Análisis microbiológico de alimentos: Muestreo y métodos

25/08/2015
Marcela Martnez M-Sc-
Es la operacin que consiste en separar un nmero

determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc. con
el fin de obtener unos resultados analticos fiables.
Mara Marcela Martnez Miranda

M.Sc Microbiologa
Docente Dpto. Ingeniera
Universidad de Caldas
Objetivos del muestreo
Investigar brotes alimentarios.
Debera (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su

recipiente original, sin abrir.
En autoclave a 121C durante 15 minutos, especialmente

para los materiales que no soporten el calor seco.
Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones

aspticas, una porcin en un recipiente estril.
Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados,

esptulas, taladros, cuchillos, pipetas, siempre estriles y
escogidos de acuerdo a la naturaleza del alimento.
Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por

el aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de
muestra o por una incorrecta manipulacin.
Esterilizacin de los elementos para el

muestreo
Condiciones para el muestreo
El recipiente no debera llenarse en ms de de su

capacidad para evitar posibles vertidos y favorecer el
mezclado en el laboratorio.
No debe sufrir dao o transformacin durante el transporte y

almacenamiento.
En estufa a 160-180C durante 2 horas. Alternativamente se

pueden utilizar los siguientes mtodos, teniendo en cuenta
que no eliminan todas las esporas:
Inmersin del utensilio en alcohol etlico al 95% y
posterior flameado.
Inmersin en una solucin de hipoclorito de sodio de 50
ppm de cloro libre durante al menos 30 segundos.
Conocer el estado higinico de

la industria, ambiente, equipos,
manipuladores, etc.
Debe ser representativa del lote.
Conocer la vida til del

producto.
Condiciones de la muestra
Detectar la presencia de
microorganismos patgenos.
Evaluar el cumplimiento de las
normas microbiolgicas.
Muestreo
Anlisis microbiolgico
de alimentos
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Pasos para el muestreo
Definiciones importantes
Lote
3. Conservacin y transporte de muestra
4. Recepcin de la muestra en el LMA
2. Toma de la muestra
1. Seleccin de la muestra
Muestra
Unidad de
muestreo
Plan de muestreo
Unidad
analtica
Plan de muestreo de 2 clases
P.M.
Variables
Dos clases
P.M. Atributos
Extraccin de muestra,
anlisis y toma de decisiones
10
Tres clases
Anlisis cualitativos
Plan de muestreo de 3 clases
Ms de 10.000
unidades del
lote.
MIL STD
105D
501- 10.000
unidades
1% del lote
11
Tamao de la muestra
12
Representativa y aleatoria
Anlisis cuantitativos
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Tamao muestra para alimentos

pre-envasados
Resolucin Mercosur 74/93
13
14
Codex Alimentarius
Indumentaria
adecuada
Alimentos envasados:
empaque original,
aleatoria, asptica,
toma de cantidad
representativa
Productos envasados
en grandes envases:
abrirlos y extraer la
muestra en
condiciones aspticas
15
Recoleccin de muestras
Lavado de manos
Los alimentos expuestos al aire

mismo y a otros contaminantes: no
requieren precauciones estrictamente
aspticas.
Alimentos preparados sin envasar de

consumo inmediato: la persona que
elabora los alimentos introduce la
muestra en los recipientes estriles
con los utensilios que usa
normalmente para servir los
alimentos.
16
Identificacin de la muestra
Cuando la toma de
muestra se realice en un
conducto de salida o una
compuerta de una partida
a granel, antes de obtener
la muestra se deben dejar
pasar las primeras
fracciones del producto
para limpiar dicha salida
con el flujo.
En productos a granel:
tomar la muestra de varios
puntos del contenedor
para obtener una muestra
representativa.
Naturaleza del alimento.

No. de lote.
Fecha de vencimiento.
Peso de la muestra.
En caso de alimentos
lquidos y semilquidos:
agitar o mezclar hasta
conseguir homogenizar y
despus efectuar la toma
de muestra en diferentes
niveles.
La muestra debe ser identificada de manera clara y

completa con la siguiente informacin mnima:
Fecha, lugar y hora del muestreo.

17
Razones del muestreo.

T del producto en el momento del muestreo.
18
25/08/2015
Transporte de la muestra
Debe asegurar que se minimice la alteracin en el nmero de
microorganismos presentes.
La muestra se enva al laboratorio con prontitud, manteniendo

dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales.
Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames.
Las muestras que necesitan refrigeracin o congelacin deben
transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo
seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte
respectivas.
19
Temperaturas de transporte
recomendadas
No debe utilizase hielo suelto para

evitar contaminaciones.
20
Recepcin de la muestra
Si las condiciones no son satisfactorias o la muestra es insuficiente,
el laboratorio debera rechazarla.
Productos estables:
temperatura ambiente <40C
Productos congelados y ultracongelados:

entre - 15C y -18C
- Identidad y codificacin.
Productos inestables a temperatura ambiente:

entre 1C y 8C
- Fecha y hora de recibo.

- Detalles del muestreo (fecha, hora y lugar).
- Nombre y direccin del cliente.
Documentar las muestras admitidas de tal manera que se garantice

la trazabilidad en todas las fases:
- Temperatura de recepcin.
Examinar las muestras tan pronto sea posible:
21
Referencia:
- Productos altamente perecederos: antes de 24 h.
NTC 4092:2009 Microbiologa de los alimentos y productos para alimentacin animalRequisitos generales y directrices para anlisis microbiolgico.
22
- Productos perecederos: Mximo 36 h.
DILUYENTE
9 x mg ml
Peptona Bufferada
STOMACHER
Buffer Fosfato
Peptona salina
DILUYENTES:
ALIMENTO
mg ml
HOMOGENEIZADO
DILUCIN 1:10 (10 -1)
23
Norma
Porcin de ensayo
Diluyentes
1- Agua de peptona
salina
ICMSF
Alimentos no
homogneos 50 g
alimentos no menor a
10 g ml.
2- Agua de peptona
BAM-FDA
Entre 50 y no menos de Buffer Fosfato de

10 g ml de alimento. Butterfield (KH2PO4)
ISO 68871:1999
Muestra representativa Peptona Bufferada

m g V ml, no menor a Buffer Fosfato
10 g ml.
Peptona salina
Preparacin de la muestra
24
Manteniendo condiciones aspticas
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Mtodos de recuento y deteccin de

microorganismos en la industria
alimentaria
Preparacin de diluciones
Muestras slidas
Solucin madre:
1/10 de alimento
en Diluyente
10 ml
10 ml
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-1
10-2
10-3
10-4
Muestras lquidas
Solucin madre:
1/10 de alimento
en Diluyente
10-5
25
Mtodos cualitativos
Mtodos microbiolgicos
Mtodos convencionales
Mtodos rpidos
Mtodos rpidos
Filtracin por membrana
Numero Ms Probable
(NMP)
Recuento en placa
a. Por profundidad
b. Por superficie
28
Mtodo convencional
Salmonella spp.
1. Enriquecimiento previo NO selectivo
Listeria monocytogenes
Vibro cholerae
Mtodos convencionales
27
Microorganismos a detectar
E. coli O157:H7
Estn diseados
para determinar si
una muestra de
alimentos contiene
o no una especie
microbiana
especfica.
Clostridium botulinum
29
Reparar clulas
lesionadas o
estresadas y
proliferen hasta
una cantidad
medible.
2. Enriquecimiento selectivo
Proliferacin del
patgeno
especfico y
multiplicacin
abundante.
3. Diferenciacin
Desarrollo de
colonias
caractersticas
del patgeno en
medios
selectivosdiferenciales
Identificacin
Realizacin de
pruebas
bioqumicas y
serolgicas.
2. Mtodos cuantitativos
Mtodos rpidos
1. Mtodos cualitativos
30
25/08/2015
Mtodos rpidos
Detectar patgenos.
Cargas bacterianas.
Verificar los controles

del proceso de
manufactura.
31
Calentar por 10 minutos.

Enfriar la muestra y agregar 5 gotas a la
paleta.
Leer el resultado.
Son rpidos.
Sensibles.
Especficos.
Requieren menos trabajo.
Entrega oportuna de desviaciones de proceso.
1. Rehidratar el medio con agua estril. 4.

2. Aadir 25 g de la muestra e incubar por 5.
8-20 h.
3. Transferir 2 mL de la muestra a un tubo 6.
de ensayo.
32
Ventajas
Vigilar las prcticas de

limpieza y desinfeccin
utilizadas en cada
planta.
Toxinas.
33
Mtodos
cuantitativos
34
Recuento en placa
Numero ms probable
1. Filtrar un volumen determinado de la muestra de agua a analizar a

travs de una membrana de 0,45m
2. Incubar en placas con medios de cultivo selectivos.
36
3. Realizar el recuento.
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Mtodo Filtracin por Membrana
Paso 1:
Paso 2:
En condiciones aspticas, se utiliza un filtro de membrana

de 0,45 m de tamao de poro que se coloca en el
portafiltros de la rampa de filtracin de vaco.
Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.
37
38
Paso 3:
Paso 4:
Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas
estriles y se coloca en medios de cultivo selectivos.
Se inicia la filtracin de los 100 mL de agua.
39
40
Nmero ms probable (NMP)
Paso 5:
Se incuban a la temperatura y tiempo indicados segn el
microorganismo y se hace el recuento.
41
Una sola clula viva puede desarrollarse y producir un

cultivo turbio.
Al aumentar el factor de dilucin, algunos tubos contendrn
tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn
ninguno.
Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan
recibido ninguna clula, se puede estimar el NMP de m.o.
presentes en la muestra original, a partir de una tabla
estadstica.
Determina la presencia/ausencia de un atributo especfico

del m.o. en rplicas obtenidas por diluciones consecutivas.
42
25/08/2015
Procedimiento
NMP de coliformes
Sembrar cada dilucin por

quintuplicado
1
10-1
Crecimiento y formacin de gas
No crecimiento ni formacin de gas
1 ml
10-1
1 ml
10-2
10-2
1 ml
2
10-3
44
10-3
Realizar diluciones
hasta 10-3
Recuento en placa
Tabla de NMP
Es un mtodo de recuento de clulas viables (aquella capaz de

dividirse y originar descendencia).
Muestra
En la mayora de los casos se hacen diluciones de la muestra antes de

la siembra.
45
Se cuentan las clulas capaces de formar colonias cuando se inoculan

en un medio de cultivo slido luego de un periodo de incubacin.
46
El resultado se expresa como UFC/ml.
Mtodos de siembra
Profundidad
Superficie
Se inocula 0,1 ml de la muestra

sobre la placa de agar y se
extiende con una asa.
Se mezcla 1 ml de la muestra con

el medio de cultivo fundido y se
deja solidificar.
47
48
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Ensayo cuantitativo
Gua general para el recuento de

microorganismos
Recuento en medio slido: Cuntas placas se deben

sembrar?
ISO 7218
-1 placa por dilucin para un mnimo de dos diluciones

consecutivas si el laboratorio trabaja bajo un sistema de
garanta de calidad (ISO 17025)
10-1
10-2
- Si se realiza una sola dilucin o el laboratorio no trabaja bajo
un sistema de garanta de calidad, deben sembrarse 2 placas
50
10-1
Generalidades:
Mtodo de clculo: caso general
Inoculacin de una placa de Petri de 90 mm por

cada dilucin.
N=
Recuento mximo de colonias totales presentes:

300 por placa.
C es la suma de las colonias contadas en todas las placas

escogidas de dos diluciones sucesivas, en las que al menos una
contiene 15 colonias.
Nmero de colonias sospechosas inoculadas para su

identificacin de cada placa escogida: 5
V es el volumen del inculo aplicado a cada placa, en mililitros;

n1 es el nmero de placas escogidas en la primera dilucin;
Estas cifras se definen en las normas

especficas
51
10-3
n2 es el nmero de placas escogidas en la segunda dilucin;
52
d es la dilucin correspondiente a la primera dilucin escogida.
Ejemplo:
Esquema de siembra para muestra lquida
10-2
C
V (n1 + 0,1n2)d
Donde:
Recuento mximo de colonias tpicas o

sospechosas: 150 por placa.
Siembra directa
100
10-1
10-2
El conteo del producto lquido da los siguientes resultado:

En la primera dilucin escogida (10-2): 232 y 244 colonias
10-4
En la segunda dilucin escogida (10-3): 33 y 28 colonias

Aplicando la frmula:
N=
1 mL
Incontables
1800, 1722
232, 244
33, 28
232+244+33+28
V (n1 + 0,1n2)d
1 (2+0,1x2) x 102
537 = 24.409
0,022
1, 3
Se deben escoger para el recuento las placas 300

y 10 colonias
53
54
25/08/2015
Mtodo de clculo: despus de la identificacin

Los resultados se redondean a dos cifras significativas.
Cuando el mtodo requiere identificacin, se identifican un
nmero A de colonias sospechosas de cada placa escogida para
el recuento. Tras la identificacin, se calcula el n de colonias de
cada placa, a, que cumple con los criterios de identificacin con
la siguiente frmula:
a= bxC
A
Si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra

anterior; si es 5 o ms, la cifra anterior se incrementa en una
unidad.
24.409
24.000
Se toma como resultado el nmero de microorganismos por

mililitro (productos lquidos) o por gramos (productos
slidos), expresados como un nmero entre 1,0 y 9,9
multiplicado por la potencia de 10 adecuada o un nmero
entero con dos cifras significativas.
2,4 x 104 24.000 UFC/mL
b es el n de colonias que cumplen con los criterios de

identificacin dentro de las colonias identificadas A.
C es el n total de colonias sospechosas contadas en cada placa.
55
El recuento da los siguientes resultado:
Si la placa contiene < 10 colonias, pero como mnimo

4, el resultado se calcula siguiendo el caso general y
se expresa como:
- en la segunda dilucin escogida (10-4): 4 colonias.

Realizamos la identificacin de las colonias:
- De las 66 colonias, se identificaron 8 (A) de las cuales 6 (b)
cumplieron con los criterios
6 x 66
Nmero estimado de microorganismos / g mL

Si el recuento oscila entre 1 y 3, la precisin del
anlisis es demasiado baja y el resultado debe
expresarse como:
a = 50
- De las 4 colonias, las 4 cumplieron con los criterios, a = 4
Hay microorganismos presentes, pero a un nivel

inferior a 4 x 1/d (dilucin) / g mL
Aplicando la frmula:
N=
50 + 4
= 54
56
Mtodo de clculo: recuento bajo
- en la primera dilucin escogida (10-3): 66 colonias;
a= bxC
El nmero de microorganismos identificados se calcula

reemplazando C por a en la frmula.
= 49.0 90
V x 1,1 x d
1 x 1,1 x 10 3
0,011
El resultado se informa 4,9 x 104 49.000 UFC/ g mL
57
Si la dilucin inoculada es 10-1: Hay microorganismos

presentes, pero a un nivel inferior 40 UFC/g mL
Ejemplo 1 : Lquidos
Caso en que la placa no contiene

colonias
Slidos
100
Si la placa de siembra directa para productos

lquidos o la suspensin inicial para productos
slidos, o la primera dilucin inoculada no
contiene colonias, el resultado se expresa:
58
10-1
10-2
10-3
Sin
Desarrollo
Sin
Desarrollo
Sin
Desarrollo
Siembra directa
Menor de 1/d / g mL
Sin
Desarrollo
Donde d es la dilucin de la suspensin inicial o la

primera dilucin inoculada.
Menos de 1 por mililitro (productos lquidos) < 1 UFC/mL

Menos de 1/d por gramo (productos slidos)
59
En donde d es la dilucin de la suspensin inicial.

Si la dilucin inicial es
10-1
60
: < 10 UFC/g
10
25/08/2015
Ejemplo 2
10-2
10-3
10-4
10-5
Ejemplo 3: Recuentos superior a 300 colonias
Si el recuento de las colonias en todas las placas de todas las diluciones es
mayor de 300 el resultado se expresa:
Ms de
/ g mL
300 / microorganismos
d
Donde d es la dilucin correspondiente a la ltima dilucin escogida

Sin
Desarrollo
Sin
Desarrollo
Sin
Desarrollo
Sin
Desarrollo
Ejemplo: Si la ltima dilucin (ms diluida) sembrada fue 10-3 el resultado

se expresa como:
Menos de 1/d . En donde d es la primera dilucin inoculada.
Ms de 300.000 microorganismos/ mL o g
En este ejemplo donde la primera dilucin inoculada es 10-2
El resultado es <
100 UFC/g si es un producto slido

< 100 UFC/mL si es un producto lquido.
61
62
Ensayos cualitativos
Nunca informar !!!

Cero (0)
Un mtodo de deteccin es el que determina

la presencia o ausencia de microorganismos
en una cantidad dada de producto
Sin Desarrollo
No se observa desarrollo
63
Si el microorganismo buscado ha sido detectado, se

informa el resultado de la siguiente manera:
Informe de
resultados
Presencia en X ml analizados (productos

lquidos) o X g ( productos slidos)
Los resultados deben

ser informados en
forma exacta, clara, no
ambigua y objetiva
Si el microorganismo buscado no ha sido detectado,

se informa el resultado de la siguiente manera:
Ausencia en X ml analizados (productos
lquidos) o X g (productos slidos)
Bajo ninguna circunstancia se generaliza a

cantidades mayores de producto
64
65
66
11
25/08/2015
Debe incluir:
- Ttulo: Informe de Ensayo.
- Nombre y Direccin del Laboratorio.
- Identificacin nica del Informe y Paginado.
- Nombre y Direccin del cliente.
- Identificacin del Mtodo utilizado.
- Descripcin, condicin e identificacin exacta de la muestra.
- Fecha de recepcin y fecha de ejecucin del ensayo.
- Referencia al plan y procedimiento de muestreo (si
corresponde).
- Los resultados con sus unidades de medida.

- Nombre, funcin y firma de los responsables.
- Declaracin que los resultados slo estn relacionados con la
muestra ensayada.
67
Solo una cosa vuelve a un sueo imposible:

el miedo a fracasar
68
Paulo Coelho
12

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Marcela Martnez M-Sc-

Es la operacin que consiste en separar un nmero

Mara Marcela Martnez Miranda

Objetivos del muestreo

Investigar brotes alimentarios.

Debera (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su

Marcela Martnez M-Sc-

En autoclave a 121C durante 15 minutos, especialmente

Marcela Martnez M-Sc-

Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones

Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados,

Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por

Esterilizacin de los elementos para el

Condiciones para el muestreo

El recipiente no debera llenarse en ms de de su

No debe sufrir dao o transformacin durante el transporte y

En estufa a 160-180C durante 2 horas. Alternativamente se

Marcela Martnez M-Sc-

Conocer el estado higinico de

Debe ser representativa del lote.

Marcela Martnez M-Sc-

Conocer la vida til del

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Pasos para el muestreo

3. Conservacin y transporte de muestra

4. Recepcin de la muestra en el LMA

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

Plan de muestreo de 2 clases

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

Plan de muestreo de 3 clases

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

Tamao muestra para alimentos

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

Resolucin Mercosur 74/93

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

Los alimentos expuestos al aire

Alimentos preparados sin envasar de

Naturaleza del alimento.

Marcela Martnez M-Sc-

Marcela Martnez M-Sc-

La muestra debe ser identificada de manera clara y

Fecha, lugar y hora del muestreo.

Razones del muestreo.

Marcela Martnez M-Sc-

La muestra se enva al laboratorio con prontitud, manteniendo

No debe utilizase hielo suelto para

Productos congelados y ultracongelados:

Marcela Martnez M-Sc-

Productos inestables a temperatura ambiente:

- Fecha y hora de recibo.

Marcela Martnez M-Sc-

Documentar las muestras admitidas de tal manera que se garantice

- Productos altamente perecederos: antes de 24 h.

- Productos perecederos: Mximo 36 h.

Marcela Martnez M-Sc-

Entre 50 y no menos de Buffer Fosfato de

Muestra representativa Peptona Bufferada