Trabajo prctico N2

Protenas 2
Curvas de calibracin para la concentracin
de protenas y de ONF

Integrantes: Humberto Cuadra V.

Roco Ramrez F.
Fecha de realizacin: 22-09-2015
Fecha de entrega: 01-09-2015
Profesor de laboratorio: Dra. Victoria Guix L.
Ayudante: Pamina Contreras K.
Introduccin
Dentro del rea bioqumica, es fundamental el estudio de las protenas por su
importante funcin y distribucin celular. Para poder estudiar las protenas, es necesario

medir su concentracin en una muestra. Existen diversos mtodos para la cuantificacin de

las protenas, cada uno con sus respectivas ventajas y desventajas. Los criterios utilizados
para la eleccin de un mtodo adecuado son principalmente: la cantidad de protena
presente en la muestra, la especificidad del mtodo, presencia de sustancias que puedan
interferir y la facilidad, rapidez y reproducibilidad del mtodo (1).
Uno de los mtodos ms utilizados es el mtodo de Bradford, el cual utiliza el
colorante Azul de Coomassie G-250, que se une a las protenas formando un complejo
coloreado de color azul, cambiando su mximo de absorcin de 465 a 595 nm, por lo que
se cuantifica la concentracin de protenas mediante espectrofotometra a 595 nm. Tiene
como ventaja ser reproducible y rpido (2).
Las absorbancias que se obtienen, mediante un espectrofotmetro, van a depender
de la cantidad de complejos formados entre la protena y el reactivo utilizado, y se comporta
segn la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la cantidad de luz absorbida por la muestra
con la concentracin de sta, dada la ecuacin 1 (3):

A = lc (1)
Donde A = Absorbancia, = Coeficiente molar de extincin, l = Distancia en cm (espesor de
cubeta), c = Concentracin molar

Para comparar los valores obtenidos experimentalmente con los tericos, se calcula
el error porcentual de dicho valor emprico, dada la ecuacin 2 (4):

(2)
Los objetivos de este prctico son:
-Realizar curva de calibracin, con la absorbancia de soluciones de concentraciones
conocidas de BSA (seroalbmina de bovino), mediante el mtodo de Bradford y el uso de
un espectrofotmetro, para luego determinar la concentracin de una muestra problema (A)
con la interpolacin de la curva obtenida.
-Realizar una curva de calibracin para el ONF ( o-nitrofenol), para posterior uso en
el prctico de enzimas 1, y determinar la calidad de la curva obtenida, comparando el valor
de coeficiente de extincin obtenido con el terico.

Materiales y mtodos
Experimento 1.-

Se utilizaron los materiales descritos en la Gua de trabajos prcticos (5)

Para la construccin de la curva de calibracin de BSA se utilizaron 6 tubos de
ensayo en donde se les introdujo distintas mezclas que contenan un volumen constante de
reactivo de Bradford, volmenes variables de solucin patrn y agua destilada. Al tubo de
ensayo nmero 7 se le agregaron, en vez de solucin patrn de BSA, un volumen
especfico de muestra problema de BSA junto al reactivo de Bradford y agua destilada. En la
tabla I se especifican los volmenes de cada sustancia que se introdujeron en los distintos
tubos de ensayo.
Tabla I.- Volmenes de solucin patrn de BSA, reactivo de Bradford, muestra problema de BSA
y agua destilada en cada tubo de ensayo.
N del tubo

Solucin patrn de
BSA (mL)

Reactivo de
Bradford (mL)

Muestra problema
de BSA (mL)

Agua destilada
(mL)

0.2

0.8

0.1

0.2

0.7

0.2

0.2

0.6

0.3

0.2

0.5

0.4

0.2

0.4

0.5

0.2

0.3

0.2

0.6

0.2

A cada tubo se le realiz un duplicado con los mismos volmenes indicados en la tabla I.
Luego se procedi a calibrar el espectrofotmetro, a 590 nm, con agua destilada
dentro de la cubeta para, posteriormente, medir la absorbancia de cada mezcla presente en
todos los tubos. Con estos datos se construy una grfica de absorbancia versus volumen
de solucin de BSA (en L).
Experimento 2.Se utilizaron los materiales y protocolos descritos en la Gua de trabajos prcticos.
(6)
Para esta parte del prctico, a cada tubo de ensayo se le introdujo distintos
volmenes de ONF, agua destilada, buffer y solucin de carbonato de sodio. En la tabla II se
encuentran descritos los volmenes especficos de cada sustancia en cada tubo.
Tabla II.- Volmenes de o-nitrofenol, agua destilada, buffer de fosfato de potasio a pH 7,2 y
solucin de carbonato de potasio en cada tubo de ensayo.
N del tubo

ONF (mL)

Agua destilada
(mL)

Buffer de fosfato de
sodio pH 7,2 (mL)

Solucin de
carbonato de sodio
(mL)

2.2

0.5

0.3

0.4

2.0

0.5

0.3

0.6

1.6

0.5

0.3

1.2

0.5

0.3

1.4

0.8

0.5

0.3

1.8

0.4

0.5

0.3

Al igual que en el experimento anterior, se calibra el espectrofotmetro, a 420 nm,

llenando la cubeta con agua destilada, para luego medir la absorbancia de las mezclas al
interior de los 6 tubos de ensayo. Luego se construy un grfica de absorbancia versus
concentracin de o-nitrofenol.
Resultados
Experimento 1.Los valores de la absorbancia obtenida de las mezclas en cada uno de los 7 tubos
de ensayo, y sus duplicados correspondientes, se encuentra detallado en la tabla III.
Tabla III.- Se indican las concentraciones utilizadas de la muestra problema A y solucin patrn de BSA,
volmenes de agua destilada, reactivo de Bradford, y la absorbancia de los 7 primeros tubos
(absorbancia 1) y la absorbancia medida de los duplicados (absorbancia 2).
N del tubo

Muestra
problema de
BSA (g/mL)

Solucin
patrn de
BSA (g/mL)

Agua
destilada
(mL)

Reactivo de
Bradford
(mL)

Absorbancia
1 (nm)

Absorbancia
2 (nm)

0.8

0.2

0.530

0.532

0.7

0.2

0.568

0.489

0.6

0.2

0.624

0.599

0.5

0.2

0.634

0.623

0.4

0.2

0.653

0.633

10

0.3

0.2

0.698

0.711

0.2

0.2

0.721

0.726

Como se observa en la tabla III, los valores de absorbancia 1 y 2 van en aumento a

medida que la concentracin de la protena aumenta, exceptuando el valor de absorbancia
del tubo duplicado 2, en donde disminuye significativamente su a pesar de que la
concentracin de protena BSA aument de 0 a 2 g/mL.
Experimento 2.-

Los resultados obtenidos de absorbancia para cada tubo, sin duplicado, se observa
en la tabla IV.
Tabla IV.- Resultados de absorbancia, medidos a 420nm, para distintas concentraciones de ONF (g/mL)
y solucin blanco
N del tubo

ONF (g/mL)

Buffer de
fosfato de sodio
pH 7,2 (mL)

Agua destilada
(mL)

Solucin de
carbonato de
sodio (mL)

Absorbancia
(nm)

0.5

2.2

0.3

0.026

0.06

0.5

2.0

0.3

0.082

0.1

0.5

1.6

0.3

0.228

0.16

0.5

1.2

0.3

0.250

0.23

0.5

0.8

0.3

0.290

0.3

0.5

0.4

0.3

0.520

Anlisis de resultados
Experimento 1.La protena de BSA est disueltas en distintas sustancias, para poder determinar
cul es la absorbancia de estos solventes, y si existen trazas de sustancias que podran
interferir en la medicin de la absorbancia del complejo protena-reactivo, se midi la
absorbancia del tubo blanco, que slo contena el solvente sin protena, para luego restar
este valor a todas las absorbancias obtenidas en los distintos tubos. En la tabla V se
observan los valores de absorbancia medidos para todos los tubos con sus duplicados
segn la concentracin de la protena en la solucin patrn.(7)

Tabla V.- Absorbancias reales (sin la absorbancia del solvente) obtenidas para la curva de
calibracin, a travs del mtodo de Bradford, segn la concentracin de la solucin patrn de BSA. La
absorbancia 1 corresponde a las mediciones de los 7 primeros tubos y absorbancia 2 a los respectivos
duplicados.
N del tubo

Solucin patrn BSA

(g/mL)

Absorbancia 1 (nm)

Absorbancia 2 (nm)

0.530

0.532

0.038

0.043

0.094

0.067

0.104

0.091

0.123

0.101

10

0.168

0.179

0.191

0.144

A partir de los datos tabulados en la tabla V se construy una grfica, que se

encuentra en la figura 1, de absorbancia versus concentracin de protena BSA para
determinar qu relacin matemtica existe entre el aumento de la concentracin de la
protena y la absorbancia medida.
Figura 1.- Grfica de absorbancia versus concentracin de la protena de BSA, a partir de la
solucin patrn. Se observa, en la parte superior, la ecuacin de la grfica al trazar la recta que mejor se
ajusta a los puntos. En la parte inferior de donde se encuentra la ecuacin del grfico se seala la
regresin lineal (R2) de la lnea. Slo se consider la absorbancia 1 para construir la grfica y los 5
primeros tubos.

En la grfica de la figura 1, al encontrar la tendencia lineal de los puntos arroj una

ecuacin de la recta y un valor de regresin lineal de 0.9605, al calcular el ndice de
correlacin ( ) de 0.98, valor muy cercano a 1, lo cual indica que es un tendencia casi
lineal entre la absorbancia medida en los tubos a 590 nm y la concentracin de la protena
en g/mL. (8)
La pendiente de la recta que mejor se ajusta a la grfica corresponde al coeficiente
de extincin molar, de la ecuacin que arroja la recta se tiene que la pendiente tiene un
valor de 0,0158. Este valor lo utilizamos para calcular la concentracin de BSA en la
muestra problema A utilizando la frmula algebraica (1). El valor de la concentracin de la
protena en la muestra problema, segn la absorbancia que se midi del tubo que contena
la muestra problema A (tabla III), es 12.09 g/mL. El error porcentual asociado en la
determinacin de la concentracin se calcul a partir de la ecuacin algebraica (2), el cual
di un 64,5%.

Experimento 2.Los resultados de la absorbancia de cada tubo sin la absorbancia medida del tubo
blanco se encuentra en la tabla IV.
Tabla VI.- Absorbancias reales obtenidas restando medicin de solucion blanco (0.026 nm), para las
distintas concentraciones de ONF (g/mL)
N del tubo

ONF (g/mL)

Absorbancia (nm)

0.026

0.06

0.056

0.1

0.202

0.16

0.224

0.23

0.264

0.3

0.494

A partir de los datos de la Tabla VI, se realiz un grfico (Figura 2) de absorbancia

versus concentracin, para determinar la relacin matemtica que existe al comparar el
aumento de la absorbancia con el aumento de concentracin de la muestra analizada .Se
obtuvo una ecuacin de la recta a partir de una regresin lineal, y se obtuvo un valor de
coeficiente de correlacin ( ) de 0,9527, teniendo por tanto un valor cercano a 1, que
indica una relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin del compuesto.(9)

Figura 2.- curva de concentracin de ONF (g/ml) en funcin de la absorbancia a 420 nm).

La pendiente de la grfica de la figura 2 indica el coeficiente de extincin molar para

el ONF, cuyo valor es de 1,4424. La bibliogrfica indica que a 420 nm, el coeficiente de
extincin molar del ONF es de 4,5 mmoles, dando un error porcentual de 67,95%, en base a
la frmula de error porcentual.

Discusin
En el experimento 1 se obtuvo un 65,4% de error experimental, esto tambin se
puede contrastar con la concentracin real de la muestra problema de BSA la cual era 20
g/ml y la concentracin experimental fue de 12 g/ml. La explicacin de esto se puede dar
por distintos motivos, tanto como la mala utilizacin de los instrumentos de laboratorio, ya
sea la poca precisin con que se utilizaron las distintas pipetas y los desperfectos que
presentaba el mismo material. Independiente de esto en la literatura se indica que el
complejo reactivo-protena empieza a los 2 minutos de mezclado el reactivo de Bradford con
la solucin que contiene la protena y se dura 1 hora aproximadamente, luego de esto la
tendencia lineal que existe entre la concentracin de las protenas y la absorbancia medida
comienza a modificarse, ya que el complejo reactivo-protena comienza a separarse
(Bradford M; 1976). La absorbancia de los tubos se midi a los 90 minutos
aproximadamente luego de comenzada la reaccin, por lo que la absorbancia medida no
corresponda a la del complejo protena-reactivo en su totalidad, sino que cierta cantidad de
protena se encontraba disuelta en la solucin, lo cual afect significativamente en la
construccin de la curva de calibrado y, en consecuencia, en el clculo de la concentracin
de la muestra patrn A.
Con respecto a la curva de calibracin para el o-nitrofenol, los resultados de la figura
2 muestran que se obtuvo un valor de coeficiente de extincin molar alejado del terico
(67,95% de error porcentual). Esto se puede explicar en trminos de errores experimentales
y calibrado del instrumento utilizado (espectrofotmetro). Por un lado, posiblemente se
cometieron errores al pipetear los volmenes del buffer, carbonato de sodio, agua o ONF, en
los tubos que posteriormente se utilizaron para medir la absorbancia, tenindose
concentraciones errneas en algn tubo y, dada la sensibilidad del mtodo, esto se vio
reflejado como un error importante al momento de medir la absorbancia de cada tubo.
Tambin hay que considerar que el instrumento utilizado posiblemente no se
encontraba bien calibrado, dado el uso reiterado que se le da durante el prctico por parte
de varios grupos de trabajo, afectando tambin la medicin correcta de la absorbancia para
las distintas cubetas analizadas
Cuestionario
1.- En trminos de absorcin de la luz Cmo se explica que un vidrio tenga color
verde?
El hecho de que un vidrio se observa de color verde, significa que dentro del espectro de luz
visible, se, absorben todas las longitudes de onda excepto la longitud de onda que corresponde al
color verde, que ser reflejada por el objeto, observndose as el color verde.(10)

2.- Qu se entiende por coeficiente de extincin molar?

El coeficiente de extincin molar o absortividad molar, es una medida que determina la
cantidad de luz que una especie qumica absorbe a una determinada longitud de una. Es una medida
caracterstica para cada especie qumica o protena.(11)

3.- Qu se entiende por absorbancia? D la frmula que la define, indicando

claramente el significado de los trminos.
La absorbancia en trminos simples, es la relacin que existe entre la intensidad de luz que
incide sobre una muestra determinada y la intensidad de esta, que es transmitida luego de pasar por
la muestra, donde parte de la luz que incide sobre la muestra, es absorbida. Segn la frmula
matemtica (Ley de Lambert-Beer), la luz transmitida ser menor a la luz que atraviesa la muestra,
dependiendo de 3 caractersticas: concentracin de la sustancia que absorbe la luz (c), la distancia
de que la luz debe atravesar (l), y el coeficiente de extincin molar (). (12)

A = lc
Donde A = Absorbancia, = Coeficiente molar de extincin, l = Distancia en cm (espesor de
cubeta), c = Concentracin molar

4.- Represente grficamente la relacin entre la transmitancia (ordenada) y la

concentracin de una sustancia

Figura 3.- Grfica de transmitancia versus concentracin de la protena de BSA, a partir de la solucin
patrn. Slo se consider la absorbancia 1 para construir la grfica y los 5 primeros tubos,
especificados en tabla V. La transmitancia se obtuvo a partir de la absorbancia, segn la siguiente
ecuacin: A = -log T (A: absorbancia, T: transmitancia) (13)

5.- Se quiere determinar la concentracin de una sustancia midiendo la absorbancia

en una longitud de onda en que tambin absorbe el solvente Cmo podra descartar
la absorcin de este?
Con un tubo blanco o ensayo blanco, que contenga solo el solvente. El sentido de este tubo
es poder determinar la absorbancia de la sustancia, cuya concentracin se desea determinar,
restando el valor de absorbancia del ensayo blanco, a los tubos que contienen la sustancia y el
solvente y as obtener eficazmente la absorbancia de la especie qumica a determinar.(14)

Conclusin
Debido a que el error porcentual asociado, tanto en el primer experimento en el
clculo de la concentracin de la muestra problema y para el experimento 2 en la
construccin de la curva de calibracin, es demasiado alto, sobrepasando el 50% de error,
no se puede asegurar que la concentracin de la protena BSA y el ONF presentan una
relacin lineal con la absorbancia que se mide, o alguna tipo de relacin matemtica entre
las dos variables, y no da una referencia confiable si se utiliza en trabajos experimentales
posteriores. Para llegar a resultados concluyentes se debe repetir ambos experimento
intentando eliminar los errores de manejo de instrumentacin, control del tiempo debido a lo
que se explic anteriormente en la discusin y cambiando el instrumento que se encuentra
en mal estado, as se eliminan los factores que fueron identificados como influyentes en el
error experimental y se puede determinar la relacin entre las concentraciones de los
compuestos y su absorbancia.

Bibliografa
(1) http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf.
(2) Referencia 1.
(3) http://solutions4processcontrol.com/es/ley-de-lambert-beer/
(4) http://colabora.inacap.cl/sitios/merlot/Materiales
%20MerlotChile/mlcastro/Ciencias%20y%20Tecnolog%C3%ADa/F
%C3%ADsica/Manuales%20F%C3%ADsica%20Mec%C3%A1nica/Error
%20absoluto%20error%20relativo.pdf
(5) Guix V, Preller A. Gua de trabajos prcticos y de ejercicios, Curso
Bioqumica, Ed. Facultad de Ciencias Universidad de Chile, Santiago (2015), pp. 78.
(6) Referencia 5.
(7) Harris D, Anlisis qumico cuantitativo, 3 edicin (sexta edicin original),
Editorial Revert S.A, Barcelona, Espaa, 2007.
(8) http://www.udc.es/dep/mate/estadistica2/sec6_8.html
(9) Referencia 8.
(10)
http://blog.graficasazorin.es/la-percepcion-del-color/
(11)
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/absortividad
(12)
Referencia 3.
(13)
http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/
Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm
(14)
Referencia 7.