Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Bioqumica Experimental I
Professor Francisco Pinto
Grupo: 3
Turma: PL 13
ndice
Resumo.......................................................................................3
Tratamento e Discusso de Resultados..........................................4
Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato4
Determinao da concentrao proteica do homogenato de fgado
e de cada uma das fraes isoladas..................................................5
Frao mitocondrial Determinao da atividade do sucinato:
citocromo c oxidoreductase.......................................................................7
Frao lisossomal Determinao da atividade do fosfatase cido...9
Distribuio dos Marcadores Enzimticos Estudados.........................11
Anlise da Frao Nuclear isolamento do DNA..................................13
Determinao da concentrao de DNA na preparao final......13
Determinao da percentagem de DNA obtido por grama de fgado
............................................................................................................... 14
Bibliografia
16
Resumo
Este trabalho teve como objetivo isolar vrias fraes subcelulares a partir de um
homogenato de fgado de porco por centrifugao diferencial e proceder sua
caracterizao bioqumica, efetuando a extrao de DNA da frao nuclear e a anlise da
distribuio do succinato citocromo c oxidorredutase e o fosfatase cido nas diferentes
fraes isoladas, de modo a que fosse possvel determinar o grau de pureza do DNA
extrado.
Da anlise da distribuio do succinato citocromo c oxidorredutase nas vrias
fraes, conclui-se que este enzima existe em maior concentrao no pellet 2, uma vez que
este especfico da frao mitocondrial. Quanto ao fosfatase cido, podemos afirmar que a
maior concentrao do enzima se encontra no pellet 3, como era esperado visto que este
especfico da frao lisossomal. De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir
que o fracionamento celular foi realizado com sucesso.
Aps a extrao de DNA, foi possvel calcular a sua concentrao na preparao
final, obtendo-se o valor de 33,65 g/mL e ainda a percentagem de DNA por grama de
fgado, em que se obteve o valor de 0,2048%. Em relao ao grau de pureza, o valor obtido
foi de 1,66 que, em comparao com o valor tabelado 1,8 nos permite afirmar que o
DNA extrado ainda continha impurezas, nomeadamente as histonas.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Volume (mL)
Massa (mg)
0,05
0,25
0,10
0,50
0,20
1,00
0,30
1,50
0,40
2,00
0,50
2,50
0,60
3,00
0,80
4,00
1,00
5,00
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
1 Ensaio
2 Ensaio
3 Ensaio
P1
P2
P3
S3
Abs540
0,201
0,078
0,177
0,133
0,137
0,111
0,176
0,197
0,214
0,271
0,285
0,185
0,274
0,264
0,101
Mediana
Massa de Protena
num volume de 4 mL
de H2O (mg)
0,177
1,5799
6,3196
0,5
12,6392
0,133
1,0472
4,1889
0,5
8,3778
0,197
1,8220
7,2881
0,75
9,7175
0,271
2,7179
10,8717
0,75
14,4960
0,264
2,6332
10,5327
0,75
14,0436
Volume
(mL)
Amostra
Concentrao
(mg/mL)
x=1,5799 mg
Visto que se adicionaram 4 mL de gua de modo a suspender o pellet e que se
utilizou apenas 1 mL da suspenso resultante no mtodo do biureto, necessrio
6
6,3196
=12,6392mg/mL
0,5
Os valores das restantes fraes foram calculados do mesmo modo.
Homogenato
Pellet 1
Declive
(s)
0,0013
0,0010
0,0012
0,0013
Mediana
do
Declive
(s)
Abs550/t
(min-1)
Velocidade
(M/min)
0,0012
0,072
3,4286x10
3428,57
7,46571
0,0013
0,078
3,7143x10
3714,29
8,08786
Unidade
Velocidade enzimtica Atividad
(nM/min) (nmole/min e (U/mL)
)
Volume
(mL)
Atividade
total (U)
149,314
89
13289
161,757
20
3235,14
total
Pellet 2
Pellet 3
Sobrenadante 3
0,0012
0,0013
0,0020
0,0019
0,0019
0,0017
0,0016
0,0017
0,0003
0,0002
0,0003
0,0019
0,114
5,4286x10
5428,57
11,8207
236,414
2127,73
0,0017
0,102
4,8571x10
4857,14
10,5764
211,529
1903,76
0,0003
0,018
8,5714x10
857,143
1,86643
37,3286
89
3322,24
||
cm, temos:
C 0,072
C
=
=3,42857 106 M /min
t 21000 t
C
=
t
Amostra
Homogenato
Pellet 1
Pellet 2
Pellet 3
Sobrenadante 3
0.48
0.292
0.435
0.244
0.167
0.204
0.246
0.209
0.275
0.391
0.324
0.338
0.283
0.235
0.303
Unidade
Velocidade enzimtica Atividad
(M/min) (mole/min e (U/mL)
)
Mediana
Abs400
Concentra
o (M)
Volume Atividade
(mL)
total (U)
0.435
0.291
1.38571x10-5
1.385714
0.005543
0.554286
89
49.3314
0.204
0.060
2.85714x10-6
0.285714
0.001143
0.114286
20
2.2857
0.246
0.102
4.85714x10-6
0.485714
0.001943
0.194286
1.7486
0.338
0.194
9.23810x10-6
0.923810
0.003695
0.369524
3.3257
0.283
0.139
6.61905x10-6
0.661905
0.002648
0.264762
89
23.5638
total
Em primeiro lugar, de salientar que foram utilizados os tubos B, uma vez que os
valores de absorvncia obtidos para os tubos A eram demasiado elevados.
Para determinar a atividade do fosfatase cido, registaram-se os valores de
absorvncia a 400 nm. Foi ainda necessrio calcular a mediana dos 3 valores de
absorvncia medidos para cada frao. Sabendo que o valor de absorvncia do branco
corresponde a 0,144 e que os valores da mediana correspondem aos valores da 3 coluna,
para calcular Abs400, necessrio subtrair a cada mediana de absorvncia o valor do
branco. Assim sendo, para o caso do homogenato, temos:
Abs 400=0,4350,144=0,0291
Abs
0,291
Concentrao=
Concentrao =1,3857110 M
21000
10
Aps este clculo, necessrio calcular a velocidade (em M/min). Sabendo que a
leitura das absorvncias foi feita durante 10 minutos e os valores de concentrao para
cada frao (calculados da forma indicada acima), podemos calcular a velocidade da
seguinte forma:
Velocidade=
Concentrao
1,38571 10
Velocidade=
Velocidade=1,38571106 M /min
t
10
11
Amostra
V total
(mL)
Homogenato
Pellet 1
Pellet 2
Pellet 3
Sobrenadante 3
89
20
9
9
89
Succinato:citocromo c
oxidoreductase
Atividade
Atividade
especfica
(U/mL)
(U/mg)
149,314
11,81356
161,757
19,30801
236,414
24,32868
211,529
14,59264
37,3286
2,658052
[Protena]
(mg/mL)
12,6392
8,37772
9,71751
14,4956
14,0436
0,043854
0,013642
0,019993
0,025492
0,018803
atividade 149,314
=
=11,81356 U / mg
[ protena] 12,6392
actividade 0,55429
=
=0,043854 U /mg
[ protena] 12,6392
12
Succinato:citocrmo c oxidoreductase
250
200
150
100
50
0
P1
P2
P3
S3
Fraes
Actividade (U/mL)
Fosfatase cido
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
P1
P2
P3
S3
Fraes
Actividade (U/mL)
13
no pellet 3, o que se pode dever ao facto das protenas terem sido arrastadas por
organitos celulares mais pesados ou macroestruturas.
Para analisar a presena de atividades enzimticas caractersticas da frao
mitocondrial, recorre-se determinao da atividade do succinato citocromo c. Analisando
a Figura 2, podemos afirmar que a maior frao mitocondrial se encontra no pellet 2, tal
como se esperava, uma vez que o enzima especfico da frao mitocondrial, pelo que se
pode concluir que existe nesta frao a maior concentrao de mitocndrios.
Em relao ao fosfatase cido, ou seja, o enzima especfico da frao lisossomal e
analisando a Figura 3, podemos afirmar que a maior frao lisossomal se encontra no
pellet 3, tal como seria de esperar. No entanto, atravs da anlise da mesma figura,
podemos ainda afirmar que a concentrao de lisossomas no sobrenadante 3 tambm
elevada. A explicao para este facto pode dever-se ao facto de estes organitos serem
bastante heterogneos no seu tamanho.
[ DNA ]=
||50 g/mL
0,673 50
[ DNA ] =
[ DNA ] =33,65 g/mL
1 U . A 260 nm
1
14
m ( DNA )=
9,0855 10 20
m ( DNA )=1,8171 10
1
Uma vez que queremos determinar qual a percentagem de DNA por grama de
fgado, necessrio calcular o quociente entre a massa de DNA e a massa de fgado
inicialmente pesada. Sabemos ainda que a massa de fgado inicial correspondia a 8,8730 g
pelo que se obtm:
( m/m )=
1,8171 10
100 ( m/m )=0,2048
8,8730
Desta forma, podemos concluir que em cada grama de fgado de porco, esto
presentes 0,002 gramas de DNA (corresponde a %(m/m) = 0,2048%).
Abs260
Abs280
Nuclear
0,673
0,405
Pureza
de DNA
1.66
16
Bibliografia
Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley: Reading,
MA
http://www.bio.davidson.edu/GCAt/protocols/NanoDrop_tip.pdf (consultado no dia
17