CAPTULO 1.1.6.

MTODOS DE LABORATORIO PARA LOS ENSAYOS

DE SENSIBILIDAD DE LAS BACTERIAS FRENTE A
LOS ANTIMICROBIANOS

RESUMEN
Histricamente, los mdicos y los veterinarios seleccionaban antimicrobianos para tratar las
enfermedades infecciosas basndose sobre todo en experiencias clnicas pasadas. Sin embargo,
con el aumento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos tradicionalmente utilizados,
empez a ser ms difcil para los clnicos seleccionar empricamente un agente antimicrobiano
adecuado (15). Como resultado, deben utilizar mtodos validados en las pruebas de sensibilidad a
los antimicrobianos in vitro (AST) de los patgenos bacterianos relevantes, a partir de las muestras
tomadas adecuadamente. Por tanto las pruebas de sensibilidad inciden en las directrices
generales que deben seguirse a nivel mundial para un uso prudente de los antimicrobianos en la
produccin animal, y los veterinarios de todos los pases deberan tener en cuenta estos datos
para la toma de decisiones con conocimiento de causa (1).
Aunque existe una variedad de mtodos, el objetivo de una prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos in vitro es proporcionar un pronosticador fiable de cmo un microorganismo es
probable que responda a una terapia antimicrobiana en el hospedador infectado. Este tipo de
informacin ayuda a los clnicos a seleccionar el agente antimicrobiano apropiado, ayuda en el
desarrollo de la poltica de uso de los antimicrobianos y proporciona datos para una supervisin
epidemiolgica.
Los datos de tal control epidemiolgico suministran un punto de partida para elegir adecuadamente
un tratamiento emprico (primera lnea de terapia) y para detectar la aparicin y/o la diseminacin
de cepas bacterianas resistentes as como los determinantes de la resistencia en diferentes
especies de bacterias. La seleccin de un mtodo AST particular se basa en muchos factores tales
como datos de validacin, practicabilidad, flexibilidad, automatizacin, coste, reproducibilidad,
precisin y preferencia individual.
El uso de enfoques genotpicos para la deteccin de genes de resistencia antimicrobiana tambin
ha sido fomentado como una manera de aumentar la velocidad y la precisin de la prueba de
sensibilidad. Se han desarrollado numerosos ensayos basados en el ADN para detectar
genticamente la resistencia bacteriana a los antibiticos. Estos mtodos, cuando se utilizan en
conjuncin con anlisis fenotpicos, prometen un aumento de la sensibilidad y rapidez en la
deteccin de genes de resistencia especficos conocidos y pueden utilizarse conjuntamente con los
mtodos AST tradicionales de laboratorio.

INTRODUCCIN
La propagacin de mltiples bacterias patgenas resistentes a los antimicrobianos ha sido reconocida por la
Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE), la Organizacin para la Alimentacin y la Agricultura (FAO) y la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), como un serio problema global de salud humana y animal. El
desarrollo de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos no es un fenmeno ni nuevo ni inesperado. Esta es,
sin embargo, una situacin problemtica debido a la frecuencia con la que nuevos fenotipos de resistencia
emergentes ocurren entre muchos patgenos bacterianos e incluso en los microorganismos comensales.
Histricamente muchas infecciones se pudieron tratar con xito basndose en la experiencia clnica pasada de
los clnicos (es decir, la terapia emprica). Sin embargo, esto se est convirtiendo ms en la excepcin que en la

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

regla. Se ha observado la resistencia a prcticamente todos los agentes antimicrobianos actualmente aprobados
para su uso en medicina clnica humana y veterinaria. Esto, combinado con la variedad de agentes
antimicrobianos actualmente disponibles, hace de la seleccin de un agente apropiado una tarea cada vez ms
difcil. Esta situacin ha hecho a los clnicos ms dependientes de los datos de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos in vitro, y pone de relieve la importancia del laboratorio de diagnstico en la prctica clnica.
Existe un nmero de mtodos de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (AST) disponibles para
determinar la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. La seleccin de un mtodo se basa en muchos
factores tales como la practicabilidad, la flexibilidad, la automatizacin, el coste, la reproducibilidad, la precisin y
la preferencia individual.
La estandarizacin y homologacin de las diversas metodologas de ensayo de sensibilidad frente a
antimicrobianos, utilizadas en el control epidemiolgico de la resistencia a los compuestos antimicrobianos,
constituyen un factor clave si se pretende comparar datos entre los diferentes programas nacionales e
internacionales de seguimiento de los pases miembros de la OIE. Resulta esencial que los mtodos de ensayo
de sensibilidad a los antimicrobianos generen resultados reproducibles en laboratorios de uso diario y que los
datos puedan ser comparables con los resultados obtenidos por un mtodo patrn de referencia conocido como
la norma de oro. En ausencia de mtodos estandarizados o de procedimientos de referencia, los resultados de
sensibilidad obtenidos en laboratorios diferentes no pueden compararse con fiabilidad. El mtodo utilizado en la
seleccin de las muestras para su inclusin en los programas de vigilancia de la resistencia a los
antimicrobianos, as como los mtodos utilizados para el aislamiento bacteriano primario, son tambin factores
importantes que deben estandarizarse y homologarse para permitir una comparacin directa de los datos entre
las diferentes regiones; se ofrecen reflexiones sobre estos temas en los documentos de la OIE (17).
A medida que ha progresado la ciencia del AST, ha empezado a estar ms claro un mayor entendimiento de los
mltiples factores que pueden afectar al resultado global de las pruebas de sensibilidad. Este captulo contiene
directrices y estandarizaciones metodolgicas para las pruebas de sensibilidad frente a los antimicrobianos y la
interpretacin de los resultados de dichas pruebas.

1.

Requerimientos de las pruebas

Para lograr la estandarizacin de los mtodos de determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos y la

comparacin de sus resultados, hay que tener en cuenta los siguientes principios:
i)

Son cuestiones esenciales el uso de parmetros de prueba ATS y la homologacin de los datos sobre
sensibilidad (incluyendo la eleccin de los agentes antimicrobianos y los subsiguientes criterios de
interpretacin).

ii)

Los mtodos estandarizados, incluyendo las especificaciones esenciales y los criterios de interpretacin,
deberan ser claramente definidos, documentados con detalle y utilizados por todos los laboratorios
implicados.

iii)

Todos los mtodos de determinacin de sensibilidad a los antimicrobianos deberan dar lugar a resultados
reproducibles y precisos.

iv)

Todos los datos han de poder describirse en trminos cuantitativos

v)

Resulta esencial establecer una red de laboratorios designados a nivel nacional o regional para coordinar
las metodologas, interpretaciones y controles de calidad de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos.

vi)

Los laboratorios de Microbiologa deberan implementar y mantener un programa de gestin de calidad

formal (vase el captulo 1.1.3 Gestin de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias).

vii)

Los laboratorios deberan adquirir una acreditacin a terceros que incluya las metodologas de AST para
ser utilizadas dentro del marco de dicha acreditacin. El organismo de acreditacin debe cumplir con los
estndares y directrices aceptados por el Laboratorio Internacional para la Cooperacin de la Acreditacin
(ILAC) relativos a los estndares utilizados en el proceso de acreditacin. Los estndares de acreditacin
utilizados deberan incluir la exigencia de participar en los programas de prueba de competencia.

viii) La existencia de cepas bacterianas especficas de referencia y control de calidad resulta necesaria a fin de
determinar el nivel de control de calidad, la seguridad y la mejora de las pruebas dentro de un mismo
laboratorio, y entre varios laboratorios.

2.

Seleccin de antimicrobianos para las pruebas e informes

Puede ser difcil seleccionar los antimicrobianos apropiados para las pruebas de sensibilidad dado el gran
nmero de agentes disponible. Deben tenerse en cuenta las siguientes directrices:

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

i)

El taller de expertos de la FAO/OIE/WHO en el uso de antimicrobianos en no humanos y en resistencia a

los antimicrobianos recomienda elaborar una lista de antimicrobianos de importancia fundamental para las
pruebas de sensibilidad y los correspondientes informes,

ii)

La seleccin de los antimicrobianos ms apropiados es una decisin que debe hacer cada pas miembro de
la OIE en colaboracin con los organismos adecuados,

iii)

Los antimicrobianos de la misma clase pueden tener actividades in-vitro similares frente a los patgenos
bacterianos seleccionados. En estos casos, debera seleccionarse un antimicrobiano representativo que
nos permita pronosticar la sensibilidad de otros miembros de la misma clase,

iv)

Ciertos microorganismos pueden ser intrnsecamente resistentes a clases de antimicrobianos concretas;

por tanto, es innecesario y engaoso probar ciertos agentes para actividad in-vitro. Debe determinarse el
tipo de resistencia intrnseca para dichos microorganismos bien sea a partir de la literatura cientfica o a
travs de pruebas.

v)

Debe limitarse el nmero de antimicrobianos a probar con el fin de garantizar la relevancia y la

practicabilidad de la AST.

Se recomienda una revisin peridica de los microorganismos que actualmente son previsiblemente sensibles a
ciertos agentes antimicrobianos para garantizar la deteccin de una resistencia inesperada cuando esta ocurra.
Tambin puede sospecharse la presencia de resistencia despus de una respuesta escasa a un rgimen de
tratamiento antimicrobiano estndar.

3.

Metodologa de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

Deben tenerse en cuenta las siguientes exigencias:

i)

Las bacterias sometidas a ensayo deben aislarse en cultivo puro a partir de las muestras enviadas,

ii)

Se deben utilizar mtodos de referencia estndar para la identificacin, de modo que las bacterias
estudiadas puedan ser identificadas de forma correcta y lgica hasta el nivel de gnero y/o especie,

iii)

Los aislamientos bacterianos considerados ms importantes y una muestra de otros aislamientos, deben
ser guardados para ulteriores anlisis (mediante liofilizacin o conservacin en fro entre 70 y 80C).

Los siguientes factores, que influyen en los ensayos AST, deben ser determinados, optimizados y documentados
en un detallado procedimiento operativo estndar.
i)

Una vez aislada la bacteria en cultivo puro, debe determinarse la concentracin ptima del inculo para
obtener resultados de sensibilidad precisos. Tanto las bacterias como otros microorganismos utilizados en
las pruebas AST, deben proceder de un cultivo fresco.

ii)

La composicin y preparacin de los medios slidos y lquidos utilizados (en cuanto al pH, cationes, timidina
o timina, o el uso de medios de cultivo suplementados). Tambin se deben determinar y documentar las
pruebas de realizacin y esterilidad de los lotes de medios, as como los procedimientos empleados.

iii)

El contenido de la sustancia antimicrobiana en la forma de suministro utilizada (antibiticos utilizados en

placas de microtitulacin, en disco, en tira o en tableta).

iv)

La composicin de los disolventes y diluyentes empleados en la preparacin de las soluciones stock de

antimicrobianos.

v)

Las condiciones de crecimiento e incubacin (tiempo, temperatura, tipo de atmsfera, por ejemplo
presencia de CO2).

vi)

Concentracin del agar como agente solidificante.

vii)

Nmero de concentraciones ensayadas para cada caldo y dilucin de agar.

vii)

Los controles de las pruebas que deben utilizarse, incluyendo los microorganismos de referencia utilizados.

ix)

Los criterios de interpretacin posteriores.

Por estos motivos, se debe destacar la especial importancia de los procedimientos documentados utilizados y de
los mtodos validados y bien documentados, ya que slo puede lograrse una reproducibilidad adecuada
mediante el uso de dicha metodologa.

4.

Seleccin de la metodologa para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos

La seleccin de una metodologa apropiada para determinar la sensibilidad frente a los antimicrobianos debe
estar basada en los siguientes principios:

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

i)

Facilidad de realizacin

ii)

Flexibilidad

iii)

Adaptacin a los sistemas automatizados o semiautomatizados

iv)

Coste

v)

Reproducibilidad

vi)

Fiabilidad

vii)

Exactitud

viii) Mcroorganismos y antimicrobianos que sean de inters en ese particular pas miembro de la OIE.
ix)

Disponibilidad de datos de validacin apropiados para la variedad de microorganismos cuya sensibilidad se

ha de ensayar.

5.

Mtodos para probar la sensibilidad a los antimicrobianos

Los tres mtodos que se citan a continuacin son los nicos que suministran resultados significativamente
reproducibles (14, 15):
i)

Difusin en disco

ii)

Dilucin en medio lquido

iii)

Dilucin en medio slido con agar

a)

Mtodo de difusin en disco

La difusin en disco hace referencia a la difusin que experimenta un agente antimicrobiano a una
determinada concentracin a partir de discos, tiras o tabletas, que se depositan en un medio de cultivo
slido que ha sido sembrado con el aislamiento del inculo seleccionado en cultivo asptico (vase la
seccin 3i). El mtodo de difusin en disco se basa en la determinacin de una zona de inhibicin del
crecimiento que es proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente al antimicrobiano presente en el
disco.
La difusin de un antimicrobiano en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia
antimicrobiana. Cuando su concentracin llega a ser tan diluida que no logra inhibir el crecimiento de la
bacteria ensayada, termina la zona de inhibicin. El dimetro de esta zona de inhibicin alrededor del disco
antimicrobiano se corresponde con la concentracin mnima inhibitoria (MIC) para esa combinacin
concreta de bacteria y antimicrobiano. En otras palabras, la zona de inhibicin se correlaciona de modo
inversamente proporcional con el valor de la MIC para la bacteria ensayada. En general, cuanto mayor es la
zona de inhibicin, menor es la concentracin del antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento
de los microorganismos. No obstante, esto depende tambin de la concentracin del antibitico en el disco
y de su capacidad de difusin.
Hay que advertir que las pruebas de difusin en disco basadas solamente en la presencia o ausencia de
una zona de inhibicin, sin considerar su tamao, no son aceptables como ensayos para la sensibilidad a
los antimicrobianos desde el punto de vista metodolgico.

Consideraciones sobre el uso de la tcnica de difusin en disco

La difusin en disco es fcil de realizar, reproducible, y no requiere disponer de una infraestructura cara.
Sus principales ventajas son:
i)

Bajo coste

ii)

Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando as se requiera.

iii)

Se puede utilizar como una prueba de deteccin frente a gran nmero de aislamientos.

iv)

Se puede identificar a un subconjunto de aislamientos para pruebas posteriores por otros mtodos,
como la determinacin de las MIC.

La medicin manual de las zonas de inhibicin puede llevar un tiempo excesivo. Sin embargo, existen
dispositivos automticos que permiten leer las zonas y que pueden integrarse en sistemas de
procesamiento de datos y de informes de laboratorio. Los discos deben distribuirse equitativamente de
forma que las zonas de inhibicin alrededor de los discos antimicrobianos en la prueba de difusin en disco
no se solapen hasta tal punto que no pueda determinarse la zona de inhibicin. Generalmente esto se
puede conseguir si los discos no estn a ms de 24 mm. desde el centro de un disco al centro del otro,

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

aunque esto depende de la concentracin de los discos y de la capacidad del antimicrobiano para
difundirse en agar.

b)

Mtodos de dilucin en un medio lquido y en un medio slido

La finalidad de estos mtodos es determinar la concentracin ms baja del antimicrobiano ensayado que es
capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria analizada (MIC, concentracin mnima inhibitoria, que
normalmente se expresa en mililitros o miligramos/litro). Sin embargo, la MIC no siempre representa un
valor absoluto. La "verdadera" MIC es un punto que se encuentra entre la concentracin ms baja del
ensayo que inhibe el crecimiento de la bacteria y la siguiente concentracin ms baja del ensayo. Por tanto,
se puede considerar que las determinaciones de la MIC utilizando una serie de diluciones tienen una
variacin inherente de una dilucin.
El rango de los antimicrobianos debera abarcar tanto los criterios de interpretacin (sensibilidad, valor
intermedio y resistencia) para una combinacin especfica entre bacteria y antibitico como los
microorganismos de referencia apropiados para el control de calidad.
Los mtodos para determinar la sensibilidad a los antimicrobianos que se basan en diluciones parecen ser
mas reproducibles y fciles de cuantificar que los basados en difusin. Sin embargo, los antibiticos se
ensayan normalmente mediante diluciones seriadas reduciendo la concentracin a la mitad, lo que puede
originar datos inexactos relativos a la MIC.
Cualquier laboratorio que pretenda usar un mtodo de dilucin y utilizar sus propios reactivos y diluciones
de antibiticos debera tener la capacidad de obtener, preparar y mantener un stock de soluciones de
antimicrobianos con una pureza adecuada y generar diluciones de trabajo de modo regular. Por
consiguiente, es importante que tales laboratorios usen microorganismos de control garantizado (ver ms
adelante) para asegurar la precisin y estandarizacin en sus procedimientos.

Dilucin en caldos de cultivo

La dilucin en medio lquido es una tcnica en la que se prueba una suspensin de bacterias de una
concentracin predeterminada, ptima y apropiada frente a varias concentraciones de un agente
antimicrobiano (normalmente mediante diluciones seriadas dobles) en un medio lquido de formulacin
documentada y predeterminada. El mtodo se puede realizar tanto en tubos con un contenido mnimo de
2 ml (macrodilucin) como en volmenes ms pequeos, utilizando placas de microtitulacin
(microdilucin). Existen en el mercado varios tipos de placas de microtitulacin que contienen antibiticos
prediluidos dentro de los pocillos de las placas. El uso de lotes idnticos de estas placas de microtitulacin
puede ayudar a reducir al mnimo la variacin que puede surgir durante la preparacin y dilucin de los
antimicrobianos que proceden de diferentes laboratorios. Dicho uso, junto a un protocolo de prueba
documentado, que incluya la especificacin de los microorganismos de referencia apropiados, facilitar la
equivalencia de resultados entre laboratorios.
Debido a que en la actualidad la mayor parte de las pruebas para antimicrobianos mediante microdilucin
en medio lquido se preparan comercialmente, este mtodo es menos flexible que el basado en la dilucin
en medio slido o en la difusin en disco en cuanto a su capacidad para admitir cambios necesarios
derivados del programa de control y seguimiento.
Como la compra de placas antimicrobianas y de la infraestuctura necesaria puede ser costosa, esta
metodologa no es viable para algunos laboratorios.

Dilucin en medio slido

La dilucin en medio slido implica la incorporacin de concentraciones variadas de agentes

antimicrobianos, en un medio solidificado con agar, utilizando generalmente diluciones seriadas dobles y la
aplicacin de un inculo bacteriano definido a la superficie de la placa que contiene el agar. A menudo, los
resultados derivados de estos ensayos se consideran como los ms fiables para la determinacin del valor
MIC para una determinada combinacin bacteria/antimicrobiano en una prueba concreta.
Las ventajas de los mtodos de dilucin en medio slido son:
i)

La capacidad de ensayar simultneamente varias bacterias, excepto las que se acumulan, en una
misma placa de medio con agar.

ii)

La mejora potencial en cuanto a la determinacin de valores MIC por extensin del rango de
concentraciones del antimicrobiano.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

iii)

La posibilidad de semi-automatizar el procedimiento mediante la utilizacin de un replicador del

inculo. Existen en el mercado unos replicadores de los inculos que pueden transferir entre 32 y
36 inculos bacterianos diferentes a cada una de las placas con medio slido.

Los mtodos de dilucin en medio slido tienen algunos inconvenientes; por ejemplo:
i)

Si no estn automatizados, son muy laboriosos y requieren importantes recursos econmicos y

tcnicos.

ii)

Una vez preparadas las placas deben utilizarse al cabo de una semana.

iii)

Los puntos finales no son siempre fciles de determinar ni resulta fcil verificar la pureza del inculo.

La dilucin en medio slido se recomienda a menudo como un ensayo estandarizado para medir la
sensibilidad a los antimicrobianos de microorganismos difciles de cultivar (8), como es el caso de los
anaerobios y las especies Helicobacter y Campylobacter.

c)

Otras pruebas para determinar la sensibilidad de las bacterias y la resistencia a los

antimicrobianos especficos
Las concentraciones mnimas inhibitorias de los antimicrobianos para bacterias se pueden obtener tambin
mediante tiras de gradientes disponibles en el mercado que permiten la difusin de una concentracin de
antibitico predeterminada. Sin embargo, el uso de tiras de gradientes puede ser muy caro y originar
discrepancias en cuanto a la MIC cuando se prueban ciertas combinaciones de bacterias con
antimicrobianos y se comparan con las obtenidas mediante dilucin en medio slido (2, 5).
Cualquiera que sea el mtodo usado, los procedimientos deberan documentarse detalladamente para
lograr resultados exactos y reproducibles. Cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos se necesita probar tambin los microorganismos de referencia apropiados para asegurarse
de la exactitud de los resultados.
La eleccin apropiada del sistema para determinar la sensibilidad depender, en ltimo trmino, de las
propiedades del crecimiento de la bacteria en cuestin. En circunstancias especiales, pueden resultar
adecuados nuevos mtodos para la deteccin de fenotipos de resistencia particulares. Por ejemplo,
pruebas basadas en cefalosporinas cromognicas (8) (como nitrocefin), pueden revelar resultados rpidos y
fiables sobre determinacin de beta-lactamasas en algunas bacterias, ya que la resistencia inducible a la
clindamicina en Staphylococcus spp. puede detectarse utilizando el mtodo de difusin en disco empleando
discos de cindamicina y eritromicna estndar en posiciones adyacentes y midiendo las zonas de inhibicin
resultantes (como la zona D) (18).
De modo similar, puede detectarse un amplio espectro de actividad beta-lactamasa (8) en algunas bacterias
mediante mtodos estndar de sensibilidad por difusin en disco incorporando cefalosporinas especficas
(cefotaxima y ceftazidima) en combinacin con un inhibidor de beta-lactamasas (como el cido clavulnico),
y midiendo las zonas de inhibicin resultantes. Adems, la resistencia al cloranfenicol atribuible a la
produccin de cloranfenicol-acetil transferasa se puede detectar en algunas bacterias mediante pruebas
rpidas en un tubo o en papel de filtro en cuestin de 12 horas (8). Tambin puede detectarse la protena
2a (PBP 2a) de unin a la penicilina en estafilococos resistentes a la meticilina con una prueba de
aglutinacin en latex.

d)

Perspectivas de futuro en la deteccin de la sensibilidad/resistencia a los antimicrobianos

Se ha fomentado el uso de enfoques genotpicos para la deteccin de los genes de resistencia a los
antimicrobianos como una forma de aumentar la rapidez y precisin de las pruebas de sensibilidad (3). Se
han desarrollado numerosos ensayos basados en el ADN para detectar la resistencia bacteriana gentica a
los antibiticos. El ms novedoso y quizs el ms moderno de los enfoques es predecir los fenotipos de
resistencia a los antimicrobianos por la via de la identificacin y la caracterizacin de los genes conocidos
que codifican los mecanismos de resistencia especficos.
Los mtodos que utilizan la genmica comparativa, pruebas genticas, micromatrices, tnicas de
amplificacin de cido nuclico (como la reaccin en cadena de la polimerasa [PCR]), y la secuenciacin
del ADN, ofrecen la promesa de un aumento de la sensibilidad, especificidad y velocidad en la deteccin de
genes de resistencia especfica conocidos (3, 4, 10). Los mtodos genotpicos se han aplicado con xito
para suplementar los mtodos fenotpicos de AST tradicionales para otros microorganismos, incluidos los
estafilococos resistentes a la meticilina, los enterococos resistentes a la vancomicina y la deteccin de las
mutaciones de la resistencia a la fluoroquinolona (3, 4, 10). Se han descrito tambin los mtodos de la PCR
para las betalactamasas, enzimas inactivadores de aminoglucsido, y los genes de eflujo de la tetracilina (4,
10).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

Las innovaciones tecnolgicas en los diagnsticos basados en el ADN pueden permitir la deteccin de
genes de resistencia mltiples y/o sus variantes durante la misma prueba. El desarrollo de los mtodos de
identificacin diagnstica rpidos y de las pruebas genotpicas de resistencia ayudar a disminuir la
aparicin de la resistencia a los antimicrobianos, haciendo posible el uso de los antimicrobianos ms
apropiados cuando se inicia la terapia. Sin embargo, est por demostrar que las tcnicas de ADN sean
complementarias a los mtodos y resultados de las AST.
Adems, los nuevos avances tecnolgicos pueden incrementar la capacidad de detectar especies
bacterianas para un gran nmero de genes de resistencia antibacteriana de forma rpida y barata,
proporcionando de esta forma, datos adicionales relevantes para los programas de supervisin y vigilancia.
Sin embargo, a pesar de la nueva influencia de las pruebas genotpicas, en un futuro inmediato se
requerirn los mtodos de AST fenotpicos documentados y consensuados para detectar los mecanismos
de resistencia que aprecen entre los patgenos bacterianos.

6.

Puntos crticos de la sensibilidad a los antimicrobianos y criterios relativos a la zona de

inhibicin

El objetivo de las AST in vitro es predecir el modo en que un patgenos bacteriano puede responder al agente
antimicrobiano in vivo. Los resultados generados por dichas pruebas, independientemente de si se usan mtodos
de difusin o de dilucin, son generalmente interpretados y descritos como resistentes, sensibles o con efecto
intermedio respecto a la accin de un antimicrobiano concreto. No se ha establecido ninguna frmula para la
seleccin de los puntos crticos ptimos. El proceso incluye una revisin de los datos existentes y est influido
por la subjetividad de los individuos encargados de la seleccin de los puntos crticos apropiados.
Generalmente, los puntos crticos de sensibilidad a los antimicrobianos los establecen organizaciones
nacionales, sociedades profesionales o las agencias reguladoras. Deberan consultarse los documentos
pertinentes. No obstante, pueden existir notables diferencias en relacin con un mismo agente antimicrobiano,
dentro de un pas y entre diferentes pases, debido a diferencias entre las organizaciones que fijan los
estndares y las agencias reguladoras y debido a decisiones nacionales o regionales sobre los sistemas de
dosificacin (6).
Como se ha indicado previamente, los resultados de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos deberan
expresarse cuantitativamente:
i)

como distribucin de concentraciones mnimas inhibitorias en miligramos por litro o mg/ml.

ii)

o como dimetros de zonas de inhibicin en milmetros.

Los dos siguientes factores son importantes para interpretar si una bacteria es sensible o resistente a un agente
antimicrobiano:
i)

El desarrollo y establecimiento de intervalos de control de calidad (8), usando siempre que sea posible
pruebas de difusin y pruebas de dilucin para microorganismos de control de calidad.
El establecimiento de rangos de control de calidad resulta esencial para validar los resultados de las
pruebas obtenidas mediante la utilizacin de mtodos especficos de sensibilidad a los antimicrobianos. Los
rangos de categora de interpretacin permisibles para los microorganismos de referencia deberan
establecerse antes de determinar los puntos crticos de sensibilidad o de resistencia. El uso de
microorganismos de referencia es una actividad de control de calidad y de garanta de la calidad. Sin
embargo, slo es necesario exigir el uso de microorganismos de referencia.

ii)

La determinacin de criterios de interpretacin apropiados relativos al establecimiento de los puntos crticos

(8).
Esto implica la generacin de tres tipos de datos diferentes:

distribucin poblacional de valores MIC para los microorganismos relevantes

parmetros farmacocinticos y farmacodinmicos del agente antimicrobiano

resultados de ensayos clnicos y experiencia

La interpretacin de los datos incluye la creacin de un diagrama de puntos a partir de la distribucin de la

poblacin bacteriana (especies bacterianas representativas), representando la zona de inhibicin frente al
logaritmo en base 2 del valor de la MIC para cada patgeno bacteriano. La seleccin de puntos crticos se
basar en mltiples factores, incluyendo el anlisis de la lnea de regresin que correlacione los valores MIC y

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

los dimetros de la zona de inhibicin, distribucin de poblaciones bacterianas, lmites de error, farmacocintica
y, finalmente, la verificacin clnica.
El desarrollo del concepto de "puntos crticos microbiolgicos" o puntos lmite epidemiolgicos, que se basa en
las distribuciones poblacionales de la especie bacteriana concreta comprobada, puede ser ms adecuado para
algunos programas de control. En este caso los aislamientos de las bacterias que se desvan de la poblacin
sensible normal del tipo de campo, se deberan considerar resistentes, y los cambios de sensibilidad en una
combinacin especfica entre un antimicrobiano y una bacteria podran ser objeto de seguimiento (12). Existe una
gran ventaja en el registro de los datos de sensibilidad cuantitativos, ya que dichos datos pueden analizarse de
acuerdo con los puntos crticos clnicos as como utilizando los valores lmite epidemiolgicos.

7.

Directrices para las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

Se dispone actualmente de varias directrices y estndares en el mundo (6) para las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos y para los correspondientes criterios de interpretacin de las pruebas. Entre otras, se incluyen
las directrices y las referencias publicadas por:
Instituto de Estndares Clnicos y de Laboratorio (CLSI/NCCLS, EE. UU.)
Sociedad Britnica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC, Reino Unido)
Comit de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiologa (CASFM, Francia)
Grupo Suizo de referencia para antibiticos (SIR, Suiza)
Instituto Alemn de Normativas (DIN, Alemania)
Sociedad Japonesa de Quimioterapia (JSC, Japn)
Commissie richtlijnen gevoeligheidsbepalingen (CRG, Pases Bajos)
Hasta ahora, slo el CLSI/NCCLS ha desarrollado protocolos para los ensayos de sensibilidad de las bacterias
aisladas en los animales y ha determinado criterios interpretativos (8). Sin embargo, existen protocolos y
directrices disponibles de varias organizaciones y sociedades profesionales (como el Instituto de Estndares
Clnicos y de Laboratorio, la Sociedad Britnica de Quimioterapia Antimicrobiana, la Sociedad Japonesa de
Quimioterapia [JSC], el Grupo Suizo de Referencia para Antibiticos [SIR], el Instituto Alemn de Normativas, el
Comit de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiologa, el Commissie richtlijnen
gevoeligheidsbepalingen, y otros) sobre pruebas de sensibilidad para especies bacterianas afines que causan
infecciones en los humanos. Es posible que se puedan adoptar tales directrices para las pruebas de sensibilidad
de las bacterias aisladas en los animales pero cada pas debe evaluar sus propias directrices y pautas de
estandarizacin. Adems, estn progresando determinados esfuerzos encaminados a estandarizar y homologar
a escala internacional los puntos crticos de sensibilidad y resistencia. Estos esfuerzos inciden principalmente en
la adopcin de los estndares y directrices del CSLI, que contempla la existencia de laboratorios con mtodos y
valores de control de calidad que permiten establecer comparaciones sobre las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos y sobre los datos generados (8, 16). Para los pases miembros de la OIE que no tienen mtodos
de determinacin de sensibilidad estandarizados en su pas, la adopcin de los estndares del CSLI debera ser
un paso inicial apropiado hacia mtodos aceptables y hacia la armonizacin.
Como primer paso hacia una comparacin de los datos de seguimiento y control, se anima a los pases
miembros a disear un programa homologado y estandarizado (14). Los datos procedentes de pases que usan
otros diseos metodolgicos y de programa pueden no ser directamente comparables (7. 14). A pesar de esto,
los datos acumulados a lo largo del tiempo en un determinado pas pueden servir al menos para permitir la
deteccin de apariciones de resistencia microbiana o de tendencias en la prevalencia de sensibilidad y
resistencia en dicho pas (11). No obstante, si se presentan juntos los resultados que se han obtenido con
diferentes mtodos, debe demostrarse que es posible la comparacin de los resultados y que se puede alcanzar
un consenso interpretativo.
Nota: Esto podr llevarse a cabo ms fcilmente utilizando mtodos de determinacin de la sensibilidad a los
antimicrobianos que sean exactos, fiables y documentados, junto con un seguimiento operativo de la aplicacin
de dichos ensayos mientras se utilizan microorganismos de referencia bien descritos entre los laboratorios
participantes.

8.

Comparacin de resultados

Para determinar la comparacin de resultados que se originan en diferentes sistemas de vigilancia, deben ser
cuantitativos y deben incluir informacin sobre el funcionamiento de los mtodos, los microorganismos de
referencia y los antimicrobianos.
Los datos de las pruebas de sensibilidad frente a los antimicrobianos, que consisten en un resumen de patrones
de sensibilidad anteriores y en curso (antibiogramas) entre microorganismos clnicamente importantes y de
vigilancia, deben crearse, registrarse y analizarse peridicamente a intervalos regulares (9). Los datos tambin

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

deben presentarse de forma clara y coherente a fin de poder identificar los patrones nuevos de resistencia y
puedan confirmarse o refutarse los hallazgos atpicos. Estos datos deben estar disponibles en un banco central
de datos y deben publicarse anualmente.
Los datos acumulativos de AST sern tiles para la monitorizacin de las tendencias de resistencia/sensibilidad
en una regin a lo largo del tiempo y para la valoracin de los efectos de las intervenciones para disminuir la
resistencia a los antimicrobianos.

9.

Control de la calidad y de la seguridad de la calidad

Los laboratorios que realizan determinaciones de sensibilidad a antimicrobianos deberan establecer sistemas
adecuados para lograr tanto control de la calidad como seguridad de la calidad.
i)

El control de la calidad se refiere a las tcnicas operativas que se utilizan para garantizar la precisin y
reproducibilidad de las AST.

ii)

Control de la calidad.

Deben determinarse y verificarse los siguientes componentes:

i)

La precisin del procedimiento de las AST

ii)

La exactitud del procedimiento de las AST

iii)

Las aptitudes, competencia y habilidad del personal del laboratorio, as como del personal que interpreta los
resultados y de aquellos que estn involucrados en la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos.

iv)

El funcionamiento de los reactivos apropiados.

Tambin deberan respetarse las siguientes exigencias:

i)

El estricto cumplimiento de las tcnicas especificadas y documentadas junto a un control de calidad (i.e.
seguridad en la realizacin y otros criterios crticos) de los medios y reactivos.

ii)

Mantener registro de:

Los nmeros de lote de todos los materiales y reactivos adecuados

Las fechas de caducidad de todos los materiales y reactivos

La calibracin y la vigilancia del equipo

Las especificaciones crticas del procedimiento de las AST (resultados de referencia, tiempo,
temperatura, etc.)

iii)

Siempre deben utilizarse los microorganismos de referencia independientemente del mtodo utilizado para
la determinacin de la sensibilidad.

iv)

Los microorganismos de referencia se deben obtener de una fuente fiable, por ejemplo de la Coleccin de
Cultivos tipo Americano (ATCC), de fuentes comercialeas fiables, o instituciones con fiabilidad demostrada
para almacenar y usar los microorganismos correctamente.

v)

Los microorganismos de referencia deben ser catalogados y bien descritos incluyendo los fenotipos de
sensibilidad a los antimicrobianos definidos en firme. Los registros relacionados con estos microorganismos
de referencia deben incluir tambin los lmites de sensibilidad y resistencia establecidos de los
antimicrobianos que se van a probar, y la referencia al mtodo o mtodos por medio de los cuales se
determinaron.

vi)

Los laboratorios involucrados en las AST deben utilizar los microorganismos de referencia apropiados en
todas las pruebas AST.

vii)

Las cepas de referencia deben mantenerse en cultivos stock de los que se puedan derivar subcultivos de
trabajo y deben proceder de colecciones de cultivos nacionales o internacionales. Las cepas bacterianas de
referencia deben mantenerse en los laboratorios centrales o los regionales designados al efecto. Los
cultivos de trabajo no deben ser subcultivados diariamente ya que esto introduce contaminacin y el
mtodo de produccin de cultivos de trabajo debe garantizar que a penas se utilicen los cultivos stock. Esto
puede lograrse con la produccin de un stock de cultivos intermedio derivados de los cultivos originales que
se utilizan comprobar diariamente los cultivos de trabajo.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

viii) El mejor mtodo para analizar en su conjunto las realizaciones de cada laboratorio debe probar el stock de
trabajo de los microorganismos de referencia apropiados cada da que se lleven a cabo pruebas de
sensibilidad.
Como esto no siempre resulta fcil o econmico, puede disminuirse la frecuencia de tales ensayos si el
laboratorio puede demostrar que los resultados de las pruebas con los microorganismos de referencia
utilizando el mtodo seleccionado son reproducibles. Si aparecen asuntos relacionados con la exactitud, la
reproducibilidad o la validez del mtodo, el laboratorio tiene la responsabilidad de determinar las causas y
repetir las pruebas utilizando los materiales de referencia. Dependiendo de la causa o causa, puede
reiniciarse el material de referencia utilizado diariamente y cualquier otra accin correctiva.
ix)

Cada vez que se inicie el empleo de un nuevo lote de medio de cultivo o de placas, y de forma peridica, se
deberan probar los microorganismos de referencia en paralelo con los microorganismos a estudiar.

x)

Se debe tener en cuenta la adopcin de medidas adecuadas de bioseguridad cuando se reciban o se

enven los microorganismos a los laboratorios participantes.

10. Pruebas externas de capacitacin

Para asegurar que los datos de la sensibilidad a los antimicrobianos que se describen son de hecho correctos,
los pases miembros de la OIE deberan llevar a cabo un programa de pruebas de capacitacin entre los
laboratorios. Estas pruebas de habilitacin pueden desarrollarse a nivel nacional. Se invita tambin a que los
laboratorios de pases miembros participen en las comparaciones internacionales entre diferentes laboratorios
(como Enter-Net) (6). Deberan tenerse en cuenta todas las especies bacterianas sometidas a AST.
Cada pas debera designar o establecer laboratorios nacionales o de referencia responsables de:
i)

Verificar los programas de seguridad sobre la calidad de los laboratorios que participan en el control y
seguimiento de las resistencias frente a los antimicrobianos

ii)

Describir y suministrar a dichos laboratorios un lote de microorganismos

iii)

creacin, gestin y distribucin de muestras para su uso en pruebas de competencia externa

iv)

Crear una base de datos centralizada, disponible en Internet (p. ej. European Antimicrobial Resistance
Surveillance System [EARSS]) que contenga los diferentes perfiles de sensibilidad/resistencia de cada
especie bacteriana bajo vigilancia.

11. Conclusin
Aunque existe una variedad de mtodos, el objetivo de la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos in-vitro es
el mismo: proporcionar un predictor fiable de cmo es probable que un microorganismo responda a la terapia
antimicrobiana en el hospedador infectado. Este tipo de informacin ayuda al clnico en la seleccin de los
agentes antimicrobianos apropiados, proporciona datos para la vigilancia y ayuda al desarrollo de las polticas de
uso de antimicrobianos.
Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos in-vitro pueden realizarse utilizando una variedad de formatos;
los ms comunes son la difusin en disco, la dilucin en medio slido, la macrodilucin en caldo, microdilucin en
caldo y la prueba de gradiente de concentracin (p.ej., E test). Cada uno de estos procedimientos requiere el
uso de las condiciones de la prueba y mtodos especficos, incluyendo el medio, las condiciones y los tiempos
de incubacin, y la identificacin de microorganismos de control de calidad apropiados junto con sus rangos de
QC especficos. Es esencial que los mtodos AST proporcionen resultados reproducibles en el uso diario del
laboratorio y que los datos sean comparables con los resultados obtenidos mediante un mtodo de referencia
(norma de oro) reconocido. En ausencia de mtodos estandarizados o de procedimientos de referencia, los
resultados de resistencia y sensibilidad a los antimicrobianos de diferentes laboratorios no se pueden comparar
de manera fiable.
Tambin se ha fomentado el uso de enfoques genotpicos para la deteccin de los genes de resistencia a los
antimicrobianos como una manera de aumentar la rapidez y la precisin de las pruebas de sensibilidad. Adems,
los nuevos avances tecnolgicos pueden facilitar la capacidad de probar especies bacterianas para una gran
cantidad de genes de resistencia a los antimicrobianos de forma rpida y barata, y, en consecuencia,
proporcionar datos adicionales relevantes para los programas de vigilancia y supervisin. A pesar de la cantidad
de nuevas pruebas genotpicas, los mtodos AST fenotpicos estandarizados seguirn siendo necesarios en un

10

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

futuro inmediato para detectar los mecanismos de resistencia que van apareciendo entre los patgenos
bacterianos.

REFERENCIAS
1.

ANTHONY F.,
VAN VUUREN

ACAR J., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELLFALL E.J., VOSE D.,
M. & WHITE D.G. (2001). Antimicrobial resistance: responsible and prudent use of antimicrobial
agents in veterinary medicine. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 829839.

2.

BROWN D.F. & BROWN L. (1991). Evaluation of the E-test, a novel method of quantifying antimicrobial activity.
J. Antimicrob. Chemother., 26, 185190.

3.

CAI H.Y., ARCHAMBAULT M., GYLES C.L. & PRESCOTT J.F. (2003). Molecular genetic methods in the veterinary
clinical bacteriology laboratory: current usage and future applications. Anim. Health Rev., 4, 7393.

4.

CHEN S., ZHAO S., MCDERMOTT P.F., SCHROEDER C.M., WHITE D.G. & MENG J. (2005). A DNA microarray for
identification of virulence and antimicrobial resistance genes in Salmonella serovars and Escherichia coli.
Mol. Cell. Probes, 19, 195201.

5.

WALKER R.D., WHITE D.G., ZHAO S., MCDERMOTT P.F. & MENG J. (2002). Comparison of Etest and agar
dilution for in vitro antimicrobial susceptibility testing of Campylobacter. J. Antimicrob. Chemother., 50, 487
494.

6.

KAHLMETER G., BROWN D.F.J., GOLDSTEIN F.W., MACGOWAN A.P., MOUTON J.W., OSTERLUND A., RODLOFF A.,
STEINBAKK M., URBASKOVA P. & VATOPOULOS A. (2003). European harmonization of MIC breakpoints for
antimicrobial susceptibility testing of bacteria. J. Antimicrob. Chemother., 52, 145148.

7.

LEEGARD T.M., CAUGANT D.A., FROHOLM L.O. & HOIB, E.A. (2000). Apparent differences in antimicrobial
susceptibility as a consequence of national guidelines. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 6, 290293.

8.

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M31-A2.
Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from
Animals, Approved Standard, Second Edition. NCCLS document M31-A2. NCCLS, 940 West Valley Road,
Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 80 pp.

9.

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M39-A. Analysis and
Presentation of Cumulative Antimicrobial Susceptibility Test Data; Approved Guideline. NCCLS document
M39-A. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 30 pp.

10. PERRETEN V., VORLET-FAWER L., SLICKERS P., EHRICHT R., KUHNERT P. & FREY J. (2005). Microarray-based
detection of 90 antibiotic resistance genes of gram-positive bacteria. J. Clin. Microbiol., 43, 22912302.
11. PETERSEN A., AARESTRUP F.M., HOFSHAGEN M., SIPILA H., FRANKLIN A. & GUNNARSSON E. (2003).
Harmonization of antimicrobial susceptibility testing among veterinary diagnostic laboratories in five Nordic
countries. Microb. Drug Resist., 9, 381388.
12. RINGERTZ S., OLSSON-LILJEQUIST B., KAHLMETER G. & KRONVALL G. (1997). Antimicrobial susceptibility testing
in Sweden II. Species-related zone diameter breakpoints to avoid interpretive errors and guard against
unrecognised evolution of resistance. Scand. J. Infect. Dis. (Suppl.), 105, 812.
13. STEPANOVIC S., HAUSCHILD T., DAKIC I., AL-DOORI Z., SVABIC-VLAHOVIC M., RANIN L. & MORRISON D. (2006).
Evaluation of phenotypic and molecular methods for detection of oxacillin resistance in members of the
Staphylococcus sciuri group. J. Clin. Microbiol., 44, 934937.
14. THRELFALL E.J., FISHER I.S.T., WARD L., TSCHAPE H. & GERNER-SMIDT P. (1999). Harmonization of antibiotic
susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the
European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist., 5, 195199.
15. WALKER R.D. (2000). Antimicrobial susceptibility testing and interpretation of results. In: Antimicrobial
Therapy in Veterinary Medicine, Prescott J.F., Baggot J.D., Walker R.D., eds. Ames, IA, Iowa State
University Press, 1226.
16. WHITE D.G., ACAR J., ANTHONY F., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELFALL
J.E., VOSE D., VAN VUUREN M., WEGENER H., & COSTARRICA L. (2001). Standardisation and harmonisation of

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11

Captulo 1.1.6 Mtodos de laboratorio para los ensayos de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos

laboratory methodologies for the detection and quantification of antimicrobial resistance. Rev. Sci. Tech. Off.
int. Epiz., 20, 849858.
17

WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2003). OIE International Standards on Antimicrobial
Resistance. OIE, Paris, France.

18. ZELAZNY A.M., FERRARO M.J., GLENNEN A., HINDLER J.F., MANN L.M., MUNRO S., MURRAY P.R., RELLER L.B.,
TENOVER F.C. & JORGENSEN J.H. (2005). Selection of strains for quality assessment of the disk induction
method for detection of inducible clindamycin resistance in staphylococci: a CLSI collaborative study. J. Clin.
Microbiol., 43, 26132615.

*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la resistencia a los antimicrobianos (vase el cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese una lista ms actualizada en la pgina web de la OIE:
www.oie.int).

12

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008