SEPARAO DE PIGMENTOS DE FOLHAS VERDES POR

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE SLICA GEL (CCD)

Este experimento visa apresentar aos alunos algumas tcnicas bsicas
empregadas em um laboratrio de qumica orgnica. Faremos uso de mtodos
simples de extrao (lquido-lquido) e cromatografia, a fim de analisar
visualmente uma mistura de compostos orgnicos e isolar substncias
coloridas encontradas em material vegetal.
Objetivo: Verificar a separao por CCD dos pigmentos ( caroteno, clorofila A
e B) extrados de folhas verdes (espinafre).
Introduo: Entre os mtodos modernos de anlise, a cromatografia ocupa um
lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separao, identificao
e quantificao de espcies qumicas, por si mesma, ou em conjunto com
outras tcnicas instrumentais de anlise, como por exemplo, a espectroscopia
no infravermelho ou a espectrometria de massas.
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes
de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes em duas
fases, que esto em contato ntimo. Uma fase permanece estacionria e outra
se move atravs dela. Durante a passagem da fase mvel pela fase
estacionria, os componentes da mistura so distribudos entre as duas fases,
de tal forma que cada um dos componentes seletivamente retido pela
estacionria, resultando em migraes diferenciais destes componentes. So
vrios os critrios usados para classificao das diferentes modalidades de
cromatografia, sendo os mais comuns relacionados tcnica empregada, o
mecanismo de separao envolvido e aos diferentes tipos de fases usadas. Na
cromatografia em CCD a fase estacionria a slica e a fase mvel uma
mistura de solventes. Toda cromatografia trabalha com o mesmo princpio:
depende de diferenas de solubilidade ou adsorvidade das substncias em
relao s duas fases.
Cromatografia em camada delgada: A cromatografia em camada delgada
(CCD) consiste na separao dos componentes de uma mistura atravs da
migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre
uma superfcie plana. O processo de separao est fundamentado
principalmente no fenmeno de adsoro. Este processo fsico baseado
principalmente em atraes eletrostticas ou dipolares (foras de Van der
Waals), incluindo a formao de pontes de hidrognio. Quando se trata de um
slido, como slica ou alumina, como fase estacionria, a adsoro ocorre na
interface entre slido e a fase mvel, devido a presena de grupos ativos nas
suas superfcies.
A CCD uma tcnica simples, barata e muito importante para a
separao rpida e anlise quantitativa de pequenas quantidades de material.
Ela usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes
em uma mistura comparando-os com padres; acompanhar o curso de uma
reao pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e
ainda para isolar componentes puros de uma mistura.

Adsorventes: Slica (SiO2) que um dos adsorventes mais utilizados e

Alumina (AlO3) que o segundo mais utilizado.
Fase mvel: Solventes ou misturas de solventes.
Solventes
em
ordem
de
polaridade:
gua>metanol>cido
actico>acetona>etanol>acetato
de
etila>ter
etlico>clorofrmio>tolueno>benzeno>tetracloreto de carbono>pentano>ter de
petrleo>ciclo hexano.
Na CCD as molculas tm uma certa atrao pela slica e uma atrao
diferente pelo solvente que se move pela ao da capilaridade.
Compostos muito polares (lcoois, aminas e cidos carboxlicos) se fixam
fortemente superfcie da slica formando pontes de hidrognio com os
resduos cidos da slica, portanto necessrio usar solventes muito polares
para puxar esses compostos e fazer com que eles se movam.
Compostos no polares no so muito atrados pela slica e se movem
rapidamente mesmo com solventes no polares.

Figura 1: Cromatografia em camada delgada (CCD).

Um parmetro freqentemente usado em cromatografia o "fator de

reteno" de um composto (Rf). Na CCD, o Rf funo do tipo de suporte (fase
fixa) empregado e do eluente. Ele definido como a razo entre a distncia
percorrida pela mancha do componente e a distncia percorrida pelo eluente.
Portanto:
Rf = dc / ds
Onde:
dc = distncia (cm, mm) percorrida pela substncia.
ds = distncia (cm, mm) percorrida pela frente da fase mvel (eluente).
Experimental:

I- Materiais e Reagentes
- ter de petrleo (p.e. 30 60 oC) ou hexano
- Etanol
- Acetona
- Clorofrmio
- Sulfato de sdio anidro
- Folhas de espinafre
- Almofariz
- Pipeta de Pasteur
- Funil de separao de 60 mL

- Bquer de 50 mL
- Erlenmeyer de 25 mL
- Proveta de 10 mL
- Papel de filtro
- Placa de Petri
- Cubetas ou bquer de 100 mL
- Placas de slica gel
- Capilares

II Procedimento:
a) Preparao do extrato
Colocar em um almofariz 5-10 folhas de espinafre e alguns mililitros de
uma mistura de 2:1 de ter de petrleo ou hexano e etanol. Triturar bem as
folhas. Utilizando uma pipeta de Pasteur, e uma bolinha de algodo, filtrar o
extrato, transferindo-o para um funil de separao. Adicionar, igual volume de
gua. Girar lentamente o funil, pois a agitao brusca pode causar a formao
de emulso. Separar e descartar a fase aquosa. Repetir esta operao de
lavagem, por mais duas vezes, sempre descartando a fase aquosa. Transferir a
soluo de pigmentos para um Erlenmeyer e adicionar aproximadamente 2 g
de sulfato de sdio anidro. Aps alguns minutos, utilizando uma pipeta de
Pasteur, decantar a soluo de pigmentos do sulfato de sdio, transfirindo para
um bquer. Se a soluo no estiver fortemente colorida de verde escuro,
concentrar parte do ter de petrleo, usando uma suave corrente de ar.
b) Aplicao da amostra na placa
Utilizando um capilar, aplicar duas ou trs pores da soluo de
pigmentos sobre uma placa de slica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das
extremidades. Evitar a difuso da mancha de forma que seu dimetro no deva
ultrapassar a 2 mm durante a aplicao da amostra. Deixar o solvente
evaporar.
c) Desenvolvimento do cromatograma
Preparar uma cuba colocando uma tira de papel de filtro de 4x5 cm e 5
mL de clorofrmio. Esperar o tempo suficiente para que ocorra a completa
saturao. Colocar cuidadosamente a placa na cuba, evitando que o ponto de
aplicao da amostra mergulhe no solvente. Quando o solvente atingir cerca de
0,5 cm do topo da placa, remover a placa e marcar a frente do solvente (linha
de chegada da fase mvel). Deixar secar ao ar e observar o nmero de
manchas coloridas. Copiar a placa com as substncias separadas
(cromatograma), obedecendo fielmente a distncia entre o ponto de aplicao
e a frente do solvente, bem como a distncia percorrida por cada substncia,
iniciando pelo ponto de aplicao at o centro de maior concentrao da
mancha.
Preparar uma nova cuba usando como eluente uma mistura de CHCl 3 e
acetona (9:1). Esperar que ocorra a saturao completa e efetuar um novo
desenvovimento da placa, tendo o cuidado de no deixar que a frente do

solvente atinja a mancha amarela de maior fator de reteno (R f), obtida na

primeira eluio. Copiar o cromatograma.
Observao: As manchas observadas no cromatograma, so normalmente
identificadas, em ordem decrescente de valores de R f, como carotenos (duas
manchas laranja), as xantofilas (quatro manchas amarela) clorofila a (azul
esverdeada) e clorofila b (verde).
III - Questionrio
1. Pesquisar estruturas das clorofilas a e b, xantofilas e carotenos.
2. Qual o estado fsico da fase mvel e da fase estacionria na
cromatografia em camada delgada (CCD)?
3. Qual o mecanismo de separao da cromatografia em camada
delgada de slica gel?
4. Com que finalidade a soluo de pigmentos lavada com gua?
5. Por que o sulfato de sdio anidro adicionado soluo de pigmentos?
6. Que se entende por fator de reteno (Rf)?
7. Dois componentes A e B, foram separados por CCD. Quando a frente do
solvente atingiu, 6,5 cm, acima do ponto de aplicao da amostra, a
mancha de A, estava a 5 cm, a de B a 3,6 cm. Calcular o R f de A e de B.
Desenhar esta placa, obedecendo o mais fielmente possvel as
distncias fornecidas. O que se pode concluir sobre a resoluo das
manchas, nesta separao?
IV - BIBLIOGRAFIA
1. ROBERTS, R. M.; GILBERT, J. C.; RODEWALD, L. B. WINGROVE, A.
S., Modern experimental organic chemistry, 4th ed, Phyladelphia
Saunders College Publishing,1985.
2. COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Introduo a mtodos
cromatogrficos, 6. ed, Campinas, Editora da UNICAMP, 1995.
3. DEGANI, A. L. G., CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Qumica Nova na Escola,
1998. 7, 21.
4. BOBBLIO, F. O.; BOBBLIO, P.A. Introduo qumica de alimentos. 2.
ed. So Paulo: Livraria Varela. 1992.