Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativoLos fundamentos de la

tcnica se basan en las diferencias entre las paredescelulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativasLa pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa
capa depeptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la carainterna
de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra elcido lipoteicoico, y ms
en la superficie, el cido teicoico que est ancladosolamente en el peptidoglucano (tambin
conocido como murena)Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas
es delgada,y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior
(decomposicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capadelgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. Lamembrana exterior est
hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se
tien diferencialmente debido a estasdiferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglicano, ya que esel material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las
Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.La diferencia
que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a quela membrana externa de las
Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano queposee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristalvioleta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa,perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las
Grampositivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcinde
peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sinoque este acta
deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
Descripcin de la tincin de GRAM: Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se
tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan
efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El
portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente
activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y
forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo
despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran,
mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe
probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la
clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La
delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando que
el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la
decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son
incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica.
Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con
cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad
con las clulas. 2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso
del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. 3) Cultivos de ms de

24 horas de teidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.
2.4.
Tincin diferencial: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN) Las paredes celulares de
ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a
90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcoholcido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistentes. El frotis se tie durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave.
Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir
durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar.
FUNDAMENTO
La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la decoloracin con cidos fuertes
despus de ser coloreadas con solucin de fucsina caliente, permite reunirlas bajo la
denominacin general de bacterias cidoresistentes o cido-alcohol resistentes. La cidoalcohol resistencia es la capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos despus de
someterlos a la accin de cidos y alcohol y est determinada por la presencia en la pared
celular de los cidos miclicos que son cidos grasos de cadenas ramificadas de alto peso
molecular (60 a 70 tomos de carbono). Las micobacterias son bacilos cido-alcohol
resistentes, cortos, ligeramente curvos. El gnero Mycobacterium, incluido en esta
clasificacin, comprende especies patgenas para el hombre, animales y especies saprfitas.
El grado de cido-alcohol resistencia es variable entre las especies de este gnero y est
relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo utilizarse esta
diferencia para distinguirlos entre s. Los bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) se
observan de color rojo al ser coloreados con los colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que
otros grmenes y clulas toman distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se
utiliza como colorante de contraste. La coloracin de Ziehl Neelsen consituye una tcnica
sencilla rpida y econmica, de baja sensibilidad pero es una valiosa herramienta para
detectar los casos de tuberculosis pulmonar.