DNA RECOMBINANTE

DNA Recombinante: Una molcula de DNA formada por la unin de segmentos de

DNA de distintos orgenes. Los DNAs recombinantes son utilizados en el clonamiento
de genes, en la modificacin gentica de organismos y como herramienta general en
biologa molecular.

Algunas tcnicas utilizadas:

Corte de DNA en secuencias especficas por endonucleasas de

restriccin (enzimas de restriccin)
Hibridizacin o Hibridacin de cidos nucleicos: permite encontrar una
secuencia especfica de DNA o RNA sobre la base de la
complementariedad de bases
Clonamiento de DNA: una molcula de DNA puede ser copiada para
generar muchas copias idnticas de ella
Amplificacin de segmentos de DNA por la reaccin en cadena de la
polimerasa o PCR.

Analisis de DNA
Southern blot
PCR
RFLP

Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

Tipo I y Tipo III:

Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). Cortan a cierta
distancia de la secuencia de reconocimiento

Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro

abajo.
Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen.
Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo II:
Slo tienen actividad de restriccin.
Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
Slo requieren Mg++ como cofactor.
No necesitan ATP.

Endonucleasas o
Enzimas
de Restriccin

Permiten generar un mapa o patrn de restriccin

Anlisis de DNA Digerido con

Enzimas de Restriccin

Aplicaciones de las enzimas de restriccin:

1.- Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago.
2.- Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.
3.- Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southern
y Northern blotting.
4.- Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creacin de DNA recombinante.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) es diferentes

secuencias de DNA homlogos que pueden ser detectadas por la
presencia de fragmentos de diferentes longitudes luego de la
Digestin de muestras de DNA con especificas Endonucleasas de
restriccin.
Para ello se utilizan combinaciones de Enzimas de Restriccin

Adems del clsico plasmidio (utilizado para clonar),

existen diferentes sistemas de Expresin.
Yeast Artificial Chromosome (YAC)
Vectores de Expresin
Vectores Retrovirales
Vectores Lentivirales

Hibridacion

La hibridacin de Ac. Nucleicos es fundamental en estudios

moleculares. Utiliza la capacidad natural de union entre DNA o
RNA para formar dsDNA o dsRNA.
Es una propiedad utilizada en muchas tecnicas de biologia
molecular (diagnostic tests).

DNA unido a
la membrana

sonda

3 ACCAGAGCCTAGC 5
5 ACTGCTCGATGCTCTCGGATCGCTCTGATTCG 3
Nitrocelulosa

Southern blot

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Componentes:

Template
Pureza, origen, concentracion
DNA genmico ~ 100-250 ng

DNA plasmidial

20 ng

Buffer
Necesario el MgCl2
(0.5mM to 3.0mM 1.5mM default)
dNTPs
Concentracin Final 200M
Polimerase
Grado de error y condiciones requeridas
Primer(s)
tamao (typically 18-30 nt)
G+C content (40-60%)

Parametros Criticos:
Annealing Temperature
Cerca de 5-7C bajo la Tm
Annealing Time
Regla de 1kb por minuto
Primer Design

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

(polymerase chain reaction)
Hebras de DNA complementarias separadas por calor

Partidores
definidos

Sntesis de DNA

Regin amplificada

El primer ciclo de la
reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) para
amplificar secuencias
especficas de DNA. El
DNA aislado de clulas es
calentado para separar
sus hebras
complementarias. Estas
hebras son hibridizadas a
dos fragmentos de DNA
de hebra simple
(oligonucletidos), que
han sido sintetizados
qumicamente. Estos dos
oligonucletidos sirven
como partidores
especficos para la
sntesis de DNA por la
DNA polimerasa, la cual
copia el DNA que se
encuentra entre las
regiones de unin de los
partidores.

DENATURACIN:

HIBRIDACIN:

PARTIDORES

ELONGACIN:

PARTIDORES

Cada ciclo tiene 3 etapas: denaturacin (separacin de hebras), hibridizacin

(unin de partidores al templado) y elongacin (polimerizacin de
desoxirribonucletidos para sintetizar DNA sobre el templado).

La cantidad de DNA producido se duplica en cada ciclo, logrndose una amplificacin

exponencial del fragmento deseado, a partir de poca cantidad de DNA. La enzima utilizada
para amplificar DNA en el PCR es la de la bacteria Thermus aquaticus (Taq Polimerasa).
Este organismo vive en ambientes de temperaturas muy altas (giseres), lo cual permite
que su DNA polimerasa resista las temperaturas requeridas para la amplificacin por PCR

Early Exponential
CT
Phase
Log-Linear
Phase

Linear Ground Phase

Real-Time PCR
Existen tres mtodos generales para la deteccin cuantitativa:
1. Reactivo que se une al DNA (SYBR Green)
2. Hidrolisis de sondas (TaqMan, Beacons, Scorpions) utiliza la actividad
exonucleasa de la DNA Pol

M 10fg 100fg 1pg 10pg 100pg 1ng 10ng control

RT-PCR EN TIEMPO REAL (SYBR Green)

SYBR Green I binds dsDNA

SGI fluorescence increases
when bound to dsDNA
As dsDNA accumulates, more
SGI binds the DNA and the
fluorescence increase

l
PCR
Reaction
Progression
l

l
l

l
l

RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)

Target specific hybridization probe

5 reporter and 3 quencher
Utilizes FRET quenching

Light*

Light

Reporter

Quencher

Energy

Q
* heat for BHQs

RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)

1. During PCR, probe hybridizes

to target sequence

Taq

R
Taq

2. Probe is partially
displaced during extension
3. Probe cleaved by 5- 3
nuclease activity of polymerase
4. Illuminated free reporter
exhibits unquenched fluorescence

iScript qRT-PCR Standard Curve Comparison:

cDNA serial dilution vs. total RNA serial dilution
40

HeLa, -actin

cDNA Standard
Curve
Total RNA Standard
Curve

35

30

25

20

15

Cy
cle
Th
re
sh
old
Nu
m
be

10

total
RNA
-3.382
0.999
38.09
97.6%

cDNA
-3.394
0.999
38.91
97.1%

Slope
Corr. Coef.
Intercept
PCR efficiency

5
1

Log Starting Quantity

(femtograms of input RNA)
Note: 1/10th of cDNA reaction used for PCR

Mtodo RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN