidrilas, o
que acarretou a reduo da atividade recuperada dos derivados.
Os derivados de LPF e Lipex 100L e as lipases solveis tambm foram
incubados a 70 C na presena do tampo fosfato pH 8,0 100mM e os tempos de meia-vida e
o fator de estabilizao foram estimados pelo ajuste de dados experimentais de inativao
trmica ao modelo de decaimento no-linear de Sadana e Henley (1987), como mostrado na
Figura 4.16.
142
(A)
(B)
Lipex 100L
1,0
0,8
Atividade Relativa
0,8
Atividade Relativa
LPF
1,0
0,6
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
0
10
20
30
40
Tempo (min)
50
60
10
15
20
25
Tempo (min)
Figura 4.16. Estabilidade trmica das lipases () solveis e dos () derivados de Lipex
100L (A) e de LPF (B) imobilizados por 24 h em suporte epxi-quitosana-alginato.
Lipex 100L foi totalmente inativada aps 1 h de incubao a 70 C. Na

mesma temperatura, o derivado de LPF foi totalmente inativado em 25 min. A imobilizao
das lipases em epxi-quitosana-alginato forneceu diferentes fatores de estabilizao. Lipex
100L imobilizada em epxi-quitosana-alginato foi 6,2 vezes mais estvel que a lipase na
forma solvel, com tempo de meia-vida de 11,2 min. A estabilizao de LPF foi inferior
Lipex 100L, da ordem de 2,2 vezes mais estvel que a LPF solvel, com tempo de meia-vida
de 5,5 min. LTL e Lipex 100L apresentaram fatores de estabilizao prximos a 6,
mostrando que o procedimento de imobilizao de ambas as preparaes foi importante para a
estabilizao da enzima. Apesar da baixa estabilidade trmica dos derivados de lipases
preparados em gel epxi-quitosana-alginato em relao aos derivados de LTL-glioxil-agarose,
estes derivados se mostraram mais resistentes ao da temperatura que a enzima solvel,
que sofreu completa inativao em apenas 5-10 min de incubao na mesma temperatura.
Os resultados obtidos com os suportes epxi mostram que foi possvel obter
derivados com atividades hidrolticas similares s obtidas com agarose e quitosana-alginato
com ativao glioxil. Porm, enquanto se obteve fatores de estabilizao superiores a 250
para glioxil-agarose-LTL, e de 45 para glioxil-quitosana-alginato-LTL, para os derivados
epxi-quitosana-alginato-LTL os fatores de estabilizao foram inferiores a 10. Assim, entre a
143
ativao glioxil e epxi, evidentemente melhor a ativao glioxil e mesmo considerando-se

o maior custo de agarose provvel que em uma anlise econmica o menor custo final do
produto seria obtido com agarose.
4.2. Imobilizao de Lipases por Adsoro Fsica em Matrizes Hidrofbicas
Outra estratgia adotada para a preparao de derivados de lipases foi a

imobilizao das lipases por adsoro fsica em matrizes hidrofbicas de alto custo como
octil-agarose, hexil-toyopearl, octadecil-sepabeads e em poli-(hidrxibutirato) (PHB). Este
mtodo de imobilizao tem sido utilizado em processos de purificao de lipases presentes
em caldo de fermentao (Mendes et al., 2008b) e em processos de modificao qumica de
lipases (Fernandez-Lorente et al., 2008). Os resultados so mostrados a seguir. Este mtodo
de imobilizao muito utilizado em processos industriais porque no necessrio ativar o
suporte e aps a inativao da enzima o suporte pode ser empregado (Bornscheuer et al.,
2002). Os ensaios foram conduzidos de acordo com metodologia apresentada nos itens 3.2.8.1
(matrizes hexil-toyopearl, octil-agarose e octadecil-sepabeads) e 3.2.8.2 (PHB).
4.2.1. Imobilizao de Lipases em Matrizes Hidrofbicas Hexil-Toyopearl, OctilAgarose e Octadecil-Sepabeads
Lipases LTL e CALB foram imobilizadas em suportes hidrofbicos octadecilsepabeads, hexil-toyopearl e octil-agarose e as cinticas de imobilizao das lipases so
mostradas nas Figuras 4.17 e 4.18.
Estes suportes hidrofbicos tm sido extensivamente empregados na
imobilizao de lipases via adsoro fsica para modulao das propriedades catalticas de
lipases em reaes de resoluo de racematos e no processo de purificao de lipases
comerciais (Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002). A imobilizao destas lipases nessas
matrizes foi realizada no Instituto de Catlisis y Petroleoqumica em Madrid-Espanha sob a
144
orientao do Dr. Jos Manuel Guisn. A atividade enzimtica das lipases foi estimada na
hidrlise do ster p-nitrofenilbutirato (p-NPB) em pH 7,0, conforme metodologia descrita no
item 3. 2.2.1.
(A)
(B)
Hexil-Toyopearl
Octadecil-Sepabeads
16
Atividade Relativa
Atividade Relativa
1,0
0,5
0,0
10
20
30
40
50
14
60
Tempo (min)
10
20
30
40
50
60
Tempo (min)
(C)
50
Atividade Relativa
Octil-Agarose
40
2
1
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (min)
Figura 4.17. Cintica de imobilizao de lipase LTL por adsoro fsica em suportes
hidrofbicos (A) octadecil-sepabeads, (B) hexil-toyopearl e (C) octil-agarose. () atividade
hidroltica do controle, () suspenso e () sobrenadante. Imobilizaes realizadas em
tampo fosfato pH 7,0 5 mM a 25 C com carregamento de protena de 1 mg.g-1 de gel).
De acordo com a Figura 4.17A, a lipase LTL imobilizada em octadecilsepabeads sofreu reduo da atividade de 41% durante a imobilizao. Octadecil-Sepabeads
uma resina acrlica altamente hidrofbica modificada quimicamente com grupos octadecil na
superfcie do suporte (Palomo et al., 2002).
145
A imobilizao de lipases em suportes hidrofbicos realizada pela interao

entre a regio do stio ativo e o suporte e, possivelmente, neste caso, ocorreu uma forte
interao entre os grupos octadecil da matriz com a enzima, distorcendo, assim, o seu stio
ativo. A imobilizao de lipases em baixo carregamento em matrizes hidrofbicas inativa a
enzima por distoro da sua estrutura ativa e este comportamento relatado na literatura para
a imobilizao de lipases, dentre elas LTL e CALB, em polipropileno macroporoso (Bosley e
Peilow, 1997; Salis et al., 2003). No entanto, a lipase imobilizada interfacialmente em hexiltoyopearl e octil-agarose sofreu hiperativao, com aumento da atividade hidroltica da ordem
de 16-45 vezes. Para a LTL imobilizada em hexil-toyopearl, o valor de hiperativao foi de
16 vezes (Figura 4.17B) e imobilizada em octil-agarose foi aproximadamente trs vezes maior
que este derivado (45 vezes), como mostrado na Figura 4.17C.
O efeito de hiperativao pode ser verificado em diversas preparaes de
lipases (Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002; Mendes et al., 2008b). Bastida et al. (1998)
imobilizaram diferentes preparaes de lipases tais como Candida antarctica A,
Thermomyces lanuginosus, Mucor javanicus, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens e
Rhizopus niveus em octil-agarose e a preparao com maior porcentagem de hiperativao foi
verificada em Thermomyces lanuginosus, da ordem de 20 vezes, mostrando que os resultados
obtidos no presente trabalho esto de acordo com a literatura.
Lipase CALB adsorvida em octadecil-sepabeads tambm apresentou elevada
reduo da atividade hidroltica (63%), em relao atividade inicial, mostrando que a
adsoro neste suporte afetou sensivelmente a sua atividade hidroltica em relao lipase
LTL, como mostrado na Figura 4.18A. Para a lipase imobilizada em hexil-toyopearl e octilagarose, esta reduo da atividade foi de apenas 19 e 23%, confirmando que a natureza do
suporte influencia a interao enzima/suporte (Figura 4.18B e C). Normalmente, o fenmeno
de hiperativao interfacial no verificado para derivados de CALB imobilizados por
adsoro fsica (Bastida et al., 1998).
importante salientar que o stio ativo das lipases coberto por uma cadeia
polipeptdica hidrofbica lid, fazendo com que o stio ativo esteja inacessvel ao meio
(conformao fechada). Na presena de uma superfcie hidrofbica, a tampa sofre uma
mudana conformacional expondo o stio ativo ao meio reacional (conformao aberta). A
lipase LTL possui uma tampa hidrofbica que cobre seu stio ativo e para a lipase CALB, a
tampa inexistente. Isto mostra que para a lipase LTL na presena de superfcie hidrofbica,
146
a tampa sofre mudana conformacional, o que permite ocorrer hiperativao, pois os dmeros
de lipases na presena de uma superfcie hidrofbica deslocam o equilbrio para a
conformao aberta e, consequentemente, h um aumento da atividade da lipase. Por esta
razo, a atividade cataltica de lipase CAL B se assemelha a uma esterase e a lipase LTL a
uma lipase verdadeira. Palomo et al. (2003) verificaram por filtrao em gel que a lipase
LTL se apresenta na forma bimolecular, em meios isentos de detergentes e baixa fora inica.
No entanto, na lipase CALB, esta estrutura bimolecular no foi verificada, mesmo em altas
concentraes de enzima decorrente da ausncia da tampa hidrofbica, mostrando que o
fenmeno de hiperativao no ocorre com a CALB.
(A)
(B)
Hexil-Toyopearl
Octadecil-Sepabeads
1,0
Atividade Relativa
Atividade Relativa
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
10
20
30
40
50
60
10
20
30
40
50
60
Tempo (min)
Tempo (min)
(C)
Octil-Agarose
Atividade Relativa
1,0
0,5
0,0
10
20
30
40
50
60
T em po (m in)
Figura 4.18. Cintica de imobilizao de lipase CALB por adsoro fsica em suportes
hidrofbicos (A) octadecil-sepabeads, (B) hexil-toyopearl e (C) octil-agarose. () atividade
hidroltica do branco, () suspenso e () sobrenadante. Imobilizaes realizadas em tampo
fosfato pH 7,0 5 mM a 25 C com carregamento de protena de 1 mg.g-1 de gel).
147
Preparaes de lipases produzidas por fermentao em escala laboratorial tm

sido purificadas por adsoro da lipase em suportes hidrofbicos como octil-agarose. Lipase
de Bacillus thermocatenulatus no disponvel comercialmente e a estratgia de imobilizao
em octil-agarose foi empregada para a purificao da lipase do caldo fermentativo (Mendes et
al., 2008b).
Os derivados de lipases CALB, BTL2 e LTL imobilizados por adsoro fsica
foram incubados a 70 C e determinada a influncia do tipo de suporte hidrofbico sobre a
estabilidade trmica dos derivados incubados em pH 7,0 25 mM, conforme mostrado na
Figura 4.19. Neste estudo, a lipase BTL2 foi imobilizada somente em octil-agarose.
(A)
(B)
CALB
1,0
0,8
Atividade Residual
Atividade Residual
0,8
0,6
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0,0
LTL
1,0
0,0
10
15
20
25
10
15
20
25
Tempo (h)
Tempo (h)
(C)
BTL2
1,0
Atividade Residual
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
10
15
20
25
Tem po (h)
Figura 4.19. Estabilidade trmica de CALB (A), LTL (B) e BTL2 (C) solvel () e
imobilizadas em octadecil-sepabeads (), hexil-toyopearl () e octil-agarose () a 70 C.
148
Lipases CALB e LTL imobilizadas em octadecil-sepabeads foram os derivados

que apresentaram maior velocidade de inativao. CALB imobilizada em octil-agarose e
hexil-toyopearl apresentou semelhante cintica de inativao, mas o derivado de octil-agarose
mostrou um pequeno aumento na estabilizao em relao ao derivado de hexil-toyopearl.
LTL imobilizada em hexil-toyoperal foi ligeiramente mais estvel termicamente que o
derivado imobilizado em octil-agarose. A estabilizao trmica de LTL em octadecilsepabeads foi superior CALB, mostrando realmente que a atividade hidroltica de CALB foi
drasticamente reduzida quando imobilizada neste suporte.
BTL2 imobilizada em octil-agarose foi 339 vezes mais estvel que a lipase na
forma solvel, com tempo de meia-vida do derivado de 8,53 h. Este derivado foi o mais
estvel imobilizado por adsoro fsica. Lipase CALB imobilizada em octil-agarose foi
ligeiramente mais estvel que o derivado de hexil-toyopearl, 196 e 181 vezes mais estvel que
a enzima solvel, respectivamente. No entanto, LTL imobilizada em hexil-toyopearl foi mais
estvel que o derivado de octil-agarose, 176 e 126 vezes mais estvel que as formas livres,
respectivamente. CALB e LTL imobilizadas em octadecil-sepabeads foram os derivados com
menor estabilizao trmica, 62 e 70 vezes mais estveis que a lipase na forma solvel,
respectivamente. Na Tabela 4.25 so mostrados os tempos de meia-vida das lipases testadas
nas formas solvel e imobilizada. Para as trs lipases empregadas neste trabalho, todas
apresentaram tempo de meia-vida a 70 C de aproximadamente 0,03 h e com o processo de
imobilizao por adsoro fsica foi possvel obter derivados com elevada estabilidade
trmica.
Tabela 4.25. Estimativa do tempo de meia-vida (t1/2) e fator de estabilidade (FE) de lipases
nas formas solvel e imobilizadas em suportes hidrofbicos.
Lipase
Suporte
t1/2
FE
(Fonte)
(h)
solvel
0,03
octadecil-sepabeads
1,75
62
CALB
octil-agarose
5,55
196
hexil-toyopearl
5,13
181
solvel
0,03
octadecil-sepabeads
2,05
70
LTL
octil-agarose
3,72
126
hexil-toyopearl
5,18
176
solvel
0,03
BTL2
octil-agarose
8,53
339
149
Alguns desses derivados foram mais estveis que os derivados preparados por
imobilizao covalente, de acordo com dados relatados na literatura (Palomo et al., 2002) e os
obtidos neste trabalho, conforme descrito no item 4.1.
4.2.2. Imobilizao de Lipases por Adsoro Fsica em PHB
Na etapa anterior, foram empregados como matrizes para imobilizao por

adsoro fsica de lipases suportes disponveis comercialmente e de alto custo tais como
octadecil-sepabeads, hexil-toyopearl e octil-agarose. Como suporte alternativo, foi empregado
poli-(hidrxi-butirato), uma matriz altamente hidrofbica e de baixo custo, ideal para a
imobilizao de lipases. Foram adquiridas duas configuraes de PHB, nas formas de
grnulos e em p. Lipases microbianas disponveis comercialmente como CALB, LTL, LPF e
Lipex 100L e a lipase obtida por fermentao no Laboratrio de Controle de Processos
(DEQ-UFSCar) BTL2 (B. thermocatenulatus) foram imobilizadas em PHB, conforme
metodologia descrita por Bastida et al. (1998) e apresentada no item 3.2.8.2. O procedimento
de imobilizao se baseia na interao hidrofbica do lid da enzima com o suporte em baixa
fora inica. Foram empregados carregamentos de 5 mg de protena.g-1 de gel para as lipases
disponveis comercialmente e carregamento de 10 mg.g-1 de suporte para a lipase obtida por
fermentao. As propriedades catalticas dos derivados obtidos esto sumarizadas na Tabela
4.26.
As lipases CALB, LTL e Lipex 100L foram completamente imobilizadas em
PHB nas formas em p e granular. Isto mostra que nestas preparaes h somente lipase, ou
seja, as condies empregadas na imobilizao somente as lipases so imobilizadas e
impurezas presentes nas amostras permanecem no sobrenadante final. Esta estratgia de
imobilizao por adsoro hidrofbica muito empregada na literatura para a purificao de
preparaes de lipases comerciais e obtidas por fermentao em escala laboratorial (Bastida et
al., 1998; Palomo et al., 2002; Palomo et al., 2005). Para estas trs preparaes de lipases
verifica-se que a geometria do suporte no influenciou no processo de imobilizao. Porm
para a lipase LPF a geometria do suporte teve uma forte influncia. Aproximadamente 80%
da atividade hidroltica oferecida foi imobilizada em PHB em p e para o suporte na forma de
150
grnulos, o rendimento de imobilizao foi prximo a 60%. A lipase de Bacillus

thermocatenulatus (BTL2), obtida por fermentao, foi completamente imobilizada em PHB,
ou seja, aps a imobilizao no havia atividade hidroltica no sobrenadante final. Este
comportamento no foi verificado para esta mesma lipase imobilizada no suporte granular que
apresentou aproximadamente 70% de rendimento de imobilizao. Neste caso pode-se notar
tambm a influncia da geometria do suporte, similar lipase LPF.
Tabela 4.26. Parmetros de imobilizao de lipases de diferentes fontes em PHB em p e
granular.
Lipase
PHB
RI
PI
AHder.
AR
(%)
(%)
(U.g-1 de suporte)
(%)
CALB
P
100
~100
135,5
25,8
Granular
100
~100
43,0
10,8
100
~100
1558,1
65,4
Granular
100
~100
200,0
11,1
100
~100
1717,5
82,2
100L
Granular
100
~100
190,2
9,10
LPF
78,7
77,2
1099,6
80,4
Granular
59,4
56,2
212,8
22,5
100
73,6
256,6
31,5
Granular
67,2
50,4
69,6
7,80
LTL
Lipex
BTL2
RI: Rendimento de imobilizao (atividade hidroltica desaparecida do sobrenadante durante a imobilizao)

(%); PI: Protena imobilizada (%); AHder.: Atividade hidroltica do derivado (U.g-1 de suporte); AR: Atividade
recuperada (%)
Para as preparaes comerciais CALB, LTL e Lipex 100L aproximadamente

toda a protena oferecida foi completamente imobilizada, mostrando que a concentrao de
protenas contaminantes foi desprezvel. Os valores de protena imobilizada de LPF em PHB
foram similares aos valores de rendimento de imobilizao, mostrando que a pequena
diferena entre rendimento de imobilizao e protena imobilizada se deve presena de
contaminantes contidas nesta preparao enzimtica, porm em pequena quantidade (Palomo
et al., 2004; Palomo et al., 2005). Para a lipase BTL2 imobilizada em PHB em p, a
porcentagem de enzima imobilizada foi em torno de 75% do carregamento oferecido (10
151
mg.g-1 de suporte). Como no sobrenadante final no havia atividade lipsica, pode-se afirmar
que aproximadamente 25% da protena inicialmente oferecida na imobilizao era composta
de protenas contaminantes oriundas do processo de ruptura celular ou de enzimas
contaminantes presentes no interior da clula, pois a lipase de BTL2 uma enzima
intracelular. Para a lipase imobilizada em PHB granular, a porcentagem de protena
imobilizada foi prxima a 50%, mostrando a influncia da geometria do suporte.
O tamanho de partcula muito importante para a atividade enzimtica, pois a
rea superficial da matriz est intimamente relacionada com a atividade cataltica da enzima.
Os parmetros de imobilizao que obtiveram maior influncia da geometria do suporte foram
a atividade hidroltica e, consequentemente, a atividade recuperada. As lipases imobilizadas
em PHB em p apresentaram valores de atividades hidrolticas bastante superiores aos
derivados de PHB granular. Os maiores valores de atividade hidroltica foram obtidos para
Lipex 100L (1717,5 U.g-1), LTL (1558,1 U.g-1) e LPF (1099,6 U.g-1) imobilizadas em p e
os valores respectivos de atividade recuperada foram de 82,2, 65,4 e 80,4%. As lipases mais
afetadas pela geometria do suporte foram as preparaes enzimticas Lipex 100L, LTL e
LPF, com drstica reduo da atividade cataltica da enzima de nove, oito e cinco vezes,
respectivamente. De acordo com a literatura, a geometria do suporte exerce uma influncia
bastante significativa sobre a atividade cataltica da enzima visto que suportes com maior rea
superficial tendem a aumentar o acesso do substrato aos stios ativos da enzima. Para as
lipases CALB e BTL2, a atividade cataltica dos derivados de PHB em p foram trs a quatro
vezes maiores que as dos derivados de PHB granular.
Foi realizada tambm a sntese do ster butirato de butila para determinar a
atividade sinttica destes derivados, conforme mostrado na Tabela 4.27. Foi verificada que a
conformao do suporte no influenciou no rendimento de esterificao. importante
salientar que a atividade hidroltica estimada foi realizada empregando azeite de oliva
emulsificado e para a atividade de sntese a formao do butirato de butila, substratos muito
distintos quanto ao tamanho da cadeia carbnica. Os rendimentos de esterificao foram
superiores a 90% para todos os derivados com exceo dos derivados de BTL2 que oscilaram
entre 80 a 90%.
152
Tabela 4.27. Sntese de butirato de butila catalisada por lipases imobilizadas por adsoro
fsica em PHB em p e granular.
Lipase
PHB
Butirato de Butila
(mM)24 h
CALB
LTL
Lipex 100L
LPF
BTL2
95,0
Granular
91,5
95,0
Granular
94,6
93,7
Granular
94,3
93,0
Granular
90,1
89,0
Granular
82,8
4.3. Seleo dos Derivados Preparados para a Sntese de Biodiesel
Aps a imobilizao de lipases por diferentes protocolos, os resultados obtidos

foram condensados no Quadro 4.1 que apresenta um resumo de todos os derivados obtidos ao
longo do trabalho, e respectivas caractersticas j determinadas, visando facilitar a anlise de
resultados e selecionar os derivados preparados com maior atividade cataltica e estabilidade
trmica, bem como o custo do biocatalisador. Neste quadro foram apresentados somente os
derivados preparados com baixa carga de enzima (1 e 5 mg de protena.g-1 de gel).
De acordo com o Quadro 4.1, os derivados preparados por imobilizao
covalente multipontual que apresentaram maior atividade hidroltica foram obtidos para a
LTL imobilizada em glioxil-agarose 6BCL, glioxil-quitosana-alginato-TNBS e epxiquitosana-alginato e Lipex 100L imobilizada em glioxil-agarose e em epxi-quitosanaalginato. Os derivados com maior estabilizao foram preparados com BTL2 imobilizada em
glioxil-agarose 10 BCL nas formas aminada (FE=3460) e no aminada (FE=2648), seguido
de LTL imobilizada em glioxil-agarose 6BCL (FE=~300), CALB imobilizada em glioxilagarose 10BCL nas formas aminada (FE=289) e no aminada (FE=211), LTL imobilizada em
153
glioxil-quitosana-alginato-TNBS (FE=45) e LTL imobilizada em glioxil-amino-toyopearl

(FE=~30). Apesar da elevada atividade hidroltica dos derivados de Lipex 100 L, os valores
de fator de estabilizao foram inferiores a 10.
Na imobilizao por adsoro fsica de lipases, os derivados mais estveis
foram preparados por imobilizao em octil-agarose e hexil-toyopearl. Entretanto, os
derivados com maior atividade hidroltica foram preparados com a imobilizao das lipases
em PHB em p. A utilizao desta matriz na imobilizao de lipases atrativa devido ao
baixo custo da matriz (US$ 10,00 o quilo) e hidrofobicidade (ideal para o processo de
adsoro fsica de lipases). Ainda no reportada na literatura a aplicao de PHB como
suporte de imobilizao de enzimas.
Aps a etapa de imobilizao de lipases por diferentes protocolos foi possvel
selecionar os derivados com maior atividade cataltica em reaes de hidrlise e de
esterificao e termoestveis para mediar a sntese de biodiesel por etanlise de leos vegetais
de babau e palma. Os derivados preparados de LTL em glioxil-agarose 6BCL, glioxil-aminotoyopearl e glioxil-quitosana-alginato-TNBS foram selecionados por atenderem aos prrequisitos necessrios no que se refere estabilizao de enzimas. Lipase LPF, apesar da
baixa atividade hidroltica e estabilidade trmica tambm foi utilizada na reao de interesse,
pois apresentou elevada atividade cataltica na sntese de butirato de butila e por se tratar de
uma lipase bastante empregada em sntese de biodiesel. No Laboratrio de Biocatlise da
Escola de Engenharia de Lorena, coordenado pela Dra. Heizir Ferreira de Castro esta lipase
foi empregada com sucesso na etanlise do leo de palma (Moreira et al., 2007), apresentando
elevada atividade de transesterificao. Outros biocatalisadores selecionados foram aqueles
imobilizados por adsoro fsica em PHB, um suporte de baixo custo e que at o presente
momento no foi empregado como matriz na imobilizao de enzimas. Os derivados
selecionados se encontram destacados em negrito.
Vale ressaltar que at o presente momento, a imobilizao de enzimas por
ligao covalente multipontual nas matrizes testadas e selecionadas no foram ainda testadas
na sntese de biodiesel e este trabalho apresenta resultados inditos de aplicao de enzimas
imobilizadas nestes suportes por ligao covalente multipontual e por adsoro em PHB para
a posterior aplicao em sntese de biodiesel.
Apesar de alguns biocatalisadores no terem sido selecionados para a sntese
de biodiesel, o Quadro 4.1 pode ser uma importante ferramenta para a seleo de derivados
154
para outras possveis aplicaes potenciais de lipases como a sntese de steres de acares,
empregados como antitumorais e emulsificantes, resoluo de misturas racmicas na obteno
de intermedirios de frmacos e pesticidas, sntese de lipdeos estruturados na obteno de
anlogos da gordura do leite materno e enriquecimento com cidos graxos poli-insaturados
em gordura do leite. A sntese destes compostos requer elevada seletividade, como por ex.
enantiosseletividade, para a obteno de compostos de alto valor agregado. Por esta razo,
vale ressaltar a importncia do quadro resumo de atividades desenvolvidas para outras
possveis aplicaes dos biocatalisadores preparados de lipases.
155
Quadro 4.1. Propriedades catalticas dos derivados de lipases preparados por diferentes protocolos.
Lipases
Lipase pancretica
Suporte
Protocolo de Ativao
Agarose 6BCL(12h)
Glioxil-GLI(1)
Glioxil-EPI(1)
(LPP)
Glioxil-amino-GLU
Thermomyces
lanuginosus (LTL)
(24h)
Agarose 6BCL
(1)
26,8
95,4
291
297,6
85,5
25,0
96,0
276
117,0
(a)
57,3
100
10,2
206
290,8
(a)
NR
26,4
87,7
329
279,5
(a)
NR
25,0
89,0
295
129,3(a)
NR
100
10,3
221
(a)
NR
27,0
81,8
277
279,2(a)
NR
26,4
81,5
271
105,8
(a)
NR
100
8,42
208
109,1
(a)
Glioxil-EPI
Glioxil-EPI
(1)
(1)
(1)
(1)
271,3
Glioxil-EPI(1)
Glioxil-GLI
Glioxil-EPI
GLU
Quitosana-TNBS(12h)
86,7
Glioxil-amino-GLU
Quitosana
Fator de
Estabilidade
(a)
Glioxil-GLI
(12h)
Atividade
Recuperada
(%)
-
(1)
Glioxil-amino-GLU(1)
Agarose 6BCL(72h)
Protena
Imobilizada
(%)
-
319,5(a)
Glioxil-GLI
Agarose 6BCL
Formao de
Butirato de Butila
(mM)24 h
-
Glioxil-GLI(1)
Glioxil-amino-GLU
(48 h)
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
-
(1)
(1)
(1)
Glioxil-GLI(1)
Glioxil-EPI
GLU(1)
(1)
(1)
NR
28,4
40, 0
15,2
97,6
(a)
NR
24,0
42,5
12,5
95,3
(a)
NR
60,0
13,1
7,10
108,9(a)
NR
17,4
65,5
13,9
(a)
NR
19,6
47,1
17,7
90,8(a)
NR
39,6
16,0
8,75
97,6
156
Quadro 4.1. Propriedades catalticas dos derivados de lipases preparados por diferentes protocolos (continuao).
Lipases
Thermomyces
Suporte
Protocolo de Ativao
Quitosana-Gelatina(12h)
Glioxil-GLI(1)
lanuginosus (LTL)
Glioxil-EPI
GLU
Quitosana-GelatinaTNBS
(12h)
(1)
(1)
(12h)
Carragenina
Carragenina-TNBS(12h)
TNBS
99,9
(a)
NR
26,2
40,0
11,2
95,3
(a)
NR
61,0
16,3
8,62
12,5
NR
23,6
52,4
23,5
NR
23,2
74,2
27,3
113,6(a)
Glioxil-EPI
Glioxil-GLI
Glioxil-EPI
(1)
(1)
(1)
Glioxil-GLI
(1)
Glioxil-EPI(1)
(1)
121,6
NR
64,0
16,4
11,0
74,0
(a)
NR
19,0
25,1
7,45
50,0
(a)
NR
21,6
16,1
5,24
36,3
(a)
NR
39,6
5,80
2,31
(a)
NR
21,2
38,7
9,44
140,7(a)
NR
24,4
50,2
16,5
NR
37,4
14,3
10,6
104,4
95,7
(a)
Glioxil-GLI(1)
131,5(a)
NR
28,8
44,6
14,3
(1)
(a)
NR
31,0
38,9
14,6
104,1(a)
NR
57,6
15,3
12,3
160,5
(a)
NR
27,2
51,3
30,1
178,7
(a)
NR
27,8
54,9
31,4
148,9
(a)
NR
54,4
23,1
22,1
GLU(1)
(12h)
Fator de
Estabilidade
(a)
Glioxil-EPI
Quitosana-PVA-
Atividade
Recuperada
(%)
48,5
(1)
GLU
Quitosana-PVA(12h)
Protena
Imobilizada
(%)
21,6
118,1(a)
GLU
Quitosana-
Formao de
Butirato de Butila
(mM)24 h
NR
Glioxil-GLI(1)
GLU(1)
Quitosana-
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
99,9(a)
Glioxil-GLI
Glioxil-EPI
GLU
(1)
(1)
(1)
115,1
157
Lipases
Thermomyces
lanuginosus (LTL)
Suporte
QuitosanaAlginato
(12h)
Formao de
Butirato de
Butila
(mM)24 h
NR
Protena
Imobilizada
(%)
Atividade
Recuperada
(%)
Fator de
Estabilidade
36,4
51,4
7,89
201,7
(a)
NR
34,0
58,9
12,3
194,9
(a)
NR
59,4
28,3
9,29
234,6
(a)
57,4
14,4
67,8
45,3
217,0
(a)
55,8
22,2
61,7
45,2
213,7(a)
42,9
70,8
31,7
44,2
(a)
NR
34,8
47,7
43,3
126,0(a)
NR
34,6
44,5
48,7
(a)
NR
73,8
29,2
42,2
Glioxil-GLI (LAU-1%)(1)
54,8(a)
NR
21,2
22,7
18,0
Glioxil-GLI (LAU-3%)(1)
71,2(a)
NR
23,6
29,1
24,2
(1)
(a)
NR
27,2
36,4
24,5
Protocolo de Ativao
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
Glioxil-GLI(1)
163,5(a)
(1)
Glioxil-EPI
GLU
Quitosana-AlginatoTNBS
(12h)
(1)
Glioxil-GLI
(1)
(1)
Glioxil-EPI
GLU(1)
Quitosana-AlginatoTNBS(24h)
Glioxil-GLI
147,9
Glioxil-EPI(1)
GLU
Quitosana-AlginatoLAU
(1)
(12h)
(1)
164,4
Glioxil-GLI (LAU-5%)
Quitosana-Alginato(12h)
levedura-TNBS
Glioxil-GLI(1)
109,6(a)
NR
21.7
37,2
37,8
(1)
(a)
NR
22.3
48,2
48,8
148,0(a)
NR
51.1
42,1
46,1
(a)
66,6
32,4
60,9
27,0
(a)
244,9
60,0
36,8
69,7
31,0
169,6(a)
46,2
100
18,0
21,0
Glioxil-EPI
GLU(1)
Glioxil-GLI
Amino-Toyopearl
(24h)
87,7
Glioxil-EPI
(1)
(1)
Glioxil-amino- GLU(1)
158,9
188,4
158
Lipases
Suporte
Thermomyces
lanuginosus (LTL)
PHB
(12h)
Protocolo de Ativao
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
Glioxil-GLI(1)
76,7(a)
Glioxil-EPI
(1)
Glioxil-amino- GLU
Bagao de cana-deacar
(12h)
Glioxil-GLI
Glioxil-EPI
(a)
79,5
(1)
Quitosana-
Epxi
(24h)
Epxi-tiol
(1h)
Octil-agarose
(1h)
Hexil-toyopearl
(1)
(2)
Adsoro fsica
Adsoro fsica
Adsoro fsica
Octadecil-
20,0
40,7
22,5
16,2
NR
25,4
75,5
17,7
(a)
NR
25,4
78,8
19,1
(a)
NR
39,8
21,1
13,2
305,8
(a)
24,3
52,0
61,9
6,0
175,1
(a)
27,5
44,0
41,7
3,4
NR
100
4500
126,0
NR
100
1600
176,0
NR
100
51,0
70,0
880,0
(2)
NR
23,1
2475,0
(2)
Fator de
Estabilidade
34,8
191,8
(1)
Atividade
Recuperada
(%)
NR
183,6
(1)
Protena
Imobilizada
(%)
(a)
76,8
(1)
Glioxil-amino- GLU
Alginato
(1)
Formao de
Butirato de
Butila
(mM)24 h
32,5
(b)
(b)
(b)
(1h)
sepabeads
PHB em p(12h)
(18h)
PHB granular
Bacillus
thermocatenulatus
(1h)
Octil-agarose
Agarose 10BCL
(24 h)
(BTL2)
Adsoro fsica(1)
1558,1(a)
95,0
~100
65,4
NR
(1)
200,0
(a)
91,5
~100
11,1
NR
(1)
NR
NR
NR
NR
340
NR
NR
87
14,0
2648
NR
100
22,0
4360
89,0
73,6
31,5
NR
82,8
50,4
7,80
NR
Adsoro fsica
Adsoro fsica
Glioxil-GLI
(2)
Glioxil-GLI (lipase aminada)

PHB em p
(12h)
(18h)
PHB granular
Adsoro fsica
(1)
Adsoro fsica
(1)
(2)
NR
256,6
69,6
(a)
(a)
159
Lipases
Candida antarctica
B (CALB)
Suporte
Protocolo de Ativao
Octil-agarose(1h)
(1h)
Hexil-toyopearl
(1h)
Octadecil-sepabeads
PHB em p
(12h)
(18h)
PHB granular
Epxi-Sepabeads(24h)
Agarose 6BCL
77,0
196,0
Estabilidade
243,0
NR
100
81,0
181,0
111,0
(b)
NR
100
37,0
62,0
135,5
(a)
Adsoro fsica
(2)
Adsoro fsica
Adsoro fsica
(1)
Adsoro fsica
(1)
95,0
~100
25,8
NR
(a)
91,5
~100
10,8
NR
38,1(b)
NR
100
15,0
13,0
(b)
NR
100
13,0
21,0
Glioxil-GLI(1)
64,7(a)
NR
40,6
40,0
23,0
(1)
(a)
NR
43,0
34,4
18,0
35,3(a)
NR
100
8,90
15,0
52,9
(a)
NR
45,4
30,0
21,4
52,9
(a)
NR
41,0
22,5
20,0
35,3
(a)
NR
100
8,90
17,0
41,2
(a)
NR
43,4
23,8
22,0
41,8(a)
NR
45,6
19,0
22,5
(a)
NR
100
7,40
20,0
143,4(b)
NR
77,0
56,0
211,0
(b)
NR
88,0
61,0
287,0
43,0
Glioxil (CALB no aminada
Glioxil-EPI
Glioxil-EPI
(1)
(1)
(1)
Glioxil-EPI(1)
Glioxil-amino-GLU
33,0
58,8
(1)
Glioxil-GLI
Agarose 10BCL(24h)
100
Fator de
(b)
Glioxil-amino-GLU
Agarose 6BCL(72h)
Atividade
Recuperada
(%)
(2)
Glioxil-GLI
Agarose 6BCL
Protena
Imobilizada
(%)
231,0(b)
(48h)
Formao de
Butirato de
Butila
(mM)24 h
NR
Adsoro fsica(2)
Glioxil (lipase aminada)

(24h)
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
(1)
Glioxil (lipase no aminada(1)

Glioxil (lipase aminada)
29,4
155,0
160
Lipases
Suporte
Pseudomonas
fluorescens (LPF)
(24h)
Agarose 6BCL
Formao de
Butirato de
Butila
(mM)24 h
NR
Protena
Imobilizada
(%)
Atividade
Recuperada
(%)
Fator de
Estabilidade
70,6
8,60
7,80
59,0
(a)
NR
65,0
8,30
7,40
40,0
(a)
NR
100
5,20
6,80
64,6
(a)
NR
66,8
6,33
7,40
58,8
(a)
NR
60,0
6,43
8,70
40,0(a)
NR
100
5,20
6,50
(a)
NR
68,0
5,70
6,90
52,9(a)
NR
63,0
5,51
8,40
(a)
NR
100
5,60
7,00
Glioxil-GLI(1)
44,0(a)
62,2
37,8
10,7
5,20
(1)
(a)
65,5
44,0
12,3
5,70
27,4
62,8
15,2
2,2
Protocolo de Ativao
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
Glioxil-GLI(1)
66,0(a)
(1)
Glioxil-EPI
Glioxil-amino-GLU
Glioxil-GLI
(48h)
Agarose 6BCL
Glioxil-EPI
(1)
(1)
(1)
Glioxil-GLI
Agarose 6BCL(72h)
(1)
Glioxil-EPI(1)
Glioxil-amino-GLU
Amino-Toyopearl(24h)
Glioxil-EPI
QuitosanaAlginato(24h)
PHB em p(12h)
PHB granular(18h)
Lipex 100L
Agarose 6BCL
(1)
42,4
58,7
Epxi (monofuncional)
(1)
150,7
(a)
Adsoro fsica(1)
1099,6 (a)
93,0
77,2
73,1
NR
Adsoro fsica(1)
212,8 (a)
90,1
56,2
22,5
NR
(a)
NR
96,8
16,4
6,10
244,0(a)
NR
90,0
17,0
6,50
NR
100
5,80
4,70
Glioxil-GLI
(24h)
58,8
(1)
253,0
Glioxil-EPI(1)
Glioxil-amino-GLU
(1)
92,0
(a)
161
Lipases
Suporte
Lipex 100L
(48h)
Agarose 6BCL
Protocolo de Ativao
Atividade
Hidroltica
(U.g-1 de gel)
Glioxil-GLI(1)
235,2(a)
(1)
(a)
Glioxil-EPI
231,1
Glioxil-amino-GLU
Glioxil-GLI
(72h)
Agarose 6BCL
Glioxil-EPI
(1)
(1)
(1)
Quitosana-Alginato
(24h)
PHB em p(12h)
(18h)
PHB granular
Epxi (monofuncional)
Adsoro fsica(1)
Adsoro fsica
(1)
(1)
75,0
(a)
Formao de
Butirato de
Butila
(mM)24 h
NR
Protena
Imobilizada
(%)
Atividade
Recuperada
(%)
Fator de
Estabilidade
95,6
15,5
6,70
NR
88,8
15,7
6,40
NR
100
4,71
4,20
211,7
(a)
NR
96,0
13,9
7,50
217,0
(a)
NR
88,4
14,6
9,00
NR
100
4,30
4,00
34,1
42,0
63,8
6,0
93,7
~100
82,2
NR
94,3
~100
9,10
NR
77,5(a)
235,2
(a)
1715,5 (a)
190,2
(a)
GLI: glicidol; EPI: epicloridrina; GLU: glutaraldedo; Rendimento de imobilizao: Atividade hidroltica teoricamente imobilizada; t1/2: tempo de meia-vida das lipases
solveis a 70 C; Fator de Estabilidade: relao entre o tempo de meia-vida do derivado e da lipase solvel; PHB: poli-hidrxibutirato; (1) e (2): imobilizao das lipases com
carregamento de 5 e de 1 mg protena.g-1 de gel, respectivamente NR: no realizado; TNBS: cido 2,4,6 trinitrobenzenossulfnico; (a) hidrlise do azeite de oliva
emulsificado; (b) hidrlise do p-nitrofenilbutirato (p-NPB).
162
4.4. Etanlise de leos Vegetais Catalisada por Derivados de Lipases Selecionados

4.4.1. Sntese de Biodiesel Catalisadas por Lipases LTL e LPF Imobilizadas em Matrizes
Comerciais Agarose e Amino-Toyopearl
Lipase de Thermomyces lanuginosus (LTL) foi imobilizada em gis glioxilagarose 6BCL e os derivados obtidos apresentaram maior fator de estabilidade. Esta lipase
tambm foi imobilizada em glioxil-toyopearl e a estabilizao foi entre 27 a 31 vezes mais
estvel que a enzima solvel. Por este motivo foram adotados estes derivados que permitiram
imobilizar LTL por ligao covalente multipontual para a sntese de biodiesel, empregando os
leos vegetais babau e palma, e etanol como doador de grupo acila. No Laboratrio de
Biocatlise da Escola de Engenharia de Lorena a preparao de lipase de Pseudomonas
fluorescens (LPF) tem sido extensivamente empregada em reaes de biotransformaes
(Moreira et al., 2007, Da Rs, 2009). A imobilizao de LPF em gis de agarose previamente
ativados foi realizada, porm no foi possvel estabiliz-la termicamente. Para efeitos
comparativos, foi empregada esta lipase para a sntese de biodiesel com os dois tipos de leos.
As condies reacionais empregadas para a sntese de biodiesel foram baseadas em estudos
realizados no Laboratrio de Biocatlise da Escola de Engenharia de Lorena EEL/USP
(Moreira et al., 2007; Da Rs, 2009). Na sntese de biodiesel a partir do leo de babau foi
empregada a relao molar leo:etanol de 1:9 (Da Rs, 2009) e para o leo de palma a relao
molar foi de 1:18 (Moreira et al., 2007). A temperatura de sntese foi de 45 C, empregando 2
mg de protena imobilizada.g-1 de leo vegetal. Os derivados ativados por glutaraldedo no
foram empregados nestes testes, somente aqueles obtidos por ativao glioxil (glicidol e
epicloridrina). Os testes de sntese de biodiesel foram realizados em meios isentos de
solventes orgnicos e a miscibilidade entre leo e etanol foi auxiliada pela agitao do meio
reacional (200 rpm em incubadora rotativa).
Os resultados de converso do leo de palma em mono-steres de etila
catalisada por lipases LPF e LTL esto sumarizados na Tabela 4.28.
Em 24 h, os valores de rendimento de leo de palma em steres etlicos
variaram entre 85,2 e 100% e em 48 h o valor mnimo de converso foi superior a 93%. Os
derivados de LPF preparados por imobilizao em glioxil-agarose ativado por glicidol e
163
glioxil-toyopearl ativado por epicloridrina e o derivado de LTL imobilizado em glioxiltoyopearl ativado por glicidol apresentaram mximo rendimento em 24 h. Ao final de 48 h,
apenas LTL imobilizada em glioxil-agarose ativado por glicidol e em glioxil-toyopearl
ativado por epicloridrina no atingiram rendimento mximo. No foi verificada influncia
significativa do tipo de enzima, agente de ativao e tipo de suporte para a sntese de biodiesel
a partir do leo de palma. Estes valores de rendimento esto de acordo com dados relatados na
literatura (Moreira et al., 2007).
Tabela 4.28. Rendimento de transesterificao de leo de palma e etanol por lipases
microbianas de Thermomyces lanuginosus (LTL) e Pseudomonas fluorescens (LPF)
imobilizadas covalentemente em gis glioxil-agarose e glioxil-toyopearl ativados por
diferentes protocolos.
Suportes
Lipase
Agente de
Rendimento
Ativao
(%)
24 h
48 h
Toyopearl
LTL
GLI
100
100
Toyopearl
LTL
EPI
95,5
97,3
Toyopearl
LPF
GLI
95,3
100
Toyopearl
LPF
EPI
100
100
Agarose
LTL
GLI
85,2
93,5
Agarose
LTL
EPI
90,7
100
Agarose
LPF
GLI
100
100
Agarose
LPF
EPI
93,1
100
Na sntese de biodiesel a partir do leo de babau o rendimento foi inferior aos

resultados obtidos para o leo de palma (Tabela 4.29). Em 24 h, os valores de rendimento de
leo de babau em biodiesel variaram entre 63,6 a 84,7% e em 48 h o valor mnimo de
rendimento foi superior a 82%. Nenhum derivado converteu 100% do leo de babau em
biodiesel ao final de 48 h.
Estes valores de rendimento foram inferiores ao leo de palma devido
especificidade das duas lipases testadas por cidos graxos de cadeia longa presentes no leo
de palma. Os principais cidos graxos presentes no leo de palma so os cidos palmtico C16:0 (46,8 %) e oleico - C18:1 (37,6 %) (Moreira et al., 2007). No leo de babau os principais
cidos presentes so lurico - C12:0 (44,7%), mirstico C14:0 (17,5 %) e oleico (15,2 %)
164
(Urioste et al., 2008). De acordo com os resultados, as lipases LPF e LTL possuem maior
afinidade por cidos graxos de cadeia longa como cidos palmtico e oleico e a composio
do leo de babau predominantemente de cidos graxos de cadeia curta e mdia. Neste
contexto, as lipases testadas catalisaram preferencialmente a transesterificao do leo com
maior concentrao de cidos graxos de cadeia longa (leo de palma). A transesterificao
dos leos de babau e palma empregando etanol como doador de grupo acila foi catalisada
por lipases LPF e de Pseudomonas cepacia (LPC) assistidas por microondas (Da Rs, 2009).
A lipase LPF apresentou maior atividade de transesterificao para o leo de palma,
mostrando que os resultados obtidos no presente trabalho esto de acordo com a literatura.
Tabela 4.29. Rendimento de transesterificao de leo de babau e etanol por lipases
microbianas de Thermomyces lanuginosus (LTL) e Pseudomonas fluorescens (LPF)
imobilizadas covalentemente em gis glioxil-agarose e glioxil-toyopearl ativados por
diferentes protocolos.
Suportes
Lipase
Agente de
Rendimento
Ativao
(%)
24 h
48 h
Toyopearl
LTL
GLI
74,5
82,2
Toyopearl
LTL
EPI
73,8
84,0
Toyopearl
LPF
GLI
84,0
88,6
Toyopearl
LPF
EPI
68,9
83,8
Agarose
LTL
GLI
63,6
89,0
Agarose
LTL
EPI
81,5
91,9
Agarose
LPF
GLI
84,7
93,2
Agarose
LPF
EPI
78,0
94,9
Os valores de viscosidade cinemtica obtidos para o biodiesel do leo de palma

aps 48 h de reao foram prximos de 4,30 cSt e o biodiesel de leo de babau foi inferior a
3,40 cSt e de acordo com as especificaes recomendadas pela ANP, os mono-steres de etila
(biodiesel) obtidos na transesterificao dos leos testados podem ser utilizados em motores
de ciclo a diesel sem nenhuma adaptao, pois a faixa de viscosidade apropriada para a
utilizao de biodiesel como combustvel de 3 a 6 cSt.
165
4.4.2. Sntese de Biodiesel Catalisada por LTL Imobilizada em Polieletrlito QuitosanaAlginato Hidrofobizado por TNBS
Foi feita uma triagem de suportes para a estabilizao da lipase LTL

empregando hidrogel de quitosana e complexos polieletrolticos empregando como agente de
hidrofobizao cido 2,4,6 trinitrobenzenossulfnico (TNBS). O complexo polieletroltico
quitosana-alginato hidrofobizado por TNBS ativado por glicidol, epicloridrina e glutaraldedo
permitiu obter um microambiente favorvel imobilizao da enzima, pois foi possvel obter
derivados termoestveis (FE=45) e com alta atividade cataltica. Derivados de LTL
imobilizados neste suporte s foram menos estveis que os derivados de LTL imobilizados
em glioxil-agarose (Tabela 4.8).
Estes derivados foram empregados na sntese de biodiesel a partir da etanlise
do leo de palma empregando razo molar leo:etanol de 1:18 e carregamento de 2 mg de
protena imobilizada.g-1 de leo. Os perfis de sntese de biodiesel empregando LTL
imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativado por diferentes protocolos so mostrados na
Figura 4.20.
Os perfis de sntese de biodiesel por LTL imobilizada em glioxil-quitosanaalginato-TNBS foram bastante similares para a enzima imobilizada em gel glioxil (glicidol e
epicloridrina) como pode ser visto na Figura 4.20. Em 14 h de reao, aproximadamente 70%
do leo foi convertido em mono-steres de etila e para o derivado obtido por ativao com
glutaraldedo, o rendimento foi prximo a 50%. Em 24 h, o rendimento da reao catalisada
pelos derivados glioxil foi prximo a 90% e para o derivado ativado por glutaraldedo foi de
70%, o mesmo valor obtido para os outros derivados em 14 h. Ao final de 48 h, o rendimento
em mono-steres de etila foi de 100% para os derivados glioxil, o que no foi verificado para
LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS-glutaraldedo (85,5%). Estes valores so
similares aos resultados obtidos na sntese de butirato de butila, na qual os derivados glioxil
foram mais ativos em meio orgnico.
De acordo com a Figura 4.20, em 14 h de reao a viscosidade dos monosteres de etila produzidos atingiu a faixa tima de aplicao como combustvel de acordo
com espeficaces recomendadas pela Agncia Brasileira de Petrleo (ANP) para ser usado
como biocombustvel, com viscosidade final de aproximadamente 4,30 cSt.
166
100
80
30
60
20
40
10
Rendimento (%)
Viscosidade (cSt)
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Tem po (h)
Figura 4.20. Rendimento de transesterificao do leo de palma em biodiesel (smbolos

vazios) e reduo da viscosidade (smbolos cheios) por etanlise do leo de babau catalisada
por LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS ativada por glicidol (quadrado),
epicloridrina (tringulo) e glutaraldedo (crculo).
4.4.3. Sntese de Biodiesel Catalisada por Lipases Microbianas Imobilizadas em

Diferentes Configuraes de PHB
Lipases CALB, LTL, LPF, BTL2 e Lipex 100L foram imobilizadas por
adsoro hidrofbica em PHB em p e granular e empregadas na sntese de biodiesel por
etanlise do leo de babau. A concentrao de enzima empregada foi de 10% em massa de
derivado em relao massa total dos reagentes de partida (leo + etanol). Os perfis de
converso de leo de babau em monosteres de etila (biodiesel) so mostrados na Figura
4.21.
Os perfis de rendimento de transesterificao para as preparaes de lipases
CALB, LTL e Lipex 100L imobilizadas em PHB em p e granular foram bastante similares.
A influncia da configurao do suporte na atividade hidroltica foi significante, mas na
sntese de biodiesel este comportamento no foi observado. Possivelmente, a viscosidade do
substrato empregado na reao de hidrlise (azeite de oliva emulsificado com goma arbica)
maior que a viscosidade do substrato empregado na sntese de biodiesel e alguns fatores
167
contribuem para uma possvel reduo dessa viscosidade como o excesso de etanol
empregado e a temperatura de reao (45 C), contribuindo para uma maior difusividade do
substrato empregado na sntese de biodiesel ao microambiente da enzima imobilizada.
(A)
(B)
Viscosidade (cSt)
80
25
20
CALB
15
60
40
10
20
40
60
80
LPF
15
60
40
10
20
80
20
20
100
100
Rendimento (%)
30
Rendimento (%)
25
100
Viscosidade (cSt)
30
0
0
20
40
Tempo (h)
60
80
100
Tempo (h)
(C)
(D)
100
Viscosidade (cSt)
80
25
20
Lipex 100L
15
60
40
10
Rendimento (%)
30
80
20
60
LTL
15
40
10
20
20
0
0
20
40
60
Tempo (h)
80
100
Rendimento (%)
25
100
Viscosidade (cSt)
30
0
0
20
40
60
80
100
Tempo (h)
Figura 4.21. Rendimento de transesterificao (quadrados) e reduo da viscosidade (crculos)

por etanlise do leo de babau catalisada por lipases (A) CALB, (B) LPF, (C) Lipex 100L e
(D) LTL imobilizadas por adsoro hidrofbica em PHB em p (cheio) e granular (vazio).
Em 24 h, a lipase CALB converteu 50,0% do substrato em biodiesel, inferior
lipase Lipex 100L que converteu aproximadamente 63,0%. Em 48 h, observado o mesmo

168
comportamento, pois a lipase CALB havia convertido 75,0% em biodiesel e a lipase Lipex
100L 86,0%. O rendimento mximo obtido para estas lipases foi em 72 h. Para a lipase LPF, a
geometria do suporte influenciou a sntese de biodiesel. Em 24 e 48 h de reao, a converso
obtida para a lipase imobilizada em PHB granular foi duas vezes superior ao derivado em p.
O rendimento mximo obtido para o derivado preparado em PHB granular foi em 72 h, 24 h a
menos que o derivado em p.
Os valores de viscosidade para o biodiesel sintetizado a partir de lipases
imobilizadas em PHB tambm atingiram as especificaes da ANP. De acordo com a Figura
4.21, os valores de viscosidade s atenderam as especificaes aps 72 h de reao, com
viscosidade em torno de 3,4 cSt. Para a lipase LTL, o derivado preparado em PHB em p
apresentou viscosidade do biodiesel final foi de 5,95 cSt e para o derivado preparado em PHB
granular foi de 6,76 cSt, fora das especificaes para ser utilizado como combustvel, pois a
faixa limite de 3 a 6 cSt.
Dentre as lipases testadas, apenas BTL2 apresentou baixa especificidade pelo
substrato. A converso obtida ao final de 96 h foi prxima a 2%. Acreditava-se, inicialmente,
que esta enzima mostrasse um desempenho similar s outras lipases, pois na reao de sntese
de butirato de butila esta lipase mostrou ser bastante ativa.
A concentrao de lipase imobilizada oferecida para cada meio reacional, bem
como os valores de rendimento mximo e produtividade em 24 h de reao so mostrados na
Tabela 4.30. As concentraes de lipases oferecidas de CALB, LTL, Lipex 100L e BTL2
imobilizada em PHB granular foram de 0,79 mg.g-1 de leo, pois estes derivados
apresentaram a mesma concentrao de enzima imobilizada. BTL2 imobilizada em PHB em
p foi o sistema com maior concentrao de lipase oferecida (1,17 mg.g-1 de leo). Embora,
para a LPF imobilizada em PHB granular, a relao protena/leo tenha sido a menor testada
entre os derivados de lipases preparados em PHB (0,45 mg.g- 1 de leo), o rendimento de
transesterificao foi similar aos outros derivados como CALB e Lipex 100L. LPF
imobilizada em PHB em p, mesmo com maior concentrao de protena oferecida,
converteu totalmente o leo de babau em biodiesel aps 96 h de reao. O rendimento
mximo obtido para LTL, entre 80 e 85%, foi alcanado aps 96 h de reao. BTL2 no
transesterificou o leo de babau e etanol.
169
Tabela 4.30. Protena imobilizada oferecida na etanlise do leo de babau e produtividade.

Lipases
PHB
PIoferecida.g-1 de
Rendimento
Produtividade
leo
mximo/tempo (mgbiodiesel.h-1. mgP1-1)24 h
(h)
P
0,79
100%/72h
21,4
CALB
LTL
Lipex
100L
LPF
BTL2
granular
0,79
100%/72h
18,9
0,79
80,7%/96h
22,8
granular
0,79
85,2%/96h
23,4
0,79
100%/72h
25,7
granular
0,79
100%/72h
25,1
0,61
100%/96h
15,8
granular
0,45
100%/72h
40,9
1,17
granular
0,79
PIoferecida: protena imobilizada oferecida (mg) na transesterificao por grama de leo.
Apesar da menor concentrao de lipase oferecida na etanlise de leo de

babau, o derivado de LPF preparado por adsoro fsica em PHB apresentou maior
produtividade em 24 h (40,9 mgbiodiesel.h-1. mgP1-1), quase trs vezes maior que a mesma
enzima imobilizada no suporte em p. Uma possvel explicao para este fato a sua massa
molecular ser superior s outras enzimas testadas e com a imobilizao em suporte com maior
rea superficial (PHB em p) o nmero de molculas de enzimas imobilizadas tambm
maior e limitaes difusionais podem ocorrer. Outra hiptese para o menor desempenho de
LPF imobilizada em PHB em p que a enzima pode ter sofrido maior efeito de inibio pelo
etanol e/ou glicerol produzido devido ao acmulo destes compostos no microambiente da
enzima quando imobilizada em matriz com menor dimetro de poro. Para os outros derivados
preparados de lipases no foi verificada influncia significante da geometria do suporte sobre
a converso do leo de babau em biodiesel, o que no foi constatado para a LPF.
Na literatura so reportados estudos conduzidos com diferentes lipases
imobilizadas por adsoro fsica em polipropileno macroporoso na sntese de biodiesel a
partir da metanlise de leos de vegetais (Salis et al., 2008). Os autores testaram oito
preparaes de lipases microbinas de Mucor javanicus (Lipase M), Penicillium camembertii
(Lipase G), Rhizopus oryzae (Lipase F), Candida rugosa (Lipase AY), Penicillium roquefortii
170
(Lipase R), Pseudomonas fluorescens (Lipase AK), Pseudomonas cepacia (Lipase PS) e de
Aspergillus niger (Lipase A) fornecidas pela empresa Amano Enzymes e o mximo
rendimento de transesterificao foi alcanado para a reao catalisada por lipase de
Pseudomonas fluorescens (LPF), comportamento semelhante ao obtido no presente trabalho.
BTL2 imobilizada em PHB no converteu o leo de babau em mono-steres
de etila. Algumas lipases imobilizadas por adsoro fsica em suportes hidrofbicos,
oferecendo baixo carregamento de enzima, so inativadas devido forte interao entre a
enzima e o suporte (Bosley e Peilow, 1997; Salis et al., 2003). Em reaes de hidrlise e
esterificao, os derivados de BTL2 apresentaram atividade cataltica e por esta razo a
hiptese de que a enzima sofreu inativao durante a imobilizao foi descartada. Lipase
BTL2 imobilizada em PHB apresentou elevada atividade cataltica em meio orgnico na
sntese de butirato de butila (Tabela 4.27) e por esta razo ela foi empregada na esterificao
dos cidos butrico (C4:0), lurico (C12:0) e oleico (C18:1) com etanol e butanol em diferentes
razes molares e os valores de converso obtidos esto sumarizados na Figura 4.22.
100
Concentrao de steres (mM)
80
(1:1)
(1:1)
60
(1:1)
(1:9)
(1:1)
(1:9)
AB/But AO/But AO/Et
AO/Et
40
20
0
AL/Et
AL/Et
Figura 4.22. Sntese de steres catalisadas por BTL2 imobilizada em PHB em p.
A maior converso em ster foi verificada na esterificao cido butrico (C4:0)

e butanol (AB/But), como mostrado anteriormente, convertendo aproximadamente 90% dos
materiais de partida em butirato de butila. Na esterificao do cido oleico (AO) com butanol
171
(AO/But), a converso foi ao redor de 70%. Substituindo o butanol por etanol, a concentrao
de oleato de etila obtida foi de 60 mM e em excesso de etanol (1:9) a concentrao de ster foi
a mesma que a reao conduzida em concentraes equimolares (1:1), no havendo influncia
da concentrao de etanol sobre a sntese de oleato de etila. A substituio do butanol por
etanol na esterificao com cido oleico reduziu ligeiramente a atividade enzimtica do
biocatalisador. Na esterificao do cido lurico com etanol (AL/Et), a reao equimolar (1:1)
mostrou maior converso em laurato de etila.
De acordo com os resultados, a enzima mostrou maior atividade cataltica na
esterificao de cido carboxlico de cadeia curta (C4:0) com butanol e na esterificao de
cidos graxos de cadeia mdia (C12:0) e longa (C18:1) a converso foi ligeiramente inferior,
mostrando maior afinidade por cidos de cadeia curta. O tipo de lcool e razo molar na
esterificao de cidos graxos de cadeia mdia e longa no apresentou influncia significante
sobre a atividade cataltica da enzima.
Esta preparao de lipase no catalisou eficientemente a transesterificao de
leo de babau com etanol, mas mostrou ser ativa na esterificao de cidos de cadeia curta e
longa com alcois de cadeia curta, e de acordo com os resultados mostrados a lipase BTL2
mostrou ser altamente seletiva, similar lipase de Penicillium camembertii (Lipase G),
fornecida pela Amano Enzymes, que no catalisa a reao de transesterificao de leos e
gorduras, mas apresenta elevada atividade cataltica em reaes de esterificao (Freitas et al.,
2007). Estudos ainda devem ser realizados para a elucidao do mecanismo de BTL2 em
meios no-convencionais e a sua aplicao nestes meios na obteno de produtos de alto valor
agregado.
172
5. CONCLUSES
O objetivo principal do trabalho foi a preparao e seleo de derivados de

lipases imobilizados com elevada atividade cataltica e termoestveis visando a sntese de
biodiesel por etanlise dos leos de babau e palma. Os resultados obtidos foram bastante
satisfatrios, e nesse conjunto de dados destacam-se:
Lipase de pncreas de porco (LPP) foi totalmente inativada durante a imobilizao em gel
glioxil-agarose aps 5 h de incubao em tampo bicarbonato pH 10,05. A substituio
por tampo borato e adio de agentes protetores durante a imobilizao no permitiu
obter derivados com atividade cataltica.
O aumento do tempo de imobilizao da lipase microbiana LTL em glioxil-agarose

ativada com glicidol e epicloridrina de 4 para 72 h, aumentou consideravelmente a
estabilizao trmica dos derivados. Em 24 h de imobilizao foram obtidos os derivados
mais termoestveis de LTL (FE~300). Para as lipases Lipex 100L, CALB, LTL e LPF o
aumento do tempo de imobilizao de 24 at 72 h no melhorou a estabilizao trmica
dos derivados. Por isso o tempo adotado para as imobilizaes destas lipases em glioxilagarose foi de 24 h. O processo de imobilizao estabilizou a CALB de 15 a 23 vezes em
relao enzima solvel. A estabilizao trmica dos derivados de Lipex 100L e LPF foi
inferior a 10 vezes. Os derivados com maior atividade hidroltica foram obtidos para a
LTL e Lipex 100L. Derivados obtidos por ativao com glutaraldedo apresentaram
maior concentrao de protena imobilizada e, consequentemente menores valores de
atividade hidroltica devido maior limitao difusional e/ou distoro da enzima. Na
sntese de butirato de butila, o desempenho dos derivados preparados por LTL e LPF foi
similar, apesar da baixa atividade cataltica dos derivados de LPF na hidrlise do azeite de
oliva.
173
A aminao qumica de lipases aumentou consideravelmente a estabilidade trmica de

derivados de BTL2 preparados por imobilizao em glioxil-agarose 10 BCL. CALB
aminada imobilizada em glioxil-agarose (FE=289) foi ligeiramente mais estvel que
CALB no aminada (FE=211). No entanto, para BTL2 a imobilizao da lipase aminada
(FE=3460) foi muito mais estvel termicamente do que a lipase no-aminada (FE=2648).
A imobilizaco de CALB imobilizada em glioxil-sepabeads nas formas aminada e noaminada no gerou derivados termoestveis. A aminao qumica tambm aumentou a
estabiliade dos derivados em solventes orgnicos dioxano e etanol.
Na imobilizao de LTL via glioxil em complexos polieletrolticos de quitosana, o

derivado mais ativo e estvel termicamente foi preparado em quitosana-alginato
hidrofobizado com TNBS e ativado por glicidol, epicloridrina e glutaraldedo (FE=45). O
processo de modificao qumica com TNBS possibilitou a formao de um
microambiente favorvel enzima, na gerao de um suporte mais hidrofbico ideal para
a atividade cataltica de lipases.
Empregando suporte quitosana-alginato na imobilizao de LTL via epxi, inseridos por

ativao com epicloridrina, a estabilidade trmica dos derivados foi inferiores aos obtidos
via glioxil, mesmo variando o tempo de imobilizao de 12 a 72 h, com fatores de
estabilidade inferiores a 10. Entretanto, derivados preparados na imobilizao de LTL e
Lipex 100L apresentaram valores de atividade hidroltica similares aos obtidos em
agarose.
A estabilizao dos derivados de LTL em bagao de cana e PHB via glioxil, prximos a
20 vezes mais estveis que a enzima solvel, foram ligeiramente inferiores aos preparados
em glioxil-amino-toyopearl (FE=30). Em relao agarose, seus derivados foram 10
vezes menos estveis.
Adsoro hidrofbica de lipases em suportes hidrofbicos permitiu obter derivados

altamente estveis (FE~200), entretanto o custo das matrizes superior queles testados
174
como agarose 6 BCL. Fenmeno de hiperativao interfacial foi observado para a LTL
imobilizada nestas matrizes.
Um suporte hidrofbico de baixo custo foi empregado para a imobilizao de lipases,

PHB nas formas granular e em p. Os derivados preparados mostraram elevada atividade
cataltica em meio aquoso (hidrlise) e em meio orgnico (esterificao). A geometria do
suporte influenciou somente na atividade hidroltica dos derivados (limitao difusional).
Um quadro resumo dos derivados preparados durante o trabalho foi feito (Quadro 4.1),
comparando as propriedades catalticas dos biocatalisadores com a finalidade de
selecionar os derivados mais ativos em meio orgnico e aquoso, termoestveis e de baixo
custo. Foram selecionados os derivados de LTL preparados por ativao glioxil em
agarose, amino-toyopearl e quitosana-alginato-TNBS ativada via glioxil (glicidol e
epicloridrina) e glutaraldedo. Os derivados de LPF, apesar da baixa atividade hidroltica e
estabilidade tambm foram selecionados. Derivados de PHB preparados por adsoro
fsica tambm foram selecionados por apresentarem alta atividade cataltica, fcil
preparao e baixo custo.
Na sntese de biodiesel por etanlise dos leos de babau e palma catalisada por derivados
de LTL e LPF imobilizados em glioxil-agarose e glioxil-amino-toyopearl, no foi
verificada influncia significativa do tipo de suporte, lipase e agente de ativao, somente
do tipo de leo empregado. Em 24 h, quase todo o leo de palma foi convertido em
biodiesel e para o leo de babau, a converso variou entre 63,6 a 84,7%, mostrando que
estas lipases testadas apresentaram maior especificidade pelos cidos graxos contidos no
leo de palma.
Derivados de LTL preparados por imobilizao em glioxil-quitosana-alginato-TNBS

converteram todo leo de palma em mono-steres de etila em 48 h de reao e para o
derivado preparado por ativao glutaraldedo o rendimento mximo foi de 85%. Atribuise estes resultados reduo do tamanho de poros do suporte durante a ativao pelo
175
glutaraldedo devido sua elevada reatividade.
Na sntese de biodiesel tambm no foi verificada influncia significativa do tipo de

suporte. Mximas converses foram obtidas em 72 h de reao para as lipases CALB,
LPF e Lipex 100L. LPF imobilizada em PHB granular obteve maior produtividade em
24 h. LTL converteu 85% do leo de babau em mono-steres de etila ao final de 96 h.
Lipase BTL2 no apresentou atividade de transesterificao, mas mostrou alta atividade
cataltica em reaes de esterificao.
Os valores de viscosidade cinemtica obtidos para os mono-steres de etila obtidos foram

inferiores a 4,5 cSt e de acordo com espeficaes recomendadas pela Agncia Brasileira
de Petrleo (ANP) para ser usado como biocombustvel.
176
6. RECOMENDAES PARA TRABALHOS FUTUROS
Para dar continuidade ao estudo realizado, recomendam-se as seguintes etapas:
Estudo de inativao trmica das lipases na temperatura adotada de sntese de biodiesel

(45 C);
Caracterizao das propriedades bioqumicas (pH e temperatura tima), massa molecular
e concentrao de resduos lisina presentes na preparao enzimtica Lipex 100L;
Purificao da lipase LPF por adsoro em suportes hidrofbicos e posterior imobilizao

covalente da enzima;
Purificao e aminao qumica da lipase LPP adsorvida em matrizes hidrofbicas;
Ensaios de carga mxima de BTL2 imobilizada em glioxil-agarose e aplicao destes

derivados em meio orgnico;
Caracterizao morfolgica dos suportes obtidos em laboratrio empregando as tcnicas

de infravermelho, MEV, DSC, TGA, BET e DRX;
Imobilizao de outras lipases em bagao de cana de acar previamente ativado e

verificar a influncia do tempo de imobilizao sobre a estabilidade trmica dos derivados
preparados em bagao;
Caracterizao das propriedades bioqumicas e cinticas (Km e Vmax) dos derivados mais
ativos e estveis termicamente;
177
Otimizao das condies de sntese de biodiesel para os derivados testados por meio de
planejamento experimental variando a concentrao de enzima no reator, temperatura de
reao e razo molar leo:lcool;
Sntese de biodiesel em reatores contnuos com os derivados preparados de agarose;
Aplicao dos derivados termoestveis preparados em reaes em meio orgnico para a

obteno de produtos de alto valor agregado.
178
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194

Protocolo de Adsorção

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

SELEO DE SUPORTES E PROTOCOLOS DE

Adriano Aguiar Mendes

SELEO DE SUPORTES E PROTOCOLOS DE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

SELEO DE SUPORTES E PROTOCOLOS DE

Adriano Aguiar Mendes

Tese de doutorado apresentada ao

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Mendes, Adriano Aguiar.

Dedico esta tese de doutorado minha me

A Deus por tudo que ele representa em minha vida.

Este trabalho teve como objetivo preparar e selecionar derivados imobilizados

quimicamente (FE=4360), seguido de CALB aminada imobilizada em glioxil-agarose 6BCL

Palavras-chave: Suportes, imobilizao, lipases, transesterificao, biodiesel.

thermocatenulatus (BTL2), Pseudomonas fluorescens (LPF) and Lipex 100L were

followed by aminated CALB immobilized on glyoxyl-agarose BCL (SF=290) and TLL

Keywords: Supports, lipases immobilization, thermal stablization, transesterification,

Reaes catalisadas pelas lipases...............................................

Mecanismo da influncia de tensoativos sobre a atividade

Estrutura qumica da resina acrlica Toyopearl AF-Amino650M.........................................................................................

Estrutura dos biopolmeros quitina, quitosana e celulose..........

Influncia do pH sobre a estrutura do hidrogel..........................

Estrutura qumica de quitosana reticulada com glutaraldedo

Imobilizao de lipases por adsoro fsica em suportes

Esquema representativo de imobilizao de enzimas em

Mecanismo de aminao dos grupos carboxlicos da lipase

Esquema representativo de imobilizao de enzimas em

Equao geral de transesterificao de leos e gorduras com

Produo de biodiesel por transesterificao alcalina (A) e

Esquema representativo de preparao dos polieletrlitos de

Mecanismo de reao entre TNBS e os grupos amino de

Esquema representativo do processo de aminao qumica de

Estabilidade alcalina da lipase LPP em tampo bicarbonato

Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes

Perfil de inativao trmica de LTL imobilizada em gel

Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes

Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes

Estabilidade trmica de CALB (A) e BTL2 (B) solveis () e

Estabilidade em dioxano (A) e etanol (B) dos derivados de

Desaparecimento de atividade hidroltica dos sobrenadantes

Estabilidade trmica da lipase LTL solvel () e imobilizada

Cintica de adsoro do corante hidrofbico Rosa de Bengala

Porcentagem de reticulao de hidrogis de quitosanaalginato-TNBS e ativados por diferentes protocolos.................

Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL

Influncia da temperatura na atividade hidroltica de LTL

Inativao trmica das enzimas solveis () e dos derivados

Estabilidade trmica das lipases () solveis e dos ()

Cintica de imobilizao de lipase LTL por adsoro fsica em

Cintica de imobilizao de lipase CALB por adsoro fsica

Estabilidade trmica de CALB (A), LTL (B) e BTL2 (C)

Rendimento de transesterificao do leo de palma em

Rendimento de transesterificao (quadrados) e reduo da

Sntese de steres catalisadas por BTL2 imobilizada em PHB

Mercado mundial de enzimas e aplicao (milhes de

Concentrao de protena imobilizada em diferentes resinas

Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas

Parmetros de imobilizao de enzimas em Sepabeads

Exemplos de produo de biodiesel por transesterificao

Principais caractersticas das preparaes de lipases

Propriedades dos leos de palma e babau................................

Composio em cidos graxos e massa molecular dos leos de

Condies de preparao dos derivados de LTL, LPF, Lipex