1

2
3
4
5
6
7
8

EFECTO DEL MANGANESO EN LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE Y CONCETRACIN DE COMPUESTOS
FENLICOS EN LOLIUM PERENNE CV.NUI Y BANQUET
Aviles, J. 1, Godoy, R. 1, Hernndez, S. 1, Jara, C. 1, Moore, F. 1,
Prez, A. 1*

91Departamento de Ciencias Qumicas y Recursos Naturales, Universidad de La

10Frontera, Temuco. Chile.
11*Contacto autor: a.perez09@ufromail.cl
12
13
Resumen
Palabras claves:
14Crecimiento relativo
La comnmente llamada ballica o csped ingls
15Actividad Antioxidante (Lolium perenne) es una especie nativa de Europa y
16Compuestos fenlicos norte de frica. Esta forma vegetal habita en cspedes,
17
jardines y pastos hmedos que estn en zonas
18
templadas. En esta investigacin se realiz un estudio
19
comparativo entre dos variedades de lolium perenne,
20
Banquet
y
Nui
estresadas
con
diferentes
21
concentraciones de manganeso (Mn), para determinar
22
la velocidad de crecimiento relativo, actividad
23
antioxidante y su contenido de fenoles totales. Para la
24
obtencin de los cultivares se promovi la germinacin
25con abundante agua, luego los cultivares fueron sometidos a estrs con
26diferentes concentraciones de Mn. Este tratamiento se llev a cabo durante
27cuatro das en solucin nutritiva. Se tomaron muestras de la parte area y de la
28raz al inicio y final del tratamiento, para determinar la velocidad de
29crecimiento relativo. La medicin de la actividad antioxidante se realiza por el
30mtodo DPPH y la concentracin de polifenoles se determina siguiendo el
31mtodo de Folin-Ciocalteu. Se obtuvo una disminucin no significativa de la
32velocidad de crecimiento relativo de la raz de los cultivares. En cuanto a la
33parte area se pudo observar una inhibicin del crecimiento. Respecto al
34contenido de fenoles totales, el cultivar Nui present mayor cantidad
35comparado con Banquet. El aumento del contenido de fenoles, aumenta la
36actividad antioxidante de las plantas, promoviendo la defensa frente a
37radicales libres txicos. En conclusin en poco tiempo de administrado el
38tratamiento provoco que no se lograran observar cambios significativos en los

39cultivares y que a grandes rasgos el cultivar Nui present mayor resistencia a

40estrs con Mn.
41
42

431. Introduccin
44
La ballica
(Lolium perenne) se emplea en praderas sembradas
45destinadas a la produccin animal en la mayora de los Andisoles del sur de
46Chile. La ballica es una especie que se caracteriza por presentar rpido
47establecimiento, alta produccin y excelente calidad de forraje. Se generan
48sola, o asociada a cereales de grano pequeo (Demanet, 2013).
49
Entre las caractersticas de las ballicas perennes se encuentran su buena
50adaptacin a condiciones edafoclimticas poseen un potencial de produccin
51elevado y generan un producto de alto valor nutritivo en condiciones
52adecuadas de manejo (Demanet, 2014). Su desarrollo es en forma de macollos
53Se establece en los meses de febrero y octubre, en sistemas de labranza
54convencional, mnima labor, cero labranza y regeneracin (Demanet, 2014).
55
Los cultivares de lolium perenne pueden ser clasificadas segn su
56diploidia. La variedad Nui pertenece a los cultivares diploides (2n) y se
57caracterizan por tener hojas finas y delgadas, mayor nmero de macollos,
58adems presenta mayor tolerancia a periodos secos. La variedad Banquet
59pertenece a los cultivares tetraploides (4n) y se caracterizan por presentar
60hojas largas y gruesas, mayor tamaos de macollos, mayor produccin en
61periodo primaveral y mayor produccin de protena bacteriana (Demanet,
622013). Las ballicas en estado natural son diploides, sin embargo al duplicar el
63nmero cromosomtico cambian las caractersticas externas (fenotpicas) y las
64caractersticas internas (genotpicas) (Demanet, 2014).
65
Los compuestos fenlicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de
66sustancias qumicas, con diferentes estructuras, propiedades qumicas y
67actividad biolgica. Qumicamente, los compuestos fenlicos son sustancias
68que poseen un anillo aromtico, con uno o ms grupos hidroxilo (-OH). Como
69antioxidantes, los polifenoles pueden proteger las clulas contra el dao
70oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de varias enfermedades degenerativas
71asociadas al estrs oxidativo causado por los radicales libres. El estrs
72oxidativo se define comnmente como el desequilibrio entre las especies
73oxidantes y reductoras a nivel celular en un organismo (Gutirrez et al, 2008).
74
Los mtodos usados comnmente para determinar y cuantificar fenoles
75totales en alimentos y vegetales son el ensayo de la vainillina y el de Folin76Ciocalteu. El mtodo de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles
77para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene
78molibdato y tungstato sdico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol,
79formando complejos fosfomolbdico-fosfotngstico. La transferencia de
80electrones a pH bsico reduce los complejos fosfomolbdico-fosfotngstico en
81xidos, cromgenos de color azul intenso, de tungsteno y molibdeno, siendo
82proporcional este color al nmero de grupos hidroxilo de la molcula (Gutirrez
83et al, 2008).
84
Los Antioxidantes son compuestos los cuales pueden inhibir o retardar la
85oxidacin de otras molculas inhibiendo la iniciacin y/o propagacin de las
86reacciones en cadena de los radicales libres. Muchos antioxidantes naturales,
87en especial los flavonoides, muestran un amplio rango de efectos biolgicos

88incluyendo
funciones
antibacterianas,
antivirales,
antiinflamatorias,
89antialergnicas, antitrombticas y vasodilatadores (Muoz et al, 2008).
90
Existen muchos mtodos para medir la capacidad antioxidante de una
91especie o sustancia. Un mtodo muy usado se basa en la estabilidad del radical
921,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), la cual se atribuye a la deslocalizacin del
93electrn desapareado, esta deslocalizacin tambin le otorga una coloracin
94violeta caracterizada por una banda de absorcin, en solucin etanlica,
95centrada alrededor de 520 nm. Cuando una disolucin de DPPH entra en
96contacto con una sustancia que puede donar una tomo de hidrgeno o con
97otra especie radical (R) se produce la forma reducida DPPH-H DPPH-R con la
98consecuente prdida del color y por lo tanto la prdida de la absorbancia
99(Muoz et al, 2008).
100
El manganeso (Mn) es un micronutriente esencial para las plantas, pero
101puede llegar a ser fitotxico bajo ciertas condiciones del suelo. Comnmente,
102la toxicidad de Mn puede ocurrir en las plantas cultivadas en suelos con la
103reduccin de las condiciones creadas por la acumulacin de materia orgnica,
104la compactacin, y/o inundaciones. Adems, en algunos suelos cidos, el
105exceso de Mn en forma de Mn 2+ intercambiable es uno de los factores ms
106importantes que limitan el crecimiento del cultivo (Rivera et al, 2013).
107
En la literatura se encuentra que el Mn es clave en la funcin de
108aparatos fotosintticos asociadas con funciones en el fotosistema II (FSII). Este
109metal es un componente esencial del centro cataltico del FSII hidrolizando
110molculas de agua, alimentando de electrones a la cadena transportadora de
111electrones, guiando la generacin del poder reductor y ATP (Rivera et al, 2013).
1122. Metodologa
1132.1 Condiciones de germinacin y crecimiento.
114
Los dos cultivares de Ballica cv. Banquet y Nui fueron elegidos para este
115estudio comprados en Agrcola Nacional S.A.C (ANASAC). Las semillas fueron
116germinadas de acuerdo al mtodo propuesto por Rosas et al., (2007) y Taylor y
117Foy (1985) con algunas modificaciones La germinacin se realiz durante 8
118das en condiciones controladas (20C, humedad relativa del 70% y fotoperiodo
11916/8 horas (luz/oscuridad)) en papel absorbente con agua desionizada.
120Posteriormente las plantas fueron transferidas a un cultivo hidropnico el cual
121se encontraba a un pH 4.8 con solucin nutritiva de forma vertical para evitar
122que las races penetraran en el medio de cultivo (Vargas, 2007). Las plantas
123fueron oxigenadas una vez al da durante todo el proceso (Mora et al., 2009).
124La solucin con las plantas se mantuvo durante 7 das y fue removida
125posteriormente con una nueva solucin nutritiva en adicin con el tratamiento
126a 25 muestras con 5 concentraciones distintas de Mn (50 mM, 150 mM, 350
127mM, 750 mM) la cual se mantuvo durante 4 das.
1282.2 Preparacin de la muestra.

129
Las plantas fueron extradas de la solucin y se les cort las races y
130hojas, las cuales fueron posteriormente divididas de acuerdo a las
131concentraciones de Mn a las que haban sido expuestas. Se guardaron en
132nitrgeno lquido y otras se llevaron a una estufa por 2 das a 65 C como est
133descrito en el mtodo (Sadzawka et al., 2004) para la determinacin del
134crecimiento relativo.
135
Posteriormente, se sac muestra del nitrgeno lquido y se sigue una
136relacin de 0.1 g: 1 mL de metanol al 80% a temperatura controlada, para ser
137centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos y 4C. Posteriormente se recogi el
138sobrenadante el cual sirvi para las mediciones de actividad antioxidante y
139cuantificacin de fenoles.
1402.3 Medicin de actividad antioxidante.
141
Inicialmente se tomaron 200 L del extracto anterior, se aadieron 100
142L de metanol al 80% y 1mL del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH)
143mediante el ensayo descrito por Chyau et al,

144(2006) con menores modificaciones. Se realiz una curva de calibrado,

145utilizando Trolox como patrn. La longitud de onda utilizada fue 515 nm para la
146medicin, a los tiempos de 0 y 8 minutos. La solucin de DPPH 80 M sin
147ninguna cantidad de extracto sirvi como medicin blanco.
1482.4 Determinacin total de fenoles.
149
La cantidad total de fenoles en el extracto fue medida por
150espectrofotometra usando el mtodo de Folin-Ciocalteu extrado y modificado
151desde Slinkard y Singleton (1997) utilizando cido glico como estndar.
1522.5 Anlisis estadstico
153
Los clculos de estadstica descriptiva correspondiente a medias y
154desviaciones estndar se realizaron ocupando Excel 2013. El anlisis
155estadstico de datos se realiz utilizando el software IBM SPSS versin 20.0
156para el anlisis de normalidad, comparacin de promedio de Tukey (p<0.05) y
157significacin de Shapiro-Wilk.
1583. Resultados
1593.1 Velocidad de crecimiento relativo
160
Segn Evans et al., (1972) el concepto de la velocidad de crecimiento
161relativo (tambin conocida por las siglas MRGR, del ingls mean relative
162growth rate), se define como el incremento de biomasa por unidad de
163biomasa y tiempo. De acuerdo a esto, se muestra en las Figuras 1 y 2, los
164valores de crecimiento de los tejidos raz y hoja respectivamente, en ambos
165cultivares. Estos valores fueron obtenidos luego de cuatro das de tratamiento
166a las distintas concentraciones de Mn.
167
En la Figura 1, podemos observar una leve diminucin del crecimiento de
168la raz, mientras que en la Figura 2, se muestra una inhibicin del crecimiento
169de la hoja en los dos cultivares.

0.50
0.45
0.40
0.35
0.30

MRGR g/d PS 0.25

0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

a
Control
a

a
50mM
a

a
150mM
a

Tratamiento

170

a
350mM
a

a
750mM
a

171Figura 1 Velocidad media de crecimiento relativo en raz para cada cultivar.

172Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas
173estadsticamente (p < 0.05) entre los tratamientos y el control de acuerdo a la
174prueba de comparacin de promedios de Tukey.
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30

MRGR g/d PS 0.25

0.20
0.15
0.10
0.05
0.00

a
Control
a

a
50mM
a

a
150mM
a

a
350mM
a

a
750mM
a

Tratamiento

175
176Figura 2 Velocidad media de crecimiento relativo en hojas para ambos
177cultivares. Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas
178estadsticamente (p < 0.05) entre los tratamientos y el control de acuerdo a la
179prueba de comparacin de promedios de Tukey.
180
Los sntomas de toxicidad por Mn son diversos, y en muchos casos la
181toxicidad se manifiesta como la inhibicin del crecimiento (Horiguchi, 1988).
182Estos podra explicar la inhibicin y ms an la diminucin del crecimiento en
183los tejidos de ambos cultivares.
184
En condiciones cidas (pH bajo 5,5) existe un incremento en las
185concentraciones de protones y de manganeso (adems de otros iones como el
186aluminio). Causando en la planta inhibicin en el crecimiento radical, lo cual
187tiene consecuencia con la reduccin en la toma de agua y nutrientes por parte
188de la planta (Casierra y Aguilar, 2007). Lo que reafirma los resultados
189obtenidos transcurridos los cuatro das de tratamiento con manganeso, en
190donde no hubo incremento en la biomasa de ambos cultivares.
1913.2 Actividad antioxidante
192
Adems del crecimiento, la toxicidad por Mn induce la formacin de un
193exceso de radicales libres y especies reactivas de oxgeno, lo que resulta en
194estrs oxidativo (Gonzlez et al., 1998; Shi et al., 2006; Yu y Rengel, 1999). Los
195radicales libres se forman generalmente como productos de las reacciones
196biolgicas normales y su difusin en el espacio celular es controlada por el
197sistema antioxidante de las clulas, que incluye a los sistemas enzimticos
198tales como superxido dismutasa, catalasa y peroxidasas (Shi et al., 2006).

199
En la figura 3 se indican los valores obtenidos para la actividad
200antioxidante junto con sus estadsticos para cada cultivar de ballica mostrando
201un rango de 27.8 a 48.8 g/g PF y 42.9 a 77.1 g/g PF en Banquet y Nui
202respectivamente para los distintos tratamientos aplicados. En contraste

203con el control, los tratamientos vieron aumentada su actividad antioxidante

204siendo estadsticamente significativa para Banquet. No as para Nui, donde no
205presenta datos estadsticamente significativos. Adems, el tratamiento 50 mM
206para ambos cultivares se comport de manera elevada a diferencias de los
207dems tratamientos.
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0

g/g PF 40.0
30.0
20.0
10.0
0.0

b
aControl

a
50
b mM
a

a
150
a mM

a
350a mM

a
750 a
mM

Tratamiento

208
209Figura 3 Actividad antioxidante segn los cultivares de ballica. Las letras
210iguales indican que no existe diferencias significativas estadsticamente (p <
2110.05) y letras diferentes indican que existe diferencia significativa entre los
212tratamientos de acuerdo a la prueba de comparacin de promedios de Tukey.
2133.3 Fenoles totales
214
Los valores y estadsticos de fenoles obtenidos para cada cultivar de
215ballica se indican en la Figura x. La cantidad de fenoles vari de 27.8 a 48.8
216g/g PF y 42.9 a 77.1 g/g PF para los distintos tratamientos en Banquet y Nui
217respectivamente. Ambos cultivares mostraron un aumento en la cantidad de
218fenoles comparados con el control, siendo Nui quien present una
219concentracin mayor de estos compuestos. Adems se obtuvo un aumento en
220la concentracin fenoles para ambos cultivares en el tratamiento 50 mM,
221comportndose de manera diferente a los dems tratamiento que fueron en
222aumento desde la concentracin 150 mM.
223

90.0
80.0
70.0
60.0
50.0

g/g PF 40.0
30.0
20.0
10.0
0.0

a
aControl

a
50
a mM

a
150
a mM

a
350a mM

a
750 mM
a

Tratamiento

224
225Figura 4 Contenido de fenoles segn los cultivares de ballica Las letras iguales
226indican que no existe diferencias significativas estadsticamente (p < 0.05)
227entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de comparacin de promedios
228de Tukey.
2294. Discusin
230
En condiciones cidas (pH bajo 5,5) existe un incremento en las
231concentraciones de protones y de manganeso (adems de otros iones como el
232aluminio). Causando en la planta inhibicin en el crecimiento radical, lo cual
233tiene consecuencia con la reduccin en la toma de agua y nutrientes por parte
234de la planta (Casierra y Aguilar, 2007). Lo que reafirma los resultados
235obtenidos transcurridos los cuatro das de tratamiento con manganeso, en
236donde no hubo incremento en la biomasa de ambos cultivares.
237
Las plantas han desarrollado mecanismos muy especficos para
238absorber, acumular y traslocar nutrientes (Lasat, 200). A pesar de esto, existen
239algunos metales que no son esenciales para la planta y son absorbidos. Esto
240por presentar un comportamiento electroqumico similar a los metales que si
241son requeridos por las plantas. El Manganeso (Mn) esencial para el crecimiento
242de las plantas, ya que es requerido para la activacin de algunas enzimas y en
243la activacin del fotosistema II (Mahler, 2003). A pesar de ser un nutriente
244esencial para las plantas, es reemplazado fcilmente por Magnesio.
245
La absorcin y acumulacin de nutrientes por la planta depende del
246movimiento de los nutrientes desde una solucin a la raz de la planta, el paso
247de metales por las membranas de las clulas corticales de la raz, el transporte
248de nutrientes desde estas clulas corticales al xilema hacia los tallos y una
249posible movilizacin de metales desde las hojas hacia los tejidos de
250almacenamiento (semillas, frutos, tubrculos) por el floema. (Jorhem y
251Sundstrom, 1993). El Manganeso (Mn) esencial para el crecimiento de las

252plantas, ya que es requerido para la activacin de algunas enzimas y en la

253activacin del fotosistema II La toxicidad por manganeso tiene efectos visuales
254en hojas jvenes, como manchas de color marrn (Mahler, 2003). Lo que por el
255poco tiempo bajo condiciones de estrs, no se logr identificar dichos efectos.

256
Como bien se describa en un principio la especie de Lolium perenne
257pueden variar en el nmero de cromosomas que poseen. En forma natural esta
258especie es diploide (2n), pero mediante ingeniera gentica se logr duplicar el
259nmero de cromosomas, lo que dio como resultado cultivares tetraploides. Este
260nuevo nmero de cromosomas le otorg a estas plantas ciertas caractersticas
261distintas.
262
Esta modificacin gentica hizo que los cultivares tetraploides
263presentaran hojas ms grandes y gruesas, macollos ms grandes y una mayor
264relacin entre el contenido celular y la pared celular, por tanto mayor
265produccin de la parte digestible. Debido a esto, tienen mayor concentracin
266de carbohidratos solubles por lo que los hace aptos para su aprovechamiento
267en corte. En resumen, son de mejor calidad sin embargo esta modificacin
268gentica es benfica en el sentido en que tienen un mayor consumo voluntario
269debido a sus mejorados niveles de carbohidratos solubles y menos nivel de
270fibra. Por otra parte estos cultivares requieren mayores cuidados en su manejo,
271una mayor fertilidad y humedad en el suelo para poder expresar sus ventajas.
272Esto puede explicar en parte que el cultivar Nui sea ms resistente que
273Banquet en las mismas condiciones de cultivo. (Lopetegui, 2009).
274
En la figura 3 se muestra la actividad antioxidante de los dos cultivares
275frente a los distintos tratamientos. La diferencia entre cada tratamiento para
276cada cultivar no es significativa, sin embargo al comparar esta actividad entre
277cultivares, Nui, presenta una mayor actividad antioxidante Se ha verificado
278que a mayor concentracin de fenoles totales, mayor es la actividad
279antioxidante promoviendo la defensa frente a radicales libres txicos
280(Baderschneider et al, 1999).
2815. Conclusin
282
Los cultivares utilizados presentaron en el corto periodo diferencias
283sustanciales en las actividades antioxidante, en el crecimiento de las hojas y
284races por separados. El cultivar que mostr una mayor actividad frente al
285estrs oxidativo fue banquet con una mayor cantidad de fenoles.
286
Sin embargo, el tratamiento impartido bajo el sometimiento de estrs a
287distintas concentracin de manganeso (50 mM, 150 mM, 350 mM, 750 mM) fue
288solo de 4 das a diferencia de tratamientos hechos en otras investigaciones
289relacionados con el mismo tema, o que involucraban manganeso en el
290crecimiento de Banquet y Nui, los cuales eran de al menos 15 das para
291obtener resultados representativos los cuales se pueda observar el efecto del
292manganeso sobre estos cultivares.
2936. Agradecimientos
294
Al Dr. Marcelo Panichini por su colaboracin y disposicin, a los
295ayudantes Jorge Gonzlez y Elizabeth Ulloa y a la Dra. Marjorie Reyes Daz.
296

2977. Referencias
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