Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
INSTITUTO TECNOLGICO
OCCIDENTE (ITESO)
DE
ESTUDIOS
SUPERIORES
DE
Introduccin
2.
Objetivo
3.
Campo de aplicacin
4.
Referencias
5.
Definiciones
6.
Smbolos y abreviaturas
7.
8.
Muestreo
9.
Mtodos de Prueba
10.
Bibliografa
11.
Apndice Normativo A
Mtodos de Prueba
de
clulas
1. INTRODUCCIN
La importancia alimenticia de la leche en la nutricin humana, reside bsicamente
en la calidad de sus protenas, su alta digestibilidad y alto valor biolgico, as como
en su contenido de calcio y de vitaminas A, B1 y B2. Es un alimento energtico y
complementario para toda la familia, en particular para los nios, mujeres
embarazadas y ancianos, que forma parte de la dieta de los mexicanos y es
materia prima para la elaboracin de numerosos productos.
Por sus caractersticas fisicoqumicas y de composicin, la leche es altamente
susceptible a la contaminacin y el deterioro, afectndose su calidad por las
condiciones higinicas y sanitarias de produccin, almacenamiento y transporte,
adems de que puede constituirse en un excelente vehculo de organismos
patgenos.
Por lo anterior, es necesario contar con una Norma Mexicana que establezca las
especificaciones de la leche cruda en el pas, con la finalidad de uniformizar los
requisitos que la industria solicita a los productores de leche.
2. OBJETIVO
El presente Proyecto de Norma Mexicana tiene por objeto establecer las
especificaciones de calidad de la leche cruda de vaca y los mtodos de prueba
usados para su evaluacin.
2.- CAMPO DE APLICACIN
El presente Proyecto de Norma Mexicana es aplicable a la leche cruda de vaca,
de origen nacional o extranjera, destinada a la fabricacin e industrializacin de
productos para consumo humano en territorio nacional.
3. REFERENCIAS
Para la correcta aplicacin de ste Proyecto de Norma Mexicana se deben
consultar las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas
vigentes:
NOM-008-SCFI-2002
NOM-155-SCFI-2003
NMX-F-718-COFOCALEC-2006
NMX-F-730-COFOCALEC-2008
Prcticas
de
higiene
recomendadas para la obtencin de leche
, declaratoria de vigencia publicada en el
Diario Oficial de la Federacin el 7 de
agosto de 2008.
NMX-F-737-COFOCALEC-2010
4. DEFINICIONES
Para fines del presente Proyecto de Norma Mexicana se entiende por:
4.1 Alimento, cualquier sustancia o producto, slido, semislido o lquido natural o
transformado, destinado al consumo humano, que proporciona al organismo
elementos para su nutricin por va oral.
4.2 Almacenamiento, accin de guardar en un silo o sitio especfico la leche para
su conservacin, custodia, suministro, futuro procesamiento o venta.
4.3 Calostro, secrecin de la glndula mamaria obtenida en el periodo
comprendido de 5 das antes a 5 das despus del parto, que difiere de la leche
principalmente por su alto contenido de inmunoglobulinas (anticuerpos), clulas
somticas, cloruros y la presencia de eritrocitos, y cuyo color va del amarillo al
rosado.
5. SMBOLOS Y ABREVIATURAS
Cuando en ste Proyecto de Norma Mexicana se haga referencia a los siguientes
smbolos y abreviaturas, se entiende por:
g/L
mL
g
g/kg
+/m/m
v/v
%
C
H
mn.
mx.
UFC/mL
CS/mL
<
>
2
cm
2
mm
mm
Mtodo de Prueba
NMX-F-737-COFOCALEC-2010
NOM-155-SCFI-2003
NOM-155-SCFI-2003
NOM-155-SCFI-2003
NOM-155-SCFI-2003
NOM-155-SCFI-2003
NOM-155-SCFI-2003
Clulas
Negativa
Libre
Inhibidores
Aflatoxina M1 g/kg
Cuenta
total
de
Bacterias
Mesoflicas Aerobias UFC/mL Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
Conteo de
CS/mL
Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
Especificacin
1,3 a 1,6
Negativo
0,5 mx.
< 100 000
101 000 a 300 000
301 000 a 599 000
600 000 a 1 200 000
Mtodo de Prueba
NOM-155-SCFI-2003
Vase inciso 1 del
Apndice Normativo A
Vase inciso 2 del
Apndice Normativo A
NOM-243-SSA1-2010
NOM-243-SSA1-2010
NOM-243-SSA1-2010
Somticas
< 400 000
401 000 a 500 000
501 000 a 749 000
750 000 a 1 000 000
7. MUESTREO
Para fines de muestreo del producto objeto de este Proyecto de Norma Mexicana
se propone el uso de la Norma Mexicana NMX-F-718-COFOCALEC-2006 (Ver el
punto 2 Referencias).
8. MTODOS DE PRUEBA
Para la verificacin de las especificaciones que se establecen en el presente
Proyecto de Norma Mexicana se deben aplicar los mtodos de prueba sealados
en las tablas 1 y 2 (vanse tablas).
9. BIBLIOGRAFIA
CODEX STAN 206-1999. Norma General para el uso de Trminos Lecheros.
International Standard ISO 13366-1:2008|IDF148-1:2008 Milk Enumeration of
somatic cells Part 1: Microscopic method (Reference method).
10. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
Este Proyecto de Norma Mexicana coincide bsicamente con la Norma
Internacional ISO 13366-1:2008 Milk Enumeration of somatic cells Part 1:
Microscopic method (Reference method), en el punto 3 del Apndice Normativo A
y los Apndices Informativos A, B y C. Difiere en el resto de su contenido por no
existir Norma Internacional sobre el tema tratado.
APENDICE NORMATIVO A
- Mtodos de prueba
A.1. Prueba del alcohol al 72 % v/v
A.1.1 FUNDAMENTO
Cuando se mezcla un volumen dado de alcohol con leche, provoca una
deshidratacin parcial de ciertos coloides hidroflicos presentes en la muestra,
desnaturalizndolos y alcanzando un estado de desequilibrio entre sus dos fases
discontinuas (emulsin grasa y suspensin coloidal) por lo que floculan. Este
cambio slo se produce cuando la mezcla final alcanza un cierto contenido de
alcohol, abajo del cual la leche trmicamente estable no flocular y por lo tanto la
leche resistir un tratamiento trmico.
A.1.2 REACTIVOS Y MATERIALES
A.1.2.1 Alcohol etlico al 72 % v/v
A.1.2.2 Tubos de ensayo de 10 ml.
A.1.2.3 Pipetas de 20 ml.
A.1.2.4 Alcoholmetro o aermetro graduado.
A.1.2.5 Probeta.
A.1.3 PROCEDIMIENTO
Medir 2 ml de muestra y colocarla en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de alcohol
etlico al 72 % v/v, mezclar y observar si hay formacin de grumos.
A.1.4 CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS
La formacin de grumos (reaccin positiva), es clara evidencia de que la
estabilidad de la suspensin coloidal de la leche se encuentra afectada, por lo que
no resistir el proceso trmico de la pasteurizacin.
Expresar el resultado como positivo o negativo.
A. 2. Determinacin de materia extraa en leche
A.2.1 FUNDAMENTO
Se filtra una cantidad predeterminada de leche (a temperatura de 32 a 38 C), a
travs de un disco de algodn, para retener la materia extraa y comparar la
cantidad obtenida contra estndares preparados de acuerdo con este
procedimiento.
mg o
acerquen al disco que est siendo calificado. No utilice fotografas que se han
deteriorado, manchado o daado.
A.2.3.4 Verificacin de los analizadores de materia extraa.
Para verificar los aditamentos para evaluacin de materia extraa es necesario
llevar a cabo las siguientes actividades: Mida el volumen real de leche entregado
para asegurarse que los 473 mL son retirados y pasados a travs del disco.
Transfiera 10 mL de la solucin al 2% de la suspensin de sedimento en sacarosa
(vase A.2.2.4), utilizando una pipeta graduada de punta amplia a un bote de
leche con 37,8 L de agua destilada limpia filtrada. Despus de agitar la mezcla
bien, remueva 473 mL con un medida que asegure dicho volumen y fltrelos a
travs de un disco de sedimentos con un rea dimetro de 28,6 mm (vase
A.2.2.2), ensamblado en un embudo apropiado de tamao correcto (por ejemplo
vase A.2.2.3.1). Despus de una agitacin adecuada del contenido de la cantara
de leche, de nuevo remueva una muestra de 473 mL con el aditamento de prueba
de sedimentos y pselo a travs del disco exactamente de la misma forma en que
se evala la leche. Repita esta operacin con el analizador varias veces para
determinar si los discos obtenidos de esta manera proporcionan la misma materia
extraa que el disco obtenido a travs de la filtracin por el embudo (vase
A.2.2.3.1).
A.2.3.5 Obtencin de la muestra
A.2.3.5.1 Mtodo de muestra de prueba mezclada. Para cantaras de leche, de 20
a 40 L, y tanques de almacenamiento, utilizar muestras de 473 mL 3,78 L. Antes
de mezclar la leche, transfiera con un colador pequeo cualquier materia extraa
flotante, tal como moscas, pelo, pedazos grandes de restos, etc., al disco instalado
(vase A.2.3.6.1), o instale un disco separado adecuadamente identificado.
Mezcle adecuadamente la leche en la cantara antes de tomar la muestra para
prueba. Evite contaminar la muestra con materia extraa que vaya en los
agitadores o por cualquier otro medio. Para contenedores de comercializadores
tome 473 mL del contenedor mezclado o el nmero suficiente de muestras para
lograr un volumen de 3,78 L. Lleve a cabo las actividades de acuerdo con lo
descrito en A.2.3.6.1.
A.2.3.5.2 Mtodo del fondo. Para cntaras de leche de 20 a 40 L tome muestras
de 473 mL mediante cualquiera de los probadores de fondo de cantaras de leche
sin agitar. Antes de sacar la muestra, remueva con un colador pequeo cualquier
materia extraa flotante como en el punto anterior. Tome una muestra a < 6,4 mm
del fondo de una cntara de leche sin agitar introduciendo el aditamento para
muestrear y, durante el movimiento hacia arriba del embolo, mover la cabeza del
instrumento cruzando una vez el dimetro del fondo de la cntara o alrededor de
la circunferencia si el bote tiene un centro elevado. Expulse la leche con la pistola
en la cntara y despus con un golpe corto remueva el exceso de fluido de la
almohadilla. Proceder como se describe en A.2.3.6.2.
A.2.3.6 Determinacin
A.3.2 DEFINICIONES
Para los fines de este mtodo de prueba aplica la siguiente definicin:
A.3.2.1 Clulas somticas, son clulas con ncleo (leucocitos y clulas
epiteliales) de acuerdo con el procedimiento descrito en este mtodo de prueba.
A.3.3 FUNDAMENTO
Se prepara un frotis extendiendo sobre un portaobjetos una porcin de la muestra
leche por analizar. El frotis se seca y se tie. Posteriormente las clulas somticas
teidas son contadas usando un microscopio. El nmero de clulas somticas
contadas en un rea determinada se multiplican por el factor de trabajo, para
obtener el nmero de clulas somticas por mililitro.
Los reactivos deben ser grado analtico a menos que se especifique algn otro
requerimiento y por agua se entiende agua destilada o desionizada o agua de
pureza equivalente.
A.3.4.1 Disoluciones colorantes
ADVERTENCIA.- El tetracloroetano es venenoso. El bromuro de etidio es mutagnico. Atienda las
medidas de seguridad vigentes para su manejo, uso y disposicin. La preparacin y
aplicacin de la disolucin colorante debe llevarse a cabo en una campana de extraccin de
humos, utilizando equipos de proteccin.
A.3.4.1.1 Disolucin
Levowitz - Weber)
colorante
modificada
Newman-Lampert
(Modificacin
A.3.4.1.1.1.; Componentes
Etanol 95%
54,0 mL
Tetracloroetano
40,0 mL
Azul de metileno
0,6 g
Acido actico, glacial
6,0 mL
Alternativamente puede usarse xileno en la misma cantidad de volumen que la descrita
para el tetracloroetano.
A.3.4.1.1.2.; Preparacin
Mezclar el etanol y el tetracloroetano en un frasco con tapa. Calentar la mezcla en
un bao Mara a 65 C, agregar el azul de metileno en una campana de extraccin
de humos y mezclar cuidadosamente. Enfriar la mezcla a 4 C.
Agregar el acido actico glacial y mezclar de nuevo cuidadosamente. Filtrar la
disolucin, colocarla en un frasco adecuado con tapa de cierre hermtico y
almacenarla en dichas condiciones.
Antes de usar la disolucin de tincin Newman Lampert filtrarla de nuevo.
A.3.4.1.2 Disolucin colorante de bromuro de etidio
A.3.4.1.2.1 Disolucin patrn colorante.
A.3.4.1.2.1.1 Composicin
Bromuro de etidio
Agua desmineralizada
A.3.4.1.2.2.; Preparacin
0,25 g
100
0,51 g
0,162 g
100
A.3.4.1.3.2.; Preparacin
Disolver por separado el ftalato cido de potasio y el hidrxido de potasio en agua
desmineralizada.
La disolucin amortiguadora se conservara durante dos meses mximo cuando se
almacena en la oscuridad a 2 C +/- 2 C.
A.3.4.1.4 Disolucin colorante de trabajo de bromuro de etidio.
A.3.4.1.4.1 Composicin
2 mL
Disolucin patrn colorante de bromuro de
etidio
Disolucin amortiguadora.
8 mL
Triton X10
0,1 mL
Agua desmineralizada
90 mL
Temperaturas elevadas pueden reducir la capacidad de tincin del bromuro de etidio.
A.3.4.1.4.2 Preparacin
Sucesivamente aadir en el agua desmineralizada la disolucin colorante patrn
de bromuro de etidio, la disolucin amortiguadora y el Triton X-100 y mezclar
cuidadosamente.
Preparar la disolucin colorante de trabajo de bromuro de etidio inmediatamente
antes de su uso.
8g
KCl
0,2 g
1,15 g
Na2HPO47
H2O
KH2PO4
Agua desmineralizada
0,2 g
1000
A.3.4.1.5.2 Preparacin
Disolver las sales en agua desmineralizada. Ajustar a 1000 mL con el agua
desmineralizada restante.
Ajuste el pH a 7,2 +/- 0,1
NOTA - Tambin es posible utilizar una disolucin amortiguadora de fosfato comercialmente
disponible con un pH = 7,2
obtener una cuenta aproximada de clulas somticas de 500 000 clulas/mL para
cada muestra diluida.
En donde:
d,
A.3.8.1.1 Preparacin del frotis y tincin con disolucin colorante Newman Lampert.
Tomar con la microjeringa 0,01 ml de la muestra (eventualmente diluida). Enjuagar
la microjeringa con la muestra de ensayo. Si es necesario, limpiar con cuidado y
suavemente la parte exterior de la microjeringa que ha estado en contacto con la
muestra de ensayo.
2
Mojar suavemente el frotis con agua de la llave hasta que todo el colorante
excedente se elimine con el lavado. Secar de nuevo y almacenar protegido del
polvo.
A.3.8.1.2 Tincin con disolucin colorante de bromuro de etidio y preparacin del
frotis.
Mezclar 1 mL de la muestra preparada con 1 mL de solucin colorante de trabajo
de bromuro de etidio en un tubo de ensayo. Mantener la muestra protegida de la
luz. Calentar el tubo en un bao de agua a 50 C por 3 min. Enfriar a temperatura
ambiente.
Con la microjeringa tomar 0,01 mL de la mezcla. Enjuagar la microjeringa con la
mezcla. Si es necesario, limpiar cuidadosa y suavemente la parte exterior de la
microjeringa que ha estado en contacto con la mezcla.
2
Macrfagos
8-30 m
La relacin entre
citoplasma/ncleo
es
grande.
Fagositosis,
antgeno
presente,
secrecin
de
factores
quimiotcticos
PMN
10-14 m
90% de la mastitis
aguda
60% crnica. La
relacin
entre
citoplasma/ncleo
es
pequea.
Fagocitosis.
Primera lnea de
defensa contra la
mastitis.
Linfocitos
5-10 m
La relacin entre
citoplasma/ncleo
es
pequea.
Ncleos
intensamente
teidos.
T
auxiliares y T
superiores
de
clulas B
Clula epitelial
10-14 m
Ncleo redondo.
Citoplasma
dbilmente
teido
(Aumento 500x)
(Aumento 1000x)
Longitudes de clulas: L22 = 9,08 m; L23 = 8,27 m; L24 = 4,95 m; L25 = 7,39 m;
L26 = 6,37 m and L27 = 3,58 m.
FIGURA 3 - Ejemplos de clulas de leche de vaca a granel
NOTA - El entrenamiento y la habilidad del analista es el principal factor crtico de xito para la
correcta ejecucin del mtodo. La frecuente ejecucin del mtodo y la participacin en
ensayos interlaboratorio son esenciales para garantizar un nivel adecuado de contar.
Concentracin (x1000
clulas/mL)
CV %
N clulas
10
100
150 a 250
200
250 a 400
300
400
< 150
> 400
adecuando dw). A fin de obtener las bandas apropiadas que sean representativas
de todo el frotis.
Calcular el resultado como se describe en A.3.9.2.
Clave
I hacia abajo hasta el borde inferior
En donde:
c,
Nt,
Df,
Nf,
En Donde:
Nb, es el nmero de bandas contadas por completo
Los otros smbolos fueron definidos en A.3.9.1
A.3.9.3 Contando campos sucesivos en forma circular
Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio verificar que el dimetro
del frotis fue de 11,28 mm.
Calcular la concentracin total, c, de clulas utilizando la siguiente ecuacin:
En donde:
Dc, es el dimetro, en milmetros, del frotis.
Los otros smbolos fueron definidos en A.3.9.1
A.3.9.4 Expresin de resultados.
Expresar los resultados de la prueba en nmeros enteros de miles (por ejemplo
401 586 clulas/mL expresarlo como 402 000 clulas/mL).
A.3.10 Precisin
Los valores de repetibilidad y reproducibilidad se han derivado de los resultados
de un estudio interlaboratorios llevado a cabo de acuerdo con las normas
aplicables para determinar la exactitud (veracidad y precisin) de resultados y
1
mtodos de medicin . Los detalles de este estudio interlaboratorios se resumen
en el Apndice Informativo A.
ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 1:
General principles and definitions, e ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results Part 2: Basic method for the determination of repeatability
and reproducibility of a standard measurement method.
Sr
(x 1000 clulas/mL)
r
(x 1000 clulas/mL)
245
38
107
455
43
121
679
69
192
791
110
308
3.10.2 Reproducibilidad
La diferencia absoluta entre dos resultados de prueba, que se obtiene utilizando el
mismo mtodo, misma muestra, en diferente laboratorio, con distinto analista y
utilizando equipos diferentes, ser en no ms del 5% de los casos mayor que los
valores dados en la tabla 5 (vase tabla).
TABLA 5 - Valores de reproducibilidad
sR
(x 1000 clulas/ml)
R
(x 1000 clulas/ml)
245
41
114
455
62
174
679
78
218
791
110
308
Concentracin (x1000
clulas/ml)
APNDICE INFORMATIVO A
Ensayo de colaboracin del conteo de clulas somticas
(Mtodo de referencia)
General
Un estudio de colaboracin internacional para leche de vaca, que involucr
dieciocho laboratorios y trece pases, se llev a cabo en octubre de 2005. La
prueba incluy 8 muestras en cuatro niveles de clulas/mL y se dividi en 16
duplicados ciegos.
Los valores medios para cada nivel fueron respectivamente:
-
Nivel 1, muestras A y B:
Nivel 2, muestras C y D:
Nivel 3, muestras E y F:
Nivel 4, muestras G y H:
24
23
24
24
245
38
455
43
679
69
791
110
169
10
14
107
41
121
62
192
78
308
110
17
14
11
14
114
174
218
308
APNDICE INFORMATIVO B
60 mL
Cloroformo
Pironina Y
1,0 g 20 mL
cido actico glacial Alcohol etlico
0,56 g100%
Verde de metilo
120 mL
196 mL
Agua desmineralizada Tincin de leche de cabra para el conteo de clulas somticas
B.1.1.2 Preparacin
Agregar sucesivamente el cloroformo y el cido actico glacial en el alcohol etlico
y mezclar cuidadosamente.
B.1.2 Disolucin colorante verde de metilo - pironina Y
B.1.2.1 Componentes
B.1.2.2 Preparacin
Sucesivamente adicionar la pironina Y y el verde de metilo en una botella con
agua desmineralizada y mezclar con cuidado. Filtrar a travs de un filtro adecuado
(tamao de poro de 10 a 12 ) y guardar en un frasco mbar. Antes de usar
filtrar nuevamente a travs de un filtro adecuado.
B.2 Preparacin del frotis
Preparar el frotis con el esquema de tincin siguiente:
1. Fijador Carnoy, durante 5 minutos;
2. Etanol al 50%, durante 1 minuto;
3. Etanol al 30%, durante 1 minuto;
4. Agua, durante 1 minuto;
5. Disolucin colorante verde de metilo pironina Y, durante 6 minutos;
6. Lavar brevemente con N-butil alcohol y luego con xileno;
7. Almacenar el frotis protegido del polvo.
APNDICE INFORMATIVO C
Distribucin de Poisson
Generalmente, las clulas en la leche estn distribuidas de
distribucin de Poisson. La distribucin de Poisson presupone que:
acuerdo a la
M=V=s
donde
M es el valor promedio;
V es la varianza;
s es la desviacin estndar.
El coeficiente de variacin, CV, es entonces:
CV =
s
M
x 100 %
o
CV = 100 %
s
o
CV = 100 %
M
En donde:
M, es el valor promedio el cual, en el caso de contar el nmero de clulas
somticas, es el nmero de partculas (clulas) contadas.
APNDICE INFORMATIVO D
D.1.3 EQUIPO
D.1.3.1Bao con circulacin mecnica a 37 C
D.1.4 PROCEDIMIENTO
Colocar de manera asptica 10 mL de la muestra de leche por analizar en un tubo
estril y aadir de igual forma 1 mL de la solucin de azul de metileno. Cerrar el
tubo con el tapn e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el
colorante. Incubar a 37 C en bao de agua, cuidando que el nivel del agua del
bao sobrepase el de la mezcla de leche contenida en el tubo. Registrar con
precisin la hora de la inmersin. Observar el tubo cada media hora, para controlar
la reaccin. Los tubos con la mezcla de leche decolorada se sacan del bao,
registrando el tiempo en el que se ha producido la decoloracin. Los tubos cuyo
contenido permanece azul, se invierten una vez cada media hora y se contina la
incubacin hasta la desaparicin del color azul. Es frecuente que en la zona de
contacto de la leche con el aire persista una franja coloreada que no se toma en
cuenta para la interpretacin de la prueba.
D.1.5 INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se pueden calcular aproximadamente los resultados de la prueba del azul de
metileno de la siguiente forma:
Tiempo de decoloracin
Calidad de la leche
5 horas
Nmero estimado de
bacterias por mL
100 000 a 200 000
2 a 4 horas menos
Buena a regular
de 2 horas
2 a 10 millones
Mala
Buena
Coloracin de la leche
Azul (disco 6)
Violeta (disco 5)
Malva (disco 4)
Rosa Violeta (disco 3)
Malva Rosa (disco 2)
Rosa (disco 1)
Calidad de la leche
Decoloracin total
Mala
Buena
Regular
APNDICE INFORMATIVO E
Listado de Normas Mexicanas que describen mtodos de prueba rpidos
aplicables a leche cruda de vaca