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Reinhard Renneberg
Darja SBbier (Ilustraciones)

BIOTECNOLOGA
PARA PRINCIPIANTES

Q
'W'

EDITO RIAL
REV ERT

Barcelona Bogot Buenos Aires Caracas Mxico


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Registro bibliogrfico (lseo)

Renneberg, Reinhard
[Biotechnologie fr Einsteiger. Espaol]
Biotecnologa para principiantes I Reinhard Renneberg ; [vers in espaola por Josep Joan Centelles y Magdalena Ferrer Peralta].
Barcelona : Revert, (2008]
XI, 300 p. : il. col. ; 28 cm.
Traduccin de: Biotechnologie fr Einsteiger. - Bibliografia. nd ice
l. Biotecnologa. l. Centelles Serra, Josep Joan, trad. Il. Ferrer Peralta, Magdalena, trad. III. Ttulo.

66

Ttulo de la obra original:


Biotechnologle fr Einsteiger
Versin original publicada en lengua alemana:
Elsevler GmbH, Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Germany
Copyright 2004 Elsvier GmbH, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Versin espaola por:


Dr. Josep J oan Centelles
Profesor Titular de Bioqumica y Biologa Molecular
Universidad de Barcelona

y
Magdalena Ferrer Peralta
Traductora diplomada de ingls y alemn
Universidad Autnoma de Barcelona
MAQUETACIN: REVERT-AGUILAR, S. L.

Edicin en espaol:
Editorial Revert, S. A., 2008

Propiedad de:
EDITORIAL REVERT, S . A. Barcelona. ESPAA

Esta obra ha sido publicada con una subvencin de la Direccin General del Libro, Archivos y Bibljotecas del Millisterio de
Cultura, para su prstamo pblico en Bibliotecas Pblicas, de acuerdo con lo previsto en el artculo 37.2 de la Ley de Propiedad
Intelectual.
Impreso en Espaf'a - Printed in Spain

Impreso por Alvagraf


La Llagosta (Barcelona).

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LA SUERTE FAVORECE
AL ESPRITU PREPARADO.
Louls Pasteur

A mis maravillosos
padres, llse y Herbert
Rennenberg, dedicado
con amor y
agradecimiento

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COLABORADORES

Colaboraciones en todo el libro


Francesco Bennardo, Llceo Scientifico S. Valentini,
Castr0libero, Cosenza
Davd S. Goodsell, The Scripps Research lnstitute,
LaJolla
Oliver Kayser, Rijksuniversiteit Groningen
Oliver Ullrich, Hochschule fr Angewandte
Wissenschaften Hamburg

Colaboraciones en captulos
individuales
Rlta Bemhardt, Universitat des Saarlandes, Saarbrcken
Uwe Bornscheuer, ErnstMoritzArndt-Universitat,
Grelfswald
George Cautherley, R&C Biogenius Hong Kong
Ananda Chakrabarty, University of lllinois
Arnold L. Demain, Drew University, Madison
Theodor Dingermann, Johann Wolfgang Goethe
Universitat, Frankfurt am Main
Stefan DUbel, Technische Universitat Braunschweig
Peter Fromherz, Max-Planck-lnstitut fr Biochemie,
Martinsried/ Mnchen
Saburo Fukui (t ), Kyoco University
Roland Friedrich, JustusLiebigUniversitat GieBen
Dietmar Fuchs, Universitat lnnsbruck
Oreste Ghsalba, Novartis AG, Base!
Horst Grunz, Universitat Dusburg Essen
Georges Halpern, University of California at Davis
Albrecht Hempel, Krankenhaus DresdenFriedrichstadt
Choy-L. Hew, National University of Singapore
Bertold Hock, Technische Universitat Mnchen
Ma.rtln Holzhauer, IMTEC, Berlin-Buch
Woo-Suk Hwang, Seoul National University
Hwa A. Llm, D'Trends lnc., Silicon Valley, Kalifornien
Inca Lewen-Dorr, GreenTec., Koln
lsao Karube, Tokyo lnstitute of Technology
Frank Kempken, ChristianAlbrechts-Universitat Kiel
Albrecht F. Klderlen, Robert-Koch-lnstitut, Berln
Uwe Klenz, lnstitul fr Physikalische Hochtechnologie
e.V.Jena
Jutta Ludwig-MUller, Technische Universitat Dresden
Stephan Martln, Deutsehes DiabetesZentrum,
Dsseldorf
Alex Matter, Novartis Singapore
Marc van Montagu, Max-Planck-lnstirut fr PflanzenzOchtung, Koln
Reinhard Niessner, Technische Universitat Mnchen
Susanne PauJy, Hochschule Biberach
Jrgen Polle, Brooklyn College of the City University
ofNewYork

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Tom Rapoport, Harvard Medica! School, Boston


Matthias Reuss, Universitat Stuttgart
Frieder W. Scheller, Universltat Potsdam
Andreas Sentker, Die Zelt, Hamburg
Matthias Seydack, 8 sens.biognostic AG, Berlin
Georg Sprenger, Unlversitat Stuttgart
Gary Strobel, Montana State University, Bozeman
Eric Stewart, INSERM - University Paris 5
Kurt StUber, K51n
Atsuo Tanaka, Kyoto University
Dieter Trau, Natlonal Univers!ty of Singapore
Thomas Tuschl, Rockefeller University, NewYork
Larry Wadsworth, Texas A&M University
Catherine Wan, Hongkong
Terence S. M. Wan, Head of Racing Laboratory,
The Hong Kong Jockey Club
Eckhard Wellmann, Universitat Freiburg
Dieter Wolf, Boehrlnger-lngelheim, Biberach
Christian Wandrey, lnstltut.fr Biotechnologie,
Forschung.szentrum Jlich
Zeng-yu Wang, The Noble Foundation, Ardmore,
Oklahoma
Michael Wmk, Ruprecht-KarlsUniversitat Heidelberg
Mengsu Yang, City University of Hong Kong
Leonhard Zastrow, Research and Development Coty
lnc., Monaco

Con las contribuciones de


Charles Coutelle, Imperial College, London
Rainer Erb, Zentrum fr Umweltkommunikation,
Osnabrck
Herrmann Feldmeler, Instlcut fr Infektionsmedizin
der Charit, Berln
Ricardo Gent, Verband der Chemischen Industrie,
Frankfurt am Main
Oreste Ghisalba, Novartls AG, Base!
Frank Hatzak, Novozymes Danemark
Stefanle Helden, Deutsehe Bundesstiftung Umwelt,
Osnabrck
Jorg Knliblein, Schering AG, Berlin
Norbert MUlleder, Syngenta, Dilsseldorf
Nerzwerke TransGen und bioSicherheit, Aachen
Uwe Perlitz, Deutsehe Bank Research, Frankfun am
Main
Jens Reich, MaxDelbrckCentrum, Berlin-Buch
Christoph Wmthertaler, Wackel'Chemie GmbH,
Mnchen
Eckhard Wolf, Unlversitat Mnchen
Holger Zinke, B.R.A.1.N. AG, Zwingenberg

CONTENIDO

INTRODUCCIN

Captulo 1

1.1 Al principio fue la cerveza y el vino: la leche materna de !a civilizacin 2 1.2 Las levaduras son los
burros de carga de la fermentacin alcohlica 2 1.3 Tambin hoy en la industria cervecera se utlli
zan levadura, agua, malta y lpulo 5 1.4 Las clulas funcionan con energa solar 11 1.5 El alcohol
no es un placer sino una necesidad para las levaduras 11 1.6 Los licores muy concentrados se produ
cen mediante destilacin 12 l.7 Productos bacterianos: La acidez los hace duraderos! 15 1.8 Caf,
cacao, vainilla, tabaco - Fermentacin para el placer 18 t. 9 Los mohos cooperan con las bacterias
y producen queso 18 1.1 OSake y salsa de soja 22 1.11 Qu es en realidad la fermentacin? 22
ENZIMAS - Supercatalizadores moleculares para el hogar y la industria

25

Captulo 2

2.1 Las enzimas son biocatalizadores eficaces y especficos 26 2.2 La lisozima: la primera enzima
cuya anatoma y funcin se entendieron en detalles moleculares 27 2.3 Los cofactores sirven como
herramientas a las enzimas complejas 31 2.4 Las enzimas pueden obtenerse de animales, plantas y
microorganismos 32 2.5 Las hidrolasas extracelulares degradan los biopolmeros en pequeas unida
des utilizables 34 2.6 Las amilasas mezclan, cuecen y trenzan 34 2.7 Las pectinasas prensan ms
zumo de fruta y verduras 36 2.8 Los biodetergentes son Ja aplicacin ms importante de las enzimas
hidrolfticas 37 2.9 PLas proteasas ablandan la carne y cunen la piel 38 2.1 OInmovilizaciones: cuando se quiere reutilizar las enzimas 40 2.11 Glucosa isomerasa y jarabe de fructosa: azcar con mayor
fuerza edulcorante 40 2.12 Alimentos y forrajes con enzimas inmovilizadas 42 2.13 Los reactores
de enzimas de membrana usan regeneracin de cofactor 44 2.14 Clulas inmovilizadas 46
/iQ

C:i nt u1" 3

3.1 DNA: La doble hlice porta el material hereditario 50 3.2 Las DNA polimerasas catalizan la repll
cacin de la doble hebra de DNA 50 3.3 No todos los genes constan de DNA: los virus RNA utilizan
RNA de una nica hebra 513.4 La aclaracin del cdigo gentico 513.5 El genoma humano Una enorme enciclopedia de 24 volmenes 52 3.6 El cdigo de DNA se agrieta: el RNA sinttico
descifra los codones 53 3.7 Los genes estructurales cercanos a los fragmentos de DNA controlan la
expresin de los genes 58 3.8 Rlbosomas- La fbrica de protenas de la clula: una molcula gigante de RNA y protenas 58 3.9 Recombinacin: las cartas genticas se barajan de nuevo 60 3.1 OLos
plsrnldos son vectores ideales para el material gentico 6 / 3.11 Tijeras y pegamento moleculares:
endonucleasas de restriccin y DNA ligasas 62 3.12 Los primeros experimentos de ingeniera gen
tica: bacterias que croan? 62 3.13 Cmo se obtienen los genes 65 3.14 Insulina humana a partir de bacterias? 66 3.15 Cmo se sintetiza la insulina en humanos: desde la preproinsulina, pasan
do por la proinsullna, hasta la insulina activa 68 3.16 Los inicios de la ingeniera gentica con proin
sulina de rata 69 3. 17 Hibridacin de DNA: cmo se encuentran bacterias con sondas de
DNA 713.18 Un pequefio desvo: la somatostatina - La primera protena humana de bacte
rias 71 3.19 Cmo se obtiene enzimticamente insulina humana a partir de insulina de cer
do 73 3.20 Finalmente se consigui! La primera insulina humana producida por ingeniera gentica 73 3.21 Asilomar: cul es el peligro de la nueva ingeniera gentica? 74 3.22 Proinsullna
humana a partir de una nica cepa de E coli76 3.23 Levaduras de coccin como productoras de proin
sulina 77 3.24 Variantes artificiales de la insulina (mutema) mediante ingeniera gentica 78 3.25 Los
genes manipulados de clulas de mamfero producen protenas complejas modificadas 78

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VII

Captulo 4

BI OTECNOLOGA BLANCA - Las clulas como fbricas de sntesis

83

4.1 El problema de la visin general 84 4.2 Adaptacin tctica: regulacin por retroacoplarnien
to 86 4.3 Adaptacin estratgica: produccin de enzimas a demanda 87 4.4 Un ordenador molecu
lar alostrlco: la glutamlna slntetasa 89 4.S Represin de catabolltos o cmo se pesca una pollmera

sa 90 4.6 Mohos en lugar de limones! 90 4.7 Uslna en abundancia: la retrolnhlblcln de la asparta


to quinasa se burla con mutantes 91 4.8 Lglutamato: condimento de sopa "levorrotatorio" en exceso 93 4.9 Tienen que ser siempre microbios? La sntesis qumica contra la fermentacin 94 4.1 O
cido Lascrblco, la vitamina C 96 4.11 Aspartamo - La marcha triunfal de un ster dlpeptdlco dul
ce 99 4.12 Las clulas inmovilizadas producen aminocidos y cidos orgnicos I OI 4.13 Mutaciones: un camino hacia la programacin selectiva de microbios IOI 4.14 Penlcfllfum notatum el hongo
milagroso de Alexander Aemlng 1O 4.1 S Screenfng; blotecnlogos a la caza de hongos 106 4.16
El men de los microbios 107 4.17 La blofbrica moderna 11O 4.18 Calor, fro y sequedad nos man
tienen los microbios en el cuello 1IO 4.19 Recuperacin del producto: downstream proces
stng 114 4.20 Estreptomicina y cefalosporlna - Los siguientes antibiticos despus de la peniclll
na 115 4.21 La competencia con los microbios: resistencias 115 4.22 Clclosporlna - Un producto
microbiano para trasplantes 117 4.23 Hormonas esteroldeas: la cortisona y la pldora anticonceptiva 119

Captulo 5

VIRUS, ANTICUERPOS

y VACUNAS

123

S.1 Virus- La vida prestada 124 S.2 De qu forma atacan los virus a las clulas 124 S.3 Cmo se
defiende el cuerpo de las Infecciones: respuesta Inmunitaria humoral mediante anticuer
pos 127 S.4 Respuesta Inmunitaria celular: clulas T asesinas 129 S.S La primera vacuna: la
viruela vacuna contra la viruela humana 134 S.6 Las vacunas modernas 137 S.7 Las vacunas
vivas 139 S.8 Anticuerpos monoclonales: balas mgicas de un blorreactor altamente especficas y
uniformes 140 S.9 Anticuerpos catalticos 141 S.10 Anticuerpos recomblnantes 142 S.11 Blbllo
tecas de anticuerpos combinatorias 143 S.12 "A cuestas" o visualizacin de fagos - La prxima
revolucin 144 5.13 Visualizacin de fagos para la hormona del crecimiento de alta afinl
dad 144 S.14 Nuevas esperanzas en el cncer: rituxlmab, un anticuerpo recomblnante 145

Captulo 6

BIOTECNOLOGfA DEL MEDIO AMBIENTE - Adis a los caminos

de una direccin, bienvenido a los circuitos

149

6.1 Agua limpia -Un bloproducto 150 6.2 Depuracin aerbica de los vertidos: campos de aguas
residuales, tanques depuradores por filtracin y lodo activado 152 6.3 Blogs 153 6.4 El blogs
podra salvar bosques! 154 6.S El blogs en los pases Industrializados: explotacin del estircol
lquido 155 6.6 SE! alcohol que crece en los campos 156 6.7 Los devoradores de petrleo de
Ananda Chakrabarty 157 6.8 Azcar y alcohol a partir de la madera 158 6.9 Materias primas
qumicas de blomasa? 160 6.1 OMinera silenciosa 164 6.11 Una nueva vida para los pozos de
petrleo agotados? 164 6.12 Bloplstica: circuitos en lugar de caminos de una direccin! 165

Captulo 7

BIOTECNOLOGA VERDE

171

7 .1 Los microbios son comestibles 172 7.2 Algas y clanobacterlas 172 7 .3 La protena single celt
la esperanza de las fuentes baratas de proteCnas 174 7.4 La mlcoprotena tiene xito como prote
na vegetal para el consumidor 175 7.S La biotecnologa "verde" ante portaSi; 178 7.6 El campo
en un tubo de ensayo: cultivo de plantas In vitro 178 7.7 El cultivo de merlstemos 179 7.8 Cul
tlvos haploldes: anteras y ovarios 180 7.9 Cultivos de callos y en suspensin 181 7.1OLas clulas
vegetales en un blorreactor producen principios activos 183 7.11 Qu principios activos vegetales
seguirn a la shlkonlna? 184 7.12 Agrobactertum -Un parsito como Ingeniero gentico 185
7.13 Transferencia gentica blolfstica: un disparo de DNA 185 7.14 Plantas transgnlcas: resisten
cla a Jos herbicidas 188' 7.1S Insecticidas biolgicos 189' 7.16 Claveles azules y tomates "anillo
fos" 193 7.17 Son peligrosos los allmentos genticos? 194 7.18 Hay que Identificar a los allmen
tos genticos? 195 7.19 GenePharmtng(granja de produccin gentica) 195 7.20 Plantas transg
nlcas-Un debate acalorado 198 7.21 Palmeras tropicales en Alemania? 198 7.22 Las bacterias de
los cariones de nieve aseguran las vacaciones de esqu 200

VIII

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EMBRIONES, CLONES Y ANIMALES TRANSGhlCOS

203

Captulo 8

8.1 Inseminacin artificial 204 8.2 Transferencia embrionaria y fecundacin artificial 204 8.3 Las
especies en peligro de extincin y amenazadas se pueden salvar mediante la transferencia embrlona
ria 205 8.4 Las quimeras tienen como mnimo cuatro padres genticos 206 8.S Animales transg
nicos: del ratn gigante al toro gigante? 207 8.6 Hormonas del crecimiento para bovinos y cer
dos 208 8.7 GenePharmfng. valiosa protena humana a partir de huevo y leche 209 8.8 Peces trans
gnicos: del GloFts~ a la trucha gigante 211 8.9 Ratones knock out 214 8.1O Xenotrasplan
tes 215 8.11 Clonacin - Produccin masiva de gemelos 215 8.12 Clonacin de salamandras y
ranas 219 8.13 Dolly - EI descubrimiento decisivo en la clonacin 219 8.14 Diflcuitades de la clo
nacin 221 8.1 S Clonacin de gatos - Las diferentes variantes de progenitores 222 8.16 Y el ser
humano? Clonacin, FIV y DPI 223 8.17 El embrin cristalino yel proyecto del genoma humano 224
INFARTO DE MIOCARDIO, CNCER y dLULAS MADRE - La biotecnologa roja

como medio para salvar vidas

Captulo 9

227

9 .1 El Infarto de miocardio y los anticoagulantes 228 9.2 La fibrinllsls despus del infarto de mio
cardlo: disolucin enzimtica de los cogulos 228 9.3 La embolia: una enzima de vampiro sirve de
ayuda 229 9.4 Factor gentico VIII - Una ayuda segura para la hemofilia 232 9.S EPO para enfermos
de rifin y deportistas 234 9.6 El interfern contra los virus y el cncer 234 9.7 La lnterleuqul
na 238 9.8 Cncer: crecimiento celular anormal Incontrolado 238 9.9 Nuevas terapias contra el
cncer 239 9.10 El paclltaxel contra el cncer 242 9.11 La hormona del crecimiento huma
na 243 9.12 La hormona del crecimiento epidrmico-Desaparecen las arrugas y se curan los ples
diabticos 243 9.13 Las clulas madre: la fuente de juventud decisiva? 244 9.14 Terapia gni
ca 248 9.1 S Diamantes en la basura? El RNAi, el RNA que interfiere 249
BJOTf(

nu1Gf1\ ANAtfT!CA y GE OMA HUMANO

253

Captulo 10

10.1 Pruebas enzimticas para millones de diabticos 254 10.2 Biosensores 254 10.3 Sensores
microbianos: las levaduras miden la carga de los vertidos en cinco minutos 256 10.4 Prueba inmu
nolgica del embarazo 257 1O.S Pruebas del sida 258 10.6 Pruebas para el infarto de mlocar
dio 259 10.7 Pruebas PofntofCare (POC) 260 10.8 Cmo se analiza el DNA: la electroforesis
en gel separa los fragmentos de DNA segn su tamao 260 10.9 Vlda y muerte: huellas dactilares
genticas para aclarar la paternidad y el asesinato 261 10.1 O Marcadores de DNA: breves repeti
clones en tndem y SNP 263 10.11 La reaccin en cadena de Ja pollmerasa: el copiador de
DNA 264 10.12 Se despertar a los saurios y al mamut a una nueva vida? 265 10.13 Cmo se
secuencian los genes 268 10.14 Southern Blottng 268 10.1 S Secuenciacln automtica de
DNA 269' 10.16 FISH: local!zacin en cromosomas y cantidad de copias genticas 270 10.17 La
coronacin de la blotecnologfa: el proyecto del genoma humano 273 10.18 Mapas genmlcos
genticos 274 10.19 Mapas genmlcos fsicos 274 10.20 La lucha de los mtodos: Contig con
tra escopeta 275 10.21 Cmo se contina con el genoma humano? 276 10.22 Cmo se pue
de entender la secuencia genmica? 278 10.23 La farmacogenmca 279 10.24 Chips de
DNA 280 10.25 Descubrir las causas de las enfermedades: perfiles de expresin genti
ca 281 10.26 La protemlca 281 10.27 MALDI: Un gas de onesde protenas 282 10.28 Apt
meros y chips de protena 282 10.29 Finalmente el control a travs del genoma humano? 283 10.30 Quo vadfs biotecnologa? 283

(RDITOS DE LAS I LUSTRACIONES

287

fNDICE DE NOMBRES PROPIOS

289

NDICE ALFABTICO

291

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IX

INTRODUCCIN

encuentran en la pgina VI. Les estoy agradecido


de todo corazn. Espero no olvidar a nadie!
De la pereza. Desde hace diez aos enseo Bio
tecnologa analtica y Qumica en Hong kong. Mis
estudiantes de Qumica chinos no saben casi nada
sobre fabricacin de cerveza, enzimas de detergentes, DNA, bacterias comedoras de aceite, "arroz
dorado", GloFish@, infarto de miocardio o del proyecto del genoma humano. As, mis seminarios
tendan a consumir mucho tiempo en desviaciones
hacia temas biotecnolg!cos. La propuesta de una
bibliografa de 88 libros no era til. Los estudiantes queran tener un solo libro! Ahora puedo decirles: "Comprad y leed mi libro, que cubre todo lo
que necesitas saber!"

El autor, tras los


experimentos de
clonacin con los gatos
Fortuna l, 11, 111 y IV

Nadie lee las introducciones largas! As pues, corto: Por qu se origin este libro?

Oarja Sbbier con el gato


AsmarKhan

David Goodsell, grfico


molecular, se confiesa
practicante de yoga y
visionario de nanobio
tecnologa

De la curiosidad y entusiasmo. Ya cuando era


un joven, lefa todo lo que el mundo me aportaba.
Hoy, como cientfico, la biotecnologa es para m
sobre todo el tema ms excitante, pues trata de
nosotros y de nuestro futuro! Qu puede ser ms
excitante?
De la adiccin a todo el saber. Al leer determino
que "slo s, que no se nada", como dijo Scrates.
Me hubiera gustado ser un erudito universal,
como fueron algunos cientficos del Ren'acimiento.
Pero esto es actualmente del tod? imposible. Con
seguir tener una visin general sobre un tema, es
ahora an razonablemente viable. Pero para ello
se necesita el trabajo en comn con investigadores
especialistas en temas prximos. Al comprender
esto, me un dos exitosos "Olivers": Oliver Kayser
de Berln (ahora en Groningen) y Oliver Ullrich
de Hamburgo. Ambos cubren una vasta rea del
conocimiento, leyeron todo el libro e hicieron
grandes contribuciones. Gracias! Cuando el tema
era complejo, he consultado a varios expertos y he
comprimido sus opiniones (a menudo muy r~umi
das) en Cuadros. Los nombres de estos expertos se

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De la diversin. "La creatividad lo es todo", dijo


Picasso. Convertir este nuevo tipo de libro de texto
en un realidad con la ayuda de Darja Sbbier, que
para mi es la mejor "artista bio-grfica" de Alemania, fue una enorme diversin. Todas mis ideas -a
veces espontneas o inmaduras- se consolidaron y
transformaron en maravillosos grficos. Cualquier
otra artista grfica se habra perdido con mi desorden. ;Gracias, Dascha!
Que David Goodsell en La Jolla hubiera contribuido
al libro con sus estupendos grficos moleculares, fue
para mi un suefio, que se hizo realidad. Como me
aburri el recuento de los tomos de carbono del
taxol, Francesco Bennardo de Italia le dio un empu
jn y por arte de magia en una noche cre los modelos espaciales de las molculas ms importantes.
Todo esto ha sido una gigantesca diversin!
De la adiccin a imgenes. En Asia se representa
tradicionalmente todo de forma ilustrada. Durante
una bsqueda de imgenes en Google me embriagaron las figuras de Biotecnologa. La editorial en
principio se aterroriz al ver cmo a partir el "blanco del bonito libro de texto en dos colores" se convirtfa gradualmente en una explosin de color.
Apenas han quedado algunas zonas blancas!

Un problema fue conseguir los derechos de tantas


ilustraciones. Sin embargo, casi todos los propieta
rios de los derechos reaccionaron positivamente.
La editorialRingier me cedi generosamente
todos los derechos de la anterior editorialUrania
en Leipzig en mi primer libro "BioHorizonte".
El virus del escritor de libros ha Interaccionado
con el lector en jefe de la Urania, Bernd Scheiba:
"Oulen escribe, se queda!"
Algunas empresas, como la GBF Braunschweig,
la Roche Penzberg, Degussa, la red Transgen y
Bioseguridad han dado el visto bueno a docenas
de imgenes, mi servidor ha disfrutado con mails
de 10-Megabites. Larry Wadsworth de Texas me
ha mandado fotos de todos los animales clonados.
Si olvid citar o conseguir a alguien como autor
de las imgenes, por favor informadme. No fue
debido a un enfado!
El lector notar seguramente tambin mis pro
pas fotografas: gatos, aves, ranas, delfines,
comidas y bebidas, China y Japn -todo se foto
grafi para ser utilizado en el libro de Biotecno
logfa. Espero que a usted no le moleste verme a
mi en mis experimentos en lugar de a un modelo
profesional.
De la furia de la comunicacin. No haba nada
ms maravilloso que sentarse por la maana, con
una taza de caf, frente a una vista del mar de
China Meridional, abrir el ordenador porttil y
mirar los mensajes que me haban enviado por la
noche. Encontraba algunas noticias importantes
sobre biotecnologa, otras no tanto, o reciba nue
vos diseos que me enviaba Dascha desde Berln.
Definitivamente viajaron diez mil correos de aqu
para all, y todo el tiempo fue como en Navidad!
Gracias, Internet, sin ti el libro no se habra creado. Me siento en una isla subtropical, presiono
algunos botones y en Alemanla aparece un hermoso libro! Julio Veme estara impresionado.

Ouin tuvo la idea? Fue Merlet BehnckeBraun


beck quien me prometi convertir mis ideas en un
libro de texto. Esta altamente motivadora, efectiva
y al mismo tiempo encantador equipo de conferen
dantes con lmme TechentinBauer, Blirbel Hacker
y Ute Kreutzer a veces en voz baja evadieron segu
ramente, si deba cambiar de lugar o "ampliar" de
nuevo durante la noche un captulo entero, aunque
siempre reconfortaron maravillosamente mi espal
da y la de Dascha. Gracias, queridas damas!

Oliver Ullrich con un


ratn normal llamado
Ollle ...

Cmo se puede utilizar este libro?


Como una introduccin para estudiantes de
institutos y universidades, para profesores, perlo
distas o simplemente para personas interesadas en
la Biotecnologa.
Como libro de texto para estudiantes. Se pue
de estudiar sistemticamente todos los captulos e
intentar responder a las ocho preguntas que se
encuentran al final de cada captulo.

Oliver Kayser con su


hijo y su hija

Para encontrar experiencias: El libro se puede


hojear rpidamente, y espero que se sienta suficien
cemente intrigado e inspirado para buscar ms lnfor
macin en otros libros especializados o en Internet
Como libro de referencia: Puede ser el punto
de partida para resolver una duda sobre blotecno
loga. Luego el lector puede buscar ms informa
cin en Internet o en libros especializados.
Si esto va bien? A algunos colegas se les puede
torcer sus narices. El libro es un experimento!
Odio los libros aburridos: los rboles han muerto
en vano por ellos.

Me alegro de cualquier comentario de usuarios de


este libro.
Mndenme un mail a: chrenneb@ust.hk

Historia de la
Biotecnologla:
Francesco Bennardo
disfrutando de un
producto de la fermen
tacin (flecha roja),
por su efecto fue
suspenddo en tas
prcticas de orgnica.
Francesco fuma hoy
en da delante del
ordenador y modela
molculas.

Reinhard Renneberg,

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XI

CERVEZA, PAN, QUESOsuculenta biotecnologa

1.1

Al principio fue la cerveza


y el vino: la leche materna
de la civilizacin 2

1.2

Las levaduras son los burros


de carga de la fermentacin
alcohlica 2

1.3 Tambin hoy en la industria


cervecera se utilizan levadura,
agua, malta y lpulo 5
1.4 Las clulas funcionan con
energa solar 11

1.5 El alcohol no es un placer


sino una necesidad para las
levaduras 11
1.6 Los licores muy concentrados
se producen mediante
destilacin 12

1.7 Productos bacterianos: iLa


acidez los hace duraderos! 15
1.8 Caf, cacao, vainilla, tabaco
- Fermentacin para el placer t8

1.9 Los mohos cooperan con las


bacterias y producen queso t8
1.10

Sake y salsa de soja

1.11

Qu es en realidad
la fermentacin? 22

22

Captulo
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BIOTECNOLOGA

1.1. Al

principio fue la cerveza


y el vino: la leche materna de
la civilizacin

Fig. u Fabricacin de cerve


za en Egipto hace 4400 aos.

Fig.1.2 Estatuillas de mujeres haciendo pan hace 6000


aos.

Fig. t.3 levaduras en un


dibujo de leuwenhoek
{arrba) y bajo un moderno
microscopio electrnico de
barrido; claramente se ven
los brotes de las clulas hijas.

fig.1.4 Fbrica de cerveza


en la Edad Media.

Ya hace 6000 a 8000 aos los sumerios en Mesopotamia, el pedazo de tierra entre los ros tufrates y
Tigris {hoy lrak), dominaron el arte de la prepara
cin de la cerveza. De los cereales germinados produjeron una bebida nutritiva, duradera y embriaga
dora. Para ello humedecan cebada o trigo Emmer,
una antigua forma del trigo, y llevaban el cereal a la
germinacin. En una tabla pintada sumeria, el
Monument Bleu del Louvre en Pars, del tercer
milenio antes de nuestro tiempo, se representan las
conchas con Emmer para la preparacin de cerveza. De los cereales germinados, la malta, se prepa
raba entonces el pan de cerveza, se desmenuzaba y
se mezclaba con agua. Con un colador trenzado de
mimbre se separaba el lquido del residuo y se deja
ba en toneles cerrados. Muy pronto aumentaban en
los recipientes las burbujas de gas y el lquido empezaba a fermentar.
Del jugo dulce se originaba, en condiciones anaer
bicas mediante fermentacin, una bebida alcoh
lica, la cerveza.
Una parte del grano germinado se secaba al sol
-esto corresponde al actual secadero-y se mantena
como mercanca duradera para tiempos sin cereales
frescos. La cerveza babilnica tena un sabor ligeramente agrio, que provena de una fermentacin
lctica paralela escurrida. Con el cido lctico
aumentaba esencialmente la durabilidad de la cerveza, porque en medio cido muchos microbios no
pueden prosperar. En los climas calurosos de Orien
te esto era de gran importancia, pues con ello se
encontraba disponible una mezcla higinicamente
perfecta para disfrutar de ella.
El alcohol es azcar fermentado, un producto final
del metabolismo de las levaduras. Un 2 o
3 %de alcohol cambia la permeabilidad {fluidez) de
la membrana citoplasmtica de las bacterias e inhibe
con ello su crecimiento. En los climas calurosos de
Oriente, el medio de fermentacin inhibidor de
microbios es una ventajosa, si no decisiva, cualidad
higinlca. Gracias a la agricultura la poblacin creci
enormemente. El agua potable limpia result de
repente un problema, como tambin sucedi en el
siglo XIX en Europa. Recordemos tambin las imgenes actuales de los rituales sagrados en el Ganges.
Las heces animales y humanas contaminan y ensucian incluso hoy el agua potable. El agua impura
puede ser altamente peligrosa! Los productos de la
fermentacin, cerveza, vino y vinagre, estaban, sin
embargo, exentos de grmenes peligrosos. Incluso
se poda preparar con agua potable ligeramente

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sucia, porque no slo el alcohol sino tambin los ci


dos orgnicos inhiban a los patgenos existentes. El
agua no calm, pues, la sed de nuestros antepasados,
sino la cerveza, el vino y el vinagre. Ellos fueron, por
as decirlo, la "leche materna de la civilizacin". La
biotecnologa ms antigua del mundo era nutritiva,
estimulante y tambin segura - un avance revolucio
nario, que debi ser sencillamente favorable.
Tambin los egipcios prepararon cerveza. Una anti
gua pintura de la pared de un santuario egipcio de
hace 4400 aos muestra el proceso de fabricacin
del producto (Fig. 1.1).
Los egipcios ya saban que la fermentacin empeza
ba ms rpido si se utilizaban de nuevo los restos de
una cerveza prspera. Las cervezas egipcias eran
principalmente oscuras; se preparaban de panes de
cerveza tostados. Algunas tenan un contenido de
alcohol del 12 al 15 %. Los egipcios descubrieron
tambin la botella de cerveza: en la edificacin de
una pirmide se reparta cerveza en jarras en el lugar
de la construccin.
Los celtas y los germnicos prefirieron el aguamiel,
una cerveza cida, que se guardaba en recipientes
de hasta 500 litros a unos 1OC bajo tierra y se mezclaba con miel. Sin embargo, primero se desarroll
la fabricacin de cerveza como un arte, cuando los
monjes asumieron el tema en el siglo VI. Agradecemos al lema lquda nonjragunt eunum ("el lqui
do no viola la regla de ayuno") la especial fuerza y
contenido de alcohol de las cervezas fuertes.
La palabra "bier" (en alemn cerveza) se debi obte
ner de los antiguos sajones bere, o sea cebada. Los
fabricantes de cerveza prsperos del pasado no
podan saber, por supuesto, que la fermentacin era
causada por seres vivos, las levaduras.
Fue Antonie van Leeuwenhoek (16321723)
quien vio las primeras bacterias (cuadro 1.1 ), y con
su microscopio de una lente tambin fue el primer
ser humano que encontr perlas amarillas de levadura en una muestra de cerveza (Fig. 1.3). En los
tiempos de Leeuwenhoek se utilizaban ya levaduras
de forma concentrada y purificada, tanto para la
coccin del pan como para la fabricacin de cerve
za y la preparacin del vino.

Las levaduras son los burros de


carga de la fermentacin alcohlica

1.2

Las levaduras se cuentan entre los hongos (jungz),


en concreto pertenecen a la clase de los hongos con
micelio tabicado (Ascomycetes), el tipo ms abun
dante de la clasificacin de los hongos.
En contraste con las bacterias procariotas, los eucariotas (del griego ka.ryon, ncleo) tienen una estruc-

(ERVEZA, PAN,QUESO

Cuadro u Historia de
la biotecnologa: Leeuwenhoek

la locura, empez a pulr lentes de cristal


cada vez ms gruesas, hasta que alcanz con
su arte aumentos de 200 veces en el micros
copio. Durante horas le pudo cautivar, bajo
su microscopio de una lente, convertir un
fino pelo de oveja en una gruesa soga.

r-:D

Antonie van leeuwenhoek trabajando con su


microscopio de una lente; con l ampliaba
unas 200 veces.

iJ'
"Tenamos un movimiento muy fuerte y
rpido ante nosotros, y disparaban en el
lquido como si fuese un humo espeso a tra
vs del agua. Estos seres vivos eran muy
pocos en nmero. El segundo tipo tena
una forma como en B. stos giraban frecuentemente en crculos y tomaban entonces
un movimiento como en C y D. Existan en
grupos mucho mayores en nmero. Al tercer
tipo no le pude dar una forma, porque por
un lado parecfan como un valo y por otro
lado como un crculo. Eran tan pequeos
que no los poda ver ms grandes que como
en la Fig. E y por ello zumbaban tan rpidamente en la confusin, que era como tener
un gran enjambre de moscas o mosquitos
ante mf.
Eran tan numerosos, como granos de arena,
que cre ver mil en la mezcla de agua, o taro
bin en la saliva (disminuye con la materia
mencionada), aunque haba conseguido la
muestra entre los dientes incisivos y las mue
las. Principalmente constaba la materia de
una cantidad de estructuras en forma de
palo de longitudes muy diferentes y en cam
bio del mismo grosor, que se doblaban en
ngulo, otras rectas, como en la Fig. F, que
se disponan desordenadas en la confusin."
(Fuente: Paul de Krulf, Cazadores de micro
bios, 1940.)
Con esta observacin microscpica de su
placa dental, un cientfico autodidacta, el
mercader Sr. Antonie van Leeuwenhoek
( 1632- 1723), abri en la pequea ciudad
holandesa de Delft un nuevo mundo a la
humanidad. Fue la primera persona que vio
bacterias y las dibuj. Todo ello empez
cuando Leeuwenhoek observ de un fabri
cante de gafas en un mercado anual el arte
de un pulidor de lentes. Con obsesin hasta

ca clula. Los cientficos de la Royal Sociecy


se convencieron slo con sus propios ojos de
la existencia microscpica de seres vivos ms
pequeos. Las "miserables bestezuelas" pro
vacaron su activo inters. Leeuwenhoek,
que no haba asistido a ninguna Universidad,
fue escogido en 1680 por unanimidad como
socio de la Royal Society, por su habilidad,
curiosidad y resistencia ms conseguidas
que las de muchos cientficos de su tiempo,
que ante la pregunta de cuntos dientes tie
ne un burro consultaban en las escrituras del
antiguo maestro griego Aristteles antes que
mrar en la boca de un animal gris.

~e::~~

El primer dibujo de bacterias por Leeuwenhoek.


Del publicista cientfico britnico Brian F. Ford se
analiz una imagen a travs del microscopio de
Leeuwenhoek. ileeuwenhoek en realidad pudo
ver espirilos (Flg. G)!

Un da, Leeuwenhoek tuvo la idea de inves


tlgar una gota de agua de una cuba de lluvia.
No se sobresalt poco cuando vio bajo el
microscopio una multitud de pequeos seres
vivos. Nadaban enrgicamente por todas
partes y jugaban unos con otros, como le
pareci a l. Los seres vivos eran, segn
Leeuwenhoek, tesoros mil veces ms peque
os que el ojo de un piojo.
Por la presin de un amigo, Leeuwenhoek
escribi en 1673 por primera vez una carta
emusiasta en holands a la agrupacin ms
importante de cientficos del mundo en ese
momento, la Royal Society de Londres.
Los hombres eruditos leyeron con asombro
la descripcin de la "miserable pequea bes
tezuela", como denomin Leeuwenhoek a
los raros animalillos.

Microscopio de Leeuwenhoek. ~t fabric aproxl


madamente 500 microscopios de una lente.

Reyes, prncipes y cientficos de todos los


pases se interesaron en los descubrimientos
de Leeuwenhoek. La reina de Inglaterra y
Federico 1de Prusia lo visitaron, as como el
Zar de Rusia Pedro el Grande, que se detu
vieron con nombres falsos en Holanda para
estudiar la construccin naval.
Las "bestezuelas" maravillaron durante largo
tiempo como curiosdad y luego pasaron de
nuevo al olvido.

El investigador ingls Robert Hooke


( 1635 - 1703), como socio de ta Royal
Society era en ese tiempo responsable
de cada encuentro para conocer a los que
mostraban nuevos experimentos. l mismo
investig con su microscopio de varias lentes
en forma de corcho de botella, y con l des
cubri una muestra ordenada regularmente
de pequeos agujeros, que denomin "clu
las". Hooke construy con la informacin de
Leeuwenhoek el microscopio de Hollander y
pudo confirmar sus observaciones. No sospe
ch que los pequeos "animalillos" tambin
constaban de clulas, o al menos de una ni

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Microscopio de varas lentes de Robert Hooke,


con el que investig estrechos cortes delgados
de corcho y describi las "clulas".

BIOTECNOLOGA

En la fabricacin de cerveza, para la preparacin del mosto, la malta cocida se remoja, es decir, se agita y se calienta con mucha
agua. En la malta remojada se superan en
rases de parada los procesos de degradacin
enzimticos: a 50 C las ~-glucosidasas
degradan el "material elstico", que impide
la filtracin. A50-60 C se consigue Ja "parada de protena": las protenas se fragmentan.
En la "parada de azcar" (60-74 C) las enzimas degradadoras de almidn (et y ~-amila
sas) separan los restos completamente del
almidn en glucosa y maltosa, y se degradan
fragmentos de almidn mayores (dextrinas).

Cuadro 1.2 Las fbricas de


cerveza actuales
La cerveza se hace en Alemania segn se
preparaba en Baviera ya en 1516 bajo la
vigencia de la ley de pureza (vase p~g. 21 )
a partir de cebada de malta, lpulo y agua,
y la adicin de levadura.
Los cereales que contienen almidn no pue
den fermentar directamente, sino que prime
ro, mediante las enzimas fragmentadoras
de almidn (amilasas), deben convertirse
en cereales germinados y activarlos a azcar
de malta (maltosa) y "romperlos" a azcar
de uva (glucosa). A la fabricacin de la cerve
za pertenecen, por lo tanto, los procesos
de preparacin de la malta, preparacin del
mosto y fermentacin.
Primero, la cebada mana al contenedor de
malta tras la limpieza y clasificacin uno o dos
das con agua. Se dejan germinar los granos de
cebada a 15 l8 C en grandes cajas germina
doras con agitacin automtica yse interrum
pe el proceso de germinacin tras siete das.
En la malta verde as obtenida slo se alean
za en parte la degradacin enzimtica del
almdn a maltosa. Se seca (secadero) y luego,
aumentando gradualmente la temperatura
(primero a 45 C, luego a 60-80 C, para la
cerveza negra hasta 105 C), con agitacin
y agrupacin se obtiene la malta agitada.

La disolucin escurrida (mosto) tras la preci


pitacin o filtracin se cuece con lpulo,
para concentrarla, liberarla de grmenes y
aromatizarla. El lpulo con su contenido en
material amargo, resinas y aceites esenciales,
aporta a la cerveza el sabor amargo estimu
!ante y una mejor durabilidad.
El contenido de mosto troncal es el conteni
do en materiales so!ubles extrados, como glu
cosa y maltosa, en gramos de sustancia seca
por 100 gramos de mosto, y est estipulado
claramente en la ley de Ja pureza de Ja cerveza:
las cervezas sencillas contienen un 2 a 5,5 %
de mosto troncal, las cervezas lmite
7-8 %, las cervezas completas 11-14 %y las
cervezas ruenes por encima de un 16 %. El

Malta

mosto con lpulo se rebaja y se filtra (se purili- 1

ca en cubas de purificacin). Las enzimas que


fragmentan almidn se inactivan por coccin,
de modo que en la posterior fermentacin con
levaduras slo se degraden Ja glucosa y la maltosa, pero no los fragmentos de almdn conos
(dextrina) indeseados en la cerveza.
Tras el enfriamiento del mosto y la captacin
de oxgeno se produce la fermentacin
mediante la levadura Introducida (trazas
de cultivo purificado de Saccharomyces cerevisfae). La levadura necesita oxgeno para
crecer y proliferar.

Las cervezas (Pilsen, de Donmund y de


Munich, Bock) son duraderas gracias a una
lenta subfermentacin (en 8 l Odas), cervezas Lager que pueden ser enviadas, mientras
que en una rpida sobrefermentacin (4-6
das) se originan cervezas ms ligeras. Subfer
mentados son todos los tipos de cerveza corrientes, y tambin la cerveza de barril. Sobrerermentadas son la cerveza blanca de Berln,
Kolsch y Alt, la cerveza Kararnel, as como Jos
tipos de cerveza inglesas Ale, Poner y Stout
Para terminar se permite a la cerveza la
maduracin final en stanos frescos y una
posterior fermentacin lenta durante varias
semanas a 0-2 C en barriles en almacn,
de los cuales se rellenan barriles de envo
o, tras la filtracin, botellas.

Lpulo

Agua

,..............
1

r
Cocido del mosto

;
Filtrar
j
...........................

........
Molino para moler el trigo

Centrifuga

Malta remojada

..

...........

Rellenar

.........

Tanque de almacn

......,,

-==-==='

Tanque de fermentacin

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......J

Refrigerante de platos

(ERVEZA,PAN,QUESO
Modelos de bolas y varillas

-oHidrgeno (H)

Carbono (C)

Azlcar de uva (13-o-gtucosa)

Nitrgeno (N)

Oxigeno (O)

- sFsforo (P)

Amlnolcldos (p.e. L-clsteina)

Flg.1.5 En este libro se


presentan los tomos y
las molculas en diferentes
representaciones.

Azufre (S)

Agua

cido actico (acetato)

tura celular compleja (compartimentos como mitocondrias} y un autntico ncleo celular. Se deno
minan tambin hongos productores de esporas, porque se multiplican sobre todo asexualmente (vegetativos} mediante esporulacln. Sin embargo, tam
bin se pueden reproducir sexualmente por copulacn de dos clulas esporas haploldes. stos tienen
una composicin cromosmica completa simple.
Las levaduras se clasifican segn el tipo de reproduccin de los diferentes tipos de hongos.

stos se encuentran en gran parte como polisacridos


y estn disponibles para las enzimas de la gluclisls de
las clulas de Ja levadura (Fig. 1.15), si son degrada
dos a disacridos y monosacridos por las am!lasas.

1.3 Tambin hoy en la Industria

cervecera se utilizan levadura,


agua, malta y lpulo

Tambin hoy la fabricacin de cerveza empieza,


como ya hacan los sumerios con e! germen de ceba
da,
con su conversin en la malta que contiene
Las levaduras constan solamente de una nica cluenzimas
(cuadro 1.2).
la. Esta clula madre forma en la esporulacin varias
protuberancias, brotes hijos, que se separan, son a su La malta se tritura entonces y se mezcla con agua
vez viables y pueden formar nuevas clulas (Fig. 1.3). templada. Esta malta remojada se introduce en un
Crecen de modo hetertrofo (a partir de nutrientes, tanque, donde a partir del almidn de los cereales,
sin fotosntesis} preferentemente a valores de pH ci- que se guarda en los granos, gracias al efecto de las
dos. Su pared celular consta, como la sustancia del enzimas que degradan almidn (amilasas) se origl
esqueleto de los insectos, de quitina, y adems de nan en unas horas azcar de malta (maltosa), az
hemicelulosa. La cerveza se origina mediante fer- car de uva (glucosa) y otros azcares. Las enzimas
mentacin alcohlica a partir de los hidratos de car- que degradan la pared celular ( ~celulasas} destru
bono de las semillas de los cereales. Sin embargo, yen las envolturas externas de los granos de cereal,

Fig. 1.6 Fbrica de cerveza


en el antiguo Egipto.

Flg.1.7 Cerveza con burbujas de dixido de carbono


claramente visibles.

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BIOTECNOLOGA

Fig. 1.8 Bacterias


Las bacterias son procariotas. es
decir, su informacin gentica no est
localizada en un ncleo celular sino
que se encuentra libre en el citoplasma como ONA de doble hebra en forma de anillo.
Les faltan los tlpicos orgnulos
subcelulares de los eucariotas Oevadu
ras, clulas de plantas y animales
superiores), como las mitocondrias
(para la respiracin celular) o los cloro
plastos (para la fotos!ntesis) y el retculo endoplasmtico.
Las bacterias viven predominante
mente de modo hetertrofo, es decir,
captan su energla de la materia orgnica. Sin embargo, tambin existen
tipos que pueden captar energ!a foto
sintticamente o de enlaces Inorgnicos (por ejemplo azufre).
Entre las bacterias hay unicelulares
mviles e inmviles (por ejemplo
pequeos bacilos), pero tambin pluricelulares, por ejemplo asociaciones
celulares del gnero Nocordia y redes
similares a hilos de hongos (micelios)
del tipo de Streptomyces.

La ilustracin muestra las bacterias


con importancia en biotecnologa.
Sus paredes celulares estn construidas de manera diferente (Cap. 4). Por
su coloracin bajo el microscopio se
distinguen las bacterias grampositivas
de las gramnegatlvas.
A los bacilos y cocos gramnegatlvos
aerbicos pertenecen Pseudomonas
(utilizacin de hidrocarburos, oxidacin de esteroides) y Acetobacter(formacin de cido actico), Rhizobium
(oltidacin de nitrgeno) y Methylophilus (protena unicelular, oxidacin
demetanoO.
Los bacilos gramnegatlvos anaerbicos facultativos son, por el contrario,
las bacterias intestinales Escherichia
coli, los "animales de compaa" del
ingeniero gentico.
Bacillus (produccin de enzimas) y
Clostridum (produccin de acetona
y butanoO pertenecen a los bacilos y
cocos gramposltlvos formadores de
esporas.

Los grampositivos en forma de maza


del tipo Corynebocterium forman aminocidos.

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los cocos grampositivos son los formadores de cido lctico, como Streptococcus, Staphylococcus (intoxicacin de alimentos), Propionibacterium
(vitamina e,,. preparacin de queso).
Nocarda (oxidacin de hidrocarbu ros)
y estreptomlcetos (antibiticos, enzimas).
Lactobaci/lus (formacin de cido lctico) se cuentan entre las bacterias
grampositlvas no formadoras de
esporas.

Las bacterias producen un gran dao


al causar enfermedades y estropear
alimentos, pero sin embargo tambin
tienen un enorme significado econmico en los procesos biotecnolgicos.

CERVEZA, PAN, QUESO

Flg. i.9 Hongos


Los hongos desempean un papel des
tacado en los ciclos de la naturaleza,
sobre todo en los procesos de degrada
cin. Se han clasificado hasta ahora
aproximadamente 70 ooo hongos.
Las levaduras pertenecen, como todos
los hongos, a los eucarlotas, es decir,
su material gentico est concentrado
en un ncleo celular. Son hongos productores de esporas (endomlcetos).

Apartir de levadu ras salvajes se


obtienen cultivos de levaduras que
tienen un gran significado industrial,
como las levaduras de cerveza (por
ejemplo Saccharomyces carlsbergensis), levaduras de vino y de pan
(S. cerevisiae) y levaduras del forraje
(Candida). Candida utilis crece sobre
las aguas residuales de sulfito de las
fbricas de celulosa como levadura de
forraje. Candida maltosa se alimenta
de alca nos (parafinas) del petrleo y
puede generar forraje. Trlchasparon
cutaneum es un importante aerbico
que se encuentra en aguas resldua
les, que incluso puede degradar enol
- un veneno para otros hongos. Tri
chosparon y la levadura Arxula adeni
nivorans se utilizan como sensores

microbianos en aguas residuales


(Captulos 6 y 10).
Los mohos pertenecen a los mohos
con sacos esporales o esporangios
en forma de manguera (ascomlcetos),
que con 2 0 ooo tipos es el grupo
mayor de los hongos. Tienen, en
contraste con las levaduras redondeadas, largas clulas estiradas, y viven
principalmente estrictamente aerbicos. Los mohos forma n esporas asexualmente mediante divisin de los
ncleos celulares de los sacos espora les, que en general se expanden
en el aire del micelio. Las esporas
maduras se propagan con facilidad
con el viento. Si caen en un sustrato
apropiado, germinan y forman nuevos
micelios.
Muchos hongos se clasifican segn
su apariencia (morfologa) y el color
de sus sacos esporales (esporangios),
porque el micelio generalmente es
difcil de distinguir, pues es incoloro
y representa un desorden en forma
de tubo. Puesto que los hongos ms
importantes industrialmente se introducen (sumergen) principalmente
en tanques como grumos mviles
de micelios, no forman esporas.

En cuanto a alimentacin, los mohos


son similares a las levaduras, aunque
se tratan ms verstilmente. As, algunos pueden -en contraste con las leva
duras- crecer tambin sobre celulosa
(Trichoderma reese1) o lignina (!'hanoerochoete chrysosporlum) (Cap. 6) .
Los mohos del gnero Asperglllus
(mohos con esporangios en forma
de regadera) y Penlc/11/um (mohos
con esporangio en forma de pincel)
son la base para muchas fermentaciones, particularmente para la degrada
cin del almidn y las protenas en la
cebada, el arroz y las habas de soja.

Aspergil/us nigerproduce cido cltri


co. Penici/lium chrysogenum es el pro
ductor de penicilina (Cap. 4).
Otros mohos con esporangio en forma
de pincel generan quesos como el
camembert y el roquefort. las amila
sas y proteasas generadas por hongos
se obtienen tambin como preparados
enzimticos industriales (cap. 2).

Endomycopsis y Mucor producen tam


bin enzimas industriales.
Fusarium se utiliza para la produccin
de protenas para la alimentacin huma
na ("Quorn", Cap. 6).

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BIOTECNOLOGA

para que la a-amilasa pueda atrapar el almidn del


interior de las semillas. Acontinuacin se filtran los
componentes slidos de la malta remojada y se lle
va la parte liquida dulce al caldero de la mezcla. Se
afiade entonces el lpulo, que aporta a la cerveza su
sabor amargo especiado.
El mosto as creado es vertido por el fabricante de cer
veza a un tanque de fennentacin y se afiaden las
levaduras de la fabricacin de la cerveza.
Entonces empieza la fermentacin alcohlica. Tras
la fermentacin se guarda la cerveza algn tiempo en
tanques, para madurar. Para tenninar, la cerveza se
calienta brevemente para destruir microbios perjudi
ciales, y entonces se vierte en botellas, latas o barriles.
Los procesos fundamentales en la fabricacin de
cerveza moderna son, pues, los mismos desde hace
ms de mil aos. Pero entonces los seres humanos
utilizaron los microorganismos inconscientemente
para sus propsitos.
Casi todos los pueblos de la Tierra hicieron en
la antigedad descubrimientos similares a los de
los sumerios. El vino se invent seguramente hace
6000 afias en la zona del monte Ararat. Sin embar
go, los ms recientes hallazgos remiten a los chinos
como los descubridores del vino hace 9000 afias, en
la Edad de Piedra (cuadro 1.7).
Los antiguos griegos y romanos preferan el jugo fer
mentado de las uvas, el vino (cuadro 1.3). Los roma
nos fueron, pues, los que llevaron el desarrollo y la
fabricacin del vino al Rhin y Mosel. Del mijo, los afri.
canos obtuvieron con Schizosaccharomyces pombe
la cerveza pombe; el pueblo de la estepa asitica fer
ment leche de yegua en botas de cuero para el
kumys; los japoneses preparaban sake, una bebida
Flg. uo Comparacin de
la medida de importantes
microorganismos biotecno
lgicos. La longitud de los
ciliados (Paramecium) indica
el grosor de un pelo humano: 1/10 mllfmetros o
100 micrmetros.

~
<---..!__
!':

Flg.1.11, derecha:
Proporciones de clulas
eucariticas y procariticas
y virus.

t DNA

to ooo
rbosomas

Varios
: plsmdos

Longitud: 2 micrmetros 2/1000 mm

Masa: 5x101Jg

Nmero de molculas y porcentaje en peso


Flg. 1.12, derecha ms all:
Una clula bacteriana
(Escherichia co/1) en cifras.

Virus de la rabia: 150 nm


Virus de la gripe: 100 nm
Bacterl6fago: 95 nm

Virus de la pollo: 27 nm

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Agua
Proteinas
Azcar
Lpidos
Aminocidos y cidos orgnicos
DNA
RNA
Materia inorgnica

1010

80,0%

106-101
107

10,0/o

108
106-107

2,0/o

2,0/o
1,3%
0,4%

10S106
108

3,0%
t ,3%

(ERVEZA,PAN,QUESO

1 ,.

Vino y licores

Para la preparacin del vino primero se aplas


tan las uvas en las prensas. En la fabricacin
del vino blanco sigue enseguida el prensado
(prensas) o el pisado, y el jugo (mosto) se
separa de los tallos, las pieles y los granos
(como residuo, denominado orujo). La ad!
dnde pectinuu (Captulo 2) Incrementa
el rencllmlento del jugo considerablemente
y conduce a un mosto ms claro. En la pro
duccln de vino tinto se mantiene sin separar el prensado directo del fermentado prlncl
pal, pues el colorante de las antocianinas est
localizado principalmente en las pieles de
las uvas rojas y azules, y pasan a la disolucin
con la formacin de alcohol. Por ello este
prensado se separa tras 4 o 5 das en reposo.
La fermentacin tiene lugar a travs de la
parte exterior de los granos de uva por las
bacterias encargadas de ello o por la lnocul
dad y calidad tras una anterior pasteuriza
cin mediante la adicin de cultivos purifica
dos de levadura (cepas de Saccharomyces
cerevfsfae). El proceso transcurre con una
enorme formacin de espuma. El "mosto
del vino" as! originado, que nubla las clulas
de levadura, en algunas zonas es apreciado
como bebida. Durante los cuatro a ocho d!as
que dura la fermentacin principal se utl
liza casi el azcar total. Las prote!nas y pectl
nas se segregan en forma Insoluble y se unen
con las levaduras como almacenadoras de
los restos descritos, que se separan del vino.
En el primer ano, en una lenta posfermenta
cin en las fras bodegas fermenta an el
azcar restante (crecimiento); entonces se
origina un segundo almacenamiento. Slmul
tneamente se forman en el vino los materia
les aromticos que originan el bouquet (aro
ma, flores). El vino joven disponible tras la
terminacin de la fermentacin se tapa her
mtlcamente, antes de rellenar los barriles
de almacenamlento ensulfatados, en los cua
les (de vez en cuando con aireacin tempo
ral) se consigue su maduracin. Durante
este tiempo empieza tambin el tratamiento
en la bodega. tste sirve en primera Instancia
para aumentar la durabilidad (por ejemplo
mediante azufre, pues et dixido de azufre
es ms venenoso para las bacterias que para
las levaduras) y la clarlficacln. Los prlnclpa
les vinos tienen un contenido en etanol
entre el IOyel 12%.
Un proceso ms Importante es la degrada
cin del cido mllco {malato), mediante
bacterias lcticas, a cido lctico (lactato)
esencialmente dbil. Sin esta fermentacin

malo/4.ctlca los vinos alemanes, debido a


su alto contenido cido (de 8 a 10 gil), no
podran beberse.

La diferenciacin de los vinos tiene lugar


segn el color (principalmente vino blanco
y tinto), el origen y el tipo de vid (por ejem
plo Rlesllng, Trolllnger, S~tburgunder, Silvaner). El contenido restante de azcar se
produce Interrumpiendo la fermentacin
o la adicin del mosto: seco (max. 9 gil),
semlseco (max. 18 gil) y dulce (ms de
18 gil). Los vinos reforzados, como Madel
ra, Jerez, Oporto o Vermut, son vinos a los
cuales se aflade azcar, etanol y a veces hierbas. Los microbios no intervienen para nada.
El champn y otros vinos espumosos
requieren una fermentacin doble. Se lnclu
ye dellberadamente C02 dentro de la bote
lla. A una mezcla de vino blanco se le aflade
jarabe de azcar y se rellenan botellas tapn
dolas especialmente fuerte con corchos.
Las botellas se almacenan en un estante (pl
pito), donde el vino puede fermentar lenta
mente. Una levadura de champn especial
crece en la botella. Durante meses se dejan
depositar lentamente, con las botellas boca
abajo. Las levaduras y los residuos se almace
nan entonces sobre el corcho. En ese
momento se reemplaza rpidamente el corcho y se aflade jarabe de azcar y brandy. As
se origina un vino noble duradero, que gotea
con lgrima fina durante largo tiempo des
pus de abrirlo. En el vino espumoso, en
cambio, se aade co2 bajo presin a un vino
tranquilo.
Entre los espirituosos (del latn spirftus,
espritu) se encuentran los aguardientes, llcores, ponches y bebidas mezcladas (ccteles).
Son bebidas ya fermentadas, como el vino o
productos de fculas, o bien dlsoluciones de
azcar, como zumo de fruta o melazas, que
despus de la fermentacin se procesan hasta
Ucor, es decir, se destilan. En los denomina
dos Ucores nobles (brandy, conac, ron, arrak,
whisky, genciana, ginebra y Ucores de frutas)
permanecen Jos productos originados junto
al etanol (ster, alcoholes superiores, aldehf
dos, cidos, acetato, etc.), debido a su sabor
aromtico agradable, completamente o en
parte en et destilado. Si se fermentan produc
tos fuertes, se origina poco alcohol.
Las bebidas aguardientes habituales se

producen en general simplemente por rutas


fras medlante mezclas de licores primarios
con agua y con determinadas sustancias
sabrosas (por ejemplo ans, hinojo, comino,

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enebro) descritas como especias. Deben con


tener al menos un 32 %en volumen de eta
nol. Los aguardientes de cereales (tam
bln denominados aguardiente de trigo o
licor de trigo) pueden ser de centeno, trigo,
trigo sarraceno, avena o cebada. En el
whisky orlg!.nal procedente de Escocia o
Irlanda (al menos 43 %en volumen de eta
nol), los granos de malta se exponen a
menudo directamente a humo de turba o
carbn. El vodka con un 40 a 60 %en volu
men de etanol consta de centeno, patatas
u otras plantas feculentas, y se consigue a
travs de varias destilaciones contracorriente
de afrecho. La ginebra se consigue aadien
do bayas de enebro a la malta remojada de
cereales o de la extraccin de bayas de ene
bro por destilacin.
Los aguardientes de frutas (al menos 38 %
en volumen de etanol) se obtienen a partir
de una destilacin directa del fermentado
completo de frutas o bayas, o de sus jugos,
sin adicin de azcar, ms etanol y colorantes. El licor de cerezas, el licor de ciruelas
o Sllvowltz, y el Mesplrituoso" (aguardiente
de frambuesas, aguardiente de enebro) constan de frutas de bayas, albaricoques y melocotones no fermentados con la adicin de
alcohol. El brandy (al menos 38 % en volu
men de etanol) slo puede producirse de
vino.
El nombre de coftac es exclusivo del brandy
que se produce de uvas, cosechadas en la
zona de los departamentos de CharenteMaritime, Charente, Dordogne y Deux
S~vres. El ron se obtiene del jugo y de los
remanentes de la caa de azcar mediante
fermentacin y destilacin (contenido medio
de etanol 38% en volumen). El producto
de partida para el arrale es arroz o el jugo de
dtiles de palmera.
Para obtener licores, los espirituosos
se tratan con azcar y determinados produc
tos aromticos, maceracin o destilacin
con plantas y frutas. Los ponches (del hind
panscha, cinco) son preparaciones calientes
con cinco Ingredientes: etanol, condimentos,
zumo de llmn, azcar y un poco de t o
agua. Los ccteles (en ingls cocktail,
cola de gallo), bebidas mezcladas que contie
nen etanol, estimulantes del apetito,
reciben su nombre de la guerra de la lnde
pendencia americana. Entonces se esforza
ban en colocar diferentes tipos de lquidos
sin mezclar unos sobre otros, de modo que
la bebida se asemejaba a una magnfica cola
de gallo.

BIOTECNOLOGA

Amilasas

. .....................

Glucosa

........ .......... . ...... . ...... . ................ ...................

Estreptomicina

....................

:u "''''.

"''*'.

l'

VaUna

Piruvato lj
....._,

L. aAmlnoadipato ...J

02 ...:

'

...........~

t-

Biopolmeros

Etanol

'

cido lctico {lactato)

Acetll-CoA

Aspartato

Lisina

:...... cido frmico (formiato)

t C02

,. ...............*.............,

f..... cido actico (acetato)

t,,

Cistena
Penicilina
Cefalosporina

.....!

Serlna

".........
cido ctrico

Oxalacetato

'

C~c~o

r.

cido actico

Krebs /

Sucdnato

~............

______ ... .

"__
r __
Aconltato

.......

Oxoglutarato

lsoprenoide
Productos
biotecnol6gicos

Glutamato

Arginina

Cmo se transforma
la glucosa
La degradacin de la glucosa (gluclisisJ
empieza en la clula con un traslado
enzimtico de un grupo fosfato del cofactor
adenosina trilosfato (ATP) (Fig, 1.15). Esta
transformacin utiliza energla. En los
siguientes pasos, la energa se libera de los
productos.

Se forman los cofactores nkotinamida


adenina dinucletido (NADH) y ATP.
Los cofacwres son importantes productos
de ayuda regenerables para enzimas
(vase Cap. 2). Los seis tomos de carbono
originales que contiene la molcula de
glucosa por degradacin enzimtica se frag
mentan en dos partes; finalmente se origina
piruvato (cido pirvico) de glucosa, tras
una secuencia de reacciones enzimticas.

10

'

Butano!
Acetona
cido butrico

El piruvato desempea un papel cenera! en


el metabolismo. La parte principal del piru
vato se oxida y se libera "cido actico acti
vado" (acetil-coenzima A). Con ello se origi
na tambin por primera vez un producto
final de la combustin de glucosa: cor
Ahora quedan en el acetil-coenzima A slo
dos tomos de carbono. Una pequea canti
dad de piruvato se convierte en oxalacetato.
Con esta pequea cantidad de oxalacetato
empieza el denominado ciclo de Krebs
(por su descubridor, el bioqumico alemn
emigrado a Inglaterra y ganador del premio
Nobel Sir Hans Krebs), tambin denominado
ciclo de los cidos tricarboxllcos, en el cual
los dos tomos de carbono del acetilcoenzi
ma A entran en un ciclo y se oxidan a dos
molculas de C02 Los productos intermedios del ciclo de Krebs, como el cido ctrico,
estn disponibles normalmente a concentra

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Gibberelina
Esteroides
Carotenoides

Tetraciclina
Griseofulvina

dones menores; se decide en un equilibrio


de !lujos (Cap. 4). En la degradacin de glu
cosa, la deshidrogenacin (prdida de hidr
genos) libera energa. Para ello Interviene
el cofactor oxidado NAO+, sobre el cual se
transfiere el hidrgeno con el tiempo. Sin
embargo, el cofactor reducido (NADH) debe
"liberar" hidrgeno de nuevo, porque si
no no podran producirse las reacciones de
degradacin de glucosa que liberan energa.
Esto ocurre mediante reacciones enzimticas
en las mitocondrias, en la denominada cade
na de respiracin. En la cadena de respiracin, el hidrgeno del NADH lo utiliza la
enzima citocromo oxidasa (Fig 1.14 y
Cap. 2), descubierta por Otto Warburg, para
quemar hidrgeno con una elevada obtencin de energa "fra" a agua. Con ello se
obtiene energa.

(ERVEZA,PAN,QUESO

alcohlica de arroz; los rusos kwass con tipos de


Lactobacillus y el moho Aspergillus oyzae para
azucarar.
Hasta hoy la produccin del vino (Cuadro 1.3) ha
cambiado slo un poco: de uvas rojas y blancas, tras
la vendimia se obtiene por aplastamiento y presin
(prensas de vino) jugo de uva. Este jugo filtrado fermenta en barriles cerrados. Antes eran barriles de
madera, hoy se utilizan tanques de metal con capacidad de hasta 250 000 litros. Mundialmente se
producen cada ao alrededor de quinientos millo
nes de hectolitros.

1.4 Las clulas funcionan


con energa solar
Diariamente la esfera incandescente del Sol manda
cuatro miles de billones de kWh de energa a la Tie
rra. El Sol, por consiguiente, cada 30 minutos suministra gratis la energa que utilizan todos los habitantes de la Tierra juntos en un afio. Slo tres milsimas
de esta energa solar se transforman en energa qumica mediante fotosntesis en las plantas verdes.
El agua, con la ayuda de un cuanto de luz energti
co, se destruye en los cloroplastos de las clulas
(Cap. 7) en sus componentes oxgeno (anualmente
100 000 millones de toneladas) e hidrgeno, y solamente el oxgeno se libera en forma molecular, gaseosa. Lo utilizan todos los seres vivos que respiran para
la "combustin fra" de las sustancias. El hidrgeno
liberado en la fotosntesis, en cambio, se estabiliza en
un tiempo breve mediante el enlace anualmente con
200 000 millones de toneladas de carbono y se une
temporalmente a hidratos de carbono (azcares).
Los hidratos de carbono son productos cuantitativamente habituales en la fotosntesis y, por
ello, son la fuente de energa para los principales
seres vivos.
Con la respiracin, el hidrgeno se separa de nuevo
de su unin a la materia carbonada y se libera gra
dualmente en una "reaccin de explosin gaseosa
bioqumica" produciendo energa en la cadena de
respiracin. Al final, toda la energa viene del Sol!
Las clulas necesitan, tanto durante el crecimiento
como en el estado de reposo, un suministro permanente de energa, que se obtiene mediante el intercambio dirigido de las sustancias dentro de las clu
las (metabolismo o intercambio de materia).
Las fuentes de energa son los alimentos ingeridos.
Se transforman mediante una serie de reacciones
enzimticas dispuestas una tras otra en rutas metablicas.
Asf originan los componentes y la energa para las

sntesis y otros procesos complejos energticos: pri-

mero los alimentos se degradan en pequeos trozos


y se transforman en compuestos de bajo peso molecular, a partir de los cuales se construyen los componentes de la clula: azcar de uva (glucosa), amnocidos, nucletidos (bases pirimidcas y purcas y
azcares-fosfato), cidos orgnicos y lfpidos.

Cofactor reducido

H -, NAO
f

--;

./

A partir de ellos se construyen las "enormes mol


culas" de las protenas, los cidos nucleicos y los
componentes de la pared celular.
Puesto que los hidratos de carbono son cuantitati
vamente los productos habituales de la fotosntesis,
y con ello, al mismo tiempo, el alimento para la
mayora de los seres vivos, salen en primer lugar de
la glucosa (azcar de la uva). De la misma manera
en que la produccin de muchos productos de biotecnologa depende de la degradacin de glucosa en
las clulas.

1.5 El alcohol no es un placer sino

una necesidad para las levaduras


Pasemos ahora a la bioqumica, para responder a
una "pregunta vital" de las clulas de levadura.
Las levaduras pueden vivir como respiradores
(aerbicos) o fermentadores (anaerbicos), y
por lo tanto son aerbicos facultativos. En presen
cia de oxgeno las levaduras crecen esplndida
mente, con la respiracin convierten azcar en
co2 y agua, y originan con ello energa, que utili
zan para el crecimiento y la produccin de nuevas
clulas.
Si se detiene el suministro de aire a las levaduras,
los microbios interrumpen su metabolismo de fermentacin en la medida de la necesidad. La fer
mentacin les ayuda a sobrevivir en tiempos hos
tiles, a pesar de ser energticamente desfavorable.
Louis Pasteur descubri en 1861 que una levad u
ra sin oxigeno utilizaba ms glucosa. Esto se deno
min efecto Pasteur. Las levaduras en condiciones anaerbicas procesan ms molculas de az
car para compensar las prdidas de energa. Pues
to que no hay ms oxigeno para utilizar, tampoco
puede quemarse en la cadena de respiracin con
el cofactor NADH + W acumulado. La degrada
cin de glucosa permanece, por lo tanto, en la fase
de piruvato (Cuadro 1.4).
La clula transforma piruvato en acetaldehfdo. Con
ello se libera C02 El ciclo de Krebs ya no puede ser
utilizado. Para utilizar el NADH + W acumulado,
que no puede remddarse a NAD en la "combustin
fra" debido a la deficiencia de 0 21 a la clula le queda solamente un camino: utiliza la alcoholdeshidrogenasa (Hg. 1.3) y forma, a partir de acetaldehido, con la utilizacin de NAD H+ W, etanol y NAD+.

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li

NA~

J;Y, --J""
Etanol
Flg. u3 La alcohol
deshidrogenasa de la levadura transforma acetaldehdo
en etanol. Para propsitos
bioanalticos (Captulo 10)
se utiliza la reaccin inversa
para analizar la presencia
de etanol en sangre.

Ox?
Equivalentes
de reduccin

Fig. 1.14 La citocromo


oxidasa. "fermento de ta
respiracin". descubierta
por Otto Warburg. Transfor
ma en una "combustin fra"
hidrgeno en agua con
utilizacin de energa.

11

BIOTECNOLOGA

La glucosa se uquema" finalmente de modo incom


pleto a alcohol y COr En la fermentacin de una
molcula de glucosa se originan slo una a cuatro
molculas de "moneda de cambio energtico" ATP
(en lugar de un mximo de 38 en la respiracin con
oxigeno); esto es suficiente para sobrevivit

Flg. i.t5 La glucllsls y sus enzimas.


Degradacin de glucosa a plruvato (slmpllflcada).

Hexoquln1S1

El alcohol no es, por lo tanto, un placer para la leva


dura, ms bien una necesidad, pero muere si el con
tenido de alcohol supera un determinado valor. Con
trartamente a la opinin clsica, el etanol tambin
puede producirse aerbicamente (efecto Crabtree)
si el medio de alimentacin contiene ms de 100 mg
de glucosa por litro. En esta "reaccin en exceso" el
p!ruvato no se oxida siguiendo el ciclo de Krebs, sino
que se reduce a etanol.

------ t -

DGlucosa

Fosfohexosa lsomeraH

Con la ayuda de los modernos chips genticos


(Cap. 1O) para RNAm de levadura (un cido nuclei
co de una nica hebra, que desde el DNA del ncleo
celular alcanza los ribosomas con las Instrucciones
de construccin para las protenas, vase Cap. 3) se
observa que cuando hay deficiencia de oxigeno las
levaduras anaerblcas producen otras enzimas dife
rentes a las de las levaduras aerbicas. Es decir, los
genes (DNA) se escogen de manera diferente y
expresan diferentes protenas, segn la situacin de
oxgeno de la clula de levadura.

Glucosa6fosfato

FosfofructoqulnlSI

fructosa6fosfato
AldollSI

fructosa1,6blsfosfato
Olhldroxlacetona
fosfato

+ Gliceraldeh(do3
fosfato

Otros fermentadores, las bacterias, forman cido


lctico (lactobaclllus), cido butirico (Clostri
dlum butyrfcum), cido propinlco (Propionibac
terfum), acetona y butanol (Clostrldlum aceto
butyllcum) (Cap. 6), asf como otros productos con
gasto de ATP, y los secretan.
Los productos de la fermentacin se forman, pues,
en grandes cantidades, ya que slo la transforma
cin libera mucha ms cantidad de alimentos en
ausencia de oxgeno que energa requerida en for
ma de ATP de las clulas.
Ahora est claro por qu los primeros procesos de
biotecnologa que utilizaron los humanos fueron la
fermentacin del alcohol y del cido lctico: las fer
mentaciones liberan grandes cantidades de produc
to en un breve tiempo y son, por lo tamo, altamen
te efectivas.

1.6 Los licores muy concentrados


se producen mediante destilaci6n
Las levaduras forman alcohol slo hasta una determinada concentracin, pues con porcentajes altos
de alcohol mueren. La cerveza y el vino contienen
alcohol nicamente en forma diluida. El vino tieTrlos1fosf1to lsomer1S1

12

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CERVEZA, PAN, QUESO

ne un 12 a 13% de alcohol y el sake alrededor del


16 al8%.
Se conoce una forma concentrada (aguardientes o
licores) ya desde el siglo XII, cuando se calent (destil) vino en una caldera cerrada.
El truco de la destilacin de alcohol (o sea la rectificacin) es que el alcohol se evapora a 78 C, o
sea, bastante antes que el agua, que hierve a 100 C.
El vapor de alcohol creado se conduce a un refrigerante a travs del que gira agua fra, se enfra y se
condensa en forma de gotas. El alcohol altamente
concentrado se Introduce en un recipiente.

Plruvatoqulnasa
2 Lactato

~
1

2 ZAcetll
CoA

2+

2 Etanol

+C02

----------------t------------Enolasa

Los licores o espirituosos (del latn splrttus, espfri


tu) son aguardientes con al menos un 32% en vol
men de etanol (Cuadro 1.3). Mencionaremos sola
mente el col'lac, el aguardiente alemn, el armaf\ac,
el licor de frutas, el whisky, el vodka y la ginebra.

2
~

El famoso coftac se descubri a principios del siglo


y:. por los cultivadores de vino en la Charente francesa, cuando debieron responder a la menor calidad
de su vino frente a la calidad del vino de la vecina
regin de Burdeos. Tuvieron la Idea de destilar su
vino. Ms tarde el producto se destil Incluso dos
veces, una tras otra. Tambin todava hoy el cof\ac
joven viene con un contenido en alcohol del 70%
en barriles de roble de Llmousin, donde madura
parcialmente durante aflos hasta alcanzar la grandeza completa, asumiendo el color del tonel y el sabor.
Solamente despus se diluye a un 40%.
Hoy se obtiene en las destileras modernas alcohol
puro de almidn de cereales o patata. ~ste se transforma primero mediante amllasas degradadoras de
almidn en azcar, que se fermenta con las levaduras
a alcohol, se calienta y el alcohol se destila entonces
hasta el lmite superior del 96%. Un argumento de los
amantes del alcohol es que el alcohol ms concentra
do destruye los grmenes. En realidad, el alcohol al
70% se aplica en medicina para la desinfeccin exter
nade la piel.
Aconcentraciones del 2 o 3% el alcohol ya aumen
ta la perrneabllidad de la membrana citoplasmtlca
de las bacterias e Inhibe su crecimiento. Est claro
que el alcohol altamente concentrado Inhibe an
mejor. Las frutas confitadas en alcohol, por ejemplo
en Jos ponches de fruta y ron, duran mucho tiem
po y demuestran claramente el efecto lnhibldor de
los microbios que tiene el alcohol. Dentro de los
microorganismos, los que pudren e Intoxican ali
memos son principalmente sensibles al alcohol y se
destruyen.

tPiruvato

2-rosrogllcerato
Fosfo1\lcerato mutasa

3-fosfogllcerato
Fosfos\lceratoqulnasa

H~
1,3-blsfosfogllcerato
Gllceraldehldo-3
fosfato deshldropnasa

NAOJ
+

Fosrato
lnorgAnlco

Gllceraldehldo-3-tosrato

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13

BIOTECNOLOGA

Productos de leche
agria y queso

Los productos de leche agria se obtienen uti


!izando bacterias lcticas.

mijo del Profeta, adoptan forma de coliflor,


en ndulos del tamao de una avellana, que
constan de casena coagulada y azcar de la
leche fermentado por levaduras, como Saccharomyces kefiry Toru/a kejir, algunos
tipos de Lactobaclllusy Streptococcus, los
aromatizantes que forman Leuconostocy
tambin bacterias del cido actico.

cuidado la gelatina en dados (quebrado) de


un centmetro. Se retira el suero, se da formas al quebrado.
Despus de varios cambios y un bao de sal,

el queso Emmental (queso suizo) se seca


(aproXimadamente durante dos semanas) y se
almacena en un stano caliente durante seis a
ocho semanas. Entonces las bacterias propinicas fermentan el cido lctico a co2 y cido
propinico, con lo cual se forman los caracte
rsticos agujeros y el sabor del queso suizo.
Luego el queso madura durante seis meses.
El queso Limburger se lubrica varias veces
tras el secado, es decir, se trata con un
"cultivo de lubricante rojo" (Brevibacterium
lnens).

Preparacin
del camembert

La leche agria se produce con leche pasteu


rizada a la cual se aaden cultivos de Strep
tococcus cremoris, Streptococcus lactis y
Leuconostoc cremors, como bacterias aro:
mticas, unas l 6 horas en el tanque de acidi
ficacin.

Para la produccin de yogur se toma leche


de cabra, oveja o vaca. El cultivo de yogur
consta de bacterias lcticas termfilas (que
les gusta el calor), como Streptococcus ther
mophilus y Lactobacllus bulgarcus. Ambas
existen conjuntamente (simbiosis): Lactobacllusproduce el producto de fragmentacin
de la pl'otelna de la leche, casena, requerido

El Camembert, infectado con esporas de


Penicllium caseicolumde rpido crecimien
to o del tradicional P. camemberti, se deDiferentes clases de queso de Crcega

El kumys se hace con leche de yegua, que


se fermenta con una mezcla de bacterias lcticas y levaduras.
Tambin la mantequilla de nata agria es un
producto de microbios. Despus de obtener la
nata y tratarla con calor, se enfra y "madura".
Con ello cristaliza la grasa de la leche. Tras la
infeccin con acidificado res (S. /actis, S. ere
morisy Leuconostoc cremors) se convierte
el azcar de la leche {lactosa) en cido lctico
y "aroma de mantequilla" (diacetilo) y acetona. El suero de la mantequilla es un producto
colateral de la fabricacin de la mantequilla.

sarrolla en un stano seco despus de tres


a cuatro d{as de crecimiento del moho, y tras
nueve a once das se puede empaquetar y
vender. El camembert a menudo sigue madu
rando despus de comprarlo: las enzimas
fragrnentadoras de las protenas del moho
ablandan la masa del queso y liberan materias
aromticas y amoniaco (aroma muy fuerte).

los conocidos agujeros en el queso: t rabajo


de las bacterias propinicas

Camembert, un trabajo de mohos con esporangio en forma de pincel

por Streptococcus, Streptococcus forma en


cambio cido frmico, que acta como conservante.

Roquefort con entradas de aire para


el crecimiento de los hongos

El kfir es una bebida espesa, densa, ligera,


con gas. Contiene un 018 a 1%de cido lctico, un 0,3 a 0,8% de etanol y dixido de carbono, que junto a bajas cantidades de diacetilo, acetaldehdo y acetona contribuyen
esencialmente al sabor del kfir. Los granos
de kfir, llamados por los musulmanes el

La preparacin del queso empieza princi


palmente con la infeccin de Ja leche pasteurizada con bacterias lcticas y mohos (culti
vos iniciadores). Mediante el aporte de la
enzima coaguladora se coagula la leche (casi
durante una hora) y se espesa. Se corta con

14

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El Roquefort autntico se produce con


leche de oveja cruda fresca. El quebrado se
infecta con esporas de Penicillum
roqueforti. Tras darle forma se transportan
los quesos de toda Francia, desde Crcega
hasta los Pirineos, a Roquefort, donde se
salan y pinchan con agujas (amoscado) para
crear entradas de aire para el crecimiento de
los hongos. La maduracin sigue finalmente
en cuevas naturales de las montaas en
Roquefort. Los quesos maduran aerbicamente durante 20 das y luego en hojas de
estao tres meses en ausencia de aire (anaerbicamente ), donde luego actan las enzimas de los mohos fragmentadoras de protenas y grasas.

(ERVEZA,PAN,QUESO

Sake, salsa de soja


y otros productos fermentados
asiticos
la produccin del salce japons (vino de
a.tTOZ) se parece ms a la fabricacin

utiliza el prensado como forraje. la salsa de


soja contiene, adems de un 18 %de sal de
cocina, ms de un 1 % de la sal del aminoci
do glutamato (vase Cap. 4) reforzador del
sabor, y un 2 %de alcohol.

El angkak (arroz rojo) se produce con arroz


filtrado a travs del hongo Monascus purpu
reus, y se utiliza en China, Indonesia y Filipi
nas como especia picante y como colorante.

de cerve-

za que a la del vino, porque el almidn conte-

nido en el arroz debe convertirse primero en


azcar fermentable por las amilasas fragmen
tadoras. las esporas del moho Aspergillus ory
zae se mezclan con arroz cocido. La mezcla se
mantiene cinco a seis dias a 35 C, para producir el denominado Kojl, que contiene en
altas concentraciones las enzimas de los hon
gos fragmentadoras de almidn y protemas.
Koji, mezcla de grandes cantidades de arroz
cocido y cultivo iniciador (Moto) de cepas
de levadura, como Saccharomyces cerevfsfae,
fermenta durante tres meses como Moromi
el arroz a sake. El sake contiene aproximada
mente un 20 %en volumen de alcohol.
En la salsa de soja (Shoyuen Japn,
Chiangsiuen China, Sfauen Hong Kong) se
procede de forma si.milar. Se coloca el Moro
mi de las habas de soja, trigo y Koji con gran
des cantidades de sal de cocina y se fermenta
durante ocho a doce meses con Aspergiflus
soyaey A. oryzae. la bacteria Pedicoccus
soyae, la levadura Saccharomyces rouxii,
y cepas de Hansenula y de Torulopsis, a
menudo se aaden como cultivos iniciadores
que forman cido lctico y alcohol. Tras la
fermentacin, la salsa de soja se prensa; se

Habas de soja fermentadas


con mohos: Notro

Barriles de sake, apilados frente a un templo


japons

El tempeh son habas de soja cocidas, que se


envuelven en hojas de pltano.

El miso es una pasta de soja fermentada,


que desde la antigedad ha servido en Japn
como aporte de protenas principales. Se ela
bora tambin con Kojiprevio. El tofu (o
sufu) es la protena de soja coagulada con
cido, que se fermenta de Mucor su.fu.
El natto, que huele fuenemente (a amonia
co!), se hace con habas de soja filtradas,
envueltaS en hojitaS de abeto rojo, que se
infectan con Koji(Aspergillus oryzae) y tras
varios meses se fermentan con Streptococ
cusy Pediococcusotra vez.

Al menos en los albores de la humanidad, la


fermentacin del alcohol fue pues importante para la
obtencin de comida perfecta, duradera e higinica.

1.7 Productos bacterianos:


ila acidez los hace duraderos!
Las bacterias son procariotas y unas diez veces ms
pequeas que las clulas de las levaduras. Para
hacernos una idea del tamao de las bacterias, nos
podemos imaginar un dado diminuto de 1 mm de
longitud de arista (o sea, con 1 mm3 de volumen).
En l caben no menos de mil millones de bacterias.
Las bacterias (Fig. 1.8) a menudo tienen forma de
pequeos bastones. Conocemos tambin bacterias
en forma de esfera, los cocos (del griego lcolcJcus,
grano redondo); las de forma de coma, constante
mente temblando, los vibriones (del latn vibrare,
temblar, vibrar), y las serpenteantes en forma de tor
nillo, los espirilos (del latn splrtllum, pequeos
tornillos). Muchas bacterias tienen flagelos, largos

Salsa de soja (Shoyu) con Wosabi (rbano


picante rayado, que contiene peroxidasa, va
se Cap. 2).

apndices, con los cuales se pueden mover rpida


mente. Las bacterias en general reproducen sus
clulas dividiendose por la mitad. Por ello inicial
mente se denominaron "clulas separadoras" (Fig
1.16). La mayora de las clulas hijas asf formadas
se separan. Si se mantienen juntas, unas con otras,
se originan cadenas de clulas bacterianas y se
denominan estreptococos (del griego streptos,
cadena). Si se agrupan en forma de racimo de uvas
se llaman estafilococos (del griego staphyle, uva).
Adems de las levaduras estuvieron y estn las bacte
rias, que producen una variedad de alimentos y forra
je, as como productos estimulantes. Incluso para la
produccin de alcohol se utilizan bacterias especia
les. Los antiguos habitantes de Mxico utilizaron
inconscientemente durante siglos, para la prepara
cin del pulque (y de Ja forma especial tequila, que
viene de la ciudad Tequila en Mxico), el jugo fer
mentado de gaves y el vino de palma, la bacteria
Zymomonas mobilis. Como ya se estableci en los

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Fig. 1.16 El Profesor Koch


observando los "esqulzomi
cetos de un cultivo
purificado (caricatura
contempornea).

Fig. 1.17 Los productos del


pan son el trabajo de bacte
rias lcticas y levaduras.

15

BIOTECNOLOGA

ltimos aflos, la bacteria puede crecer tambin en


medios con una concentracin de azcar mucho ms
alta. Asf produce alcohol seis o siete veces ms rpi
do que las mejores cepas de levaduras.
La coccin del pan, en el sentido actual, se inven
t probablemente tras la fabricacin de Ja cerveza.
Primero se conoca solamente el slido pan plano.
Ya hace alrededor de 6000 aos, los panaderos eglp
cios produjeron un pan poroso de una pap!Jla cida
(fermentada).

Flg. 1.18 Coccin del pan


en la Edad Media.

Flg. u9 Coccin del pan


industrial hoy: los procesos
bbcos no han cambiado.

Pasteurizacin
Louls Pasteur advirti que
es suficiente calentar brevemente el vino para matar las
bacterias, que lo estropea
ban. Esto tambin era vlido
para evitar que la leche se
agriase.

Este proceso, en el que se


mata la mayorfa de microorganismos que contiene una
sustancia, se denomina hoy
pasteurizacin en honor a
Pasteur. lDespus de todo,
i ml (l cml) de leche cruda
"pobre en grmenes" contle
ne 250 ooo a 500 ooo micro
blosl Hoy, la leche para beber
se pasteuriza principalmente
calentndola un tiempo corto
entre 71y74 C. Con ello se
mata un 98 a 99,5 % de los
microorganismos. la denoml
nada lecheH, que se mantle
ne cuatro semanas sin refrl
gerar, se calienta con vapor
de agua durante corto tiempo
a 120 C y se almacena en
recipientes pasteurizados.

16

nente del procesado del azcar de remolacha (mela


za). Anualmente se producen en todo el mundo
1,5 m!llones de toneladas! Se elabora levadura
prensada con un valor de productividad de quinten
tos millones de euros.

Cuando el ser humano empez a domesticar ove


]as, cabras y vacas, y obtuvo la leche de sus anima
les caseros, se conoci tambin la leche agria
(Cuadro 1.5). Se origin "ella sola", cuando la
leche fresca se dej reposar algn tiempo. La leche
cocinada,
sin embargo, no se estropeaba tan rpi
El fermento se forma a partir de bacterias lcticas
do.
En
leche
fresca ordeflada se pueden multiplicar
(del tipo Lactobacfllus) y levaduras tolerantes al ci
las
bacterias
del
cido lctico y parte del azcar de
do. stas son levaduras que no slo pueden vivir en
Ja
leche
(lactosa)
se fermenta a cido lctico (lac
medio neutro sino tambin en medio cido, como
tato).
La
multiplicacin
de los causantes de Ja
S. cerevtstae, Candtda krusety Ptchta saitol
putrefaccin y la enfermedad, como Jos estafilocoLos productos colaterales de Ja masa fermentada, cos, no es posible en un medio cido. Se origina un
como alcohol, cido actico, acetofna, dlacetilo y producto duradero, aceptable y nutritivo.
alcohol de fusel, son Jos que confieren el aroma y el L h
d
b
in
sabor al pan.
__, a 1ec e agria se ig!ere len, porque la prote a de
la leche casena precipita en escamas finas por acl
Et principal producto deseado de ta fermentacin dlficacln. La leche agria reacciona adems en el
no es aquf, sin embargo, alcohol, sino dixido de estmago con el mineral calcio, Importante para la
carbono (C02), cuyas burbujas gaseosas hinchan formacin de los huesos, a lactato de calcio, que se
la masa. La masa "reposa" y se convierte en porosa. puede captar fcilmente de nuevo por la pared del
Como fuente de hidratos de carbono para el fermen intestino.
tacto escurrido sirve el azcar exlstente en la harina
o Jos azcares libres aportados, como glucosa (az Por ello, el calcio no se pierde en el cuerpo. En las
diferentes reglones de la Tierra, debido a las influen
car de Ja uva), fructosa (azcar de la fruta) y saca
etas
climticas y la naturaleza de la leche, podemos
rosa (azcar de remolacha), as como la glucosa y
ver
diferentes
costumbres en el tratamiento de la
Ja maltosa (azcar de malta} que se forman
leche
(Cuadro
1.5). En Europa se elabor leche
mediante las enzimas de cereales (am!lasas) a partir
agria (cuajada) y quark, en los Balcanes y el Oes
del almidn de la harina. Al cocer termina Ja fer
mentacln, pues el gran calor en el horno mata las te Medio yogur, en el Cucaso kefir, en Asia cen
tral kumys, en India dahi y en Egipto !aben.
levaduras y bacterias. El alcohol formado en la fer
mentacin se evapora, y en Ja masa cocinada per En las preparaciones de mantequilla, la leche se
manecen slo Jos espacios huecos en forma de pana pasteuriza al principio (vase el mrgen l.zqulerdo
les de las burbujas de co21 que se pueden recono de esta pgina y el Cap. 4). Se obtiene la nata y se
af\ade un "despertador cido", con un cultivo mez
cer en cada rebanada de pan.
cla de bacterias lcticas. Durante 16 a 30 horas la
Hoy se produce el pan a partir de una mezcla de
nata madura en tanques. Las bacterias forman cl
harina, levadura, sal yagua, a Ja cual se agrega el fer
dos y acetona, que cambia por oxidacin al tpico
mento acabado. La masa se amasa y se deja fermen
"aroma de mantequilla" (dlacetil). En la manteca
tar varias horas. Finalmente, una mquina divide la
cln en una mantequera se produce suero de la
masa en pedazos de Ja medida de un pan. Las por
manteca como producto secundarlo.
clones deben fermentarse de nuevo, se enrollan y se
"El cido es divertido!" Evidentemente, un cierto
rellenan moldes de coccin.
sabor cido suave resulta agradable en las comidas.
Antes de que Ja masa vaya al horno "reposa" otra vez.
Un proceso de fermentacin antiguo es la acidlftca
Tras aproximadamente 20 minutos de coccin se
cin de la col ylos pepinos. Los pepinos ms peque
sacan los panes crujientes del horno yse dejan enfriar. flos se fermentan a menudo con otras verduras
Para panes blancos y masa de pasteles se mezclan slo (mtxed ptck/es). Para ello, Lactobactl/us plantarum
levaduras con harina y agua, es decir, no tiene lugar es la bacteria ms importante. Los pepinos cidos se
ninguna fermentacin de cido lctico.
recomiendan por Ja maana, tras una noche de gozar
La levadura de coccin (Saccharomyces cerevl los placeres del alcohol... Tambin las aceitunas
stae) para pan y pasteles se cultiva sobre el rema (despus de un ligero tratamiento con sosa custica

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CERVEZA, PAN, QUESO

para separar el componente amargo oleuropena) se


hacen duraderas con bacterias lcticas: las frutas no
maduras pasan a aceitunas verdes, las maduras a
negras.
Para producir col fermentada (choucroute), la col
blanca finamente cortada se cubre largo tiempo
con sal de cocina (a veces tambin con condimentos), hasta que el liquido de las clulas vegetales
destruidas cubre la col. En un lugar fro empieza a
fermentar muy pronto. La col blanca fresca en salmuera se convierte gradualmente, en ausencia de
aire, en aceptable choucroute. Puesto que los
microorganismos causantes de la putrefaccin no
pueden prosperar en el medio fuertemente cido
creado por los cidos lctico y actico, el choucroute es largamente duradero. Hoy se produce choucroute en recipientes de hasta 80 t de capacidad en
siete a nueve das. A menudo, el choucroute originado se calienta (blanquea), lo que mata las bacterias lcticas y acaba la acidificacin. Este procedimiento genera un choucroute ms suave.
Tambin al ganado le gustan los cidos: proceso de
ensilado. En agricultura se corta el forraje verde,
mafz y hojas de nabos, se empaqueta fuertemente
apretado en el sUo y se acidifica para el invierno. Se
produce asf el ensilado nutritivo de larga duracin.

Respiracin
y

c-0- . . . .

y/~~

g /

)=

~-o-glucosa

co,

Fermentacin

Por el contrario, con insuficiente formacin de cido lctico se multiplican -reconocible por un olor
punzante- bacterias butricas (Clostrldlum butyricum). El autor de este libro fue educado de joven
en el campo alemn y sabe que las vacas no deben
ser aumentadas con ensilado estropeado, pues les
produce "flatulencia inmediata".
Tambin para hacer embutidos, al preparar la mate
ria prima de las salchichas {como salami, salchichn ahumado, longaniza) (Fig. 1.22) se produce
una fermentacin lctica. Ala carne picada de vaca
y cerdo se afladen bacterias lcticas y bacterias de Ja
familia Mfcrococcus, son los llamados cultivos de
arranque. Las bacterias lcticas fermentan el azcar, que debe af'ladirse a Ja carne, porque la carne es
pobre en azcar. El cido lctico formado no slo es
productor del sabor sino que tambin inhibe, juntamente con la sal de salmuera aadida (mezcla de sal
de cocina y el polmico nitrito sdico), los micro
bios indeseados, y contribuye a la firmeza de las
futuras salchichas. La masa de la salchicha, introducida en una tripa, se cuelga en el recinto de madu-

co,
No se reproduce
/

1 'I

~-o-Glucosa

Al inicio del ensilado crecen las bacterias aerbicas y utilizan oxfgeno. El descenso de oxgeno y el
creciente contenido de cido exigen la multiplicacin de tipos de Lactobactllus, Streptococcus y
leuconostoc.

=O

Levadura

racin, donde madura dos semanas, mientras se


ahuma y entonces prosigue la maduracin.
SI el vino se deja largo tiempo al aire o el barril de fer
mentacin no est completamente cerrado, en lugar
de vino se produce un liquido cido, el vinagre.
Se puede observar fcilmente en casa la transformacin de alcohol en vinagre si los restos de cerveza o
de vino se dejan al aire en un lugar caliente. Tambin los sumerios conocieron ya la preparacin de
vinagre. Como material de partida utilizaron el jugo
de palmera y el jarabe de dtiles, y ms tarde tam
bln la cerveza y el vino. Los griegos y los romanos
beban vinagre de vino diluido como bebida refrescante. En la Edad Media, en Franela se produjo
industrialmente vinagre de vino con la preparacin
de Orlans an poco conocida. Hoy se produce
vinagre industrialmente, en un "proceso rpido".
Las bacterias del cido actico (Acetobacter suboxydans) oxidan en seguida el alcohol a vinagre en
biorreactores con la ayuda del oxfgeno del aire. La
fermentacin del cido actico no es una autntica fermentacin, pues no ocurre en ausencia de
aire. Los estimulantes, como el caf, el cacao, el t,

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{ ' I'
t

Etanol

Fl1. uo Comparacin entre


respiracin y fermentacin
en una molcula de glucosa
mediante clulas de levadura.

F11. t.21 Autntco vinagre


balsmico de Mdena.

Fl1.1.22 Conservacin de
las salchichas y los embutidos gracias a la fermentacin
del cido lctico.

17

BIOTECNOLOGA

el tabaco y la vainilla, se fermentan como siempre,


es decir, mediante microorganismos y enzimas propios de las plantas.

1.8 Caf, cacao, vainilla, tabaco -

Fermentacin para el placer

Fig. 1.23 El fruto del rbol


del cacao (Theobroma
cacao) se encuentra en
el tronco y requiere nueve
meses para madurar. Thea
broma significa en griego
"comida de los dioses".

En la fermentacin del caf se degrada la pulpa


mediante bacterias, que forman las enzimas que
fragmentan pectina (pectinasas) y degradan las sustancias de sostn de todas las frutas (pectina).

La fermentacin de los alimentos se descubri


indudablemente
por casualidad, pero sus efectos
Las levaduras degradan la pulpa de las semillas de
ventajosos
(almacenamiento
duradero, mejor digecacao (sarcotesta, Fig. 1.23) y a continuacin el
ribles,
aroma
ms
rico,
y
experiencia
embriagadoalcohol es utilizado por las bacterias del vinagre. Por
ra
con
los
productos
que
contienen
alcohol)
fueron
ello la liberacin de calor es importante para la calitan
obvios
que
pronto
se
consiguieron
productos
dad del cacao. Las semillas mueren, originan polifenoles, que pierden el aroma del cacao, y los taninos de fermentacin de muchos cultivos. La fermentase degradan, originando el color marrn del choco- cin, por consiguiente, fue una primera forma de
refinacin de los alimentos.
late. Entonces se tuestan las semillas.
Las enzimas producen con su trabajo el fil9)Ila de
fruta de Ja orqudea vainilla (Vantlla. pla.nijolia.)
(Fig. 1.24). Los frutos no maduros se cultivan, se
secan a la luz del sol y toman el tpico color marrn
oscuro. Enzimticamente se origina del glicsido
vainillina.

Fig. 1.24 La vainilla (Vanilla


planifo/ia), una orqudea,
libera su aroma tras la fer
mentacin.

Fig.1.25 Fermentacin de
t en China.

Las hojas de t se dejan marchitar durante un da


y a continuacin se enrollan. Con ello se rompen las
clulas y su lquido cubre la superficie de las hojas.
Gracias al trabajo oxidativo de las enzimas de las
plantas, las bacterias y levaduras desarrollan el
sabor y olor caractersticos del t (Fig. 1.25).

Esto se produce sobre todo por Jos componentes


orgnicos de las hojas, los polifenoles, bien visibles
por el cambio de color originado, incipiente por
los bordes de las hojas y lentamente hacia el centro
de las hojas. Las antes hojas verdes cambian de color
a castao rojizo y ms tarde de marrn oscuro a
violeta.
En Europa se consume principalmente t negro. Se
trata, en comparacin con el verde, de t fermentado. Segn el tiempo de fermentacin se obtiene
el t oolong, el t amarillo o el t blanco no fermentado.
Para producir el t oolong, t blanco o t amarillo,
el fabricante de t debe detener el proceso de oxidacin en el momento adecuado. En una reaccin
corta, el t no desarrolla aroma y no sabe a nada. Si
el proceso es demasiado largo se genera t "quemado" y entonces tiene un sabor amargo.

Fig.1.26 Tabaco (Nicotiana


tabacum).

18

de secar, se atan en manojos que se ponen unos


sobre otros en palos {montones). Debido al calentamiento propio {hasta 50 C}, el tabaco debe girarse
una y otra vez. La fermentacin que tiene lugar a
esta temperatura causa el cambio de color de las
hojas de tabaco. A menudo es posible mejorar los
colores. Este tipo de fermentacin dura tres o cuatro meses. Tambin se garantiza con ello la posterior posibilidad de almacenamiento.

Tambin en el tabaco se producen procesos enzimticos y microbianos parecidos (Fig. 1.26). El


tabaco de los cigarros puros pasa casi siempre por
una fermentacin natural. Para ello las hojas, antes

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En realidad, los primeros pueblos sedentarios conocan slo el secado y la conservacin con sal de los
alimentos. Por eso la sal era a menudo un tesoro
(Cap. 4).
Con la introduccin de la fermentacin se pudo elaborar productos ms aceptables y ms diversos; y
tambin disminuy claramente el riesgo de intoxicaciones alimentarias.
Mientras que hoy, en los pases muy industrializados, el valor del placer de los alimentos fermentados est en primer plano, en los paises en desarrollo tienen su original importante valor. En estos pases todava se estropea un tercio de los alimentos.
La fermentacin es, en comparacin con las modernas tcnicas de enfriamiento, conservacin qumica y liofilizacin, ms barata y puede realizarse fcilmente, no requiere aparatos caros y sus productos
se aceptan psicolgicamente de modo tradicional.
Adems, permite crear puestos de trabajo.

1.9 Los mohos cooperan con las


bacterias y producen queso
La leche es rica en todos los nutrientes, vitaminas y
minerales; por lo tanto, ya era importante en los
albores de la agricultura y la ganadera, para conseguir este contenido en materia. El profesor de fisio
logfa Jared Diamond considera la utilizacin del
ganado como un factor crucial del desarrollo de los
continentes: solamente en Eurasia haba animales
domesticables. Gracias a la cabra, el cerdo y especialmente los bueyes adiestrados, se aceler el desarrollo agrcola. El caballo llev a una movilidad
insospechada. En Amrica solamente se domesticaron llamas y alpacas; en Australia ningn animal.
Los animales domsticos proporcionaban carne,

CERVEZA, PAN, QUESO

Los chinos no slo


inventaron la plvora
Pacrick McGovem, de la Universidad de
Pennsylvania, tiene un trabajo de ensueo:
combina la qumica analtica con la arquelog!a, investiga las pistas del vino. En estos
momentos est realizando una investigacin
detectlvescahistrica sobre la prpura de los
emperadores obtenida del molusco Murex
tronculus. McGovem defiende la uhiptesis
de No": el bblico No lleg a tierra en el
monte Ararat, actualmente al este de Tur
qufa, y empez el cultivo del vino. La agri
cultura se estableci en realidad en Ararat,
con ia "domesticacin" del grano de trigo.
McGovem inici la comparacin del DNA
del vino natural (vase Cap. i O).

Recipientes de vino chinos y huesos oraculares

El vino eurasitico natural (Vitis vinfera


sylvestrs) se encuentra desde Espaa hasta

Asia Central. La elaboracin del vino procede de estos vinos naturales. McGovern bus
ca en las montaas turcas Taurus (donde
nace el Tigris) el lugar donde pudo tener
su origen el vino natural. Jos Voulllamoz,
del lstltuto Italiano Agrario di San Michele
all'Adige, en Trento, y Ali Ergl de la Uni
versidad de Ankara, estn en el equipo de
DNA. Ei equipo colecciona todas las posibl

lidades de cultivadores de vino locales. Se


quiere seguir el origen de la formacin del
vino.
Los investigadores buscan tambin fragmen
tos de arcilla con restos de vino. Un indicio
potente corresponde al tartrato (cido tart
rico), investigado en su tiempo por Louis
Pasteur, que se encuentra en el vino.
Hace diez aos, Pacrick McGovern crea
ya que las pistas ms antiguas del vino y de
la cerveza de cebada son de hace 7400 aos,
en el pueblo iran Hajii Firuz Tepe.
Sin embargo, ahora se han encontrado en
Jiahu, en ia provincia Henan de China,
los ms antiguos "huesos oraculares", con
caracteres chinos, y flautas de huesos de ave
y fragmentos de arcilla. Se tomaron 16 frag
memos de arcilla de 9000 aos de antige
dad con restos de vino del Museo de
Pennsylvania de Arqueologa y Antropologfa,
en FUadeifia. Adems, 90 recipientes de
bronce cerrados de la Dinasta Shang.

McGovern no prob ei vino de Shang aro


mtico, pues los recipientes contienen hasta
un 20%de plomo ... Interesante! El vino,
como se sabe, es cido, y por ello disuelve
los metales de modo sobresaliente. Como los
romanos de clase alta con sus tazas de plomo, los emperadores chinos tambin debie
ron envenenarse: con s!ntomas de calambres
hasta la locura. El plomo es, como todos los
metales pesados, un potente inhibidor para
las enzimas, pues los metales pesados atacan
los puentes disulfuro de las protenas
(Cap.2).
Algunas bebidas chinas de 9000 aos de
antigedad se preparaban con mijo de pani
cula, y esto es asombroso, pues las mismas
trazas de mijo se descubrieron tambin en
los vinos lranles de 7500 aos de antige
dad. Parece ser que se desarroll un nter
cambio de Ideas en Asia Central.

Combinando la cromatografa de gas y de


liquido, la espectrometra de infrarrojos y
el anlisis de istopos, se observ que el vino
contena una mezda compleja de arroz fer
mentado, cera de abejas, frutas de espino
(que mostraron un alto contenido de azcar
y posiblemente las levaduras para la fermen
tacin) y vino natural
6000 aos ms tarde, en la Dinasa Shang,
la enolog!a haba hecho avances considera
bles. Ei vino del emperador Shang de los
recipientes de bronce contiene restos de flo
res (crisantemos), resina de pino (que
recuerda la moderna retsina griega), restos
de alcanfor, aceitunas, taninos cidos y tam
bin ajenjo (que ms tarde tomaron fatal
mente los bebedores de absenta de la Belle
~poque parisina de ToulouseLautrec).

leche y estircol, y tiraban de los arados. Los pro


ductores de leche, como vacas, ovejas, cabras, caba
llos, renos, bfalos indios, yac y camellos, repartie
ron en el matadero la mayora de las cantidades de
protena que haban conseguido durante su vida.
Mediante la fermentacin lctica se hicieron dura
deros los productos de la leche.
De la leche agria se obtuvo quark por filtracin del
componente slido, y a partir del quark se produjo
una forma almacenable, el queso. Los humanos des
cubrieron muy pronto que la preparacin del queso
(Cuadro 1.5) resiste mejor si se aade a la leche una
sustancia digestiva del estmago de los temeros, la

Recipiente de bronce en forma de animal (Hsi


tsun), de China, para ceremonias de vino

Para Patrick McGovern, ei estudio del vino


con todas sus conexiones sociales y econ
micas es la puerta a las civilizaciones anti
guas: "una buena botella de Meriot o Shiraz
nos puede ayudar hoy a entender los senti
mientos de la historia".

enzima coaguladora. La enzima coaguladora (tam


bin denominada renina) coagula la protena de la
leche, la casena. En la coagulacin, los componentes
slidos de la leche forman grumos muy rpido y lle
gan a ser tambin mucho ms slidos que si sta se
deja simplemente agriar.
En la preparacin del queso se aaden a la leche
bacterias lcticas como cultivos de arranque y ade
ms la enzima coaguladora. Generalmente la leche
coagula en 30 minutos y se pone espesa: la caserna
precipita y se agrega. Despus de presionar el suero
lquido se mezcla el quark creado con sal y se corta
en piezas.

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Flg. 1.27 Fermentacin de


saque en un cmic de cuan
do el Prof. Shimizu (Universi
dad de Kyoto) era estudiante.

19

BIOTECNOLOGA

Cuadro 1.8 Historia de


la biotecnologa:
Pasteur, Lleblg y Traube lQut es la fermantacl6n?
Casi transcurrieron 200 aflos desde los descu
brlmlentos de Leeuwenhoek antes de que los
microbios fueran otra vez el centro de inters.
Amitad del slglo XIX prosigui el desarrollo
Industrial de las grandes fbricas. Tampoco
el alcohol se produca ya en pequeas familias
emprendedoras, sino al por mayor. Cada vez
se necesitaban ms urgentemente, por lo tan
to, conocimientos exactos sobre los procesos
de fennentadn, para evitar fracasos costosos.

Louls Pasteur (1822-1895), fundador


de la mlcroblologla y la blotecnologla,
en el laboratorio

En la ciudad francesa de Ulle, en el afio


1856, un conocedor, Monsleur Blgo, visitan
te de una fbrica de alcohol, habl con el
profesor de qu.!mica LouJs Puteur (1822
1895). El hijo de Blgo estudi con Pasteur.
El padre Blgo Inform a Pasteur sobre una
rara enfermedad que atacaba a muchos de
sus barr!les de alcohol. Del jugo de azcar de
remolacha no se formaba sino un liquido
gris, viscoso, con olor a cido. Pasteur empa
quet su microscopio y se fue a la fbrica.
Alll tom muestras de barriles "enfermos"
y "sanos". El alcohol "sano" contiene, como
se analiz mediante observacin mlcroscpl
ca, pequeflas esferas amarillas, las levaduras
que formaban racimos. Como con Jos grme
nes, brotaban semillas desde Ja parte lateral
de las pequeflas bolas. Las levaduras, pues,
vivan. Su vida causaba la conversin de az
car en alcohol. Despus Pasteur Investig la
masa viscosa. No descubri en ella ninguna
levadura, pero sin embargo s pequeflos pun
tos grises. Cada punto contena una estruc
tura tangible de palitos temblones, millones

20

de pa!Jtos en cada punto gris. La materia cl


da, que producan los pa!Jtos, se demostr
por anlisis qumico que era cido lctico
(lactato).
Pasteur dej caer unas gotas del liquido que
con tena los palitos en una botella con una
disolucin clara de levadura y azcar. Tras
un tiempo breve tambin haban desaparee!
do aqu las levaduras, y los pa!Jtos domina
ban el campo. Se creaba de nuevo cido lc
tlco en Jugar de alcohol.
Los pa!Jtos descubiertos eran bacterias.
Tomaron su nombre de su forma: la palabra
griega para pa!Jto es bakterton. Las bacterias
producan obviamente cido lctico median
te la fermentacin lctica del azcar, mlen
tras que las levaduras fermentaban a alcohol
y al gas dixido de carbono.
Poco despus del descubrimiento de las bac
terlas lcticas en los barriles de alcohol,
Louis Pasteur fue requerido por los viticultores en Arbols (el padre de Pasteur haba sido
curtidor en Arbois). Ellos tenan problemas
con la fermentacin del vino. Una y otra vez
obtenan del jugo de las mejores uvas un
vino graso, denso, amargo. Tambin aqu
encontr Pasteur, en el caprichoso vino, en
lugar de levaduras pequeas bacterias, que
sin embargo formaban estructuras como un
collar de perlas. Pasteur descubri en sus
Investigaciones bsicas los diferentes tipos de
bacterias que arruinan el vino. Finalmente
pudo pronosticar a los perplejos viticultores
qu sabor tendra una muestra de vino, sin
que tuviesen que pagar previamente! Para
ello observ la muestra bajo el microscopio y
determin el tipo de levadura o de bacteria.
Pasteur encontr que es suficiente calentar
brevemente el vino para matar las bacterias.
La misma tcnica tambin era apropiada para
proteger la leche de agriarse. Este proceso,
con el cual se mata la mayora de microorga
nismos contenidos en una sustancia, se denomina hoy, en honor a Pasteur, pasteurizacin.
La pregunta sobre la naturaleza de la fermentacin no preocup solamente a Pasteur.
En 181 OJoseph Louis GayLussac (17781850) demostr que en la fermentacin de
jugo de uva a partir del azcar de uva (glucosa) se origina alcohol etflico y el gas dixido
de carbono. A mediados del siglo XIX, el
famoso qumico alemn Justus von Uebig
(1803-1873) propuso una teora. Aleg que
para la formacin de alcohol Intervena un
puro proceso qumico y no un proceso biolgico. Ueblg encontr sencillamente ridculo

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que la fermentacin fuera producida por


pequefios seres microscpicos. Ms bien
deberan ser "vibraciones" en la descomposi
cln de la materia orgnica sobre la transferencia del azcar y su utilizacin a C02
y alcohol. En todas las fermentaciones alcohlicas se encontraban sin embargo, levadu
ras, o sea seres vivos.

Justus von Lleblg (18o31873), el mayor


qulmlco del siglo XIX. en su laboratorio de
qulmlca en Gleben

Louis Pasteur, todava al principio de su


carrera cientfica, empez una lucha cientfica vehemente con la autoridad internacional
Justus von Uebig: "Sin levaduras vivas no
hay alcohol!" Insista tercamente Pasteur.
Ueblg se burl por otro lado: "Cierta gente,
que piensa que el proceso de fermentacin
se debe a anima/cu/es (anima!Jtos), se parecen a niflos que creen que la circulacin del
ro Rh!n la producen las palas de las ruedas
de los molinos de agua que se encuentran en
su orilla. La disputa se Inclin hacia un lado
o hacia el otro durante aflos. Finalmente se
decidi tras la muerte de Pasteur y de Uebig.
Pasteur divulg en 1876 los resultados de
dos dcadas en un libro de envergadura. "La
fermentacin es Ja respiracin sin oxgeno",
aclar Pasteur. Sirve como "impulso" de los
seres vivos, para generar energa. Todos los
seres vivos requieren energa para la vida.
Obtienen esta energa en su metabolismo
principalmente mediante la degradacin de
azcares, grasas y protenas en sus clulas
corporales. El azcar, por ejemplo, se quema
en las clulas al gas dixido de carbono y
agua. Ambos productos abandonan las clulas. La energa liberada entonces es utilizada
por el cuerpo, por ejemplo, para el movimiento de sus msculos. Para esta combustin "fra" las clulas necesitan el oxgeno
del aire, como es necesario en la combus
tin "ca!Jente" de la madera a ceniza. Sin
oxgeno, los animales y las plantas superio-

CERVEZA, PAN, QUESO

res no pueden generar energa y por consiguiente no viven. Los microorganismos poseen, en cambio, un tipo de respiracin de
emergencia en ausencia de oxgeno: la fermentacin. Seguramente esta solucin de
emergencia proviene de los inicios de la
vida, pues en la Tierra an no habla oxigeno.
Se liber ms tarde por las plantas a partir de
agua (fotosntesis). Antes, en una atmsfera
pobre en oxgeno, la fermentacin rue para
los microbios antiguos la forma normal de
obtener energa.

Morltz Traube
(1826-1894).

Tena razn Pasteur, pues, al decir que sin


microbios no es posible la fermentacin?
Moritz Traube ( 18261894), un estudiante
de Liebig, dijo ya en 1858 que las fermentaciones no vienen necesariamente de la
actividad de las levaduras, sino que ms
bien constan de procesos qumicos, que son
catalizados por "fermentos" oxidantes y
reductores. Traube caracteriz los fermentos por primera vez como materiales proteicos que actan catal!tlcamente, como molculas qumicas definidas, que pueden actuar
por su propia oxidacin y reduccin en los
organismos, pero tambin en reacciones de
oxidacin y reduccin fuera de las clulas
vivas.
Dividi los fermentos, en consecuencia,
segn el tipo de reaccin. Ms tarde seal la
necesidad del contacto molecular directo
entre la enzima y el sustrato para la reaccin.
Hasta ahora no se menciona en la bibliografa
de la historia de la bioqumica que l ya or
mui las consideraciones cualitativas para la
cintica de las reacciones, y por primera vez
la dependencia del tiempo de reaccin y la
cantidad de fermento.
En 1897, Eduard Buchner ( l 860 1917)

realiz el experimento decisivo, que acab


con la lucha entre Liebig y Pasteur (vase
Cap. 2).

En la fabricacin de quesos blandos, como el


Camembert y el Brie, se cuida de que en la superficie
de la "masa de queso" crezca moho. Desde hace tiem
pose han usado mohos muy especiales en los peque
os lugares franceses Camembert y Roquefort. Por
ello, los quesos producidos en sus pueblecitos se
denominaron segn los diferentes lugares.
Los quesos duros, como el Emmental, se endure
ceo en la denominada prensa del queso y son ms
duraderos que los quesos blandos. A la masa del
queso se aaden mohos especiales. Los hongos no
crecen entonces en la superficie sino en el interior
del queso, si se suministra suficiente aire. Para venWarlo se pincha la masa del queso con brochetas
con estrechos canales de aire. En el queso maduro
puede reconocerse el cultivo del moho a lo largo de
los canales de las brochetas.
Los agujeros y el aroma de los quesos duros, como
el Emmental, se debe a las bacterias del cido
propinico que fermentan, en el interior del que
so, el azcar a cido propinico, cido actico y
C02 El lubricante rojo del Limburger y el Romadur
tambin viene de las bacterias, que crecen en la
superficie del queso.
Reconocemos los mohos a simple vista, pues al
contrario que las levaduras son seres pluricelula
res. Sin embargo, generalmente se ven slo los
productores de esporas. Las setas de los hongos
comestibles, tal como los conocemos en las exposiciones de setas, son productoras de esporas
(cuerpos fructferos).
El cuerpo verdadero del hongo no es distinto entre
los hongos comestibles y los mohos. Consta de
hilos largos, delgados, el micelio {del griego
mykes, hongo). Del micelio crecen hacia fuera los
productores de esporas (esporangios) . Fabri
can miles de esporas, que se lleva el viento o son
arrastradas por el agua de lluvia. Las esporas germinan en un lugar rico en nutrientes y forman un
nuevo micelio.
Los quesos productores de mohos con esporangio en forma de pincel se denominan segn la for
ma de sus productores de esporas. Su nombre latl
no es Penicillium (pincelito en lan).

Flg. 1.28 El duque de Bavie


ra Guillermo IV (1493-1550)
promulg en 1516 la ley de
pureza.
Abajo: documento de la ley.

Redaccin de la ley de
pureza (extracto)
"Queremos especialmente
que, en todas partes de
nuestras ciudades, merca
dos y en tas tierras, en ninguna cerveza se puedan usar
y utilizar ms materiales
que slo cebada, lpulo y
agua. Quien reciba nuestra
orden y a sabiendas no la
cumpla, debe dar como
multa este barril de cerveza
a las autoridades de justicia,
tan a menudo como ocurra
esto, se retirar indulgentemente."
Postulada por Guillermo IV
Duq ue de Baviera, el da de
San Jorge del ao 1516 en
lngolstadt.

Los mohos con esporangio en forma de rega


dera (Aspergl/uS crecen sobre el pan y la mermelada. Al contrario que Jos mohos, inofensivos para la
preparacin del queso, Aspergillus jlavus puede,
por ejemplo, producir afia toxina, que puede activar
se en el hgado por el sistema enzimtico del cito
cromo P-450 captador de oxgeno y provocar cncer de hgado (Cap. 4).

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21

BIOTECNOLOGA

1.10 Sake y salsa de soja

En el este de Asia Uapn, China, Corea) se utilizan


los mohos, desde hace siglos, para descomponer las
habas de soja y el arroz ricos en protenas con las
enzimas del moho (amllasas fragmentadoras de
almidn, proteasas fragmentadoras de protena)
para una posterior fermentacin alcohlica y lctica.
La salsa de soja (Shoyu) (Cuadro 1.6 y Fig. 1.29)
es para nosotros en Europa la ms conocida; en
Japn se producen y se utilizan anualmente alrededor de diez litros por cabeza(!). Consta de una mezcla de trigo y soja que se trata con esporas de Aspergillus oryzae o Aspergmus soyae como cultivos
competidores.

flg.1.29 Publicidad de la
salsa de soja.

Fig.1.30 Antigua fermenta


cin combinada con la
tecnologa moderna: en
las bolas de alginato, las
clulas de levadura
encerradas (inmovilizadas)
(vase Cap. 2) producen etanol continuamente, que se
utiliza en los hogares japo
neses (dibujo no muy serio
de los aos 1980).

La fermentacin alcohlica est causada por las


levaduras. Degradan azcar, con la utilizacin de
aire, a alcohol y dixido de carbono. Las levaduras
pueden respirar bien en presencia de oxgeno o fer
mentar. Mediante la fermentacin, sin embargo,
originan mucha menor energa que con la respiracin.
Sin oxgeno se multiplican aproximadamente
Las enzimas eliminadas de los hongos descompo20
veces
ms despacio que con suficiente oxfgeno.
nen la protena de las habas de soja y las molculas
El
ser
humano
lleva las levaduras, por as decirlo, a
de almidn del trigo; adems, se aade sal de cociuna
situacin
de
necesidad, para obtener alcohol o
na a altas concentraciones para inhibir la putrefacen
la
coccin
del
pan
con las burbujas de dixido de
cin. En ocho a diez meses se desarrollan las levacarbono
para
hacer
esponjosa
la masa.
duras Ylas bacterias (cepas de Pediococcus) y con
ducen la fermentacin hasta el final. Entonces se Para sobrevivir, las levaduras deben procesar mucho
separa la salsa de soja por presin.
ms azcar en la fermentacin que en la respiracin.
De modo similar se produce el vino de arroz ;Por eso las fermentaciones son tan productivas! Sin
(sake) (Fig. 1.27). Primero se debe degradar el embargo, si se utilizan grandes cantidades de leva
almidn del arroz a azcares fermentables. Esto dura, por ejemplo para empezar bioprocesos o para
ocurre mediante enzimas (amilasas) que los mohos producir levaduras de forraje, si las levaduras deben
ceden al entorno. A continuacin los azcares as tambin multiplicarse el oxfgeno se bombea adicio
formados se fermentan a alcohol mediante cepas de nalmente a la disolucin de alimentacin. Entonces
se origina slo poco alcohol.
Saccharomyces.
El vino de arroz, por lo dems, contiene aproxima- Junto a las levaduras, como ~aerbicos facultativos"
damente un 20 %de alcohol en volumen, que no es con su doble vida, hay tambin microbios, para los
ninguna menudencia si uno considera que muchos que son mortales las ms pequeas cantidades de
pueblos asiticos se diferencian de los europeos en oxgeno (anaerblcos estrictos), por ejemplo las
la dotacin insignificante de enzimas de su hgado, metanobacterias -forman metano slo en ausencia
pues poseen una variante molecular (isoenzima) de aire- o los clostridios, que tambin pueden Vivir
de la acetaldeh!do deshidrogenasa que degrada ms en los alimentos enlatados sin aire y causan peligro
lentamente que la isoenzima "europea" el produc- sas intoxicaciones alimentarias.
to de la alcohol deshidrogenasa (Fig. 1.13). Como
consecuencia de ello, cantidades menores de aleo
hol en los asiticos tienen Indudablemente el mis
mo efecto de embriaguez que las mayores en los
europeos (;muy econmico!), y las consecuencias,
por todos conocidas a la mal\ana siguiente del pla
cer son, tambin ms graves.

es en realidad
la fermentacin?

1.11 lQu

Todos los procedimientos y procesos de fermenta


cin descritos hasta ahora se aplicaron y se aplican
por los humanos desde hace miles de anos. Las
experiencias asf recogidas pasaron de generacin en

22

generacin. Sin embargo, se desconoca lo que era


en realidad la fermentacin y cmo se ponfa en mar
cha. En el siglo XIX Louis Pasteur {1822-1895)
aclar el asunto. Coloc la primera piedra para el
dominio de los procesos tcnicos, en los cuales los
microorganismos son los "animales de carga", y por
ello es uno de los padres de la biotecnologa moder
na (Cuadro 1.8).

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(ERVEZA,PAN,QUESO

Bibliografa utilizada y aplicada


El clsico de Biotecnologa alemn: Dellweg H (1987)
Biotechnologie. VCH, Weinheim
La biblia de bolsillo de la Biotecnologa: Schmid R D (2002) Taschenatlas
der Biotechnologie und Gentechnik. Wiley-VCH, Weinheim
Escrito por el divertido decano de la biotecnologa alemana: Dellweg H (1992)
Biotechnologie verstandlich. Springer, Heidelberg
Antiguo, pero bueno - una buena introduccin: Gruss P, Herrmann R,
Klein A, Schaller H (Hrsg.) (1984) lndustrielle Mikrobiologie. Spektrum
der Wissenschaft, Heidelberg

Ocho preguntas
de autoevaluacin
1 En qu se diferencian las clulas

procariotas de las eucariotas (por


lo menos tres caractersticas)?

2 por qu el alcohol se denomina


la leche materna de la civilizacin? Quin descubri el vino?
por qu motivos bioqumicos
la fermentacin libera grandes
cantidades de producto en corto
tiempo?

Especial para interesados en tecnologa: Crger W und Crger A (1989)


Biotechnologie - Lehrbuch der Angewandten Mikro-biologie. 3. Aufl.
Oldenbourg, Mnchen.
Sucinto y didcticamente bueno, especialmente para universitarios:
Leuchtenberger A (1998) Grundwissen zur mikrobiellen Biotechnologie.
Teubner B G, Stuttgart, Leipzig
Quizs el mejor libro de bolsillo de Microbiologa: Schlegel H G (1992)
Allgemeine Mikrobiologie. 7. Aufl. Thieme, Stuttgart
Fuente de muchos Cuadros de este libro: Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry. 5th Edition, Wiley-VCH, Weinheim
Ruttloff H, Proll J, Leuchtenberger A (1997) Fermentierte Lebensmittel:
Lebensmittel-Biotechnologie und Ernahrung. Springer, Heidelberg
Cmo se pueden explicar las diferencias culturales entre diferentes
regiones: Diamond J(2000) Arm und Reich. Die Schicksale menschlicher
Gesellschaften. Fischer, Frankfurt
La interesante historia de la Microbiologa: de Kruif P (1940)
Mikrobenjager. 8. Aufl. Orell Fssli, Zrich, Leipzig
Todo sobre el vino: Ambrosi H (2002) Wein von A bis Z. Gondrom, Bindlach
Dellweg H, Schmid RO, TrommerW (Hrsg.)(1992) Rompp Lexikon
Biotechnologie. Thieme, Stuttgart

En qu se diferencian las bacterias de las levaduras? Cite dos


aplicaciones biotecnolgicas para
cada una.
'j

Qu estimulante se origina
mediante fermentacin?

6 Por qu el alcohol inhibe


el crecimiento de las bacterias?

7 Si las levaduras tuviesen "eleccin", produciran alcohol?


8 Qu puntos de vista defendi
Justus von Liebig en la discusin
sobre la fermentacin y cules
Pasteur? Quin tena razn
finalmente?

Enlaces de Web
Bscador de Biotecnologa en Internet: www.biotechfind.com
Todo sobre microorganismos: www.microbes.info
Secretariado de Informacin de Biotecnologa del BMBF: www.i-s-b.org/
Pan: http://de.wikipedia.orgWikif3rot
Museo notable: www.brotmuseum-ulm.de/
Cerveza: http://de.wikipedia.org,Nlikif3ier
Vino: http://de.wikipedia.orgWiki}Nein
Queso: http://de.wikipedia.orgWiki1<iise
Qu ocurre si se mira hoy a travs del microscopio de Leeuwenhoek:
www.sciences.demon.co.ukWav-spf htm

Todo sobre la fermentacin asitica y la fermentacin en casa:


http:/fsers.chariot.net.au/-dna/

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23

ENZIMAS Supercatalizadores moleculares


para el hogar y la industria
2.1 Las enzimas son
biocatalizadores eficaces
y especficos 26
2.2 La lisozima: la primera enzima
cuya anatoma y funcin
se entendieron en detalles
moleculares 27
2.3 Los cofactores sirven como
herramientas a las enzimas
complejas 31
2.4 Las enzimas pueden
obtenerse de animales,
plantas y microorganismos 32
2.5 Las hidrolasas extracelulares
degradan los biopolmeros
en pequeas unidades
utilizables 34
2.6 Las amilasas mezclan,
cuecen y trenzan 34
2.7 Las pectinasas prensan ms
zumo de fruta y verduras 36
2.8 Los biodetergentes son la
aplicacin ms importante
de las enzimas hidrolticas 37
2.9 Las proteasas ablandan
la carne y curten la piel 38
2.10 Inmovilizaciones: cuando
se quiere reutilizar las
enzimas 40
2.11 Glucosa isomerasa y jarabe
de fructosa: azcar con mayor
fuerza edulcorante 40
2.12 Alimentos y forrajes con
enzimas inmovilizadas 42
2.13 Los reactores de enzimas
de membrana usan
regeneracin de cofactor 44
2.14 Clulas inmovilizadas 46

Captulo
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BIOTECNOLOGA

Las enzimas son


biocatalizadores eficaces
y especficos

2.1

Las enzimas cambian, conducen y regulan casi


todas las reacciones qumicas de las clulas vivas.

Fig. 2.1 En 1926 el


americano James B. Sumner
(18871955) fue el primero
en obtener la enzima ureasa
cristalina y consigui anali
zar las propiedades de la
protena.

Hasta ahora se han descrito en detalle ms de


3000 enzimas diferentes. Se sospecha que en la
naturaleza hay hasta 1O000 enzimas distintas. De
algunos tipos de enzimas existen slo unas pocas
molculas en una clula; de otros, en cambio, de
1000 a 100 000. Todas las enzimas actan como
catalizadores biolgicos: convierten sustancias,
a menudo en fracciones de segundo, en otros pro
duetos, sin cambiar ellas mismas al hacerlo.
Las enzimas aceleran la consecucin del equilibrio
de las reacciones qumicas en un factor desde algunos millones hasta un billn. Posibilitan con ello, en
primer lugar, los procesos de la vida. La formacin
de alcohol y dixido de carbono a partir de azcar
-que realizan las enzimas en las clulas de levadura en unos pocos segundos- durara sin enzimas
miles de aos, y por lo tanto sera prcticamente
imposible. Las enzimas son biocatalizadores altamente efectivos y potentes.

Fig. 2.2 John H. Northrop


(1891-1975) cristaliz entre
193oy 1933 las enzimas de
la digestin tripsina y pepsi
na, y demostr que constaban
exclusivamente de protena.
Slo entonces aceptarla el
descubrimiento de Sumner.
Ambos obtuvieron en 1946
el premio Nobel.

En todas las clulas de alrededor de una dcima de


milmetro hasta una milsima de rnilimetro de dimetro transcurren ordenadas miles de reacciones
enzimticas por segundo.
Esto funciona slo si cada uno de Jos catalizadores
moleculares participantes, entre miles de sustancias
diferentes en la clula, reconoce "su" sustrato, que
convierte en "su" producto [Cuadro 2.1 ). La biocatalizacin se realiza en el centro activo (active site) de
la enzima.
Casi todos los catalizadores biolgicos son protenas. Sin embargo, tambin el RNA [cido ribonucleico) puede actuar biocatalticamente (vase
Cap. 3.2). A menudo se degrada mediante esta
ribozima otros RNA. Pero se pueden construir
aptmeros artificialmente, que se unen a las sustancias deseadas (vase Cap. l O).

fig. 2.3 Otto Heinrich


Warburg (18831970) descu
bri el cofactor nicotinamida
adenina dinucletido (NAO)
y las enzimas de la respira
cin que contienen hierro,
como la citocromooxidasa
(vase Fig. u4, Cap. l). Fue
distinguido con el premio
Nobel en i941.

26

cambios insignificantes ya no entran en interaccin


con la enzima. El principio de la llave-cerradura sirve para explicar la primera regla de la elevada capacidad de seleccin, la especificidad de sustrato de la
enzima. Tambin explica por qu los inhibidores
de enzimas (por ejemplo la penicilina) competitivos se parecen espacialmente al sustrato: bloquean
el centro activo de la correspondiente enzima (inhi
bicin competitiva) como una u ganza" que permanece colocada en la cerradura.
Un experimento bioqunlco sencillo clarifica la
especificidad de una enzima (Cuadro 2.1 ). Hay que
tener en cuenta que enzimas como la glucosaoxidasa
(Fig. 2.5), para los mecanismos finos de sintonizacin
en la clula, deben poseer una alta especificidad de
sustrato (comparable a la seguridad de las cerraduras]. Tales enzimas actan principalmente con alta
especificidad.
Las enzimas extracetulares, como las que degradan
protenas (proteasas) o almidn (amilasas], son en
cambio poco especficas. Trabajan fuera de las clulas y no sera rentable construir una enzima especial
para cada protena o polisacrido especial a degradar.
Veamos dos proteasas extracetulares que se
segregan de las clulas al medio circundante:
Una enzima como la tripsina debe poder fragmentar todas las protenas del estmago del cer
do o del ser humano en trozos ms pequeos. La
tripsina tiene, por un lado, slo una baja especificidad de sustrato, pero una alta especificidad
de accin: fragmenta en concreto todos los enlaces de la protena, exactamente en unos lugares
de unin de aminocidos determinados y exactamente establecidos (sobre el carboxilo de la
cadena de restos de lisina o arginina en la cadena peptdica). La tripsina se utiliza tambin para
la sntesis especfica, para la conversin de la
insulina de cerdo en insulina humana (Cap. 3).
Por el contrario, la subtilisina microbiana casi
no distingue entre las cadenas laterales de los
aminocidos, entre los cuales se fragmenta el
enlace peptdico. Posee una amplia especificidad
de sustrato y de accin. La subtilisina es segregada al medio por Bacillus subtilis, donde destruye las protenas en fragmentos "aceptables" y
por ello es una "rotura general ideal" -muy apropiada para su uso en biodetergentes (Fig. 2.17).

Ya en 1894 el qumico alemn, y ms tarde ganador


del premio Nobel, Emil Fischer (1852-1919)
(Fig. 2.4), dijo que las enzimas reconocen sus sustratos uprobando" segn el principio de la llave y
la cerradura (lock and keJ1. Una hendidura en la
superficie, el centro activo de la enzima, debe pose- La especificidad de accin sirvi como base para una
er una forma en la que, en el espacio, la molcula clasificacin y designacin uniforme de las enzi
de sustrato entra exactamente, como una llave en mas (Cuadro 2.3), la nomenclatura de enzimas (ECJ
la cerradura a que pertenece. Las molculas con dela IUPAC.

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ENZIMAS -

Cuadro 2.1 Cmo reconoce la GOD


un azcar de forma altamente especfica y lo transforma
En un vaso de reaccin se encuentra una mez
da de hidralos de carbono: glucosa (azcar de
la uva), fruclosa (azcar de la fruta), sacarosa
(azcar de remolacha o de caa), mallosa (az
car de malta) y almidn.
Si aadimos a Ja mezcla la enzima glucosa oxi
dasa (GOD) y rras algn tiempo analizamos la
disolucin qumicamente: la glucosa desapare
ce casi por completo! En su lugar se sustiruye
por otra sustancia -gluconolactona, un produc
to de oxidacin de la glucosa. Los otros hidra
tos de carbono quedan inalterados. La glucosa
se convlerte, obvlamente mediante la glucosa
oxidasa, en gluconolactona. La glucosa es,
pues, el sustrato de la glucosa oxidasa, y la glu
conolactona el produclo de oxidacin de la
reaccin enzimtica. A partir de cinco hidratos
de carbono diferentes, la tlDglucosa simple
mente es seleccionada por la glucosa oxidasa
como sustrato. Incluso la a oglucosa no es
reconocida y por lo tanto no es convertida.
tlDGlucosa significa que el grupo hidroxilo
(OH) se encuentra en el tomo C1 en la mitad
superior del plano del anillo, mientras que en la
aD-glucosa el grupo hidroxilo del tomo e, se
encuentra en la mitad inferior del plano del ani
llo. Adems de la glucosa, tambin el oxgeno
se utiliza (se reduce) como segundo susrrato y
por ello se origina perxido de hidrgeno Hp2
La maltosa, la sacarosa y sobre todo el almidn
son sencillamente "una llave demasiado grande"
para la glucosa oxidasa. La fructosa, Indudable
mente, entraa bien en la "cerradura enzlmti
ca", pero debido a la falta de ajuste exacto no
cierra, y por ello no es transformada por la enzi
ma. Slo la tlDglucosa se ajusta.

Mezcla de diferentes azcares

o
Fructosa

0000
Sacarosa

Maltosa

Almidn
~
Ox1geno

'""'

La lisozima: la primera enzima


cuya anatoma y funcin se entendieron en detalles moleculares

2.2

La lisozima fue la primera enzima de la que se ada


r su estructura espacial y cuyas propiedades se
entendieron hasta el detalle atmico. Alexander
Flemingla descubri algunos afios antes que la peni
cilina (Cuadro 2.4).
La lisozima fue un modelo excelente para estudiar
la interaccin de enzima y sustrato. El de la lla
ve y la cerradura fue indudable e inicialmente un
buen modelo que, sin embargo, demostr ser dema
siado rgido. Las protenas son estructuras dinmi
cas y flexibles.

""'~
/

~-o-glucosa

o ---o

fig. 2.4 llave y cerradura:


el ganador del premio Nobel
Emil Fischer (185n919)
propuso el principio de la
llave y la cerradura en las
enzimas. Este principio
explica bien la complemen
tariedad de la pareja de
reaccin.

Gluconolactona

~~_)
_/

Flg. 2.5 Estructura en el


espacio de la glucosa oxida
sa {GOO), que es un dmero.
Es una oxidorreductasa que
se aplica con mucho xito
en biosensores para medir
el azcar sanguneo en los
diabticos {vase Cap. 10).
El grupo prosttico en el cen
tro activo de la GOD, f!avina
adenina dinucletido (FAD).
se representa en rosa.

CatAtisis en el complejo
enzima-sustrato

Una hiptesis formulada en 1958 por Daniel


Koshland (nacido en 1920), 60 aos tras el pos
culado de Fischer, encontr una confirmacin bri
liante para la lisozima. Su teora del "ajuste indu
cido" (en ingls nducedfirj dice que el sustrato y
la enzima, mejor que con el modelo rgido de lla
ve y cerradura, deben compararse con una mano
mvil y un guante arrugado, donde la mano (sus
trato) y el guante (enzima) interaccionan.
Un guante no es un molde exacto de la mano, y
puede existir en distintas formas, como puo o
como guante abierto. Solamente cuando se intro
duce la mano se produce su ajuste espacial exacto
(Fig. 2.6).

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Fig. 2.6 la hexoquinasa,


la primera enzima de la
degradacin de glucosa
en las c~lulas, muestra tras
la unin de glucosa (flecha)
un cambio en su conforma
cin (abajo).

27

BIOTECNOLOGA

Cuadro 2.2 Historia


de la biotecnologa: Cmo se
descubrieron las enzimas
Las reacciones enzimticas se observaron
desde los tiempos ms tempranos y se utili
zaron en la prctica. Ya Homero describi
la coagulacin de la leche con ta ayuda de
zumo de higo (Fig. 2.7). Para la preparacin
del queso se us el laboratorio del estmago
de un ternero. Los animales salvajes sacrifi
cactos deban colgarse" antes de su prepara
cin para ser ms gustosos. La exploracin
de las enzimas empez ya a principios del
siglo XVIII.
Como fermentacin (en latnfermentum]
se describe generalmente la descomposicin
de un sustrato en otro. En 1780, el italiano
Lazarro Spallanzani (l 729 1799] inform
al francs Antoine Ferchault de Raumur
(l 683 1757), el inventor de la primera esca
Ja de temperatura, de que la carne se licua
con el jugo gstrico de las aves.

Anselme Payen ( 1795 187 t ), anunci


en 1833 junto con su colega Jean Fran~ois
Persoz (18051865] un "principio licuado
del almidn" a partir de la cebada germina
da. Con ello se observaron algunas cualidades generales vlidas para las enzimas: relati
vamente pequeas cantidades de los prepa
rados podan licuar grandes cantidades de
almidn. Esta caracterstica se perda al
calentar. La sustancia activa se pudo obtener
en forma de polvo de la disolucin y era de
nuevo activa tras Ja redisolucin en agua.
La sustancia descrita, denominada diastasa
(del griego diastasis, separacin), fue la pri
mera enzima de plantas que pudo analizarse
en et laboratorio en forma purificada.

(por ejemplo levaduras y otros microorganis


mos] y los solubles "no organizados" (por
ejemplo diastasa). Los fermentos no organi
zados deberan poderse separar de los proce
sos vivos. Segn una proposicin de Wil
helm Friedrich Khne (1837-1900), se
describieron en 1878 como enzimas "para
impedir malentendidos y evitar transferen
cias fatigosas" .

El cofundador de ta enseanza de clulas

Los fermentos organizados fueron uno de


los ltimos bastiones del vitalismo, cuyos
partidarios asuman un vis vitalis (fuerza
vital] de origen divino. Al principio se pens
que los compuestos orgnicos no se genera
ban en el laboracorio, porque eran inheren
tes a una fuerza vital.

Theodor Schwann ( 18 10 1882) consigui,

tres aos ms tarde, obtener y analizar en


forma pura una enzima animal del jugo gs
trico, la pepsina.

Jlns Jakob Serzelius


(1779-1848) dud en
1836 sobre miles de
procesos catalticos en
todos los seres vivos

lazarro Spallanzani
(1729-1799)

A principios del siglo XIX se asumi en gene

rat que las fermentaciones son cambios quf


micos que se producen a partir de algunas
formas especiales de materiales orgnicos,
las enzimas.

la observacin de que los procesos fermenta


tivos son procesos catalticos (del griego
k.atalysis, descomposicin). Los catalizadores
se definieron como cuerpos cuya simple presencia provoca actividades qumicas, que no
pueden tener lugar sin ellos.
1836:

En 1814, el miembro de la Academia de


Cientficos de San Petersburgo, el alemn
GoWieb Sigismund Constantin Kirchhotf f1764 l 833) demostr que existe una

sustancia en las semillas de los granos germi


nados que causa la transformacin del almi
dn en azcar.
El director de una fbrica de azcar parisina
y ms tarde descubridor de la celulosa,

28

La sntesis de la urea a partir de materiales


inorgnicos por Friedrich Wohler
(1800 l 882) hizo fracasar esta hiptesis
en 1828.

El gran qumico sueco Jons Jakob Berze


lius (17791848) se avanz a su tiempo con

Con una clara visin proftica escribi en

Antoine Ferchault
deRaumur
(1683-1757)

Wilhelm Friedrich
Khne (1837 - 1900)
denomin en 1878
enzimas a los "fermen
tos no organ izados"

Friedrich Wiihler
(1800- 1882)

Escribi a Berzelius: "No puedo, por as


decirlo, sostener mi agua qumica, y debo
decirle a usted que he podido generar urea
sin tener que precisar para ello riones ni
ningn tipo de animal, sea humano o perro".

"Llegamos a sospechar con motivos funda


dos que en las plantas y los animales vivos
se producen miles de procesos catalticos
en tejidos y fluidos entre si."
Mediante otros descubrimientos, sin embar
go, el concepto "fermento" no est claro.
En 1837, TheodorScbwann (18101882J
descubri concretamente que ta putrefac
cin, o sea la descomposicin de una sustan
cia y por lo tanto una fermentacin, se pro
duce con Ja intervencin de microorganis
mos. Se origin una situacin extraa. Se
diferencia entre dos clases de fermentos,
entre los "autnticamente organizados"

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Eduard Buchner
(1860 - 1917), premio
Nobel de qumica
en 1907

En 1897 Eduard Buchner f1860-1917) reali


z el experimento decisivo que resolvi com
pletameme la disputa entre Liebig y
Pasteur. fil quera saber si la fermentacin tam

ENZIMAS -

bin era posible sin clulas vivas y machac las


levaduras con un mbolo tras la adic!n de tierra de diatomeas (Kieselgur) en un gran morte
ro. Posterionnente presion la masa consegui

da y la envolvi en un fuerte lienzo, con una


prensa hidrulica. El jugo de la presin de las

levaduras, libre de clulas, puesto que no se


descompona, lo incorpor a una di.solucin de
azcar concentrada durante la noche. Tras un
breve espacio de tiempo, sin embargo, en la
di.solucin empez a desarrollarse un gas acti
vo: se formaba dixido de carbono!
Por primera vez se pod!a observar la rermen
tacin alcohlica sin clulas vivas de Jevadu
ras, en una disolucin libre de clulas! Por su
descubrimiento revolucionarlo de la enzima
"zimasa" Eduard Buchner obtuvo el premio
Nobel de qumica en el afio 1907.
Se demostr, dos anos despus de la muerte
de Pasteur, que es posible una fermentacin
tambin sin clulas vivas.
Pasteur y Llebig, cada uno tenla razn a su
manera: las fermentaciones eran causadas
por microbios, pero en realidad en estas con
versiones de los compuestos actuaban sus
enzimas desde dentro (in vivo). Las enzimas
son tambin capaces de actuar desde el exte
rior (in vitro) de las clulas vivas.

James B. Sumner en el laboratorio. A pesar


de ser manco, fue un hbil e~perl mentador:
cristaliz6 ureasa

El siguiente resultado fue sensacional: asom


brosamente se pueden cristalizar enzimas!
En 1926, el americano James B. Sumner
(1887-1955) (Fig. 2.1) fue el primero que
pudo obtener la enzima ureasa cristalizada
a partir de habas de soja y analizar las propiedades de la protelna.
Su compatriota John H. Northrop (1891
1975) (Fig. 2.2) cristaliz entre 1930 y 1933
las enzimas de la digestin. Ahora era indis
cutibie, tras una larga lucha, que las enzimas
son protenas.
Sumner y Northrop obtuvieron juntos el pre
mio Nobel en 1946.

Despus de su interaccin activa y tras un estado


de transicin, Ja enzima y el sustrato se combinan
exactamente. Las enzimas no unen en su centro
activo al sustrato en su configuracin original sino
en el estado de transicin ( Fi~. 2.1Oy2.11 ).
Con el entusiasmo inicial se asumi que todas las
enzimas trabajaran como Ja lisozima, segn el
principio de la distorsin del sustrato mediante
la enzima - las causas de su alta capacidad cataltica son, sin embargo, mucho ms complejas
(Cuadro 2.5).
El "truco" ms importante de las enzimas consis
te en que, debido a su estructura proteica, unen a
los sustratos en una hendidura o grieta en la mol
cula de Ja enzima para convertirlos a corto plazo.
En el centro activo se encuentran, concentrados
en el espacio ms pequeo, Jos grupos qumicos
altamente reactivos ("efecto de proximidad",
proximity effecrj.
El sustrato se introduce totalmente a travs de las
cargas en el centro --denominado algo poticamen
te "efecto Circe"- y se convierte qu!micamente en
fracciones de segundo. La propia enzima alcanza
entonces de nuevo el estado de partida, de modo
que tras repeler el producto pueda convertir otra
molcula de sustrato.
Por el orden espacial compacto y la accin concentrada de los grupos reactivos en el centro activo de
la molcula de enzima, Ja energa de activacin
requerida para causar Ja reaccin qumica (entalpa
de activacin libre) disminuye drsticamente en
comparacin con la reaccin sin enzima. Mediante
la facilitacin de la unin de Jos estados de transi
cin, las enzimas aceleran esencialmente Ja conse
cucin del equilibrio de las reacciones qumicas
(Cuadro 2.5).
En la zona de los lisozimas se poda estudiar de
modo excelente cules son los grupos y fuerzas efi
caces para constituir esta estructura en el espacio de
un centro activo (Fi~. 2.9 a 2. 11 ):
La estabilizacin de la molcula se produce a tra
vs de los diferentes grupos laterales de los aminocidos. Estn ordenados en Ja cadena peptfdica de
tal modo que sobresalen, como las cerdas de un
escobilln, hacia todos Jos lados. Con un estallido
de la cadena pueden, por lo tanto, participar fcil
mente en Ja interaccin.
La molcula consigue una solidez especial mediante

los enlaces qumicos, que se forman juntos entre los


grupos laterales que contienen azufre (S-H) coloca-

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Flg. 2.7 Ya Homero (arriba)


describi la coagulacin
de la leche con la ayuda
de zumo de higo. ste con
tiene la proteasa ficna.

Jllns Jacob BerzeUus


(1836):

"Est pues demostrado que


muchos [ ... J cuerpos [ ...)
poseen las propiedades de
ejercer una influencia total
mente diferente sobre componentes qumicos relacionados, en lo que respecta a
producir una conversin de
los componentes del cuerpo
en otras circunstancias, sin
que necesariamente estos
componentes participen en
ellas, en el caso de que oca
sionalmente pueda ser.( ..)
Esto es una[...) nueva fuerza.
(...)lo nombrar [... J la fuerza
cataltica del cuerpo y la descomposicin se realiza a tra
vs de la misma catlisis."

29

BIOTECNOLOGA

Ejemplo

Clase de enzima y principio

Producto

Oxidado

Reducido
Glucosa oxidasa

Oxldorreductasas

Oxidacin y reduccin

Hexoquinasa

Transferasas

Transferencia de grupos

Lisozima

Hidrolasas

Fragmentacin por
incorporacin de agua

RUBJSCO

liasas

Formacin de y adicin
a dobles enlaces

Cuadro 2.3 Cmo se denominan


y clasifican las enzimas
~mile Duclaux, un estudiante de Louis
Pasteur, en 1883 haba propuesto, para caracterizar una enzima, aadir al nombre del sustrato la terminacin "asa_ As, por ejemplo,
se nombraron las enzimas que degradaban
ster como esterasas, las que fragmentaban
celulosa como celulasas, las que fragmentaban protenas como proteasas. Puesto que
muchas sustancias pueden servir como sustratos de varias enzimas, pronto se incluyeron tambin los tipos de reacciones con los
nombres, asl por ejemplo glucosa oxidasa,
glucosa isomerasa o glucosa deshidrogenasa.

Junto con ellos existieron tambin todos los


nombres triviales posibles, en parte fantasiosos, como enzima de la respiracin, enzima
pH-5, enzima antiguo amarillo ... Esto produjo muchos malentendidos; adems, el nmero de enzimas conocidas creca constantemente: en 1964 fueron 900, en 1968 haba
ya 1300, y hoy se describen detalladameme
ms de 3000 enzimas. A propuesta de la
lnternational Union of Biochemistry (IUB)
se divden todas las enzimas segn su especificidad de actuacin en seis clases principales. Despus de todo, es asombroso que la
gran variedad de reacciones en todos los
seres vivos se pueda ordenar slo en seis principios de actuacin.
Cada enzima recibe adems un nmero de
cdigo segn la clasificacin de la IUB, que
consta de cuatro dgitos (clase, grupo, subgrupo, nmero de serie) separados uno de
otro mediante puntos. El nombre exacto
de la enzima se forma a partir de los sustratos
participantes en la reaccin enzimtica y el
nombre de la clase principal de la enzima.
Asl, oficialmente, la glucosa oxidasa se llama:

o
Triosafosfato isomerasa

DNA-ligasa

30

lsomerasas

ligasas

Conversiones internas
de una molcula

Enlace con utilizacin


deATP

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~-o-glucosa: 0 2 oxidorreductasa y tiene el


nmero de cdigo 1.1.3.4.

Puesto que muchos nombres de enzimas son


exactos, pero inoportunos y trabalenguas, las
principales enzimas se denominan todavia
con sus "nombres de pila", o sea glucosa oxidasa, pepsina, etctera. En las publicaciones
cientficas se debe mencionar adcionalmente
el nmero de clasificacin y el nombre oficial.

tmile Ouclaux (1840-1904)


propuso el sufijo "asa"
para la nomenclatura de
todas las enzimas

ENZIMAS .

dos entre dos componentes de aminocidos de cistena. Los cuatro puentes disulfuro (S-S) as creados
son el soporte crucial para la estructura espacial de la
lisozima. Los iones metlicos pesados atacan, por
otra parte, Jos puentes disulfuro de las protenas, una
razn para su toxicidad. Las enzimas son inhibidas de
forma no competitiva por los metales pesados.

Fig. 2.8 lisozima.


Arriba: estructura primaria
de la lisozima, serie (secuen
ca) de los aminocidos en la
molcula (estn representa
dos los 20 aminocidos
naturales; se abrevian segn
la nomenclatura intemacio
nal; los puentes disulfuro
(SS) entre los restos de cistena se destacan en color).
Abajo: estructura terciaria
de la lisozima, orden espacial de la cadena peptdica.
De la enzima y del sustrato
unidos al centro activo se
representa, por claridad,
slo el "esqueleto central"
de la cadena peptdica y del
anillo de azcar Oos puentes
di sulfuro se destacan en
color).

Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr Gin
Gty
A~
l.eu
Set

Tyr

Gty
Arg

Tyr
Asn

La estructura espacial en forma de esfera (Rgs. 2.8


y 2.1 O) se estabiliza en un medio acuoso mediante
grupos laterales polares y apolares de los aminocidos. Los grupos polares son hidrfilos (anes al agua)
y por ello se dirigen hacia fuera en el agua. Los grupos laterales apolares son en cambio hidrfobos (hostiles al agua) [Fig. 2.10). Intentan aislarse fuera del
medio acuoso. Esto slo lo consiguen colocndose
juntos en el interior de la molcula enzimtica y mantenindola as unida, igual que las gotas de aceite se
estabilizan en el agua. Adems de las interacciones
de los grupos laterales tambin se forman, sin embargo, fuertes enlaces entre tomos de oxgeno e hidrgeno cercanos del uesqueleto" de diferentes aminocidos, los conocidos como puentes de hidrgeno.

Asp
l.eu

Gly

Lys Cys Arg Asn

Gty
Thr
Asp
Val
Gin
Ala
Trp

Arg

Trp

Ala
Val
Trp

Ala

lle
Arg ---==::::;-Gty Cys Arg l.eu

His
Arg

Lys
Met

Thr
Asp

Gty

Ser
Thr
Asp

Tyr

Glu Cys Arg Gly Phe Val Lys


l.eu

Ala Ala Ala

2.3 Los cofactores


sirven como herramientas
a las enzimas complejas

Imagen espacial de la
lisozima de clara de huevo

No todas las enzimas son una molcula de protena


pura como la lisozima sino que utilizan una "herramienta", componentes qumicos adicionales, conocidos como cofactores. Tales enzimas "cualificadas" tienen tambin un complicado mecanismo de
reaccin.
Los cofactores pueden consistir en uno o ms iones
inorgnicos (Fe2 , Mg2, Mn2 o Zn 2) o complejas
molculas orgnicas, las coenzimas. Algunas enzl
mas necesitan al mismo tiempo ambos tipos de
cofactores.
Las coenzimas son molculas orgnicas que se unen
en el centro activo de la enzima (o cerca de l);
modifican la estructura del sustrato o transportan
electrones, protones y grupos qumicos entre enzi
ma y sustrato, a menudo grandes distancias dentro
de la molcula de la enzima, hasta que los liberan
para utilizar de nuevo la enzima.

Otto Heinrich Warburg ( J883-1970, Fig. 2.3) des


cubri la enzima de la respiracin citocromo oxi
dasa (Cap. 1, Fig. 1.14) y el NAD. Su descubrimiento y la siguiente clarificacin de su estructura fue un momento estelar de la bioqumica
moderna. Si se carece de la vitamina niacina en la
alimentacin, determinadas enzimas (por ejemplo
las deshidrogenasas) no pueden trabajar activa
mente en el cuerpo, y Jos afectados enferman de la
avitaminosis pelagra. Warburg present la prueba
ptica de Warburg, en la cual el NADH reduci
do puede ser cuantificado a la longitud de onda de
340 nm (el NAD oxidado no absorbe la luz de Ion
gitud de onda 340 nm). Por ello se pueden medir
importantes reacciones enzimticas, tales como el
anlisis de glucosa con glucosa deshidrogenasa,
an utilizado hoy (vase Cap. 1O).
Las vitaminas B2 (riboflavina), 812 (cianocobalami
na) y C (cido ascrbico) se producen mundialmente a toneladas por procedimientos biotecnolgicos
(Cap. 4).

Muchas coenzimas se forman a partir de precursores de vitaminas. Por ello requerimos un suministro
indudablemente bajo, pero ininterrumpido, de ciertas vitaminas. Por ejemplo, una de las coenzimas Los grupos prostticos son cofactores unidos
ms importantes, la NAD (nicotinamida adeni- potentemente. El grupo prosttico de la glucosa
na dinucletido), se forma de la vitamina niacina. oxidasa es la flavina adenina dinucletido (FAD).
Las principales vitaminas solubles en agua del gru La peroxidasa y el citocromo P-450 tienen un gru
po Bactan de modo similar a la niacina como pre po hemo, como ocurre en la mioglobina y la hemo
cursores de coenzimas.
globina. El grupo hemo consta asimismo de un ani

Fig. 2.9 El modelo espacial


de la lisozima construido
como lo hizo David Phillips.
Arriba: los primeros 38 restos
aminocidos. En el centro:
restos 1-86. Abajo: restos
1-129, la molcula completa

31

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BIOTECNOLOGA
Fig. 2.10 Estructura terciaria
de la lisozima y su sustrato.
Se muestran todos los to
mos de ambas molculas;
se destacan los grupos late
rales de los aminocidos del

llo de porfirina, en cuyo centro est unido un ion


de hierro.

Modelo del sustrato


{seis anillos de azcar)

centro activo, que participan


en la unin y conversin del
sustrato. Asp 52 y Glu 35 slg
nifican cido asprtico en la
posicin 52 de la cadena
peptdica y glutmico en la
35. Posiciones de t29 amino
cidos.

Flg. 2 .11 Abajo: mecanismo


temporal de la rotura del
sustrato ~e muestran slo
los anillos 4 y 5 del azcarcon los tomos ms lmpor
tantes de su "esqueleto cen
tral", entre los cuales se rea
liza la separacin.

llsozima
Interior de
la enzima
Grupos
laterales de los
aminocidos
apolares
hidrfobos

Superficie
de la enzima
Grupos laterales
de los aminocidos
polares hidrfilos

Centro
activo
apolar hidrfobo

Complejo lisozima-sustrato

Unin del sustrato al centro


activo.

2. Distorsin del anillo 40 del


azcar.

3. Un protn (W) del cido


glutmico (Glu) ataca la
unin entre los anillos 40
y 50 del azcar.

Mecanismo temporal de la rotura del sustrato

5. El segundo producto a
separar est, por lo tanto,
unido (anillos te a 42) y se
repele.

Con el descubrimiento de las enzimas de la


digestin se desarrollaron en el siglo XIX los
mtodos de obtencin de enzimas de animales
(Cuadro 2.2). An hoy se producen preparados
crudos, como la pepsina de la membrana de la
mucosa gstrica del cerdo y del buey, enzimas de
laboratorio a partir de estmagos de ternero y mezclas enzimticas de tripsina, quimotrpsna, lipasas
y amilasas de la glndula de la digestin (pncre
as) del cerdo. El vino de pepsina de la farmacia
contiene principalmente pepsina de estmago de
cerdo. Con fines analticos y medicinales se pueden preparar enzimas altamente purificadas de
rganos con alto rendimiento metablico (carne
muscular, hgado, bazo, rifin, corazn e intestino
delgado}.
Adems de las enzimas de los animales se estudian
tambin las enzimas de las plantas por sus posibilidades de aplicacin en la industria. Los cereales
liberan, tras el hinchado y la germinacin de la mal
ta, la enzima degradadora del almidn (amilasa) y
las fragmentadoras de protena proteasas, que se
utilizan desde la antigedad en la fabricacin de
cerveza y la destilacin de licores.
Del jugo de las plantas tropicales se produjeron de
modo ms simple ya en el siglo pasado pwteasas
con alto rendimiento: papana y quimopapafna del
rbol de la papaya (Fig. 2.19), ficna del jugo de la
higuera (Fig. 2.7) y bromelina de tallos de pia.
Estas proteasas exticas se utilizan an hoy, por
ejemplo para "ablandar" (tenderizinii la carne

6. la enzima se regenera
completamente y puede unir
la molcula de sustrato y
convertirla. Se convierten
dos molculas de sustrato
por segundo.

32

Los cofactores son las "herramientas" de muchas


enzimas. La parte proteica de la enzima encama al
"artesano", del cual depende que trabaje efectiva
mente con las herramientas. Sin su herramienta,
naturalmente, est indefenso incluso el mejor arte
sano, pero sin artesano la herramienta ms bonita
es Intil.

2.4 las enzimas


pueden obtenerse de animales,
plantas y microorganismos

4. Se origina un ion carbonfo


(C) cargado positivamente
en el anillo 42 del azcar, que
se estabflfza mediante un
grupo cargado negativamen
te del cido asprtico (Asp).
la unin entre los anillos 40
y 52 se separa, el primer pro
dueto (anillos 52 y 60) aban
dona el centro activo.
El ion carbonio se libera con
un ion hidroxilo (OH-) de una
molcula de agua. El protn
de la molcula de agua com
pleta de nuevo el lugar no
ocupado del cido asprtico
en el centro activo.

En cambio, las coenzimas estn enlazadas holgada


mente, unen sustratos y los transforman, y por lo
tanto tambin los utilizan. Al contrario que los sus
tratos, sin embargo, son usadas por una variedad de
enzimas (por ejemplo NADH y NADPH en casi
todas las deshidrogenasas), regeneradas en las clu
las (vase 2.13) y de nuevo utilizadas. Las enzimas
que utilizan la misma coenzima son, por regla gene
ral, similares mecanfsticamente.

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ENZIMAS -

Cuadro 2.4 Historia de


la biotecnologa:
El resfriado de Flemlng y sus
consecuencias enzlmol6glcas
A pesar de su resfriado, Alexander Fleming
(1881-1955) trabaj en el ano 1922 en su
laboratorio microbiolgico en Londres. Su
creciente curiosidad por la investigacin le
llev a incorporar algunas gotas de su muco
sidad a un cultivo de bacterias. Grande fue su
sorpresa al observar; unos das ms tarde, que
algo en la mucosidad haba matado las bacterias. Puesto que la sustancia era claramente
una enzima y desintegraba (lisaba) determi
nados microbios, la denomin llsozlma. Pos
teriormente Flemlng descubri la lisozima en
todas las secreciones del cuerpo, sobre todo
en las lgrimas.
Alexander
Flemlng
(t88M955)
descubri pri
mero la lisozi
ma antes de
que m~s tarde
descubriera la
penicilina.

Se cuenta que sus colaboradores, estudiantes


y visitantes deban entregar a Aeming sus
lgrimas. Especialmente rica en lisozima era
tambin la clara del huevo (en ingls, egg
whitej de galllna. Aqu se pudo sospechar
un mecanismo de proteccin frente al ataque bacteriano. Para Aemlng la decepcin
fue muy grande, pues la lisozima, tan fuerte
contra los microbios inofensivos, no tena
efecto contra las bacterias que provocaban
enfermedades.

Transcurrieron dos anos hasta que Fleming,


en un experimento tambin aparentemente
fortuito, descubri un antibitico sumamen
te efectivo: la penicilina (vase Cap. 4).

La lisozima debe ocupar, por lo tanto, un


lugar de honor en la historia de la biologa
moderna. Fue la primera enzima de la cual
se aclar su estructura espacial y se entendieron al detalle atmico sus propiedades. El
sustrato de Ja lisozima es una molcula compuesta de anillos de azcar, de cido acetil
murmico y de acetilglucosamina (Ag. 2.10),
as llamado mucopolisacrido, que sirve
como componente de las paredes celulares
de las bacterias.
Cuando la lisozima fragmenta su sustrato, la
clula se permeabiliza, toma lquido y estalla

por la elevada presin osmtica en el interior


de las clulas.

anillos de azcar encadenados, todos con


forma de silla.

En 1963 se aclar la secuencia de aminocidos (estructura primaria) de la lisozima de la


clara de huevo (Fig. 2.8).

Tres anillos de azcar encajaban exactamente


bien, cumpliendo el principio de la Uavecerradura, en la mitad superior de la hendi
dura; el cuarto no entraba bien en la hendi
dura en su forma de silla normal. Algunos de
sus tomos entraban en conflicto con los gru
pos laterales de los aminocidos en el centro
activo.

Los 20 aminocidos se diferencian por sus


grupos laterales. Sin embargo, no estaba da
ro cmo este hilo largo de la protena, con
sus 129 aminocidos y en conjunto 1950
tomos, puede formar un centro activo
y unir y transformar un sustrato.
El anilisis estructural de rayos X permi
li establecer la estructura espacial de la liso
zima. Tras la exitosa aclaracin de la estruc
tura espacial del colorante rojo de la sangre
hemoglobina y de la protena muscular mio
globina (premio Nobel 1962) por John C.
Kendrew (1917 1997) y Max F. Perutz
(1914-2004), la lisozima fue la tercera prote
na y la primera enzima cuya estructura
espacial se determin con ayuda de este
mtodo (Fi~. 2.8 a 2.1 O).

David Philipps (1924-1999) vlos cristales de


lisozima.

En 1960 David Phllipps (1924 1999) y sus


colegas de la Royal lnstitution, en Londres,
empezaron con el trabajo. Primero se crista
Uz la protena. En la primavera del afio
1965 se termin la primera imagen espacial
de la lisozima, que no mostr una molcula
claramente estirada en hilo sino una estruc
tura compacta con una hendidura. La sorprendente profundidad de la molcula de
lisozima debfa contener el centro activo.
Por primera vez se haba hecho visible el
centro activo de una enzima analizando la
estructura por rayos X!
Pero con la imagen espacial no se poda mostrar cmo se une y fragmenta el sustrato en

el lugar de donde viene la energfa para la


fragmentacin. Philipps construy, basndo
se en la imagen espacial, un modelo espa
dal de la lisozima pedazo a pedazo uniendo
cintas y bolas (Fig. 2.9).
AJ mismo tiempo construy un modelo de
cintas de una parte del sustrato, que interac
cionaba con la lisozima. Consisa en seis

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Philipps adapt el modelo de cintas del cuar


to anlllo de azcar de su forma de silla natu
ral a una extendida fragmentada anormal
"forma de bal\era". Ahora encajaba exacta
mente bien! Como en el modelo, la lisozima
deba funcionar distorsionando el cuarto anl
llo de azcar, y con ello encajaba bien.
El quinto y sexto anillos se encontraban bien
ajustados en la hendidura tras la distorsin
del cuarto anillo, sin otra lnOeccln adicional. Justo entre el cuarto anillo girado
y enganchado y el quinto anillo normal se
fragmenta el sustrato (Fig. 2.11 ).

La hendidura de la enzima se forma principalmente de aminocidos apolares, cuyos


grupos laterales no llevan ninguna carga
elctrica. Directamente junto al enlace frag
mentado, entre el cuarto y el quinto anillos,
se encontraron sin embargo los grupos laterales polares del cido asprtico (Asp) con
una fuerte carga negativa. Contrariamente,
por el otro lado la hendidura contiene los
grupos laterales del cido glutmico (aminocido N 35) (Fig 2.11 ). Ambos grupos laterales tomaron "en las tenazas" las uniones
formalmente de rotura. Por primera vez se
aclar el mecanismo de una reaccin
enzimtica hasta los detalles atmicos. En
el modelo de la lisozlma se pudieron estudiar
adems de modo excelente las leyes genera
les de la formacin de las enzimas.
Tambin el modelo de la lisozima proporcio
n otra explicacin: en realidad se esperaba,
segn el principio de llave-cerradura de
Emll Fischer, que el sustrato entrase exactamente en el centro activo, y sin embargo
el sustrato se adaptaba slo tras la distorsin
mediante la enzima en el centro activo. No
obstante, esto no era suficiente. No slo se
modificaba el sustrato; como demostr el
anlisis estructural de rayos X, se estrechaba
y profundizaba tambin la hendidura de la
lisozima mediante la unin del sustrato. Era,
por as decirlo, una cerradura de goma con
una llave de goma, o mejor un ajuste indu
ddo, como el de una mano y un guante.

33

BIOTECNOLOGA

como ayuda en Ja digestin opara la limpieza de len


tes de contacto [Fig. 2.18).

fig. 2.12 la araa zancuda


Pholcus pica a un mosquito
con su aguijn en una de las
largas patas de ste. El jugo
digestivo se inyecta para
digerir a la vctima desde
dentro. y a travs de esta
"pajita" sorber hasta vaciar
el cuerpo del mosquito por
completo. Esto dura hasta
16 horas, porque primero el
jugo de la enzima digestiva
debe ser inyectado a travs
de la estrecha pal ita del
mosquito en el cuerpo, y
tambin en las otras cinco
largas y estrechas paras,
antes de que la araa zancu
da pueda sorber el "cocktail
mosquito" en direccin con
traria.

fig. 2.13 Jokichi Takamine


(1854-1922), arriba, us
como empresario una de las
primeras enzimas microbia
nas; abajo: su medio de ayu
da para la digestin Taka
Oiastase.

34

En Europa, por otro lado, la produccin de enzimas


de plantas es difcil. La produccin y el contenido de
la enzima dependen mucho de la temporada del
ao, y la renovacin de una gran cantidad de plan
tas es muy compleja. Las enzimas de animales se
acumulan principalmente como subproductos en la
produccin de carne; las enzimas de plantas requie
ren un uso elevado de material de partida. Ambas
fuentes enzimticas no pueden cubrir la demanda
constantemente creciente de enzimas. Los micro
organismos fcilmente cultivables se considera
ron, por lo tanto, como nuevas fuentes enzimticas.
En 1894 empez la utilizacin industrial con una
patente del japons Jokichi Takamine (1854-1922)
(Fig. 2. 13), que fue a Peora, Estados Unidos, para
trabajar all. Peoria desempe ms tarde un
importante papel en la produccin de penicilina
(vase Cap. 4). El mtodo patentado por Ta ka mine
del cultivo en superficie (cultivo de Emmer)
fue sencillo y genial: de la paja de trigo se generan
alimentos y sales de nutrientes. Tras la inyeccin
con esporas de Aspergillus oryzae, almacen Ja
paja impregnada en jaulas dentro de cmaras incu
badoras. Despus de que el moho hubiera crecido,
la paja se lav en una disolucin salina para extraer
las enzimas eliminadas de las clulas (amilasas, proteasas). Hasta el final de la Segunda Guerra Mundial haba en Estados Unidos fbricas de enzimas,
que diariamente generaban hasta 1Ot de "paja con
moho". Ya hacia finales de los aos 1950 se aplica
ron mediante los cultivos sumergidos, en los cua
les se "sumergieron" los mohos.
Evidentemente, las ventajas de la utilizacin de
microorganismos como fuentes de enzimas son
obvias: pueden producirse rpidamente, en cantida
des grandes, relativamente baratas y con indepen
dencla de la ubicacin y la temporada del ao. Apli
cando mutantes apropiados es posible la induccin
y seleccin, para alcanzar rendimientos extremadamente elevados de enzimas. Finalmente se pueden
producir mediante ingeniera gentica "enzimas al
gusto" a partir de microorganismos manipulados y
mediante el diseo de protenas.

estables al calor, pues de lo contrario no podran


existir. Un ejemplo es la Taqpolimerasa de Thermus
aquaticus (Cap. 10), que sin la ingeniera gentica
hoy sera impensable. Tales enzimas termoestables
se encuentran incluso en microorganismos de los
habituales montones de abono vegetal, en los que
se orignan altas temperaturas. En los mares de agua
salada se encuentran las bacterias halfilas (afines
a la sal). Las enzimas psicrfilas (afines al fro) se
aslan de microorganismos de la Antrtida.

2.5 Las hidrotasas extracetutares


degradan tos biopolmeros en
pequeas unidades utilizables
El enfoque principal de la produccin de enzimas
microbianas se encuentra en las enzimas hidrolti
cas simples (proteasas, amilasas, pectinasas), que
degradan polmeros naturales, como protenas,
almidn o pectinas. Las enzimas se extraen de los
microorganismos al medio para ampliar las fuentes
de alimento. Estas enzimas extracelulares fragmentan las enormes molculas del sustrato fuera de
la clula en trozos pequeos, y asf los hacen dispo
nibles para los microorganismos. En el reino animal
esto se denomina digestin extraintestinal, y ocurre
por ejemplo en las araas (Fig. 2.12).
No es de extraar que hasta ahora las enzimas extracelulares se produzcan preferiblemente de forma
industrial, porque pueden obtenerse de modo simple y barato del medio y no son necesarios una
extraccin celular inoportuna y cara ni procesos de
purificacin. Puesto que una clula bacteriana con
tiene mil enzimas diferentes, una enzima intracelular (o sea, una enzima que permanece en la clula) debe separarse de todas las otras enzimas y
estructuras celulares. Las protenas se diferencian
tanto, en dos caractersticas, que se pueden usar
estas diferencias para separarlas: el peso molecular y
la carga elctrica.
Todos los procesos de separacin de protenas cono
cidos se basan en estas diferencias: precipitacin
con sales, recorrido en un campo elctrico (electroforesis), unin a portadores cargados o descargados
(cromatografa), espectrometrfa de masas y otros
mtodos (Cap. 1O).

Junto a los altos rendimientos de enzimas, se exige 2.6 Las amitasas mezclan,
cuecen y trenzan
una alta estabilidad de stas para su aplicacin
industrial. En la naturaleza existen muchos micro El duque bvaro Guillermo IV (Fig. 1.28, pg. 21 )
organismos en condiciones extremas, de modo que promulg en 1516 la ley de pureza. Dice que
existen tambin enzimas especialmente estables en "[ ... 1no se deben usar ni utilizar en ninguna cervesus clulas. Los microorganismos termfilos [afi- za ms materiales que cebada, lpulo y agua", y
nes al calor) de las fuentes calientes del parque sigue en vigor en Alemania. En los prncipales panacional americano de Yellowstone o de Kamts- ses, sin embargo, ha cambiado por motivos econchatka poseen inevitablemente tambin enzimas micos y Ja malta se ha reemplazado total o parcial-

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ENZIMAS .

Cuadro 2.5 El truco de las enzimas


Las enzimas aceleran las reaccones qumicas
en un factor de 100 millones a un billn
(108- IO'l). Asumamos que una reaccin
catalizada por enzimas se acabe completa
mente en un segundo; la misma reaccin,
con un factor terico de 10 10, requiere para
acabarse 3000 aos a una velocidad de caracol! Su velocidad serla apenas medible.
La variedad de reacciones metablicas en
el organismo serla tan lenta sin enzimas que
no tendran ninguna utilidad. Las enzimas
hacen posible la vida.
Para que los materlales puedan reaccionar
unos con otros se deben activar, lo que signi
ca que necesitan un estado capaz de reaccionar. La energa que debe utilizarse para
ello se denomina energla de activacin.
Se puede ilustrar el recorrdo energtico de
una reaccin qumica con una grfica con
apariencia de montaa (vase Fig. abao}.
Los materiales de partida son, pues, comparables a piedras que se encuentran en un
desfiladero en una vertiente de la montaa,
evitando el valle, y slo pueden rodar hacia
el valle (o sea, pueden transformarse en pro
duetos) si se alcanza la correspondiente
energa de activacin para resbalar atravesan
do el pico de la montaa. En las reacciones
qumicas, esta energa de los materiales se
puede proporcionar, por ejemplo, mediante
aumentos de temperatura o presin. Eso por
supuesto serla mortal para una clula viva!

Generalmente todos los catalzadores reba


jan la energa de activacin (entalpa de acti
vacin libre o de Gibbs). Llegan ahora, vol
viendo a la imagen, hasta el pico de Ja mon

taa, y necesitan solamente una energa baja


para vencerlo. Esta menor energa requerida
puede alcanzarse fcilmente y a menudo. Se
pueden comparar los cacalizadores tambin
con un gua de montaa, que en lugar de a
travs del pico conduce por pasos de monta
a, con un gaseo considerablemente menor.
Los estados de equilibrio de la reaccin se
simbolizan con el desfiladero (estado de par
tida) y el valle (estado final); en medio hay
un estado de transicin de los complejos
activados.
Las enzimas no modifican la sicuacin del
equilibrio de la reaccin (esto es significativo
para cambiar la profundidad del desfiladero
o del valle), sino que simplemente posibilitan
una consecucin considerablemente ms
rpida de esce equilibrio. Con ello aceleran
un proceso que, incluso sin ellas, transcurr
ra ms lentamente (en muchos casos serla
desmesuradamente lenco).
Cmo ocurre esto, sin embargo, es polmico
para el enzimlogo. No hay, obviamente, un
esquema vlido en general para codas las
enzimas.
Una posibilidad la hemos visto con la lisoz
ma (Fl~. 2.8 a 2.11 ): el sustrato se deforma
mediante la enzima, utilizada en un lugar
tenso (estado de transicin), a partir del cual

Reaccin no
catatizada
Energa de
activacin

Complejo
enzima-sustrato
......................................
Reaccin

-Energa
de la
reaccin

enzimtica.
............................

puede escapar medante la formacin del


producto.

Unin del
sustrato (rojo)
al centro activo
de la lisozima

(azuO

Una mayor cantidad de energa para la reac


cin se obtiene seguramente con la unn del
sustrato al centro activo. Las sustancias, que
deben encontrarse primero por casualidad en
una disolucin, se conducen por la enzima al
centro activo en una estrecha vecindad. Su
oportunidad de reaccionar unos con otros es
entonces mucho mayor.
En los centros activos estn concentrados en
un pequeno espacio los grupos qumicos
altamente reactivos de la enzima, ordena
dos espacialmente, de modo que tienen un
contacto directo con los enlaces del sustrato
que se deben cambiar. ~stos sufren as un
"bombardeo" masivo dirigido y coordinado.
Debido a que el centro activo est formado
principalmente por grupos apolares, esta
zona de la enzima es comparable con un
disolvente orgnico (apolarJ. Las reacciones
orgnicas transcurren en medios de disolucin orgnicos apolares generalmente ms
rpido que en el agua polar. En el encamo
orgnico del centro activo, por lo tanto, hay
unos pocos grupos laterales de aminocidos
polares cargados "superreactivos" en compa
racin con su comportamienco en disolucin
acuosa.
De dnde parte la superioridad de las reacciones de las enzimas frente a las reacciones qumicas "normales" no catalizadas, y tambin
respecto a aqullas con catalizadores tcni
cos, est claro a partir de los denominados
factores. De ellos resulta que la enzima debe
ser una molcula encadenada enorme.
Slo asr, mediante ei plegamiento de los grupos reactivos requeridos, pueden concentrarse en un lugar, de modo que sean eficaces en
el miSmo tiempo y en el mismo sitio. Por
ello, una molcula de enzima no es una
estrUctura formal sino una estructura factible
de nexibilidad y elasticidad.

Productos.
,,..........................

"Valle"
Productos

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Comportamiento energtico en una reaccin no


catalizada qufmicamente (detrs) y una catlisis
enzimtica (delante). La energa de activacin
para ambas reacciones se diferencia considerablemente.

35

BIOTECNOLOGA

Fig. 2.11 Al empresario


alemn e inventor de la
baquelita Otto Rohm
(1876-1939), de Oarmstadt,
alumno de Eduard Buchner,
se le ocurri a principios del
siglo XX purificar agua sucia
lavndola con un extracto
de enzimas de pncreas
(glndula de la digestin).
Con su empresa produjo en
1914 el detergente "Burnus",
que contiene proteasas pancreticas de cerdo.

Fig. 2.15 El detergente


"Burnus" del a~o 1914,
que contenfa proteasas
de pncreas.

Fig. 2.16 Las pectinasas


licuan la fruta.

36

mente por cereales no germinados, maz o arroz.


Puesto que la materia sustituta apenas posee ami
lasas, los preparados enzimticos deben contener
amlasas, glucanasas y proteasas de moho o bacte
rias, aftaddos como "enzimas para la fabricacin
de cerveza".
Los alemanes han llegado mientras tanto al tercer
lugar en produccin de cerveza (114 millones hL en
1998), por delante de Estados Unidos (236 millones
hL) y China (178 millones hL). Ala vuelta del milenio, los fabricantes de cerveza de todo el mundo pro
ducfan por ao aproximadamente 1500 millones de
hectolitros de cerveza, con un valor de produccin
de 50 000 millones de euros. Los procesos bsicos
enzimticos siguen siendo, sin embargo, los mismos
que hace 2000 aos en el antiguo Egipto.
El almidn de los cereales se degrada enzimticamente a azcar, que entonces se fermenta alcohli
camente mediante las levaduras. El almidn es un
material de reserva de las plantas y se encuentra en
los alimentos ms importantes de humanos y animales. Es un polisacrido y consta exclusivamente
de eslabones de glucosa. Diferentes amilasas degradadoras de almidones en la malta fragmentan de
dstintos modos los enlaces entre molculas de glu
cosa y lberan fragmentos de almidn de diversos
tamaos. La malta contiene slo un 0,5 a 1 % de
amilasas, pero es con diferencia en todo el mundo
la mayor enzima cuantitativamente hablando. Para
obtener la energtica glucosa (azcar de uva) se
debe degradar por completo, si es posible, el almi
dn de patatas o de maz. Anteriormente esto se
haca con cidos a altas temperaturas sobre el almidn (hidrlisis cida).
Desde hace aproximadamente 20 aos, sin embar
go, las amilasas se utilizan en cantidades cada vez
mayores. El almdn se incuba a 80 hasta 105 C
durante tres horas y la a -amilasa lo degrada en
pequeflos fragmentos y lo hace ms fluido. Se origina una mezcla de dextrina, que mediante otra amilasa, la glucoamilasa, se puede fragmentar a los ele
mentos bsicos (glucosa). Por cristalizacin se orig
na glucosa pura.
La aamilasa de Bacil/us species trabaja en dos a
tres horas a 95 oe. La glucoamilasa se origina de
mohos (de la lnea Aspergillus). Las ventajas de la
fragmentacin enzimtica de azcares son el alto
rendimiento en glucosa, el acortamiento de los
tiempos de degradacin del almidn y Ja supresin
del tratamiento cido que antes afectaba al medio
ambiente.
Tambin en la coccin del pan se utilizan enzimas. Las amilasas aumentan mediante la degrada-

cin de almidn el contenido de azcar en la masa


y aceleran con ello la fermentacin. Las proteasas,
sn embargo, suelen degradar la protena "pegamento" (gluten) en la masa. El gluten une una parte de agua y forma un esqueleto en forma de gel. Las
proteasas de mohos degradan el gluten, la masa
puede alargarse y mantiene mejor las burbujas de
dixido de carbono dentro. El volumen de los
"panecillos enzimticos" es mayor que si no tuvieran enzimas.
En la industria textil (por ejemplo en la fabricacin
de pantalones vaqueros) se trata el rulo de algodn
con almidn como medio de alisado; con ello se
pegan las fibras y se hace ms resistente a los esfuerzos mecnicos al tejer.
Sin embargo, el almidn debe retirarse del tejido.
Para el trenzado se utiliz al principio amilasas de
malta y pncreas, pero hoy se usan amilasas de bacterias, que son relativamente estables al calor, de
modo que pueden trabajar a temperaturas ms altas
y el proceso transcurre muy rpido. Al mismo tiem
po puede blanquearse eficientemente a estas tem
peraturas con un proceso de bao.

2.7 las pectinasas prensan ms


zumo de fruta y verduras
Los zumos de frutas y verduras son el "caballo de
carreras" de la vida sana. Al exprimir frutas y verdu
ras, sin embargo, el rendimiento en el zumo pren
sado disminuye debido a la pectina de alto peso
molecular. La pectina --Obtenida del corazn de la
manzana- es conocida por las amas de casa por ser
un mtodo gelatlnizante de ayuda para la fabricacin de confituras. Sin embargo, precisamente no se
desea la gelatinizacin al exprmir un zumo: las pee
tinas hacen espeso el zumo de fru tas.
Las pectlnasas de moho (Aspergillus, Rhizopus) se
consiguen en un cultivo superficial. Mundialmente
se producen de esta manera unas 100 t al ao. Se
aaden a las frutas y las verduras cortadas en trozos
pequeos y destruyen las largas cadenas de pectina.
As, la viscosidad (resistencia a la fluidez) del zumo
baja fuertemente, se facilta la filtracin y el rendimiento aumenta de forma considerable (Fig. 2.16).
La alimentacin de los bebs es otra aplicacin
importante de las pectinasas, al macerar (ablandar)
las frutas y verduras.
Tambin el yogur de frutas y los zumos de fruta
turbos son generalmente productos de biotecnologa. Para producir zumo de zanahorias en lugar
de pur de zanahorias, aparte de pectinasas se aaden celulasas de moho degradadoras de la pared
celular.

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ENZIMAS -

2.8 Los biodetergentes


son la aplicacin ms importante
de las enzimas hidrolticas
La eliminacin del contenido proteico de las man
chas (por ejemplo de leche, yema de huevo, sangre
ocacao) es difcil. Las contaminaciones proteicas
son muy dificilmente solubles en agua, y a altas tem
peraturas las protenas coagulan sobre las fibras del
tejido y se mantienen an ms firmemente. La ropa
sucia contiene polvo, hollfn y materia orgnica,
como grasas, protenas, hidratos de carbono y colo
rantes, juntos. En especial la suciedad se pega a la
ropa de cama y la ropa interior. Las grasas y las pro
tenas actan como un pegamento para la suciedad.

Con el lavado se elimina de los tejidos la contami


nacin grasa mediante productos activos de super
ficie (detergentes), pero las protenas permanecen
pegadas. Otto Rohm ( 1876 l 939) (Fig. 2.14), alum
no de Eduard Buchner, fue el primero en utilizar
una enzima para el lavado (Fig. 2.15).
Sin embargo, las enzimas pancreticas usadas no
eran muy estables y adems resultaban demasiado
caras. Los biodetergentes no podan producirse
masivamente. Esto cambi cuando en 1960 se
encontr en Bacllus lichenforms la subtilisina,
que acta en medios alcalinos.
Hoy los biodetergentes estn muy extendidos. Las
proteasas alcalinas, de las cuales se aade aproxi
madamente 200 mg por kg de polvos de lavado,
actuan ptimamente en la colada. Tienen una baja
especificidad de sustrato y por ello son un "redu
celotodo" que degradan el pegamento proteico a
aminocidos y pptidos de cadena corta (Fig. 2.1 7).
Con ello disuelven la contaminacin proteica del
tejido y en realidad lavan "hasta la profundidad de
los poros".

Fig. 2.17
Biodetergente y su principio
de accin.

Fibra sucia

Partcula
:sucia

! Grasa

; Protena
: en_suciada

Biodetergente

!Pptidos y
:aminocidos

Actividad de lavado

~;~e:~~i~:s

~ --

/
20

Sin enzima

40

60

So

100

Temperatura de lavado en

do enzimtico se obtiene el mximo efecto de lava


do tambin a 50 a 60 C (sin que el agua hierva)
(Fig. 2.17). Con este mtodo se ahorra una valiosa
energa. Junto a las proteasas a menudo tambin se
aaden amilasas para degradar restos de almidn
y lipasas para degradar llpidos.
Las celulasas en los detergentes completos degra
dan las microfibras que sobresalen de las fibras, de
modo que el algodn tiene un tacto ms suave y el
color parece ms vivo. Tambin los lavavajillas con
tienen ms enzimas, obviamente ms amilasas y
lipasas.

Los biodetergentes se vendieron a mediados de los


aos 1960 en grandes cantidades en Estados Uni
dos, Europa Occidental y Japn. El problema del
polvo y las alergias que podan causar en los traba
jadores en las fbricas de detergentes se solucion a
corto plazo con la granulacin del producto. Se uti
!izan ahora comercialmente y con capacidad de flo
culacin granulados sin polvo (perlas). Los deter
gentes lquidos no ofrecen ningn problema para
los alrgicos. Las pastillas (tabletas) compactas
tampoco producen problemas y obtienen los mis
mos resultados (Cuadro 2.6).

Las sales quitamanchas enzimticas contienen


proteasas, lipasas y amilasas, y no disuelven slo las
manchas especialmente difciles de vino tinto, hier
ba, fruta, verdura, caf y t, sino tambin las man
chas mucho ms frecuentes de mezclas. As, por
ejemplo, el helado, la tarta de fruta y la crema de
espinacas, aparte de los componentes coloreados
contienen tambin protenas y grasas. En las man
chas de salsa de carne, tomate "ketchup" y muchos
platos preparados tambin se encuentran los cua
tro tipos de manchas: colorante, protena, grasa y
almidn.

Debido al creciente gasto energtico cobr impor


tancia en los ltimos aos una propiedad del deter
gente: puesto que las enzimas participantes trabajan
ptimamente a 50 a 60 C, con el producto de lava

Las sales quitamanchas, como los detergentes,


contienen un producto blanqueador oxidativo, que
en realidad destruye las enzimas. Mediante lnge
niera gentica se han adaptado ptimamente las

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Fig. 2.18 Limpiador enzim


tico para lentes de contacto
(arriba); la papana de la
papaya ayuda en la diges
tin (abajo).

Flg. 2.19 rbol de la papaya


(Car/ca papaya).

37

BIOTECNOLOGA

Cuadro 2.6 Cmo se producen


las enzimas de los detergentes
En grandes tanques de 1O000 a 100 000 L
de capacidad se cultivan los productores
de enzimas. El nutriente contiene almidn
degradado de antemano (5 a 15 %) como
fuente de carbono y fuente de energfa, asf
como un 2 a 3 %de harina de habas de soja
y un 2%de albmina de leche o de gelatina
como fuentes de protena y nitrgeno bara
tas, adems de fosfato para la estabilizacin
del grado de acidez (pHJ. Se estabiliza el
medio a 121 C con vapor durante 20 a
30 minutos y entonces se enfrfa. El cultivo
sigue a 30 a 40 C con un pH neutro y bue
na ventilacin.

.. . .i.

"~-'!>/lo. ":::lA>!I~-~

9;..11~""'*1:!;\.,..,.JC-1;t:t:i..e'F.

-~ ~

Princpio de actuacin de los biodetergentes

Se genera un cultivo puro de una lfnea selec-

cionada especial de Bacfllus lichenijormis y

se inyecta primero en matraces en agitacin


con medio de cultivo. El cultivo inyectado
(inculo} se coloca en un biorreactor ms
pequeilo (10-50 L) y generalmente se alma
cena en otro cultivo en volmenes de unos
500 a 1000 Lantes de ser inyectado al reac
tor de produccin.
Las bacterias usan primero las fuentes de
nitrgeno fcilmente utilizables del medio;
antes de 1020 horas se puede analizar en
el medio la proteasa subtilisina. La a amila
sa colocada de antemano para la posterior
degradacin del almidn desaparece ms
tarde, mientras que la produccin de protea
sa sigue mientras haya protenas en el
medio.
Para no poner en peligro el producto desea
do debido a la asentacin de otros microbios,
el contenido del biorreactor se enfra rpida
mente a unos 5 C. Se separan las clulas
(aproximadamente 100 g L1 tras unos pre
parativos mediante centrifugacin o filtta
cin. Las proteasas del sobrenadante del cul
tivo se concentran finalmente mediante
ultrafiltracin. En sta, las membranas sirven

proteasas de Baci//usal proceso de lavado. Por inge


niera gentica se generan 1000 toneladas anuales
de proteasas modificadas, sobre todo subtilisinas, en
las cuales se reemplaza un aminocido que puede
ser oxidado (metionina de la posicin 222) por un
aminocido estable.
Flg. 2.20 Olio Rhm (de re
cha) con un curtidor de cuero.

Estas subtilisinas son suficientemente estables a pH


1Oy a 60 C, incluso contra tensoactivos, formado
res de complejos para endurecer el agua y produc
tos de oxidacin.

2.9 las proteasas ablandan

la carne y curten la piel


Fig. 2.21 Oropon" fue el pri
mer medio de curtido de
cuero industrial. Contena
extracto de pncreas.

Fig. 2.22 Pollo y cerdo se


aprovechan de ta adicin
de fitasa. Los campesinos
ya no aaden tanto fosfato
y disminuyen su eliminacin
y la destruccin del medio
ambiente (Cuadro 2.7).

38

En la conquista de Mxico los espaoles observaron


que antes de cocer o asar la carne la envolvfan con
hojas de papaya [Caricapapaya) (Fig. 2.19) o la unta
ban con la piel de la papaya. Este antiguo proced
miento posee las siguientes bases: las proteasas
papana y quimopapana, que se encuentran a
gran concentracin en el rbol de la papaya y en esta
fruta, degradan el tejido conectivo de la carne y con
ello la hacen tierna.
En Estados Unidos se utilizan anualmente cientos de
toneladas de papana para "ablandar" (en ingls, ten
derizin!IJ la carne. Otras proteasas de plantas para
esta finalidad son la ficina de los higos (Fig. 2.7) y la
bromelina de las pias. En muchos pases se ven
den ablandadores de carne en forma de polvo que

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de unidades de separacin, pues tienen


poros tan finos que no pueden pasar las
molculas disueltas, como las proteasas,
a pesar de poder pasar agua y las sales disuel
taS y otras pequeas molculas. Con ello la
proteasa se concentra diez veces.
Las lavadoras japonesas
no tienen en principio
un programa caliente:
iutilizan desde hace diez
aos biodetergentes!

Los preparados enzimticos secos pueden


separarse por precipitacin, pero preferen
temente se hace por evaporacin. Para ello
se coloca la disolucin que contiene las
enzimas en un lujo de aire caliente, de
modo que el agua se evapore rpidamente.
Se originan partculas de 0,5 a 2 mm de
tamai'lo. Para conseguir un preparado libre
de polvo se al'lade material inerte y materia
les creos para, por ejemplo, incorporar
polietilenglicol y arraigar la enzima seca
sobre ellos (perlas) o cubrirla (procedimien
to de Marumerizer).

contienen proteasas. Antes de prepararla, la carne se


frota o espolvorea y se deja algunas horas a tempera
tura ambiente. En este tiempo las proteasas vegeta
les degradan las protenas del tejido conectivo, como
el colgeno y la elastina. El ablandamiento acelera
procesos que ocurren de forma natural en la madu
racin de la carne. Todos saben que la carne debe
"depender" primero de la naturaleza para que sea
sabrosa. En la maduracin de Ja carne, las protea
sas (catepsinas) propias del animal muerto tienen un
papel decisivo.
Tambin en el curtido las proteasas microbianas
actan de modo altamente efectivo en el depilado y
curtido de pieles. La calidad y el rendimiento de la
piel aumentan.
La patente alemana ms antigua para la utilizacin
de enzimas la hizo Otto Rohm (Fig. 2.14) en 1911:
la aplicacin de extracto de pancreasa de animales
para dar elasticidad al cuero curtido (Figs. 2.20
y2.21).
Las enzimas reemplazaron a las heces de perro, que
se haban utilizado hasta entonces "con mala
fama" en el trabajo de curtido. A propsito, hoy
tambin se sabe por qu las heces de perro actan
como fragmentadoras de protenas (y por ello cur
ten la piel): sobre ellas crecen bacterias que produ
cen proteasas.

ENZIMAS -

Cuadro 2.7 Opinin de los


expertos: Fitasa - El jefe nmero
uno de la empresa del fsforo
El fsforo es interesante! El fsforo no es ya
una materia prima que se encuentra en exce
so, sino que cada vez es ms caro y requiere
un trato cuidadoso que lo conserve.
Durante dcadas, la agricultura induslrial
caus una carga masiva al medio ambiente
con la utilizacin excesiva de fsforo como
abono y de fosfato como forraje (fosfatos
inorgnicos). Tanto los animales como las
plantas precisan fsforo: sirve como compo
nente de los huesos y es muy importante en
el DNA y en la "moneda de energa" de la
clula, la adenosina trifosfato. Cantidades
de fosfato y nitrato demasiado altas en agri
cultura han conducido a una masiva eutrofia
(exceso de abono) en las aguas nuvlales.
Se origina finalmente una apestosa cloaca
mediante el exceso de abono con
fosfato/nitrato. Las "mareas de algas rojas"
(red tide) en los mares del sur, como en
Hong Kong, tiene los mismos motivos.
La coloracin marrnroja de las aguas, sin
embargo, no se observ hace dos aos en el
fiordo de Kiel. Las algas microscpicas perte
necen al grupo de los dlnonagelados (algas
ramificadas acorazadas). Precisan agua
caliente y alimentos, y producen toxinas.
El segundo problema del fsforo global se
origin repentinamente a travs del crec
miento dinmico de China e India. Los pre
cios de la materia prima empezaron a subir
descontroladamente y a fluctuar. Mientras
tanto, sin embargo, empez a crearse una
comratendencia, la ''empresa del fsforo".
El jefe nmero uno de la empresa es una
enzima: la fitasa.
Los animales no rumiantes, como los pollos,
los cerdos (Fig. 2.22) y tambin nosotros los
humanos, eliminamos una gran parte del fosfato recogido y de nuevo es desperdiciado.
La razn es la forma de reserva del fosfato
(mio-inositolhexaquisfosfato) en las semillas
de las plantas, que se llama tambin litato.
t;te no puede ser hdrolzado por los estmagos de los animales "monogslricos", porque las actividades enzimticas necesarias
no existen en absoluto o existen de forma
insuficiente. En los rumiantes, sin embargo,
los microorganismos en la Hora de los diferentes estmagos se encargan de la actividad
fitasa. Las fitasas microbianas fragmentan
hdrolfticamente los grupos fosfato del fitato
y lo hacen biodegradable. Muchos micro-

Sin fitasa

Sin fitasa

5,2 g P/ da

3,1 g P/da

Con fitasa

Con fitasa

5,l g P/da

2,3 g P/da

bios, cambin hongos, producen fitasa y la


eliminan extracelularmente.
Los biotecnlogos y los nutridores de animales tuvieron entonces la idea de producir
fitasas microbianas (de hongos o bacterias)
en biorreactores en grandes proporciones,
para aadirlas al forraje de cerdos y pollos.
Al mismo tiempo, se redujo la cantidad aadida de fosfato inorgnico. Los cerdos son
temibles productores de purinas y las gran
jas de cerdos son el terror del medio
ambiente. Asombrosamente ocurri:
mediante la hidrlisis del fitato catalizada
por fitasas se pudo reducir, con menos aporte de fosfato, la excrecin de fosfato por el
cerdo alrededor de un 25 a 30%! Dicho de
otra manera, con el uso de la fitasa se pudo
disminuir drsticamente la adicin de fosfa
to inorgnico al forraje de los animales, que
luego se liber de los mismos cereales. En
pases con una gran produccin de anima
les, como Holanda, Dinamarca y Alemania,
se "calcul" el uso de la fitasa con una dis
minucin clara de la carga de fosfato en ms
de mil toneladas por ao y con un ahorro
en el fosfato del forraje. Los legsladores de
Holanda y Dinamarca promueven el uso
de fitasa, as como algunos estados federales
de Estados Unidos. Otros pases, como por
ejemplo China, han restringido la minera
de fosfato por razones de regulacin de
recursos y han descendido la normalizacin
nacional para el fosfato en el forraje. Todo
ello ha hecho de la fitasa un producto enzimtico extraordinario y prspero en todo
el mundo. As, la compaa danesa Novozymes pudo lograr, como una de las productoras de fitasa mayores del mundo, una factu-

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racin en 2003 de alrededor de 100 millo


nes de dlares americ<.nos con enzimas para
el forraje la mayora con la fitasa de hongos
Penophora /yc, que bajo el nombre
comercial RONOZYME~ P se vendi a tra
vs de su grupo colaborador DSM Nutritional Products. El mayor xito es la forma gra
nulada del producto con estabilidad trmica
CT (coated thermostablej.
RONOlYME~ P (CT) es hasta ahora el ni
co producto de fitasa que puede soportar las
altas temperaturas de 80 a 85 C que se utilizan durante la fabricacin de forraje de
anmales. Al mismo tiempo, con la tremenda expansin de los productos de fitasa
microbianos se realiz tambin el avance
a la "biotecnologa verde" mediante la
incorporacin del gen de la fitasa mcrobia
no al maz, el arroz y las habas de soja.
Aparte de esto, las plantas se cultivan con
un contenido Inferior en fitato y ms fsforo
biodegradable mediante un perfecciona
miento con mutaciones seleccionadas. Aun
que la "biotecnologa verde" an lucha con
algunos problemas tecnolgcos, y sobre
todo con los problemas de aceptacin en
Europa, la fitasa probablemente saldr vencedora en la carrera.

El Dr. Frank Hatzack


es director de
Novozymes, en
Dinamarca.

39

BIOTECNOLOGA

Fig. 2.23 lchiro Chibata


(arriba) y Tetsuya Tosa (aba
jo) desarrollaron en la Tana
be Seiyaku Co. Ltd (Osaka),
en los aos 1970, el primer
proceso mundial con acilasa
inmovilizada.

Fig. 2.24 Atsuo Ta na ka


(Kyoto) inmoviliz microbios
en geles de igual medida.
El autor de este libro rue
introducido por l enlabio
tecnologa japonesa.

Fig.2.25 Minero con un


canario "inmovilizado". Los
ltimos canarios de las
minas britnicas se "jubila
ron" en 1996.

40

2 .10 Inmovilizaciones: cuando


se quiere reutilizar las enzimas

de carbono (Fig. 2.25). Si el pjaro caa muerto del


palo, eso era una seal de advertencia del biosensor (vase tambin Cap. 1O, Biosensores).

Una aplicacin satisfactoria de los procedimientos


enzimticos descritos hasta ahora requiere que las Debido a que las enzimas todava son relativamenenzimas sean tan baratas que se puedan desechar te caras, es obvio para los biotecnlogos utilizar los
los productos activos o inactivos tras su utilizacin. mismos procesos racionales que las clulas vivas
En todas las hidrolasas extracelulares (proteasas, para estabilizar enzimas y repetir la conversin con
amilasas, lipasas) puede cuestionarse, por Jo tanto, sus sustratos.
si son estables o trabajan sin adicin de coenzimas. Los ejemplos que siguen de formas inmovilizadas
Es complicado y costoso aislar las enzimas extrace de glucosa isomerasa y aminoacilasa muestran
lulares, con lo que para esta finalidad eran poco ren claramente qu requisitos esenciales deben logrartables. Por ello son necesarios los procedimientos se para poder empezar a inmovilizar enzimas.
que aumentan su estabilidad y permiten que sean
utilizadas de nuevo. En una serie de procesos, por 2 .11 Glucosa isomerasa
ejemplo en la industria farmacutica, debe evitarse
y jarabe de fructosa: azcar con
la presencia de enzimas en los productos finales, ya
mayor fuerza edulcorante
que ello permitira determinadas reacciones inmuni
El consumo de azcar en el mundo aumenta cada
tarias. Un mtodo para que las enzimas puedan sepa
vez ms. La remolacha azucarera y la caa de azrarse consiste en fijarlas en material portador: la
car requieren, sin embargo, las correspondientes
Inmovilizacin (Cuadro 2.8).
condiciones climticas y una buena calidad del
Si se asla una enzima intracelular de las clulas, suelo para su desarrollo, y debe aadirse la mate
se libera de todas las impurezas mediante pasos ria prima de inmediato a la cosecha, para evitar
complejos y se estudian sus propiedades y su com- prdidas. El almidn, el producto de almacena
portamiento en un vaso de precipitados, olvidn miento natural de las plantas, puede obtenerse de
dose a menudo de que la enzima se investiga en diferentes plantas (patatas, cereales, mandioca,
un "entorno anormal" y puede comportarse con batatas), incluso en reas agrcolamente desfavoforme a su anormalidad. "Normales" son las con- rables, y se almacena perfectamente bien. A partir
diciones del vaso de precipitados slo para pocas, del almidn se puede obtener azcar (glucosa) con
las principales enzimas extracelulares, que son ais- facilidad.
ladas al medio del entorno. Las principales enzimas de la clula se unen a los componentes celu En Alemania se utiliza cada vez ms almidn obte
lares o se integran en las membranas. Forman nido de plantas como materia prima para la
complejos con otras protenas o con materiales reproduccin en 125000 ha. En todo el mundo se
grasos (lfpidos). Por ello, se intent conseguir asla casi la mitad del almidn anual, casi 20 millomodelos para enzimas en la clula; se unieron arti nes de toneladas, con enzimas fragmentadoras de
flcialmente a materiales portadores y a membranas azcar.
o se incluyeron en geles. Tales enzimas unidas ms Como hemos visto en la fabricacin de la cerveza,
o menos fuertemente, que se fijan para inmovil el almidn industrial se degrada con amilasas. El
zarlas, se denominan enzimas inmovilizadas o producto final, la glucosa, presenta sin embargo una
deficiencia: tiene slo tres cuartas partes de la fuerportadores fijados.
Una imagen simblica para una enzima inmovili- za edulcorante de la sacarosa. Para alcanzar el miszada (Fig. 2.27) son los "ruiseores inmoviliza- mo efecto como edulcorante que la sacarosa, se
dos" en un mercado de pjaros en Hong Kong. necesita ms glucosa.
Estn encerrados en estrechas jaulas (gel polme- La fructosa (azcar de la fruta) tiene alrededor de
ro) (en ingls, gel entrapmen~y no pueden esca- un 80%de efecto edulcorante superior al de la sacapar (leakage), pero estn protegidos de los gatos rosa, y es el doble de dulce que la glucosa. Ya que la
(proteasas, microbios!). La comida, el agua y el fructosa es un ismero de la glucosa, es decir, tiene
oxgeno (sustratos) difunden bien hacia dentro y la misma frmula molecular (C6H1PJ y consta de
los productos del metabolismo alcanzan fcilmen los mismos tomos, la glucosa debera convertirse
te el exterior. Su actividad es visible y audible. Son en fructosa "slo" qumicamente y as podra
ms duraderos, o sea "reutilizables". Por cierto, en doblarse el efecto edulcorante. El Cuadro 2.9 refie
Europa se colocaban jaulas de canarios en las re la historia del jarabe de fructosa (HFCS, high
minas para evitar envenenamientos por monxido jructose corn syrup).

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ENZYME -

Cuadro 2.8 Enzimas Inmovilizadas

Adsorcin

Las enzimas inmovilizadas deben ser reutili


zables varias veces. Mediante la unin con
materiales portadores grandes, visibles a
simple vista, pueden separarse fcilmente
por medios mecnicos de la disolucin de
reaccin (por ejemplo por filtracin). Se ha
desarrollado un gran nmero de tcnicas
de inmovilizacin. Las enzimas pueden
unirse al portador directamente mediante
enlace qumico (covalente) o ffsicamente
por adsorpcin o fuerzas electrostticas.
Las molculas enzimticas se unen unas
con otras mediante reactivos especiales
(conexiones en red), pero tambin por
inclusin mecnica en geles o entre fibras.

Para que el proceso industrial sea ptima


mente til, las enzimas inmovilizadas deben
producirse de modo sencillo y relativamente
barato; una gran actividad enzimtica ocupa
la masa del portador y funciona con una alta
estabilidad de trabajo. Se empieza en dife
rentes reactores enzimticos cuyos tipos
bsicos son reactores en columna y reactores
con equipos de agitacin. Las ventajas tecnolgicas y econmicas de las enzimas inmovi
lizadas frente a las enzimas solubles son
obvias. Son reutilizables de nuevo, presentan
las mismas propiedades qumicas y ffslcas,
a menudo una estabilidad mejorada en un
rango amplio de pH (zona cida), as como
frente a elevadas temperaturas, y los produc
tos finales del proceso permanecen libres
de enzimas.

Enlace covalente

Conexin en red

fruchtzucker

flg. 2.26 La fructosa se utili


za como edulcorante para
diabticos.
Microencapsulaci6n

Inclusin entre libras

Actualmente, la produccin mundial asciende a


aproximadamente 100 000 toneladas de glucosa
isomerasa al ao. Se producen nueve a diez millones
de toneladas de jarabe de fructosa. En Estados Un
dos se prefiere utilizar jarabe de fructosa en las
bebidas. La glucosa somerasa hoy se obtiene e inmo
viliza sobre todo a partir de Streptomyces. Para ello
se presentan principalmente las celulas bacterianas
muertas, fragmentadas, para el uso de su glucosa iso
merasa, que an est completamente intacta. A
menudo se conectan unas con otras en una red
mediante glutaraldialdehfdo y asf se estabilizan.
Enormemente interesante es la fructosa para pro
ductores de alimentos: se capta ms rpido que otros
azcares y por tanto es ideal para bebidas deportivas.
Aumenta el sabor a fruta y tambin a chocolate, y
enmascara el gusto amargo de las sustancias sustitu
tas del azcar (Fig. 2.26). La fructosa reduce el pun
to de congelacin en los helados y asf los hace ms

blandos, ms cremosos y agradablemente "sabro


sos". De acuerdo con las pruebas clnicas, los diab
ticos pueden controlar su nivel de glucosa mucho
mejor con alimentos que contienen fructosa que con
los que contienen sacarosa o almidn.
La fructosa la usa el hgado en su mayor parte inde
pendientemente de la insulina. La fructosa es, pues,
un importante alimento diettico (Fig. 2.26). Deb
do a su elevada fuerza edulcorante aporta menos
caloras que el azcar (sacarosa).

El azcar de la fruta enriquecido se produce en Euro


pa a partir del almidn mediante degradacin con
amilasas y una conversin final con glucosa isome
rasa. Alternativamente, se puede partir de la sacarosa: por hidrlisis cida o fragmentacin con la enzi
ma invertasa origina azcar invertido, o sea fructo
sa ms glucosa. La glucosa menos dulce e indeseada
para los diabticos se separa por cromatografa.

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flg. 2.27 El smbolo de las


enzimas inmovilizadas: el
pjaro en la jaula en el mer
cado de pjaros en Hong
Kong. El sustrato (oxgeno,
pienso) se encuentra en la
jaula. Los productos (CO,
y excrementos) son elimina
dos. El pajarito no puede ale
jarse volando y est protegi
do del gato.

Flg. 2.28 Las clulas de


levadura encerradas en
polmeros (inmovilizadas)
mantienen su actividad
y ni siquiera germinan.

flg. 2.29 Bolas de alginato


en un reactor de columna
con levaduras inmovilizadas,
que son atravesadas por la
disolucin de azcar.

41

BIOTECNOLOGA

Cuadro 2.9 Jarabe de fructosa


El proceso puramente qumico de la isomeri
zacin de glucosa a fructosa con catalizado
res tcnicos a altos valores de pH fue un fra
caso. Se forman productos colaterales
coloreados oscuros y de mal sabor, cuya
separacin sera demasiado cara.
En 1957 se descubri la xilosa isomerasa,
que aparte de xilosa a xilulosa tambin
puede isomerizar glucosa a fructosa. Puesto
que la actividad colateral representa una
variante interesante econmicamente, la
enzima se denomina hoy principalmente glu
cosa isomerasa. La glucosa isomerasa es una
enzima intracelular y se origina a partir de
microorganismos diferentes, por ejemplo de
Streptomyces.

una glucosa isomerasa soluble. Este jarabe


contena inicialmente, sin embargo, slo un
15% de fructosa. Adems, pronto qued cla
ro que el proceso de la glucosa lsomerasa
slo puede ser rentable econmicamente
slo si se utiliza de nuevo la cara enzima.
Por suerte, la glucosa isomerasa es una enzi
ma ideal para la inmovilizacin. Es estable
a altas temperaturas, y puesto que tanto el
sustrato (glucosa) como el producto [fructo
sa) son molculas muy pequel'as, hay pocos
problemas de difusin si la enzima nmovili
zada se empaqueta en columnas. Las mol
culas de glucosa y fructosa no llevan carga
elctrica, por lo que la glucosa isomerasa
podra unirse a un derivado de celulosa car
gado como material portador; de lo contra
rio, el sustrato y el producto "permaneceran
pegados" electrostticamente al portador.
En 1968 la Clinton Corn Processing Company llev a cabo un proceso discontinuo
con una enzima inmovilizada, que liber un
42% de fructosa. En 1972 consigui desarrollar un sistema que trabajaba continuamente
con glucosa isomerasa inmovilizada.

Transporte del jarabe de fructosa en Estados


Unidos.

En 1960 se patent en Estados Unidos el


correspondiente proceso enzimtico. En
1966, unos investigadores japoneses en
la ciudad de Chiba describieron un proceso
industrial que utiliza la glucosa isomerasa
soluble. En el proceso de isomerizacin de
la glucosa se obtiene como producto una
mezcla de glucosa y fructosa. Esta mezcla
puede usarse en lugar de la sacarosa cristalina
como jarabe, puesto que su capacidad edul
corante es muy grande.
En Estados Unidos, la Clinton Corn Processing Company empez en 1967 la produccin de jarabe de glucosafructosa mediante

Esta prspera solucin tecnolgica por s sola


no bastaba, sin embargo, para el reconoci
miento del procedimiento; era decisiva la
situacin del mercado.
En los aos 1960 el precio del azcar era de
15 a 20 centavos por kilogramo. El jarabe de
fructosa no poda producirse ms barato en
ningn caso. En ese momento prevalecan
tambin las desventajas del proceso enzimti
co. Adems de la fuerza de los prejuicios;era
importante un acercamiento a la industria:
se tuvo que desarrollar un sistema complicado de filtros de presin y un aparato para la
separacin del metal pesado cobalto, que se
utiliz como estabilizador de la enzima.
Pero en noviembre de 1974 aument el precio del azcar a 1 dlar y 25 centavos el kilo-

Los gastos totales de la aplicacin de la glucosa


isomerasa inmovilizada son un 40% menores que
con la enzima soluble (Fig. 2.32).

Flg. 2.30 En Japn se aaden


aminocidos a las bebidas
saludables.

42

2 .12 Alimentos y forrajes


con enzimas inmovilizadas

El ejemplo de la glucosa isomerasa ha mostrado que


mediante enzimas inmovilizadas se pueden produ
cir grandes cantidades de productos a bajo coste.
Otra posibilidad para las enzimas inmovilizadas, la
produccin eficaz de productos de alta calidad en
pequeas cantidades, la presenta la penicilina aci

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gramo. El proceso de la isomerasa se hizo


muy atractivo de la noche a la mal'ana. Al
mismo tiempo, la compaia danesa Novo
lndustry A/S inmoviliz un preparado de
glucosa isomerasa que era ms barato, sin
adicin de cobalto y soportando la presin
en grandes reactores industriales, por lo que
no era nada raro encontrarlos en columnas
de siete metros de altura.

En 1976, solamente en Estados Unidos se


produjeron 750 t de glucosa isomerasa y con
ellas 800 000 t de jarabe de fructosa al 42%.
Puesto que el precio del azcar a finales de
1976 cay de nuevo a 15 centavos por kilogramo, se estableci y se impuls el nuevo
proceso ya exitoso. El jarabe de fructosa al
42% se produjo a precios menores que la sacarosa. En 1978 se dio otro paso adelante.
Mediante los nuevos procedimientos de sepa
racin se obtuvo un jarabe de fructosa al 55%.
Era solamente un 15 a 25% ms caro que el
jarabe al 42%. Para bebidas cidas, como la
Coca-Cola (valor de pH de 4,0), fue necesario
un jarabe con al menos un 55% de fructosa
para remplazar a la sacarosa. Con ello tuvo
xito en un mercado importante el aumento
masivo del jarabe de fructosa.
Precio del azcar desde 1901 hasta 2001
(en centavos/libra)

So-................................
40-.............................................

;::;::::;::::::::~:;::;:::;:::;.~~~~;:..,_~
1901

1951

2001

lasa, que cataliza los cambios adecuados en la mol


cula de penicilina (Cap. 4).
Los aminocidos como la lisina y la metionina
no pueden sintetizarse en los no rumiantes, por
ejemplo humanos, pollos y cerdos, o slo puede
hacerse con insuficiente velocidad, y deben propor
cionarse con la alimentacin; por ello se denominan
esenciales (indispensables}. La necesidad de ami
nocidos esenciales como adicin al forraje y para
fines mdicos (soluciones de inyeccin) aumenta
rpidamente. Hoy se empiezan a utilizar los mto
dos fermentativos y qumicos para la fabricacin

ENZIMAS -

Almidn
crudo

Licuacin
mediante
aamilasa

Fig. 2.31 Cmo se obtiene


jarabe de fructosa a partir
de almidn.

Glucosa

Azucarado mediante
glucoamilasa

Filtracin

Purificacin con
carbn activo

lntercambiador
de iones

Mezcla
glucosa
fructosa

Jarabe de
fructosa
purificado

Nota prctica:
fructosa contra la "resaca"
lntercambador
de iones

Fructosa (C6 H.,OJ

80% ms dulce

lsomerizacin
mediante
glucosa somerasa

Glucosa (C6H,1 0J
80% menos dulce

industrial de Laminocidos (vase Cap. 4), en lugar


del aislamiento convencional de hidrolizados de
protena. Los aminocidos sintetizados qunica
mente son, sin embargo, mezclas pticas inactivas
(racematos) de ismeros o y L. Slo la forma Lpti
ca (excepcin: metionina) es fisiolgicamente acti
va, y slo sta es til en medicina, para deportistas
(Fig. 2.30) y para forraje.
lchiro Chibata (Fig. 2.23) y su grupo desarrollaron
en Japn un proceso en el cual el racemato de ace
tilD,Laminocidos producido qumicamente se
separa enzimticamente en Jos Laminocidos y los
acetilDaminocidos no hidrolizados (Fg. 2.34).
Los Laminocidos deseados se separaron fcilmen
te, debido a su solubilidad reducida, de los o-amino
cidos acetilados. Los o-aminocidos no deseados
se utilizaron de nuevo para la sntesis qunica del
racemato. AJ principio, este proceso se realiz con
aminoacilasa soluble de rin o de Aspergillus
oryzae, pero no poda recuperarse la enzima.

de DEAEcelulosa) (Fig. 2.33). Es muy estable, en


65 das su actividad disminuye slo a la mitad. La
empresa Tanabe Seiyaku, de Osaka, haba utilizado
con ello por primera vez una enzima inmovilizada
industrialmente.
Desde 1969 se produjeron industrialmente con este
procedimiento Jos aminocidos Lfenilalanina, L
valina y Lalanina [Fig. 2.33 y Cap. 4).
Los gastos totales del proceso inmovilizando la ami
noacilasa se encuentran aproximadamente un 40%
por debajo que con la enzima soluble (Fig. 2.34).
Puesto que el proceso est ampliamente automati
zado se ahorran los gastos de personal, los gastos del

Algunos expertos recomien


dan una cucharada de fruc
tosa Iras una noche alegre.
Sin embargo, hay que tener
cuidado con la imposibilidad
de tomar fructosa (intoleran
cia a la fructosa) en algunas
personas, que puede condu
cir a la muerte. Es inofensivo
tomar fructosa con la miel
o la mermelada, que ambas
la contienen y tambin ta fru
ta fresca. En el hgado, la
fructoquinasa forma fructo
sa diez veces ms rpido
que la hexoquinasa la gluco
sa en el cuerpo. Este proceso
forma el cofactor NAO, que
se requiere urgentemente
en la degradacin de alcohol
(mediante ta alcohol deshi
drogenasa y ta acetaldehido
deshidrogenasa). El alcohol
y la "sustancia de la resaca"
acetaldehdo se degradan
ms rpido.

Costes relativos en %
100

Glucosa isomerasa
soluble

So

Glucosa isomerasa
inmovilizada

6o

Para determinados fines (por ejemplo para solucio


nes de inyeccin que contienen aminocidos) las
"impurezas enzimticas" se tuvieron que separar
de nuevo, con dificultad, para evitar las reacciones
inmunitarias de defensa en los pacientes. Esto con
dujo a prdidas del rendimiento y gastos adiciona
les. La inmovilizacin se ofreci como una salida. Se
une entonces la enzima de modo sencillo y barato
mediante adsorcin (fijacin) a un portador (bolas

40
20

o
Personal
Mantenimiento
Purificacin
de productos

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Portador
Enzima
Sustrato

Fig. 2.32 Comparacin de


los costes de produccin
para el jarabe de fructosa
mediante glucosa isomerasa
soluble e inmovilizada
(segn Kyowa Hakko Kogyo
Co.,Japn).

43

BIOTECNOLOGA
Fig. 2.33 El primer proceso
industrial (1969, Tanabe Sei
yaku, Japn) con enzimas
inmovilizadas: conversin
qumica de acetilD,Lamino
cido, mediante aminoacila
sa, en el fisiolgicamente
activo Laminocido (difcil
mente soluble, cristalizado)
y el inactivo acetil-o-aminocido, que puede transferir
se de nuevo trmica o qumi
camente a la forma de part
da (mezcla de forma o y t).
En el correspondiente proceso se utiliza el material crudo
completo.

Portador
DEAESephadex

Sntesis
qumica

!
Q

Racemizacin
(trmica o

~---- qumica)

~etil-o,

Laminocido

-?i--o:~

r;:? "y~

L
NAcetilo-aminocido
j "' (no activo fisiolgicamente)

Producto colateral:
Acetato

Producto: L-Aminocido
(activo fisiolgicamente)

Salida

Costes relativos en %

100

80

Aminoacilasa
soluble

60

Aminoacilasa
inmovili
zada

c===Si
20

o
Energa
tnmovili
zacin

Personal
Enzima
Sustrato

Fig. 2.34 Comparacin de


los costes de produccin
con el uso de aminoacilasa
soluble e inmovilizada
(segn Tanabe Seiyaku,
Japn).

~ L-Aminocido como producto

catalizador son menores y el rendimiento de la pro


duccin es superior. Con ello se muestra claramente la superioridad del uso de ta forma inmovilizada.
Esta superioridad no se pudo lograr con el uso de
otras enzimas. As, desde hace ya ms de 20 aos se
utiliza la glucoamilasa soluble industrialmente.
Hubo muchos intentos satisfactorios para inmovili
zar glucoamilasa. Finalmente, sin embargo - a pesar
de las ventajas que tiene tcnicamente una enzima
inmovilizada- la forma inmovilizada no compiti
con la soluble, porque es fcil obtener glucoamilasa
soluble y, por lo tanto, es barata, puede utilizarse sin
problemas tcnicos y el proceso se puede optimizar
al mximo. Con lactasa soluble o inmovilizada
(Fig. 2.35) se produce leche exenta de lactosa, fcil
mente digerible.
Otra enzima soluble se utiliza actualmente cada vez
ms para la elaboracin de forraje: la fitasa (Cuadro
2.7). La fitasa fragmenta los grupos fosfato del fita
to en los granos de forraje, y as ayuda a disminuir
la costosa adicin de fosfato y la eliminacin de fos
fato de cerdos y pollos (Fig. 2.22), lo cual resulta
mucho mejor para el medio ambiente.

Fig. 2.35 El gatito Fortuna


disfruta de la leche libre de
lactosa, que se produce
mediante el tratamiento
enzimtico con lactasa (J3
galactosidasa) inmovilizada.
La lactasa rompe la lactosa
en glucosa y galactosa.

44

2.13 Los reactores de enzimas

de membrana usan
regeneracin de cofactor
Se alcanz una nueva fase en la aplicacin de enzimas
con el desarrollo de los reactores de enzimas de mem
brana, en los cuales se utilizan las enzimas depen-

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dientes de cofactores, que constantemente regeneran


los muy caros cofactores enzimticos utilizados.
En los reactores de membrana, los cofactores
dependientes (NADH) arninocido-deshidrogenasas
y forrniatodeshidrogenasa (FDH, para Ja regenera
cin de cofactores utilizados) se colocan juntos entre
membranas de ultrafiltracin. Esto se consigue
mediante la corriente de disolucin de sustrato. Las
enzimas no pueden penetrar a travs de las membra
nas. Para que el cofactor de bajo peso molecular no
abandone la cmara de reaccin junto con los pro
duetos, se une a un polmero portador (polietilen
glicol, PEG) y se mantiene as a pesar de su tamao
cien veces menor. La aminocidodeshidrogenasa
transforma, con la participacin del cofactor, el oxo
cido en L-aminocido (Fig. 2.37), que se difunde
hacia fuera a travs de las membranas. El cofactor
NADH, en ese momento costoso, se oxida a NAD+
y se hace "intil" para la enzima. La segunda enzi
ma "atrapada" en la cmara del reactor, la forrniato
deshidrogenasa, puede transformar el barato cido
frmico (formiato) en co2 no contaminante, y redu
ce entonces NAD+ a NADH. Por consiguiente, el
caro cofactor se regenera y se utiliza de nuevo. El
concepto de regeneracin del cofactor en el reactor de enzimas de membrana de Christian Wan
drey (Fig. 2.38), Marfa-Regina Kula y Andreas F.
Bckrnann, de Jlich y Braunschweig, supuso un
considerable avance: durante ms de 90 aos cada
molcula regenera en el biorreactor de 700 000 a
900 000 veces el NAD+ utilizado!

ENZIMAS -

Fig. 2.36. Las levadura.s Inmovilizadas


producen etanol.
La Inmovilizacin (fijacin a un portador) de las clulas ofrece varias venta
jas productivas: las clulas se pueden
osar de nuevo y tienen una larga vida.
El producto final deseado permanece
exento de sustancias biolgicas y clu
las, y por lo tanto se eliminan algunas
etapas de purificacin.
Con una de las tcnicas ms utilizadas,
la inclusin de clulas en geles, se
mezcla una suspensin celular con tas
sustancias unidas al gel.
El alginato, un producto de algas mari
nas que se usa en la industria alimen
taria para la elaboracin de jaleas,
construye con los Iones calco una
espesa red y forma una estructura de
gel estable.
Se producen las bolas o perlas de gel
de alginato, en tas cuales una mezcla
de clulas-atginato se hace gotear en
una disolucin de cloruro de calcio.
Tras ta penetracin de los iones calcio

cuajan tas perlas de alginato y cierran,


por ejemplo, las clulas de levadura
fuertemente.

meses continuamente alcohol a partir


de glucosa con la ayuda de clulas
inmovilizadas.

Las pequenas molculas, como la glu


cosa, pueden alcanzar los poros en las
clulas; los productos (alcohol y dixi
do de carbono) abandonan las bolas.
Las clulas de levadura vivas permane
cen intactas.

De modo similar a las clulas de leva


dura, tambin se inmovilizan clulas
de plantas y de animales.

Para empaquetar densamente las per


las de alglnato con clulas se promue
ve, en primer lugar, el aumento de
clulas mediante la adicin de alimen
tos y oxigeno. SI el espacio disponible
en el gel se llena con tas clulas, las
perlas se apilan en un biorreactor de
columna. El biorreactor se ocupa del
paso a travs de una disolucin de glucosa, que utiliza las clulas inmovilizadas como sustrato. Puesto que el ox
geno no se encuentra abundantemente
para su uso, las clulas de levadura
fermentan glucosa a alcohol.
El alcohol producido yel co, gaseoso
formado abandonan las bolas. Las ins
talaciones piloto producen durante

En lugar de bolas pueden prepararse


clulas inmovilizadas con pelculas,
por ejemplo con membranas para bio
sensores.
La levadura Arxuta se inmoviliza y se
aplica para medir la demanda bioqu
mica de oxigeno (DBO) con biosensores en aguas residuales (vase
Cap. tO): se mide la respiracin (consumo de oxigeno) de las clulas de levadura Inmovilizadas en una membrana
de pollmero con un sensor de oxgeno.
SI no se encuentra ninguna sustancia
biodegradable en el agua ("agua lim
pia"), las levaduras no toman alimento
y, por lo tanto, tampoco respiran oxgeno. El biosensor libera una seal en
slo cinco minutos. iEI mtodo convencional necesita cinco das!

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Clulas Inmovilizadas
de la levadura Arxu/a

45

BIOTECNOLOGA
fig. 2.37 Pri ncipio del reactor de enzimas de membrana
para la produccin de L-aminocidos (por ejmplo Lalanina). El cofactor NAO- est
unido al polietilenglicol

Producto ~ -

Sustrato

~
cido frmico

LAminoc: ; _

(PEG) de alto peso molecular


yse sostiene dentro, junto al
reactor. con las enzimas. Se
reduce constantemente por
la formiatodeshidrogenasa
y con ello se regenera para
su utilizacin mediante la l
aminocido-deshidrogenasa
(segn Wandrey 1986, modi
ficado).

Amln~cldo

formlato
deshldrogenasa

deshldrogenasa

PEG
Membrana de fibras

con huecos

Cofactor reducido unido al portador

O= ;::::()

aOxocido

Dixido de carbono
Sustrato

Producto

Fig. 2.38 Christian Wandrey


consigui, con ReginaMara Kula y Andreas Frits
Bckmann, el primer reactor
de enzimas de membrana
con regeneracin de cofactor
en Jlich y Braunschweig.

fig. 2.39 Una destilera de


alcohol en 1900. Las amila
sas se utilizan para descomponer el almidn.

fig. 2.40 Instalacin


moderna en Japn con
levaduras inmovilizadas.

46

2.14 Clulas inmovilizadas

Aparte de las enzimas se pueden inmovilizar tam


bin las clulas enteras. Japn est especialmente
muy avanzado en el campo de las clulas nmovilizadas. lchiro Chibata y Tetsuya Tosa, de la compaa Tanabe Seiyaku, en Osaka, pioneros ya de la
inmovilizacin de enzimas, desarrollaron en
1973 un proceso en el cual sintetizaron anual
mente 600 t del aminocido aspartato a partir de
cido fumrico en las clulas destruidas de
Escherichia coli atrapadas en gel (vase tambin
Cap. 4). Despus de 120 das, la actividad aspar
tasa de las bacterias clicas baj a la mitad. Las
clulas libres tenan, sin embargo, slo diez das
de vida media. En el proceso con clulas inmovi
!izadas se origina un 60% de los gastos de produc
cin en comparacin con la utilizacin de clulas
libres: los gastos del catalizador bajan un 3% del
aproximadamente 30% en las clulas libres, los
gastos en personal de servicio y la energa un 15%.
Un reactor en columna de 1000 L de capacidad
libera cerca de dos toneladas (!) de L-aspartato por
da. Los microorganismos se ofrecen enseguida y
de modo natural en los procesos de varias etapas, como la produccin de alcohol con levaduras inmovilizadas. El etanol se produce anaerbi
camente (en ausencia de aire) a partir de glucosa

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u--0

mediante una reaccin de varias etapas, utilizando el sistema regenerador del cofactor (en las
clulas de levadura).
Una instalacin piloto para etanol de la compa
fa Kyowa Hakko Kogyo Co. {Fig. 2.40) trabaj en
1982 con cinco columnas reactoras (cada una de
cuatro metros cbicos de capacidad) durante ms
de seis meses y produjo continuadamente alcohol
al 8,5% a partir de melaza de cafia de azcar. El
reactor utiliz clulas vivas de levadura, que se
encerraron en bolas de alginato en forma de gel
(Fig. 2.36). El alginato se obtiene de las algas marinas (Cap. 7) y se utiliza como espesante en la
industria alimentaria. La instalacin piloto generaba cada dfa aproximadamente 2400 litros de alcohol puro.
Las ventajas de la inmovilizacin de clulas son
claras si se compara Ja productividad con la de los
procedimientos convencionales: es aproximadamente 20 veces ms alta y los gastos bajan drsticamente. Puesto que el proceso transcurre de for
ma continua, se puede controlar automticamente por ordenador y con ello se evitan recursos
humanos. La instalacin de etanol es el ejemplo
modelo para instalaciones de biosfntesis ms complicadas.

ENZIMAS -

Bibliografa utilizada y aplicada


El clsico de Biotecnologa en alemn:
Dellweg H (1987) Biotechnologie. VCH, Weinheim

Ocho preguntas
de autoevaluaci6n

El clsico "Lehninger" de Bioqumica:


Lehninger AL, Nelson O L, Cox MM (2001) Biochemie. 3. Aufl. Springer, Berlin

1. Por qu es impensable el meta-

Dingermann T (1999) Gentechnik. Biotechnik.


Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart

2. Los biocatalizadores son siempre protenas?

bolismo en la clula sin enzimas?

Renneberg R (1984) Elixiere des Lebens. Aulis-Verlag Deubner und Co., Koln
El artculo original sobre la estructura de la lisozima:
Phillips D C (1967) The hen egg-white lysozyme molecule. Proc Nat Acad Sci,
57 (3): 484. 495
La biblia de bolsillo de la Biotecnologa:
Schmid R O(2002) Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik.
Wiley-VCH, Weinheim
Lo ms nuevo sobre biocatlisis:
Bommarius AS, Riebel, B R (2004) Biocatalysis. Wiley-VCH, Weinheim
Buchholz K, Kasche V, Bornscheuer U T (2005)
Biocatalysts and Enzyme Technology. Wiley-VCH, Weinheim
El clsico sobre biocatalizadores inmovilizados:
Tanaka A, Tosa T, Kobayashi T (1993) Industrial Applications of lmmobilized
Biocatalysts. Marcel Dekker, New York
La vida de Otto Warburg y su labor cientfica:
Werner P, Renneberg R (Mitarb.) (1991) Ein Genie irrt seltener ...
Akademie-Verlag, Berln
Primrose S B (1990) Biotechnologie. Grundlagen, Anwendungen,
Perspektiven. Spektrum der Wissenschaft, Heidelberg

3. Mediante qu "trucos" pueden


disminuir drsticamente las enzimas la energa de activacin de
las reacciones?
4. (mo se modific la teora de la
llave-cerradura de Emll Fischer
con el modelo de la lisozima de
David Phillips? Qu dice la idea
de Koshland del "ajuste inducido"?

s.

lCules son las ventajas de


las enzimas inmovilizadas?
para qu se usan las enzimas
inmovilizadas? Por qu no se
utilizan enzimas inmovilizadas
en todas partes?

6. cules son los campos de


aplicacin ms importantes de
las enzimas en la industria?

Enlaces de Web
Pgina Web para ingeniera de enzimas de la Universidad South Bank de
Londres, basada en un libro de texto:
.,Enzyme Technology" von Martin Chaplin und Christopher Bucke
(Cambridge University Press, 1990):
www.lsbu.ac.ukA;Jiology/enztech/

BREN DA, la base de datos de enzimas de la Universidad de Colonia.


Todas las enzimas con propiedades y citas bibliogrficas:
www.brenda.uni-koeln.de/

7. Por qu las lavadoras en Japn


no tienen un programa caliente?

8. Por qu y cmo se regeneran


los cofactores en los reactores
de enzimas de membrana para
la sntesis de aminocidos de
alta calidad?

Base de datos de protenas (PDB) con todas las estructuras conocidas de


enzimas. El colaborador de este libro David Goodsell escribe una seccin
muy leda con el ttulo "Molcula del mes":
www.rcsb.orgfJdb/

Cmo se une la lisozima al sustrato, una animacin por ordenador


de Protein Mechanics lnc.:
www.locuspharma.com~tructureMoviesfysozyme.php

Molculas en movimiento, visin en 30 de protenas y DNA:


www.umass.edufnolvisfreichsmanfindex.html

El Prof. Blume ofrece fantsticos experimentos


(tambin con enzimas) a sus alumnos:
http://dc2.uni-bielefeld.de/cgi-binfJerlfect~earch~earch.pl

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47

EL MILAGRO DE LA
;
INGENIERIA GENETICA
;

3.1 DNA: La doble hlice porta


el material hereditario 50

3.5 El genoma humano- Una enorme


enciclopedia de 24 volmenes 52

3.2 Las DNA polimerasas catalizan


la replicacin de la doble hebra
de DNA 50

3.6 El cdigo de DNA se agrieta:


el RNA sinttico descifra
los codones 53

3.3 No todos los genes constan


de DNA: los virus RNA
utilizan RNA de una nica
hebra 51

3.7 Los genes estructurales cercanos


a los fragmentos de DNA controlan
la expresin de los genes 58

3.4 La aclaracin del cdigo


gentico 51

3.8 Ribosomas - La fbrica de prote


nas de la clula: una molcula
gigante de RNA y protenas 58

3.9 Recombinacin: las cartas


genticas se barajan de nuevo 6o
3.10 Los plsmidos son vectores ideales para el material gentico 61
3.11 Tijeras y pegamento moleculares: endonucleasas de restriccin
y DNA ligasas 62
3.12 Los primeros experimentos de
lngenieria gentica: lbacterias que
croan? 62
3.13 Cmo se obtienen los genes 65
3.14 llnsulina humana a partir
de bacterias? 66
3.15 Cmo se sintetiza la insulina en
humanos: desde la preproinsulina,
pasando por la proinsulina, hasta
la insulina activa 68
3.16 Los inicios de la ingeniera
gentica con proinsulina
de rata 69
3.17 Hibridacin de DNA: cmo se
encuentran bacterias con sondas
de DNA 71
3.18 Un pequeo desvo: la somatostatina - La primera protena
humana de bacterias 71
3.19 Cmo se obtiene enzimticamen
te insulina humana a partir
de insulina de cerdo 73
3.20 !Finalmente se consigui! La pri
mera insulina humana producida
por ingenieria gentica 73
3.21 Asilomar: cul es el peligro de
la nueva ingeniera gentica? 74
3.22 Proinsulina humana a partir
de una nica cepa de E. coli 76
3.23 Levaduras de coccin como
productoras de proinsulina 77
3.24 Variantes artificiales
de la insulina (muteina) mediante
Ingeniera gentica 78
3.25 Los genes manipulados de clulas
de mamfero producen protenas
complejas modificadas 78

Captulo
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BIOTECNOLOGA

3.1 DNA: La doble hlice porta


el material hereditario

Fig. 3.1 James D. Watson


(nacido en 1928).

Fig. 3.2 francis C. Crick


(1916-2004).

El centro y el eje de rotacin de la biorrevolucin es


Ja hlice de la vida -la portadora del material heredi
tario, el cido desoxirribonucleico (ADN), abreviado
internacionalmente DNA por las siglas de su nom- 3.2 Las DNA polimerasas
bre en ingls [deoxyribonucleic acid). La larga bscatalizan la replicacin
queda del portador de la herencia (Cuadro 3.1) culde la doble hebra de DNA
min en 1953 con un artculo de la revista cientfl
ca "Nature", escrito por dos jvenes investigadores, La base de las caractersticas de toda herencia es la
James Dewey Watson (nacido en 1928) y Francis proliferacin de clulas. Dos descendientes del misCompton Crick (19 162004) (Figs. 3.1 y 3.2). En mo tipo se originan a partir de una clula, y ambas
l se poda ver un sencillo y genial grfico de la doble llevan el mismo programa hereditario. Por lo tanto,
hlice del DNA (Fig. 3.3).
antes de la divisin celular (mitosis) el DNA debe
El DNA es comparable a una simple cremallera en preparar, por el proceso de replicacin, una copia
tirabuzn -sin embargo, es una cremallera que exacta de s mismo. Con este propsito, el DNA se
posee cuatro tipos diferentes de dientes, las cuatro abre como una cremallera, es decir, las dos hebras
bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timi sencillas se separan una de la otra. De cada una de
na (T). Estas bases son partes integrantes de los las dos hebras libres que pertenecan al DNA, la
nucletidos, los componentes bsicos del DNA. Los DNA polimerasa (Fig. 3.4) sintetiza una nueva
nucletidos, asimismo, constan de un azcar, una hebra de DNA. Se forma, con la hebra existente, de
base y un resto fosfato (Fig. 3.8). La geometra de la nuevo una doble hlice, de modo que al final se
doble hlice no es slo para ahorrar espacio, sino encuentran disponibles dos nuevas dobles hlices.
que adems permite el acceso a la informacin des
de todas partes.

Fig. 3.3 Doble hlice del


ONA. Sydney Brenner en
su primera impresin:
"The moment I saw the DNA
model ... 1realized it is the
key of understanding to ali
problems of biology".

Fig. 3.4 DNA polimerasa:


la hebra matriz se destaca
en prpura, y la nueva hebra
formada en verde.

50

juntas, dos puentes H a A y T (Fig. 3.8). La deno


minada regla del apareamiento de bases (o
regla de Watson-Crick) es el apareamiento
esencial para la transferencia exacta de la informacin gentica.

La desoxirribosa es el azcar de los nucletidos.


Adiferencia de la ribosa -el azcar del cido ribonucleico, el RNA- a la desoxirribosa le falta el tomo de oxgeno en el carbono 2'. El esqueleto consta de unidades alternantes de desoxirribosa y fosfato. Los azcares estn enlazados, pues, unos con
otros mediante puentes fosfodister. Como los
dientes de una cremallera en su soporte, las cuatro
bases estn sujetas al esqueleto, que tiene simplemente funciones portadoras. Para la informacin
gentica slo es importante la secuencia de las
cuatro bases.

La DNA polimerasa pertenece a la clase de enzimas de las transferasas (Cap. 2), as que transfiere grupos qumicos. La aisl Arthur Kornberg
(nacido en 1918, premio Nobel en 1959) de
Escherichia coli. En la replicacin de un prepara
do celular se une un nucletido A a un nucleti
do T, y delante de un nucletido C libre se coloca
un nucletido G, etc.
Mientras que el nucletido, que se encuentra desapareado en la "parte delantera", se ordena correctamente mediante puentes de hidrgeno entre las bases apareadas, la polimerasa enlaza la "parte trasera" del "elemento del esqueleto" de la desoxirribosa y fosfato
para generar la estructura con el enlace fuerte.

Las dos tiras de dientes se mantienen juntas mecLa DNA polimerasa (Fig. 3.4) cataliza, por lo tanto,
nicamente cuando la cremallera est cerrada. En el con la rotura del pirofosfato, la unin de un enlace
caso de las dos hebras del DNA se trata, en cambio, fosfodister entre el final OH-3' de una secuencia
de interacciones moleculares, puentes de hidr existente y el final trifosfato-5' de un nuevo nuclegeno (puentes H), que actan entre bases opuestido entrante.
tas de las dos hebras individuales (Fig. 3.8).
Para ello la enzima necesita una presentacin de
Erwin Chargaff [1905-2002, Fig. 3.5) determicopia, una matriz (template). sta puede ser una
n en 1950, con la ayuda de mtodos cromatogrhebra nica o tambin una doble hebra parcialmenficos, que la relacin de adenina a timina y de guate separada.
nina a citosina en todos los seres vivos es siempre
alrededor de 1 (regla de Chargaff) (Fig. 3.6). A Aparte de la matriz, la polimerasa requiere todos los
partir del modelo de DNA de Watson y Crick se componentes en forma activada, es decir, los desentiende por qu esto es as: las bases A y T, as oxinuclesidosS'-trifosfatos {dNTP), y una
como las bases C y las G, encajan en el espacio de doble hlice de punto de partida, un iniciador (pri
forma exacta; tres puentes H mantienen G y C mery, con un grupo hidroxilo 3' libre.

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fa

La DNA polimerasa 1, que se muestra en la Fig. 3.4,


tiene una doble actividad: se une a un fragmento
corto de una nica hebra (nick), perteneciente a la
molcula de DNA de doble hebra, y sintetiza entonces una hebra completamente nueva (actividad
polimerasa), mientras contina degradando la
hebra existente (actividad nucleasa). Degradacin y
construccin transcurren simultneamente, y el
nick recorre longitudinalmente todo el DNA. Esto
sirve para corregir fallos, y asr, los nucletidos que
se han instalado errneamente se reemplazan. Esta
propiedad confiere la increble precisin de la repli
cacin del DNA, con un ndice de fallo de uno por
100 000 000 de pares de bases copiados. Esto sera
como si se escribiese a mquina unas mil novelas y
slo se cometiera un error!

MILAGRO DE LA INGEN IERA GENTICA -

Contienen dos copias de RNA de una nca hebra.


Al entrar en la clula atacada, este RNA se reescri
be a DNA mediante una enzima viral que entra conjuntamente, la transcriptasa inversa (vase 3.13
y Fig. 3.35), y la doble hebra de DNA formada de
este modo entra en el genoma cromosmico del
husped. La clula del husped produce ms tarde,
con la informacin del genoma viral integrado, nue
vos RNA virales y nuevas protenas de cubierta del
virus, que se unen para formar partculas infeccio
sas de virus (vase Cap. 5).

3.4 La aclaracin
del cdigo gentico

Otra clase importante de virus RNA son los retro


virus. En ellos el ro de informacin gentica no flu
ye como es habitual, desde el DNA al RNA, sino en
direccin contraria (retro) . A los retrovirus pertenecen el VlH causante del sida y algunos virus precursores de cncer (Cap. 5).

(1905-2002).

35 ....................................
30 ....................................

Slo despus de saberse que la informacin genti


ca se encuentra en las cuatro bases se plante la pre
gunta sobre cmo se codifican las instrucciones de
la construccin gentica en esta secuencia de bases.

La molcula de la polimerasa se parece a una mano


derecha: el lugar entre tos otros dedos y el pulgar lo
ocupa el DNA. La actividad poiimerasa se sita
entre el dedo ndice y el dedo corazn. La actividad En los aos 1940, los dos investigadores de genti
nucleasa en el centro de la molcula lee la correc- ca americanos George W. Beadle ( 1903 l 989) y
cin de los nucletidos insertados. A partir de la Edward L. Tatum (1909-1975), juntamente con
doble hlice se originan asf dos copias exactas, cada Joshua Lederberg (nacido en 1925), los fundado
una de las cuales representa una molcula de DNA res de la gentica de fagos, aclararon el asunto. Ellos
completa. En la divisin de la clula madre se sepa postularon: "Un gen conduce a la produccin
de una enzima".
ran ambas en las dos clulas hijas.
En la tcnica decisiva para la ingeniera gentica, la Las enzimas son molculas proteicas. Por ejemplo,
reaccin en cadena de la polimerasa (po/yme se podra sospechar que el gen para la coloracin
rase cha.in reaction, PCR, vase Cap. 1O), se uti azul de los ptalos de las flores induce la produccin
!izan las DNApolimerasas estables al calor de la de una enzima que controla la formacin del colo
bacteria Thermus aquaticus, que entre otros luga rante azul de las flores. Beadle, Tatum y Lederberg
res viven en las fuentes de agua hirvientes del Par- obtuvieron en 1959 el premio Nobel de Fisiologa o
que Nacional de Yellowstone. Se denominan tam Medicina.
bin Taq-polimerasas.
La pregunta clave era, sin embargo, de qu forma
las instrucciones de construccin del DNA llevan a
3.3 No todos los genes constan
la formacin de protenas. Las protenas son mol
de DNA: los virus RNA utilizan
culas de medidas diferentes, que se componen de
RNA de una nica hebra
20 aminocidos distintos. El tipo, el nmero y la
El genoma de casi todos los organismos consta de secuencia de los aminocidos en la molcula de
DNA. Sin embargo, algunos virus utilizan RNA protena determinan sus propiedades (vase en el
(cido ribonucleico), que est rodeado de una Cap. 2 el ejemplo de la lisozima).
envoltura proteica. El virus del mosaico del taba
co (VMT), que ataca las hojas de esta planta, cons
ta de una molcula de RNA de una nica hebra
con 6395 nucletidos y una envoltura proteica
con 2130 subunidades idnticas (Fig. 3.7). Una
RNApolimerasa cataliza su replicacin.

Flg. 3.5 Eiwin Chargaff

La ordenacin de las bases en el DNA, la secuencia


de DNA, entrega las instrucciones para incorporar
los aminocidos en la protena. Las instrucciones de
construccin se er.cuentran en el conocido lenguaje
de las bases A, C, G y T; las protenas se escriben, en
cambio, en otro lenguaje completamente diferente,
el de los aminocidos. La clave para traducir del len
guaje del DNA al de los aminocidos se denomina
cdigo gentico.

Tras el modelo de la doble hlice de Watson y Crick


de los aos 1950 se empez a especular sobre el tipo
de cdigo gentico: cuatro bases diferentes sirven

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25 ...
20 ....

..

15 .. .
10 .. .

s ...
o

Adenina
Ti mina
Citosina
Guanina

Fig. 3.6 Composicin del


ONA humano en porcentaje.
Distribucin de las bases A,
T, C y Gen el genoma humano, como se resume en tas
reglas de Chargaff.

Fig. 3.7 Col\struccin del


virus del mosaico del tabaco
(VMn con subunidades proteicas y una molcula de
RNA de una nica hebra.

51

BIOTECNOLOGA
Fig. 3.8 Del DNA a la prote
na. Derecha, arriba: estruc
tura de la doble hlice del
DNA. Derecha, abajo: cmo
se transcribe la secuencia
de bases del DNA al RNAm
y desde los ribosomas se traduce a una secuencia de
aminocidos.

menos combinaciones de tres (tripletes o codones):


43 (4 x 4 x 4) =64. Debido a que no se requieren 64
sino 20 instrucciones para la incorporacin de los 20
aminocidos, se podra sospechar que se usan varias
combinaciones de tres para incorporar un mismo a.mi
nocido. El cdigo est, pues, "degenerado".

Nucletido

Se supo tambin a finales de la dcada de 1950 que


las protenas no se producen directamente en el
DNA. El DNA genmico de las bacterias procariotas nada libre en el plasma, mientras que el DNA
eucaritico se encuentra encerrado fuertemente en
el ncleo celular (Fig. 3.16). Aparte del DNA genmico en el ncleo celular, los eucariotas poseen
tambin DNA mitocondrial, y las clulas vegetales
lo contienen en los cloroplastos.
Las protenas se originan fuera del ncleo en el citoplasma. Las clulas disponen all sus propias fbricas
de protenas: los ribosomas. En esta brecha entre el
ncleo y la fbrica debe tenderse un puente.
Cmo llegan las instrucciones de construccin con
tenidas en el DNA desde el ncleo celular a los ribosomas en el citoplasma? Se requiere un mensajero (en
ingls messenge~. Tal mensajero biolgico es tam
bin necesario por motivos de "economa celular".
RNAm

DNA
Fig. 3.9 RNA polimerasa con
un RNAm nuevo sintetizado.

s'

3'

G C
G C
UA
A U
C G
C.. G
CG
GC
A U
G C
GC
UA
AU
GC
CG
CG
G C
C G
G C
U A
C.. G
G C
UA

Fig. 3.10 Marshall Nirenberg


(nacido en 1927) (derecha)
y Heinrich Matthaei
(nacido en 1940).

a;

~
s

Fig. 3.11 Har Gobind


Khorana (nacido en 1922),
premio Nobel en 1968 con
Nirenberg y Holley.

52

3'

s'

Polipptido

s'

3'

l
Metionlna

3.5 El genoma humano-Una enor


me enciclopedia de 24 volmenes
El genoma del ser humano tiene 3 080 000 000
letras, aproximadamente 750 megabytes en infor
macin digital. Llenara unos 5000 libros como ste
y cabra en un nico DVD (Digtal Versatile Dsc).
El ser humano posee de 20 000 a 25 000 genes
codilicadores de protenas.
Un nico de los 24 cromosomas humanos lleva
pues, como media, aproximadamente l 000 genes
diferentes.
El genoma humano se puede comparar con el contenido de una enciclopedia de 24 volmenes
"supergordos". Otra comparacin ilustrada: con l
se pueden llenar 2000 guias telefnicas como la de
Nueva York (Cap. 10).

3'

como instrucciones para la colocacin por transferencia de 20 diferentes aminocidos. Slo una combina
cin de varias bases puede, pues, aportar las instrucciones para la instalacin de un aminocido en una
protena; si fueran combinaciones de dos, se consegu
ran 4 x 4 = 16 posibilidades de combinacin para la
transferencia -demasiado pocas para la codificacin
de 20 aminocidos. Por lo tanto, se requeriran al

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Cada volumen (cromosoma) de la enciclopedia (genoma} contiene aproximadamente 1000 instrucciones


de construccin (genes) para protenas, yla longitud de
las instrucciones de construccin vara mucho. El len
guaje es raro: cada palabra (codn) consta slo de tres
letras y el alfabeto nada ms tiene cuatro letras [A, T,
C, G}. Algunas instrucciones son nicamente unas
pocas lli1eas, mientras que otras ocupan varias pginas.
Cada instruccin de construccin de protena
(exn) est interrumpida a menudo por varios, y

El M I LAGRO

DE LA INGENIERA GENTICA -

para nosotros hasta ahora incomprensibles, complicados lazos (intrones) que a veces se extienden claramente sin sentido y en repeticiones hacia los lados.
Si se solicita una determinada instruccin de construccin (un gen), la administracin de la biblioteca
(o sea, la clula) prepara una copia, en lugar de prestar el volumen original muy pesado de la enciclopedia. Cuyo valor es adems incalculable!
El nombre de esta copia gentica de una hebra es
cido ribonucleico mensajero (RNAm).
La copia de RNAm del gen se corresponde qumica-

mente al original DNA. Como ste, consta tambin


de un "esqueleto" alternando un1dades de azcar y
fosfato, en el cual se asientan las mismas bases: A,
C, G. La base timina se reemplaza, sin embargo, por
Ja base uracilo (U), que aparece en el RNA en todos
Jos lugares donde en el DNA se encuentra tlmina
(T) (Fig. 3.8).

3.6 El cdigo de DNA se agrieta:


el RNA sinttico descifra los codones

El principio del cdigo gentico ya era conocido a


principios de los aos 1960, pero an no se habla
El azcar del RNAm es, como ya se ha menciona- descrifrado. Cul de las 64 combinaciones posi
do, una ribosa. Posee, a dferencia de la desoxirri- bles de tres bases (codn) controla la incorporacin
bosa del DNA, un grupo OH en el tomo de carbo- de cul de los 20 aminocidos diferentes en una
no 2 del azcar.
protena?

Si la clula requiere una determinada protena, se


prepara primero del DNA una copia de RNAm del
gen correspondiente. En los seres vivos superiores
(eucariotas) estas copias se desplazan desde el
ncleo celular al citoplasma, hacia la fbrica de protenas en Jos ribosomas. Aqu, el RNAm dirige la formacin de la protena (Fig. 3.16).

Fig. 3.12 Cmo interaccionan qulmicamente los pares


de bases (regla de Watson
Crick): adeninatlmlna
mediante dos puentes de
hidrgeno, guanina-citosina
mediante tres puentes de
hidrgeno.

El experimento decisivo lo realizaron en 1961 el


americano Marshall Nirenberg (nacido en 1927)
y el alemn Heinrich Matthaei (nacido en 1940)
(Fig. 3.1 O), en el Congreso Internacional de Bioqumica en Mosc.

Fabricaron enzimticamente una molcula de


RNAm artificial, que constaba slo de la base uraciEl procedimiento para la produccin de una copia lo (-U-U-U-U-etc.), y trasladaron estas instrucciones
de RNAm a partir de una fraccin de DNA, la trans de colocacin artificiales a una mezcla de reaccin
cripcin, se asemeja mucho al procedimiento de la cuidadosamente preparada. La mezcla contena
copia (replicacin) de la divisin celular, en la fase S todos Jos componentes qumicos a partir de los cua
de la mitosis.
les se construyen las clulas vivas, pero con una
diferencia
significativa: no contena ningn otro
En lugar de la DNA polirnerasa acta aqu otra enzi
DNA
ni
RNA
que la molcula de RNAm artificial
ma. La "cremallera" de la doble hlice se abre local
con
bases
U.
No
obstante, tras la adicin del programente al "principio de un gen", y en las bases libres
ma
conductor,
la mezcla de reaccin "muerta"
se coloca la enzima RNA pollmerasa (Fig. 3.9)
empez
a
generar
una protena como en una clula
para la correspondiente colocacin de las "partes
viva.
La
molcula
proteica
artificial constaba de una
prefabricadas":
cadena con el aminocido fenilalanina montona
frente a una adenina del DNA un uracilo,
mente repetido: -Phe-Phe-Phe-etc.
frente a una citosina del DNA una guanina,
Nirenberg y Matthaei haban descifrado con ello la
frente a una guanina del DNA una citosina y
frente a una timina del DNA una adenina del primera de las 64 posibles combinaciones de tres del
cdigo gentico. El codn U-U-U del RNA conduce,
RNA
pues, a la incorporacin del aminocido fenilalanina
La inhibicin irreversible de las RNA polimerasas
a una molcula de protena.
mediante la a-amanitina (Fig. 3.13) es, a propsito,
la causa de que cada ao mueran en el mundo unas Pronto se determin "AAA" como el codn para la
cien personas por envenenamiento con Ja seta Ama- lisina, "CCC" para la prolina, y as sucesivamente.
nita. Las clulas no pueden sintetizar ms RNAm y Por fin, en 1966 termin la bsqueda del cdigo
gentico gracias al indio residente en Estados Unidos
por tanto tampoco ms protenas.

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Flg. 3.13 Los eucariotas tienen tres tipos de RNA-polimerasa. La seta Amonita
phalloides produce <Xamanitina, que inhibe las RNA polimerasas 11y111 humanas, con
consecuencias a menudo
mortales.

iQu es una kilobase (kb)?


Kilobase (kb) significa 1000
bases de una doble hebra
de DNA o de una molcula
de una nica hebra. t kb de
una doble hebra de DNA tiene 0,34 micrmetros de Ion
gitud y una masa de aproximadamente 660 ooo dalton.

53

llllJ' BIOTECNOLOGA

\ .----~~~~~~~~~~~~~~~~~~~---

Cuadro 3.1 Historia de


la blotecnologfa: DNA
"Mientras que el seor abad era el gua espiJitual ms popular en Brnn. ninguna alma
crea que sus experimentos fueran ms que
una diversin de tiempo libre y su teora
ms que disparates de un encantador charlatn". escribi un contemporneo de Gregor
Mendel.
Mendel (1822 l 8841 habla hecho pblicos
en 1865 sus "experimentos con guisantes" ini
ciados en 1856. fue quien formul por pri
mera vez las leyes de Ja herencia: las caracte
rsticas puras observadas externamente [por
ejemplo los colores de las flores y fas formas
de las semillas y las vainas) se determinan
por Jos factores que se heredan Independiente
mente unos de otros. Estos factores heredita
ros se denominaron m~ tarde genes.

calmeme respecto a una cadena de la mol


cula. En 1950 entreg t 5 gramos del ms
valioso DNA altamente purificado, segn
Cambridge el "man de Berna".
f.n 1928, el bacterilogo britnico Frederick
Griftith ( t 877-194 t) realiz un experimento

con neumococos, los causantes de la neumonfa. Griffith trabaj con dos cepas de neumococos. Una de ellas no tena ninguna cpsula
y recibi la denominacin R(del ingls
rough, rugosa). La otra formaba cpsulas y
se describi como cepa S [del ingls smooth,
lisa). En expetimentos con ratones. la cepa S
lisa fue mortal yla cepa Rrugosa result
inofensiva. Si se mataba a las bacterias de
la cepa S peligrosa y se inyectaban a un ratn,
no causaban dao al animal. Pero si se inyec
taba al ratn una mezcla de bactetias Rvivas
y bacterias S muertas, mora. Los neumoco
cos Roriginalmente inofensivos haban
adquirido el factor letal de la cepa S.

sino extractos celulares que se purificaban


cada vez ms. Todas las rracctones (compo
nen tes de la pared celular, diversas fracciones
proteicas y fracciones que contenan cidos
nucleicos) se estudiaron segn su capacidad
de conseguir el paso de la formas Ra la forma
S. Cuando se afladla etanol se produca una
precipitacin en el tubo de ensayo y el "principio" ya no funcionaba. Los hidratos de car
bono, como las cpsulas bactetianas, no preci
pitan con alcohol; en cambio, los cidos grasos precipitan bien. Las proteasas no mostraron ningn efecto. El experimento, pues, slo
dio resultado con las fracciones que contenan
cidos nucleicos.

Theodore Oswald Avery (18771955) demostr,


en 1944, que el ONA es el portador de la herencia. Fund la gentica molecular.

Gregor Mendel
(1822 - 1884)

En 1900 las leyes de Mendel fueron "redes


cubiertas" por C.E. Correos, E. von Tschermak y H. de Vries.
En 1869,Johann Friedrich Miescher
[1844-18951, de Basilea, aisl del pus de
un vendaje una sustancia, la "nuclena".
Esta sustancia no pudo degradarse por las
enzimas fragmentadoras de protenas. Tena
propiedades cidas, y por ello se denomin
ms tarde nuciefna, por los "cidos nuclei
cos". Miescher encontr tambin nuclelna
en levaduras. clulas de rifin y de hgado,
as como en los glbulos rojos de la sangre.

Sin embargo, pasaron ms de SO aflos hasta


que se supo que el DNA se forma conjunta
mente a partir de seis componentes: cido
fosfrico. el azcar desoxirribosa y las cuatro
bases adenina, guanlna. timlna y citosina.
Esta estructura simple no permita expUcar
funciones complejas como la herencia.
RudolfSigner {l 9031990), de Berna, produjo DNA en forma pura por primera vez en
1938. Ya haba pasado un tiempo cuando se
descubri que las bases del DNA son anillos
planos, que se encuentran colocados verti

Friedrich Miescher
(18441895) des
cubri en 1869 los
cidos nucleicos.

Griffith describi esto como una de las pri


meras posibilidades de intercambio de genes
entre las bacterias (transformacin). Hoy se
sabe que el DNA de las bacterias S mortales
haba sobrevMdo al proceso de calentamlen
to y lo haban tomado los neumococos R
inofensivos. El DNA de la cepa S contena
el gen decisivo que protege a las bacterias
del sistema inmunitario del husped.
Tras un tiempo como mdico cltnico. el cana
diense Theodore Avery (1877-1955) trabaj
como cientfico en el Rockefeller lnstitute of
Medica! Research, desde 1913 hasta 1947.
En 1944, 75 aos despus de Friedrich Mies
cher, demostr con Macleod y McCarty
que Jos cidos nucleicos son los portadores
de la informacin gentica y no las protenas,
como se asuma hasta entonces. Qu es el
"principio de transformacinn del intercambio
de genes? Y qu se considera un gen quml
camente? Aveiy fue un paso ms lejos que
Griflith y tom para su experimento no los
simples neumococos S inactivados por calor,

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Sin embargo, si Avery aada la enzima Jibo.


nucleasa, ragmentadora del RNA. el "princi
pio" an era eficaz. Ni las protenas ni el RNA
eran Ja causa de la transformacin. El test qumico para el anlisis del azcar del DNA des
oxirribosa se colore de azul: era DNA! Slo
las fracciones que contienen DNA, as como
el DNA qufmicamente puro, transforman las
clulas receptoras Rinofensivas de modo
duradero al fenotipo S patgeno. El DNA era,
pues, el principio transformador. Los expert
mentos de Griffith y Avery son, desde el pun
to de Vista actual, asombrosamente moder
nos. Fueron los primeros experimentos de
ingeniera gentica de la historia.
La tercera parte de la historia del DNA la
escribieron Erwin Chargaff, Maurice Wilkins,
Francis C. Crick y James D. Watson.

De un articulo cl&sico
de Avery: pequeas
colonias de las cepas
inofensivas rugosas
no encapsuladas de

Streptococcus pneumo
niae (arriba) y de las
cepas lisas encapsula
das (abajo).

Erwln Chargaff (Fig 3.5) venia de una


familia juda. Tras la toma de poder de los
nazis abandon Alemania y fue a Pars,

El:'MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA -

al Instituto Pasteur. En 1935 emigr a Esta

dos Unidos y trabaj, a partir de 1938, en


la Universidad de Columbia en Nueva York.
Desde 1944 en adelante Investig sobre
elDNA.
Chargaff estableci que en el DNA de cada
ser vivo existe la misma relacin de cantidad
de adenina a timina y de citoslna a guanina,
lo que formul con las por l mismo denomi
nadas "reglas de Chargaff" [Fig. 3.6).
Chargaff tuvo ms tarde una seria adverten
da por el abuso de la ingeniera gentica.

Rosalind Franklin
(1920- 1958)

De joven entusiasta en ornitologa, el enormemente inteligente james Dewey Watson


empez, a la edad de 15 atlos, los estudios
de zoologa en la Universidad de Chlcago.
Cada vez ms Interesado en las cuestiones
de la nueva gentica, realiz su trabajo de
doctorado con Salvador Lurla, uno de los fundadores de la investigacin de fagos. Estos
virus, que atacan las bacterias [Cap. 51, eran
vlidos como modelos para los genes.

Maurke Wilklns
(1916-2004), pre
mio Nobel con
Watson y Crick.

En 1950 Watson fue a Europa, a estudiar


las bases bioqumicas de la proliferacin de
fagos. Lleg a Cambridge "el hombre apro
piado en el momento apropiado en el lugar
apropiado" y junto al ffsico y criscalgrafo
Francis Crick aclararon en un tiempo corto,
en 1953, la estructura de la doble hlice del
DNA. La historia de ta doble hlice la explic
mucho mejor el mismo Jim Waison. l y
Crick se estimularon con la competencia de
la cristalgrafa de DNA londinense Rosallnd
Franklin 11920 1958) -que demostr la

estructura en hlice del DNA- y de Maurice


Wl1k1ns l l9162004}, que comparti ms
tarde el premio Nobel con Watson y Crick.
El qulmico americano Linus Pauling reconoci en 1951 la hlice como un elemento
estructural decisivo de las protenas, y luego
examin la estructura del DNA. l postul,
sin embargo, una triple hlice en lugar de
una doble hlice -y segn el hijo de Pauling,
Peter, Watson y Crick experimentaron una
completa alegra del mal ajeno acadmico".
Despus de ganar la carrera del DNA, Waison
busc otros retos prometedores. Su experi
mento para aclarar la estructura del RNA, sin
embargo, fall estrepitosamente.

El doble ganador
de premio Nobel
Linus Pauling
(t90M994).

En los siguientes aos. jvenes Investigadores


de Estados Unidos, Inglaterra y Francia, apar
te de Watson y Crick, entre otros Sydney
Brenner (Cap. 10}, Richard Feyrunan y los
expulsados de Alemania Erwin Chargaff,
Gunther Stent y Edward Teller. bajo la direc
cin del cientfico ruso-americano Georgl
Gamow, formaron el "club de la corbata del
RNA", en el cual, de modo interdiscplinario
y con el apoyo de muchos contactos informa
les, resolvieron acuciantes preguntaS de
la biologa molecular, especialmente las del
cdigo gentico.

lC6mo se escriben las


secuencias de DNA?
El grupo hidr())(ilo s' de un
nucletido est enlazado por
un grupo fosfato con el gru-

po hidroxilo 3' del siguiente


nucletido (fig. 3.8).
Todos los enlaces fosfodister en las hebras del ONA
y del RNA estn formados
de la misma manera a lo lar
go de la cadena. Esto confiere a cada hebra de cido
nucleico una determinada
polaridad y extremos s' y 3'
diferenciables. Se ha acor
dado escribi r la secuencia
en la direccin 5'3.
La forma abreviada ACCGGT
significa, pues, 5'ACCGGT3'.
A dispone de un grupo Fosfa
tos' en la cabeza": T, en
cambio. un grupo OH-3'
no enlawdo en la "cola".
La base de esta polaridad
es que ACCGGTy la comple
menta ria TGGCCAi son dos
molculas completamente
diferentes!

Fig. 3.14 Visin en un micros


copio electrnico de una clu
la de E. coll estallada (flecha:
plsmldo),

Tambin como maestro, en la Universidad,


Watson fue revolucionario. Su idea era que
el xito cientfico depende de que los profe
sores enseen rpidamente a los estudian
tes su propia independencia. Llev su idea
a la prctica en los aos 1960 en la Univer
sidad de Harvard. Juntamente con Walter
Gilbert aplic este principio, por el cual
ambos renunciaron a la prctica normal de
los profesores de poner sus nombres en las
publicaciones de sus estudiantes Incluso
aunque se hubieran origj.nado sin su ayuda
directa.
Watson fue definitivamente decisivo en el
desarrollo del proyecto del genoma humano
Cap. 101, y con sus indicaciones y comenta
rios controvertidos asegur, hasta hoy, los
debates polmicos.

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Una clula de E. coli estalla


da con su importante DNA
en forma de anillo (aproximadamente un milmetro de longitud) y algunos plsmidos.
La clula mide, en cambio,
solamente dos micrmetros.

55

BIOTECNOLOGA

Fig. 3.16 y 3.17 Todas las clulas vivas


producen protenas. Una molcula
de protena consta de aminocidos.
Las instrucciones sobre en qu orden
(secuencia) se colocan los aminocidos
uno tras otro en la sntesis de protenas
se encuentra en el cido desoxirribonucleico (ONA), largas molculas lineales
de doble hebra.
Cada hebra del ONA consta asimismo
de componentes denominados nucle
tidos y que se conocen con las letras
iniciales de las bases que contienen:
adenina (A), citosina (C), guanina (G)
y timina (T).

Fig. 3.15 El ONA no se


encuentra desnudo en los
cromosomas de las clulas
eucariotas, sino que est
estrechamente unido a
pequeas protenas, las histonas. Juntos forman los
nucleosomas.

56

Los nucletidos se encuentran en pares


complementarios, es decir, en dobles
hebras de ONA en las que siempre hay
en frente slo un nucletido A/T y C/G.
Cada aminocido en la protena significa un triplete de nucletidos en et DNA.
La totalidad de los tripletes de DNA que
especifica una molcula de protena se
decribi como gen estructural de una
protena.

En los eucariotas, un gen de estructura


como ste puede constar de varios fragmentos que llevan informacin (exones), entre los cuales se encuentran
fragmentos de ONA (intrones) que no
contienen ninguna informacin sobre
las estructuras de las protenas.

(sp/icing}. El producto es una molcula


de RNA ms corta, que se describe
como RNAm "maduro" (mature} porque
se traslada desde el ncleo celular al
plasma celular y, como un mensajero,
lleva los planos de construccin de la
molcula de protena.

Las secuencias de nucletidos no slo


pueden indicar aminocidos especficos, sino tambin seales, que son
interpretadas por la maquinaria que
sintetiza protenas como solicitudes
de " inicio" o "parada".

El orden de los nucletidos (secuen


cia} del RNAm se traduce (traduccin}
entonces en el plasma celular con la
ayuda de los ribosomas y los cidos
ribonucleicos de transferencia (RNAt}
cargados con los 20 diferentes amino
cidos en la secuencia primaria de las
protenas. Las cadenas polipeptdicas
sintetizadas se pliegan entonces para
formar las protenas.

Para que la informacin contenida en el


DNA pueda ser eficaz en el citoplasma,
el DNA debe transcribirse a cido ribonucleico mensajero (RNAm). Ta mbin
el RNAm consta de nucletidos, pero
en lugar de la base timina (T) en el DNA
aparece aqu el uracilo (U).
Al reescribir (transcripcin) se copian
primero los exones e intrones del ONA
por la poli merasa. Entonces se eliminan
del RNAm los intrones correspondientes de las secuencias de nucletidos

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El MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA -

Har Gobind Khorana (nacido en 1922) (Fig. 3.11 ),


con el desciframiento de las ltimas 64 posibles combinaciones de tres.

en principio universal. Sin embargo, hay excep


ciones: las mitocondrias, orgnulos celulares de
los cuales se asume que habran sido bacterias anti
guas
que entraron en simbiosis con las clulas
Con ello quedaba claro que los aminocidos se codisuperiores.
Las clulas ofrecan proteccin, las
fican con grupos de tres bases (trlpletes), e indudabacterias
suministraban
energa. Las mitocondrlas
blemente se parte de un determinado punto de inipueden
tener
un
cdigo
desviado del resto de las
cio. Sesenta y uno de los 64 codones deciden amiclulas.
Asf,
UGA
no
es
en
las mitocondrias humanocidos, y los tres restantes (UAA, UAG y UGA)
nas
una
seal
de
parada,
sino que codifica para
son seales de rotura de la cadena. AUG es, en los
triptfano.
Tambin
los
ciliados
(cillophora) se
eucariotas, una sefial de inicio y codifica tambin
separaron
pronto
en
la
evolucin
a
su
propio cami
para la metionina.
no y han originado un cdigo gentico ligeramen
Slo hay 61 posibles palabras en clave para 20 ami- te desviado. Por ejemplo, aqu UGA es la nica
nocidos. O sea, para algunos aminocidos existen seal de parada. Los codones de rotura de cadena
ms palabras en clave, y por lo tanto el cdigo UAA y UAG codifican en los ciliados para otros
gentico est "degenerado": para la valina y la ala- aminocidos.
nina hay cuatro codones diferentes, para la leucina hay seis. Mediante esta degeneracin del cdi- Por qu el cdigo ha permanecido casi invariable a
go gentico, la secuencia de aminocidos de una lo largo de miles de millones de afias? Cuando una
protena no deriva siempre de una secuencia exac- mutacin cambia drsticamente la lectura del RNAm
ta de nucletidos del DNA. El cdigo gentico es se desencadena la modificacin de la secuencia de

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Exones e lntrones - Un raro


manuscrito
El cientlfico-publlcista ingls

Steve Prentis compar los


genes de los eucariotas acer
tadamente con un raro
manuscrito: algunas pginas
con exquisita prosa (exones)
siguen a letras y palabras sin
sentido Ontrones), antes de
empezar otra vez los siguien
tes prrafos "ordenados"
(exones).
El lector debe extraer (cortar
y empalmar) los lugares sin

sentido en el ejemplar copia


do (RNAm) y unir los prrafos
con informacin til El
manuscrito acabado (/lNAm
maduro) puede entonces llevarse al impresor de libros
(ribosoma) y se obtiene
un libro lleno de sentido
(protena).

57

BIOTECNOLOGA

No todas las zonas del DNA codifican protenas.


Fragmentos especiales, que estn cerca de los genes
estructurales, controlan su expresin, es decir, se
ocupan de que uno de estos genes se transcriba a
RNAm (transcripcin) y se traduzca a una protena
(traduccin).

Fig. 3.18 Derecha:


traduccin del RNAm a protena en el ribosoma.

s'

3'

11

s'

Fig. 3.19 El ribosoma consta


de dos subunidades que
envuelven a un RNAm duran
te la sntesis de protena.
Arriba: un ribosoma bacteria
no. Los ribosomas eucariti
cos son algo mayores. Los
ribosomas constan mayoritariamente de RNA (en naranja
y amarillo), que forma com
piejos con protenas (azul).
la subunidad pequea "aso
cia" para cada codn del
RNAm un anticodn prueba
del RNAt con el aminocido
correspondiente. La subunidad grande cataliza la snte
sis: traslada el aminocido
del RNAt a la cadena polipep
tdica creciente.
Abajo: dos de los 20 RNAt:
el RNAt-aspartato lleva
aspartato, el RNAtfenilalani
na lleva fenilalanina (flecha).
Se ven tambin claramente
los anticodones.

Fig. 3.20 Robert W. Holley


(1922-1993) investig el
RNAt. Premio Nobel en 1968
con Nirenberg y Khorana.

58

s'

3'
Direccin de la traduccin

3'

aminocidos de casi todas las protenas. Sin embargo,


tales mutaciones seran mortales y se eliminaran
rpidamente en la evolucin por seleccin natural.

3.7 Los genes estructurales


cercanos a los fragmentos de DNA
controlan la expresin de los genes
En las bacterias, que como procariotas no poseen un
ncleo celular, el DNA forma un anillo cerrado de al
menos un milmetro de longitud. Todo esto se encuen
tra, sin embargo, como un apretado paquete en el interior de una clula bacteriana, que ocupa un espacio de
slo una milsima de milmetro (ver pg;;. 54 y55).

El primer proceso, la transcripcin, se lleva a cabo


a partir de dos secciones de DNA especiales. Una de
ellas, el promotor (punto de inicio), consta de
una corta secuencia que permite que la enzima
RNA polimerasa se una al DNA y lo recorra a lo largo. La enzima empieza entonces, en un lugar cercano a uno de los genes estructurales, con la transcrip
cin del DNA a RNAm.
La otra seccin, una secuencia de parada, se
encuentra espacialmente algo ms atrs del gen
estructural y da la seal de acabar la transcripcin.
En E. col, la seal de parada origina, en la hebra del
RNAm sintetizada de nuevo, una estructura en
"horquilla". Cuando se origina esta horquilla se
libera enseguida la RNA po!imerasa del nuevo
RNAm sintetizado.
Las eucariotas poseen otros promotores (por ejemplo el promotor metalotionefna, que se ve afectado
por iones metlicos pesados, detallado en el Cap. 8)
y las secuencias enhancer, que practican potentes
interacciones, y tambin las secuencias de parada.
En los eucariotas, el RNAm se modifica tras la transcripcin: el extremo 5' se equipa con una estructu
raen caperuza [cap), el extremo 3' con una "cola"
de componentes adenina 1Poli(A)] (vase la sntesis
de la insulina en la Fig. 3.36). Otras zonas regulado
ras se encuentran en los genes, cuya actividad cambia con la concentracin instantnea de determina
dos productos del metabolismo.
Como veremos en la regulacin de la utilizacin de la
lactosa (detallada en el Cap. 4 como ejemplo del ope
rador lac), la denominada regin del operador, que
se encuentra entre el promotor y el gen estructural,
puede unir la denominada protena represora.

De este modo, en un milmetro de DNA se alinean Un inductor (por ejemplo un azcar) se une a esta
en la "cepa de seguridad" Kl2 de Escherichia co/i protena represora, se modifica la estructura de la
exactamente 4 639 221 pares de bases, unos detrs protena en el espacio y abandona la regin del opede otros. Llevan genes codificadores de apenas 4300 rador. As se permite libremente la lectura del gen
protenas. Los denominados genes estructurales, estructural para Ja enzima degradadora del azcar
cada uno de aproximadamente 1000 pares de bases correspondiente.
de longitud, codifican la estructura de una nica pro 3.8 Ribosomas - La fbrica de
tena, principalmente de una enzima. Un gen estruc
protenas de la clula: una molcula
tural dirige la maquinaria de la clula, de modo que
gigante de RNA y protenas
algunos cientos de aminocidos en los ribosomas se
encadenan en una determinada secuencia y con ello El RNAm contiene la informacin completa, inclu
forman una determinada protena.
yendo las seales de inicio y parada, para la sntesis

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EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA

de protenas. Se lee en el ribosoma. Los ribosomas


constan de una subunidad grande y una ms peque
a (Fig. 3.19). Son complejos de protenas y RNA.
Los RNA ribosomales (RNAr) son molculas de
una sola hebra y partes estabilizantes de los riboso
mas. Los 20 RNAt diferentes se sintetizan a partir
de 20 aminoacil sintetasas (Fig 3.21) completa
mente diferentes, de las que cada una une un deter
minado aminocido a un determinado RNAt.
Junto al RNAm y al RNAr hay adems otro tipo de
RNA: los RNA de transferencia (RNAt), que
transportan aminocidos en su forma activada al
ribosoma (Fig. 3.18). Para cada uno de los 20 ami
nocidos hay al menos un RNAt. Los RNAt constan
de RNA con un "anticodn" en un extremo y el
correspondiente aminocido activado en el otro
extremo (Fig. 3.19).
Otras secuencias de DNA, que se transcriben en
RNAm junto al correspondiente gen estructural,
supervisan el paso (traduccin) en el ribosoma
para obtener una cadena peptfdica (Fig. 3.18). Un
lugar de unin especial fija el RNAm al ribosoma.
Empieza entonces la traduccin en la seal de ini
co, en el primer codn del gen estructural. Por lti
mo, una seal de parada al final del gen se ocupa de
que la cadena proteica completa quede libre del
ribosoma.
Sin una clara comprensin de todo este proceso es
impensable una programacin planificada del DNA.
As, las intervenciones en un gen estructural pue
den cambiar la secuencia de aminocidos de una
enzima y con ello influir en su actividad. El promo
tor es capaz, incluso tras una alteracin insignifican
te de su secuencia, de unir dbilmente a la RNA
polimerasa. Esto incrementa la eficiencia de la copia
del DNA en RNAm (Cap. 4). Ydefinitivamente, las
mutaciones en la regin del operador o en un gen
regulador pueden impedir que la protena represo
ra se coloque en su lugar normal. La transcripcin
se produce entonces a gran velocidad. A partir de
aqu se traducen genes exgenos "incorporados"
slo entonces a las protenas, si el promotor y los
lugares de unin del husped y del donante se pare
cen bastante uno al otro.
Las eucariotas, incluidos los organismos superio
res, desde las levaduras y algas hasta los humanos,
utilizan distintas seales de control que los pro
cariotas, las bacterias. tsta no es la nica diferen
cia: en las clulas eucariotas no hay un DNA "des
nudo" (Fig. 3.22). El DNA eucariota est empaque
tado con protenas (histonas) (Fig. 3.15) y distribu
do en cromosomas. Los cromosomas se encuentran todos juntos en el interior del ncleo celular.

La clula de un hongo contiene ya diez veces ms


DNA que la de una bacteria, y las plantas y los ani
males superiores tienen incluso mil veces ms,
aunque su repertorio gentico de ninguna manera
se ampla en esta medida. Los humanos poseen,
con 20 000 a 25 000 genes, slo aproximadamen
te cinco veces ms genes que una bacteria intesti
nal. Uno de los motivos de ello son los muchos
genes esttucturales "divididos", denominados
genes mosaico, en los cuales se van alternando
una tras otra las secciones codificadoras (exones)
y las no codificadoras (intrones, DNA "junlt' ).
Adems, entre los genes hay largas secciones con
secuencias repetidas varias veces (repetitivas), con
una funcin hasta ahora desconocida.

Fig. 3.21 Veinte diferentes


aminoatilRNAlsintetasas
conectan con mucha precisin
los veinte aminocidos con
RNAI. La isoleucina es muy
similar a la valina. Para evitar
los fallos, la isoleucilRNAt
sintetasa ocupa un centro
activo adicional, que "corri
ge". As slo aparece un fallo
en 3000 sntesis {ien lugar
de uno en 150 sin correccinO.

Las pistas de la evolucin (seguramente tambin la


historia de los ataques de virus) Indican la posible
funcin del intrn (Cap. l O), y no tienen informa
cin legtima para la clula, por lo menos sobre la
construccin de cadenas peptfdicas. En los euca
riotas, los intrones se copian a RNAm, forman

RNAr

RNAt

~minocld~s

Ribosoma

Subunidades ~ ,.....
de ribosomas
~

......

:.._ f) __.

Traduccin ( f':u

Transcrlpcl6n

Fig. 3.22 Diferencias de


la biosntesis proteica en
los procariotas (arriba)
y los eucariotas {abajo).

Membrana celular

Procesomlnto Transporte al citoplasma

_.,..

.:


Aminocidos

...

it-"/1ntrn

~ RNAm~ _.,..
lntr6 Cortey

Ex6

Traduccin

6 - ~ (jV
"~<..

_/

!Ir.

l 'U

empalme
Ex6n

N6deo celular

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59

BIOTECNOLOGA

Fig. 3. 23 Manipulacin
gentica de las clulas bacterianas como ejemplo de
la produccin de interfern
humano mediante bacterias.
De tas clulas humanas se

asla el RNAm entero. que


se convierte enzimtica mente mediante la transcriptasa
inversa en un tubo de ensayo a DNA de doble hebra,
con endonucleasas de restriccin se corta especficamente y mediante ligasas
se inserta en plsmidos bacterianos (cortados antes con
las mismas endonudeasas
de restriccin) .
Los plsmidos recombinantes se transportan en bacterias y se multiplican (clonan). Finalmente, de las mil
colonias bacterianas se asla
una, que produce el interfern humano.

60

bucles y luego se cortan (splicing, corte y


empalme), y slo se conectan juntos los exones
[Fig. 3.16).
El RNAm acortado de este modo, con informacin
exclusiva de codificacin de protenas, se denomina RNAm maduro (mature mRNA).

3.9 Recombinacin: las cartas


genticas se barajan de nuevo
Las mutaciones cambian los genes de un ser vivo
(detallado en Cap. 4).

mosomas con la misma o similar secuencia de


DNA e intercambian sus partes correspondientes
(homlogas), donde el DNA se rompe y se une de
nuevo. El intercambio es catalizado por enzimas
especiales.
En los eucariotas se encuentran recombinaciones
homlogas principalmente durante la meiosis
{maduracin de las clulas sexuales). Se forma una
nueva composicin mediante una distribucin fortuita de los cromosomas homlogos maternos
y paternos en las clulas sexuales originales. A
continuacin se unen de una sencilla serie de
cromosomas (haploide} a una serie doble

Las recombinaciones -el segundo instrumento


ms importante de Ja gentica- barajan de nuevo las (diploide).
cartas genticas: las recombinaciones organizan los
genes o partes de genes que se encuentran en dos o La recombinacin entre partes de DNA homlogas
es un procedimiento sumamente eficaz: si se sepams organismos.
ran dos individuos en genes o partes de genes, la
Una recombinacin homloga tiene lugar, por recombinacin origina dos genotipos, o sea indiviejemplo, si se encuentran en una clula dos ero- duos genticamente diferentes.

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EL MILAGRO DE
las bacterias Shgella que era resistente a tres
antibiticos -las bacterias haban desarrollado
resistencia. En los aos posteriores, con la ere
ciente utilizacin de antibiticos aument la
resistencia a los antibiticos. Las bacterias
resistentes pueden resistir el ataque de los anti
biticos y, ms an, transferir su capacidad de
resistencia a otras bacterias. Producen enzimas
que inactivan a los antibiticos de diferentes
maneras (vase Cap. 4).

Si dos cepas de bacterias se diferencian, por ejem


plo, en una docena de pares de bases, pueden origi
nar 212 o casi 5000 nuevos genotipos. En la mayo
ra de los casos, sin embargo, hay ms de una doce
na de diferencias y por lo tanto se obtienen posibill
dades de combinacin astronmicamente elevadas.
Apesar de que, presumiblemente, todos los genes de
microorganismos se pueden intercambiar con cepas
relacionadas, hasta ahora se ha obtenido, mediante
recombinacin gentica natural con la finalidad de
desarrollar a partir de varias cepas, una cepa utiliza
ble industrialmente, an poco utilizada.
Las levaduras haploldes tienen un ciclo celular
simple. Poseen una nica serle de cromosomas
durante la mayor parte de su ciclo celular y no una
doble como los principales animales y plantas. Una
clula normal de levadura puede reproducirse slo
sexualmente si se encuentra con una clula deter
minada del otro sexo, del tipo apareado contrario.
Ambas clulas se funden y originan una clula
diploide, que produce esporas sexuales haploides.
Las esporas contienen otra combinacin gentica
que las clulas haploides paternas. Con una sencilla
modificacin, las levaduras industriales pueden
poseer varias series de cromosomas o "cancelar" el
apareamiento (mating).
El cruzamiento (hibridacin) diferente - a menu
do tambin de cepas de distintos tipos- desempea
un papel significativo en el desarrollo de las levaduras industriales. Especialmente esto es vlido para
las levaduras que posibilitan una rpida produccin
de pan con los modernos mtodos de fabricacin,
generan ms alcohol para la destilacin y ayudan a
fabricar cervezas especiales, en las cuales se han
degradado casi todos los hidratos de carbono solu
bles (Cap. l ).
Dnde se producen las recombinaciones, durante
la divisin madura (meiosis) de la clula?
La recombinacin tiene una importancia decisiva
para la produccin de anticuerpos muy diversos y
algunas otras molculas en el sistema inmunitario
(Cap. 5). Algunos virus utilizan la recombinacin
para incorporar su herencia gentica en el DNA de
la clula husped (Cap. 5). Los genes pueden manipularse con la ayuda de recombinaciones artificiales,
por ejemplo en los ratones knockout(Cap. 8).

Los plsmidos son vectores


ideales para el material gentico

3 .10

En 1955, los microbilogos japoneses aislaron


durante una epidemia de disentera una cepa de

En 1960, el japons Watanabe encontr la solu


cin del enigma: los plsmidos, pequeos ele
mentos de DNA en forma de anillo (con 3000 a
ms de 100 000 pares de bases), que permanecen
libres en las clulas bacterianas fuera del DNA
principal mucho ms grande {el "cromosoma prin
cipal") (Hg. 3.29). Hay aproximadamente 50 a
100 pequeos plsmidos y uno o dos mayores por
clula. Los principales plsmidos pueden prolife
rar naturalmente en la clula. Si dos clulas bacte
rianas entran en contacto pueden intercambiar,
mediante un puente (plus), los plsmidos grandes
(conjugacin).
Sin embargo, los plsmidos pequeos no son
transferibles. El DNA del plsmido por sf mismo
no hace a las bacterias resistentes contra los antibiticos, controla mucho ms la produccin de
enzimas inactivantes de antibiticos (por ejemplo
de penicilinasas o la enzima inactivadora de la
tetraciclina).
Stanley N. Cohen (nacido en 1935, Fig. 3.25),
especialista en plsmidos de la Universidad Califor
niana de Stanford, descubri cmo utilizar el DNA
del plsmido. Los plsmidos seran un medio Ideal
de transporte de material hereditario, un vector, si
se quiere aportar DNA exgeno. Los plsmldos se
ran como el cuco que se lleva el huevo (DNA ex
geno) a otro nido (clula bacteriana). Se debe des
arrollar un procedimiento para poder seccionar el
anillo de DNA e insertar el DNA exgeno.
Esto no es fcil en absoluto: por un lado, el DNA
principal de la bacteria estirado mide aproximada
mente un milmetro (vanse pgs. 54 y 55), pero en
realidad est agrupado en una clula de una milsi
ma de milmetro de dimetro. Los plsmidos son
an cien veces ms pequeos. El gen que se debe
incorporar mide aproximadamente una diezmilsi
ma de milmetro. Por ello, la hlice de DNA tiene
slo un grosor de dos millonsimas de milfmetro.
Con tijeras y bistures mecnicos no se puede hacer
nada. Las "tijeras" se deben poder encontrar en el
mismo lugar donde hay que cortar.

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LA INGENIERA GENTICA

Fig. 3.24 Herbert W. Boyer


(nacido en 1938), cofundador
de la ingeniea gentica:
wonder s what sets up apart
(rom other le forms. No other
speces wonders obout the
meonng ofexstence ar the
complexity ofthe existence or
the universe or themselves".

flg. 3.25 Stanley N. Cohen


(nacido en 1935), especialista en pl~smidos, cofundador
de la ingenierfa gentica.

Fragmentacin

Fig. 3.26 Arriba: cmo una


endonucleasa de restriccin
rompe especlflcamente DNA
y produce extremos pegajosos" (abajo).

61

BIOTECNOLOGA

y A. En la hebra de DNA "hermana" complementa


ria enfrentada, con la secuencia de bases CTTMG,
EcoRJ fragment tambin entre las bases Ay G:
3'XXXXXXXXG/ AA'ITCXXXXXXXXS'
5'XXXXXXXXCTIAA/GXXXXXXXX3'
Fragmentar con
EcoRI

Fragmentar con
EcoRI

v"

~,,
-- c.

, . . . .~ .....::~rorj

Plsmido hbrido

Enlace con
Ugasas

As no se origina ningn "corte liso", sino que se


unen dos pedazos puente con finales superpuestos:
3'XXXXXXXXG
AA'ITCXXXXXXXX-5'
S'XXXXXXXXC'ITAA
GXXXXXXXX3'

Sin embargo, a bajas temperaturas el DNA cortado


no se separa en dos partes; sus extremos sobresa
lientes se pegan con facilidad. Janet Mertz, del labo
ratorio de Paul Berg [Fig. 3.47) en la Universidad de
Stanford, descubri que las bases Ay T, as como C
y G, interaccionan electrostfcamente en estos
"sticky endS' (extremos pegajosos) . Sin embar
go, se pueden disponer juntos mediante una enzi
ma que requlere ATP, la ONA llgasa.
Investigaciones independientes entre s encontraron
las "tijeras" y el "pegamento" para el DNA; los resul
tactos de sus esfuerzos dieron su fruto en comn.

Fig. 3.27 El primer experi


mento de ingeniera gentica
de Cohen y Boyer.

Fig. 3.28 Werner Arber


(nacido en 1929).

Fig. J.29 Plsmido pSCtot,


por Stanley Cohen, denomi
nado tambin pfasmid
neckface (plsmido collar).

62

3.11 Tijeras y pegamento


moleculares: endonucleasas de
restriccin y DNA ligasas
En los aos 1960, Wemer Arber (nacido en 1929)
(Fig. 3.28) en Ginebra y el americano Hamilton D.
Smith [nacido en 1931, ambos recibieron el premio
Nobel junto con Daniel Nathans, 1928 l 999) des
cubrieron un mecanismo de proteccin de tas bacte
ras contra la amenaza mortal mediante los virus
bacterianos (bacterifagos). Los bacterifagos
inyectan su DNA en las clulas bacterianas. Las bac
terlas cortan el DNA del virus exgeno con enzimas,
las denominadas endonucleasas de restriccin
[abreviadamente restrictasas), y lo hacen as dai
no. El DNA propio de la bacteria, en cambio, est
protegido por grupos metilo (CH3) adicionales, que
bloquean las restrictasas.

Hoy se conocen ms de 1200 endonucleasas de


restriccin, que forman tres clases diferentes. Sin
embargo, slo algunas de ellas son interesantes
para la ingeniera gentica. Hay tambin endonu
cleasas de restriccin con cortes lisos y extremos
lisos (blunt ends), por ejemplo Pvull de Proteus vul
gans y Alul de Arthrobacter luteus.
Diferentes enzimas-tijeras generan extremos igua
les: las endonucleasas de restriccin BamHI (se
cuencia de reconocimiento GGATCC) de Bacil/us
amyloliquefaciens y Bgdi (secuencia de reconoci
miento AGATCT) de Bacillus globigi originan
ambos extremos pegajosos con la misma secuencia
GATC. Los fragmentos de genes que se producen
por una de estas enzimas se unen, pues, los unos
con los otros.

los primeros experimentos


de ingeniera gentica:
bacterias que croan?

3.12

En 1970 se descubri que las endonucleasas de res A principios de 1973, casi un ao despus de que
triccin no cortan arbitrariamente el DNA, sino slo las herramientas estuviesen disponibles, Stanley N.
exactamente en determinados pares de bases. Cohen y su colaboradora Annie C.Y. Chang, de la
Herbert W. Boyer (nacido en 1936, Fig. 3.24) Universidad de Stanford, con sus colegas de la veci
investig, en la Universidad de California en San na Universidad de San Francisco, Herbert W. Boyer
Francisco, la endonucleasa de restriccin EcoRI (Fig. 3.24) y Robert H. Helling, realizaron el primer
(denominada as por la cepa de E. coliRY13). sta experimento de la nueva ingeniera gentica. Los
cortaba el DNA solamente all donde se encontraba investigadores escogieron el pequeo plsmido
la combinacin de bases GMTTC, entre las bases G pSC 1O1 no transfectable (Fig. 3.29), conocido as

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El MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA

por las iniciales de Stanley Cohen, que est disponi


ble en las clulas en gran nmero. Lleva un gen, el
gen te, que hace a E. coli resistente al antibitico
tetraciclina. Se escogi el plsmido pSC 1O1 por
que contiene un nico orden de bases, que se sepa
ra por la endonucleasa de restriccin EcoRI entre G
y Aen la secuencia GAATIC. Si hubiera tenido ms
lugares de corte, el plsmido en forma de anillo no
se habra cortado, sino que se habra dividido en
muchos pedazos.

Fragmentacin con ' "'


endonucteasas
-::-~
..._
de restriccin
~
--::::.._
:::-----..
.._.....,,,___
--..---.....
............... .--..._."'-

Fragmento de ONA
con el gen buscado

Otros fragmentos de ONA

+-

Mezclar y unir con ligasas


CaCl2

Introduccin en bacterias

EcoRI.

En el ltimo paso, la transformacin, se traslad


este DNA recombinante a bacterias. Para ello se
aadi cloruro clcico (CaCJ 2) a la disolucin de bac
terias de E. co/lmanipuladas. Esta sal hace ms per
meables las paredes celulares al DNA (Fig. 3.30).
Con este proceso artificial, que no ocurre as! en la
naturaleza, los nuevos plsmidos se introdujeron en
las bacterias (vase tambin Fig. 3.23). Luego se
hizo la prueba decisiva: la disolucin bacteriana se
extendi sobre placas de cultivo que contenan tetra
ciclina y kanamicina.

...._.

--

ONA con el gen buscado

La capacidad de resistencia a los antibiticos no


se poda perder en modo alguno con el corte. Ms
tarde se quiso averiguar en qu clulas bacteria
nas se incorpora con xito el gen exgeno. EcoR1
viene - como su nombre indica- de Escherichia
coli. Mediante EcoRI, el DNA del plsmido en
forma de anillo se convierte en DNA lineal en for
ma de hilo con extremos pegajosos. Cohen y
Boyer tambin cortaron con EcoRl otro plsmido
de E. coli (pSC 102), que contiene un gen para
la resistencia al antibitico kanamicina (gen
ka) (Fig. 3.27). Igualmente, este plsmido tenla
slo un lugar de corte y el gen ka no se corta por
Los dos plsmidos cortados poseen los mismos restos
pegajosos, que se hablan cortado en los mismos luga
res -G/AATIC- . Por atraccin electrosttica entre
los lugares de corte se unieron los dos fragmentos suel
tos separados de DNA. Los cientficos obtuvieron el
pegamento, la DNA ligasa (Rg. 3.33), que mantiene
la mezcla y une con ella los dos puntos. Se crean nue
vos plsmidos recombinantes mayores.

--

Fig. 3.30 Principio de clona


cin de un gen de clulas
demamlfero.

(:?_~
) cultivo, formacin de colonias

~"

K ~=:. . $J )!
~

Transferencia sobre papel


de filtro, desglose de bacterias

El ennegrecimiento de una placa


fotogrfica muestra el RNAm
marcado radiactivamente
del gen buscado

'

~
r:*~
~'l
RNAmdelgenbuscado,

marcado raladillamerte

Hibridacin

.
.
.
L~ ~ ).

Identificacin

~.~.1-~1.?.n.~~~'-~-

DNA recombinantes. Se cre un clon, un grupo


gentico de criaturas vivas.
La mayora de las bacterias murieron, como era Tras este xito Cohen y sus colaboradores se atre
de esperar. Slo sobrevivieron unas pocas. Deb vieron con el siguiente experimento. Recombina
an poseer un plsmido creado artificialmente con ron segmentos de DNA de plsmidos de diferentes
la doble resistencia: se formaban en las bacte bacterias: de E. col/ el plsmido pSC 1O1 y de
ras enzimas desactivadoras de kanamicina y Staphylococcus aureus un plsmido resistente a la
tetraciclina. Las bacterias sobrevivientes prolife penicilina. All, el plsmido de S. aureus proporcio
raban y crecan en colonias celulares; aproxima- na cuatro puntos de corte para EcoRI, y por consi
damente 100 millones de descendientes forma guiente se descuartiza en cuatro partes. Slo un
dos de manera idntica, que llevaban los nuevos pedacito de DNA contiene, por lo tanto, el gen de

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lQut puede extraerse


de los genes?
"Los genes no se deben
comparar con los planos
de los ingenieros, ms bien
con recetas de un libro de
cocin a. Nos dicen qu ingre
dientes se Incorporan,
en qu cantdad y en qu
orden, pero no nos entregan ningn plan completo
y ex3cto de lo que sale de
ah."
lan Stewart, Ufe's Other
Secret, Nueva Yorl< 1998.

63

BIOTECNOLOGA

Cuadro 3.2 Vectores tiles,


medios de transporte para genes
El plsmido pBR322
El plsmido pBR322 de E. coll, muy popular
para los tcnicos en gentica, se desarroll
a finales de Jos aos 1970. La p significa pls
mido, BR se refiere a los cientficos en l
Involucrados: Bolvar y Rodrguez. El n
mero 322 diferencia el plsmido de otros
del mismo laboratorio, como pBR325,
pBR327, etc.

pBR322 contiene genes para las enzimas


de resistencia a antibiticos: Ja tetracicllna
y la ampicilina. Diferentes endonucleasas
de restriccin pueden cortar el plsmido en
lugares de corte especficos. Finalmente tam
bin se insertan all los fragmentos de DNA
cortados. Si se utiliza EcoRI no se corta nin
gn gen de resistencia a antibiticos; sin
embargo, esto sf sucede si se corta por ejem
plo con BamHI. Entonces se corta el gen de
resistencia a la tetraciclina y se Inserta un
gen exgeno en medio del gen te (!nsertion).
Las clulas son, pues, resistentes a la ampici
tina, pero no a la cetraciclina, y asf pueden
seleccionarse fcilmente.

EcoR 1 Hind 111


Scoll

Pstl

Sa/ I

Los mapas gentico y fsico de pBR322 mues


tran las posiciones de dos genes de resistencia
a la ampicilina (omp) y la tetracicllna (te), el
punto de partida de la replicacin (orl} y los
lugares de corte ms importantes de las endo
nucleasas de restriccin.

Las clulas que no han captado el vector son


sensibles a los dos antibiticos. Las clulas
que contienen pBR322 sin Insercin son,
en cambio, resistentes a ambos antibiticos.
El fago :\
El fago 1 (fago lambda) adora la alternancia:
puede destruir su husped o incorporar una

64

parte de l. En el primer caso, en la lisis se


generan rpidamente protenas y DNA vira
les, y se empaquetan en partculas de virus
que conducen a Ja destruccin de Ja clula
husped (ciclo ltico). En el segundo caso,
el ciclo lisognico inserta el DNA del virus
en el genoma de Ja clula husped. Su DNA
se replica durante generaciones, sin dai\ar
al husped.
Mediante determinados cambios ambienta
les el virus DNA durmiente puede activarse
de pronto. Se separa del genoma e inicia
el ciclo ltico. El fago 1 tiene 48 kb de
DNA, y una gran parte son importantes
para una infeccin con xito. Los genes
para el ciclo lisognico tambin pueden
provenir de DNA exgeno, ideal para
un vector.
Para la clonacin de DNA se desarrollan
fagos mutantes dirigidos. Su DNA puede
cortarse en dos lugares (en lugar de cinco)
mediante EcoRI. Con ello se originan tres
productos de corte, de los cuales se separa
el central.
En su lugar se introduce, mediante ligasas,
un segmento prueba de DNA largo (aproxi
madamente l Okb). B fago an es contagioso, pero slo puede producirse el ciclo ltico
y no el lisognico (o sea, no "espera dur
miendo"). fstas son propiedades muy desea
bles para un vector de clonacin. La ventaja
de los fagos A. es que los virus manipulados
pueden penetrar ms fcilmente que las
clulas bacterianas e Incorporar cortes de
DNA mayores.
Se han construdo tambin csmidos espe
ciales. Son hbridos del fago A. y de plsmi
dos. El nombre "csmido" proviene de las
secuencias de DNA, que se describi como
el gen cos del bacterifago A..
Estos cortes hacen posible que en el cs
mido se puedan incorporar genes mayo
res (hasta 45 kb). Los csmidos se empaquetan en fagos, con la ayuda de los cua
les incorporan los genes exgenos a las
bacterias.
Los csmidos originan el gen para la resisten
cia a la ampicilina; las bacterias se pueden
desplazar para sobreviVir en un cultivo a
pesar de aadir ampicilina y para multiplicar
un DNA exgeno.

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Elfago1.

El fago Mi3
El M 13 es un fago filamentoso. Parece completamente diferente al fago/.... Se trata de
un virus en forma de hilo (900 nm de longi
tud, con slo 9 nm de dimetro), con un
DNA en forma de anillo de una nica hebra
(tambin denominada hebra +)y una cubier
ta proteica de 271 Osubunidades proteicas
idnticas (vase Cap. 5).
El virus penetra en E. co14 curiosamente,
a travs de su "rgano sexual", el pilusdel
sexo, que posibilita el intercambio de DNA
entre bacterias. M13 es tan atractivo porque
con l se puede obtener el DNA clonado en
forma de una simple hebra. Las hebras sim
ples de los genes clonados se necesitan espe
cialmente para la secuenclacin del DNA
y la mucagnesis in vitro (Cap. 1O).

El fago M13 es un virus filamentoso, es decir,


alargado.

El M13 es un actor en la tcnica de visualizacin de fagos (Cap. 5). El DNA M13 no


se integra (como en el fago/...) en el genoma
bacteriano. No provoca tampoco la lisis de
las clulas. La bacteria crece y se divide, sin
embargo, ms lentamente que las clulas no
infectadas. Las clulas hijas liberan todava
fagos M13.
Por generacin se originan aproximadamente
mil nuevos fagos M13. Puesto que el hus
ped no muere, se pueden cultivar y cosechar
fcilmente en grandes cantidades.

fa MILAGRO DE LA INGE NIERA GENTICA


Fig. 3.31 Instalacin y
clonacin del ONAde la rana
africana en bacterias.

Gen para
la resistencia a la tetraciclina

!"Extremos pegajosos"
Gen para
la resistencia a la tetraclclina

---+
Fragmentar
con fcoRI
Cultivo de f. eoli con
resistencia a la tetraciclina (te)

te

CaCl2

''.~f!~

..,,,

~..,,

, ..1

!\iJ.U;.I

El clon seleccionado
de resistencia a la
tetraciclina
incorporado en E. coli

-Extremos pegajosos"

<~..;.~
,...C ':'I ~~
~..~~i'

Plsmido

~ '

Fragmentar
con fcoR I

Pl6smido hbrido

Rana africana

DNA enriquecido

resistencia a la pencilina. Las diferentes posibilida


des de combinacin eran, por consiguiente, mayo
res que en los primeros experimentos. La hora de la
verdad vino entonces con el cultivo de las bacterias
manpuladas en medios que contuvieran tetracic
na y pencilina.

rana no contiene nngn gen de resistencia a los


antibiticos, se identificaban mediante anlisis qu
mico de los cidos nucleicos.
El 27 de julio de 1973 fue definitivo: el DNA de
rana se "acepta" en las bacterias!

El nuevo plsrndo se amplia 1000 veces en las


El laboratorio de Cohen fue un grito de jbilo: uno 1000 divisiones celulares. De ellos se producan as
de estos plsmidos recombinados se fusiona en las copias idnticas: se clon el plsmido recombinan
clulas de E. col. Con ello se sembr por primera te rana-bacteria.
vez el material hereditario de manera diferente. La
"superacin de las barreras, que normalmente tste no era an un nuevo tipo, pues menos de una
separaban unas formas biolgicas de otras", como milsima del DNA de las bacterias proceda de la
Cohen haba anunciado prematuramente, no se rana. Por un lado, las bacterias manipuladas no ero
pudo lograr porque - como hoy sabemos- tambin aban segn el tipo de rana, como bromeaban los
pueden intercambiar material hereditario "de for investigadores, pero los primeros ingenieros genti
ma natural" de diferentes microorganismos y virus. cos haban conseguido algo mucho ms importan
Todas las infecciones virales son transferencia te: haban desarrollado un mtodo de Ingeniera
gentica universal, con el cual, por primera vez, se
de genes!
pudo producir en mayor cantidad y analizar el mate
Animados por estos xitos, se deban superar enton- rial hereditario completamente inaccesible de los
ces barreras ms altas: los lmites de tipo entre bac- seres vivos superiores: la clonacin del DNA era
terias y ranas, en concreto la rana africana con tcnicamente posible (Fig. 3.30).
garras (Xenopus /aevis) (Fig. 3.32).
3.13 Cmo se obtienen los genes
El DNA genmico se afsla de las clulas de rana afri
Desafortunadamente, el experimento con el DNA
cana y se corta con enzimas de restriccin del tipo
"desmenuzado" de rana no es tan fcil de aplicar a
EcoRI. Al mismo tiempo, el plsrnido bacteriano
la produccin de protenas de seres vivos superio
pSC 101 tambin se corta con EcoRI (Fig. 3.31 ).
res. El motivo de ello son los intrones, incorpora
dos
en la cadena de DNA con su informacin "non
El DNA de rana y el DNA de bacteria se unen con
sense"
(sin sentido}que no codifica protenas. No
gasas, se incorporan en las clulas de E. coli y prosera
apropiado
fragmentar el DNA de seres vivos
liferan. Las clulas, que contienen un nuevo plsmi
eucariotas
superiores
mediante endonucleasas de
do recombinante rana-bacteria, bsicamente con
restriccin
e
instalar
el
DNA en el plsmido. Por un
resistencia a la tetraciclina, puesto que el DNA de

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Fig. 3.32 Rana africana con


garras (Xenopus /oevis), un
nuevo animal de laboratorio
como lo fueron antes el ratn
y la rata, modesto y de larga
vida. Su nombre cientfico
("pie raro") viene de sus
garras negras. En California,
estos anfi bios extremadamente devoradores, unos
diez centlmetros ms grandes que los nativos, supusie
ron una plaga.

Fig. 3.33 ONA ligasa, el


"pegamento" para el ONA cor
tado, es una enzima depen
diente de ATP (vase Cap. 2).
la ligasa es una herramienta
elemental para la ingeniea
gen~tica. El cofactor ATP
(rojo) y un resto de lisina
(magenta) son esenciales.

65

BIOTECNOLOGA

hebra del DNA (Fig. 3.35). El macerial hereditario


del retrovirus no consta de DNA, sino de una molcula de RNA de una hebra sencilla. Si escos virus ata
can el DNA contenido en las clulas husped (va
se Cap. 5) se traduce con la cointroducida transcriptasa inversa el RNA de una hebra del virus en DNA
de doble hebra, y lo integra en el DNA del husped
(Fig. 3.23).

Flg. 3.34 Sntesis de la


proinsulna de ratas
mediante bacterias.

Los ingenieros genticos utilizan ahora la transcriptasa inversa para sintetizar, a partir de la hebra
simple de RNArn, una hebra de DNA. Este DNA,
que se crea copiando un RNA, se describe como
copy.DNA (cDNA) .
Conocido el orden de los aminocidos (secuencia)
de una protena y aunque no se pueda aislar el
correspondiente RNAm de las clulas, el gen
correspondiente se puede sintetzar por va qumica. As!, es posible producir un DNA que en realidad no se encuentra en la nacuraleza. Hoy se dispone de sintetizadores automticos de DNA
(Cuadro 3.5). En ellos se une un nucletido de partda en un fuerte material portador (como silicagel
o perlas de vidrio), y a continuacin se insertan
nucletidos en la secuencia deseada. En 1988 se
podan sintetizar diariamente fragmentos de DNA
de 30 bases de longitud; para ello, en 1979 se
requera un trabajo en equipo de medio ao. Hoy
se pueden sintetizar por completo y en pocas horas
"genes a medida".

Instalacin;
del gen de la
proinsulina

Entrada en las bacterias,


expresin gentica
Protena mezcla

Flg. 3.35 Abajo: transcripta


sa inversa. Su estructura en
forma de garra.
Ms abajo: en una molcula
de transcriptasa inversa se
unen dos actividades. Con
la actividad polimerasa se
origina una molcula hbrida
RNADNA, con ta nucleasa se
degrada el RNA en el extremo sobrante. La hebra senci
lla de DNA se completa luego
y forma la doble hebra.

1Tratamiento
+ con trlpsina

~"""'" .... ct ~

lado se podran clonar miles de fragmentos de DNA


exgeno, pero apenas se podra producir una pro
terna exgena funcional. En el mejor de los casos,
el producto final sera una protena con codos los
aminocidos de los exones, pero entre medio los
completamente irrelevantes "aminocidos extra"
de los incrones.
La salida para el ingeniero gentico no era utilizar el

DNA cargado del intrn de los seres vivos superiores, sino originar el RNArn maduro (mature) que se
libera de las instrucciones de consrruccin codifica
das de las protenas de intrones. Ahora el RNAm de
hebra sencilla no se coloca junto al DNA de doble
hebra del plsmido. Por suerte, se encontr (como
ya se mencion en la Seccin 3.3) una enzima de
retrovirus, la transcriptasa inversa, que puede
transcribir la hebra sencilla del RNA como doble

66

3.14 insulina humana


a partir de bacterias?
En julio de 1980, 17 voluncarios recibieron inyecciones de insulina en el Guy's Hospital de Londres
y apareci en los titulares de los peridicos. Qu
haba tan sensacional en ello? Cada da millones de
diabticos se trataban en todo el mundo con la hormona insulina (vase Cuadro 3.3). La insulina se
obtena del pncreas de toros y cerdos. La insulina
sustituida debe regular el azcar en sangre del diabtico y luchar contra las consecuencias serias de la
diabetes -una enfermedad que en los pases industriales ocupa el tercer lugar entre las causas de
muerte [vase Cuadro 3.4).
La diabeces de tipo 1se produce por la descruccin
autoinmunitaria de las clulas que forman insulina en el pncreas y empieza antes de los 20 aos
de vida. La diabetes de tipo 11 aparece a partir de
la mitad de la vida (90% de los diabticos), sobre
todo en personas obesas (Cap. 1O). Los 17 voluntarios antes mencionados fueron los primeros en la
historia de la medicina que se trataron con una

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EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA Flg. 3.36 Sntesis de insulina


en las clulas islotes del
pncreas.
Se representa un gen de insulina tpico de una clula de
un mamfero, con intrones,

secuencias codificadoras
(exones) y secuencias de
regulacin, que se utilizan
para la transcripcin. Brevemente, antes del inicio del
gen de la insulina (en la
regin que bordea el extremo
5'), se encuentran varios elementos de secuencia que son
decisivos para la produccin
de insulina. Diversas protenas de regulacin se unen a
estas secuencias y se activan.
En las clulas que no producen Insulina se bloquean los
fragmentos de DNA mediante
otras protenas.

..
Islote de langerhans
(clula productora de insulina)

Enhancer especfico
de las clulas Islotes

,(~

RNA-

(JS,.

t........................1
Protena activadora

AA ..

RNAm, Cap en el extremos

lntrn
RNAm maduro

AA ...
Polipptido preproinsullna
(110 aminocidos)
NH2

SH

SH
SH
Plegamiento de la protena,
separacin del fragmento final

l
24 aminocidos sirven como seal
para la transferencia afuera

.X
Separacin!
del fragmento central
por rotura proteoltica

Uniones mediante
puentes disulfuro

Poli pptido proinsulna


(86 aminocidos)

Protena insulina activa


(s1 aminocidos)
Cadena A
(21)

SH

Tambi~n la velocidad de la
sntesis de insulina puede
regularse incluso tras la traduccin en el ribosoma: la
preproinsulina (128 aminocidos) es ms larga que
la hormona activa. Enzimas
especiales fragmentan en
el extremo amino una corta
parte (24 aminocidos), que
sirve como secuencia seal
para atravesar la membrana
del retculo endoplasmtico.
A continuacin, la proinsulina creada de esta manera
se separa de ella liberando
la parte central de la cadena
polipeptdica (pptido C).
Las dos cadenas cortas A y B
forman la insulina terminada. Mediante puentes disulfuro entre cistenas se mantienen unidas.

Tras su sntesis, la cantidad


de protena activa se regula
frecuentemente en el cuerpo
por retroacoplamiento.

COOH
COOH

SH

La RNA polimerasa empieza


su trabajo de transcripcin
tras estas secuencias. Los
finales del RNAm transcrito
en eucariotas se modifican
con un s'-cap ("caperuza")
y una cola )'-poli(A). la
caperuza debe proteger de
la degradacin por enzimas
(fosfatasas y nucleasas)
y refuerza la traduccin.
La cola poli(A) no se codifica
en el DNA y estabiliza abiertamente el RNAm.

Cadena C
(35 aminocidos)

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67

BIOTECNOLOGA
Anticuerpo contra pronsuli na

Placa de plstico

~------....

3.15 Cmo se sintetiza la insulina en


humanos: desde la preproinsulina,
pasando por la proinsulina,
hasta la insulina activa

Colonia bacteriana Prolnsulina (antgeno)

La insulina es una pequea hormona que consta


de dos cadenas proteicas, de las cuales una tiene
21 aminocidos (cadena A} y la otra 30
(cadena B}. A partir de 1945 Fred Sanger {Cua
dro 3.4) investig, durante diez aos de largo y
duro trabajo en el stano del Instituto Bioqumico
en Cambridge (Inglaterra), la estructura primaria
de la Insulina.
El propsito del anlisis de la insulina se conside
r intrpido en su tiempo. La insulina cristalizada
de 120 toros sirvi a Sanger como materia prima.
Fred Sanger recibi el premio Nobel en 1957, slo
tres aos despus de haber descrifrado la secuen
cia de los 51 aminocidos de las dos cadenas de la
insulina.

l Disolucin con el detector del anticuerpo contra prolnsulna marcado


radiactivamente

Unin del anticuerpo detector


radiactivo y colocacin
de la placa de plstico sobre
la pelcula de rayos X

11'

Sandwich

Oscurecimiento de la pelcula
por el anticuerpo radiactivo
Identificacin de las colonias que unen proinsulina

Flg. 3-37 Cmo se encontra


ron las colonias bacterianas
que forman proinsulina con
la ayuda de anticuerpos en
el radioinmunoensayo.

hormona de mamfero que no proceda de los rga


nos de un mamfero, sino de bacterias. Con ello se
prob la primera sustancia en humanos producida
con la ayuda de la ingeniera gentica. Dos afies
ms tarde se autoriz oficialmente la aplicacin
mdica de la insulina producida por ingeniera
gentica.

Ambas cadenas se sintetizan primero como parte de


una cadena ms larga de 11O aminocidos en las
clulas B (clulas ~} de los islotes de Langerhans en
el pncreas. Esta forma larga es la preproinsulina
(Fig. 3.36). Al igual que para otras hormonas pept
dicas, estas protenas precursoras se fragmentan en
el retculo endoplasmtico. Sus primeros 24 amino
cidos sirven como seal para la membrana celular
para la secrecin de la insulina fuera de la clula. En
la salida a travs de la membrana se rompen estos
24 aminocidos mediante enzimas (peptidasas) y
permanecen en la clula. Los restantes 86 amino
cidos son la proinsulina: cadena B, pptido C y
cadena A.
Los trozos inicial y final de esta molcula (B y A)
interaccionan uno con otro y se enlazan mediante
dos uniones de puente disulfuro (5-S). Despus
se fragmenta la parte central de la proinsulina (cade
naco pptido e, con 35 aminocidos} por enzimas
localizadas en la membrana (proteasas) en el apara
to de Golgi de la clula.

La necesidad de insulina es extremadamente alta.

fig. 3.38 Rosalyn Yalow


(nacida en 1921) descubri
el radioinmunoensayo (RIA).
Recibi el Premio Nobel en
19n.

68

Un diabtico necesitaba para cubrir sus necesidades


anuales las glndulas pancreticas de aproximada
mente 50 cerdos. La compaa alemana Hoechst
procesaba diariamente once toneladas de pncreas
de cerdo, procedentes de ms de 100 000 anmales
del matadero.

La funcin de la cadena Cconsiste en alinear corree


tamente una tras otra las cadenas A y B. Sin este
correcto plegamiento en el espacio, Ja insulina no
sera completamente activa.

A partir del ao 2005 no se export en Alemania


ms insulina animal.

cin diaria" de insulina por los humanos es de apro


ximadamente 1,8 mg.

La insulina activa y el pptido c se guar-Oan en vesculas y se liberan juntos tras el estmulo. La "utiliza

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EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA -

Cuadro 3.3 Historia


de la biotecnologa:
la fabrlcacl6n de Insulina

se pmdujo el desarrollo propio de la "antigua


insulina en el mercado, con la autorizacin
de Canad. De ah en adelante Hoechst fue
la conductora de la investigacin en insulina

Hoechst continu como el principal proveedor y lanz al mercado en 1953 la "Long


insulin, que actuaba ms tiempo. Entonces,
Frederick Sanger consigui, tras 1Oaos

y todava conrrola, bajo el nuevo nombre de

de trabajo, determinar la estructura de la

SanofiAventis, junto con Eli Ully, Novo Nor


disk y Berlin Cheme, el mercado alemn.

Insulina (vase Cuadro 3.4).

Frederick
Bantlngy
Charles Best.

Osear Minkowski
(18581931) deseo
bri en 1889. en la
Clnica de Medicina
en Estrasburgo,
que los perros desarrollan diabetes
si se les extirpa el
pAncreas. tl con
venci a Hoechst
en 1923 para pro
duclr insulina.

En 1921, los canadienses Frederick G.


Bantlng (1891 l94 l , muerto en un acciden-

te de aviacin) y Charles H. Best (18991978) consiguieron en Toronto el aislamiento de la insulina de pncreas animal. Su trabao se consider tan trascendente que Banting consigui, slo dos al\os ms tarde, juntamente conJ.J.R. Macleod, el premio Nobel
de fisiologa o medicina.
En 1922 se prob clnicamente la hormona
en un paciente, con xito. La compal\fa ame
ricana Eli Ully & Co. (lndianpolls) fue la pri
mera en recibir una licencia exclusiva para un
al\o y produjo "lletin en gJ"andes cantidades.
tste fue el disparo de salida para el consorcio
que an hoy existe entre las mayores compaias productoras de insulina del mundo.
Apartir de ese ao, el comit de la Universidad de Toronto se dedic a intereses diferen
tes. En Alemania fueron los del mdico
Osear Minkowski.
Minkowski lo cuestion en 1923 en la fbri
ca de colorantes Hoechst. En la Hoechst ya
se haba recogido anteriormente material
glandular de los mataderos de Frankfurt
y Karlsruhe, y haban intentado obtener
insulina. A principios de noviembre de 1923

Muchas otras compaas probaron suerte,


pero fallaron en la materia prima: la recogida
de material de muchos pequeos mataderos
alemanes era ardua. Se pens en el enorme
matadero descrito por Upton Sinc!air en
Chicago! Los pncreas se deban importar.
En 1936, la compaa Hoechst fue la primera que consigui producir hormona cristali
zada concentrada. Las disoluciones produci
das se purificaron mejor de las protenas exgenas acompaantes y as fueron ms funcionales. Tambin se trabaj en las insulinas
depot En 1938 lleg al mercado la "insulina
depot Hoechst" con estabilizadores superfi
ciales. Sin embargo, durante la guerra se
mantuvo el suministro mediante un nuevo
procedimiento para asegurar la conservacin
de las glndulas. Sin embargo, en los prime
ros afios tras 1945 la produccin fue baja.

3.16 Los inicios de la ingeniera


gentica con proinsulina de rata
Para producir insulina por ingeniera gentica con
ayuda de clulas bacterianas, Walter Gilbert
(Fig. 3.39) y Lyclia Villa-Komaroff, de la Universi
dad de Harvard, observaron en 1977 un tumor de
clulas ~ en pncreas de rata, por lo tanto clulas
cancerosas animales. Cuando empezaron con la
investigacin, no estaba permitido experimentar
con genes humanos.
El RNAm de las clulas cancerosas fue transscrito
por los investigadores con transcriptasa inversa a
cDNA, se cort con endonucleasas de restriccin

Izquierda: propa
ganda de la insulina de Hoechst.

Entre 1963 y 1965 se logr, en diversos SJ'U


pos de trabajo, Ja sntesis total de la insulina,
y en 1969 Dorothy Crowfoot-Hodgkin utiliz el anlisis estructural por rayos Xpara clarificar su estructura espacial.

para conseguir extremos pegajosos, y los pedazos


de DNA se insertaron en plsmidos bacterianos
que portaban genes de resistencia a la penicilina y
a la tetraciclina (Fig. 3.34). El plsmldo cargado
con el DNA exgeno se incorpor entonces a las
clulas bacterianas. De cada una de estas clulas
se cultiv un clon y se coloc en placas con agar
como medio nutriente, conteniendo penicilina y
tetraciclina.
Producen estos clones proinsulina de rata? Para
probar esto, Gilbert y sus colaboradores cargaron
placas de plstico con anticuerpos contra proinsuli
na. Se generan en ratones anticuerpos contra la
proinsulina inyectndoles la protena. Los plsticos,

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Fig. 3.39 Walter Gilbert


(nacido en 1932), premio
Nobel de Qulmica en 1980.

69

BIOTECNOLOGA

como el poliestlrol (PS], unen ligeramente anticuerpos por absorcin. Los investigadores colocaron las
placas de PS cubiertas en contacto con las colonias
bacterianas. Mediante la adicin de lisozima (vase
Cap. 2) se Usaron las clulas y pudo analizarse su
contenido.

Nucle6tldo

_
Ollgonucletido sint~tlco

Cualquier procefna en las clulas que contenga la


secuencia aminocida de la proinsulina une anticuerpos de las placas de plstico (Fig. 3.37). Estos
anticuerpos se denominan tambin anticuerpos
capturadores (capture) .

Gen de la somatostatlna sint~tico

Extremo pegajoso,

"Extremo pegajoso

Gen de la ~-galactosldasa

Gen de la ~-galactosidasa

Ligasa

llgasa

Vector plsmido pBR321

Plsmldo recombinante pBR322-somatostatina


Plsmido
recombinante
pBR322
somatostatina
......................................

DNA de bacterias

~ Expresin

Fragmentos de la j3-galactosidasa

Somatostatina activa

70

Si no existe proinsulina no se une anticuerpo


detector. Estos anticuerpos detectores no unidos
se lavan en una fase de lavado y no hay ningn
sandwich ni radiactividad unida. El mtodo se
denomina radioinmunoensayo (RIA, vase
tambin Cap. 10).
RosaJyn YaJow (nacida en 1921) (Fig. 3.38) desarroll en 1959, en Nueva York, los primeros RIA
para el anlisis de insulina en sangre {premio Nobel
en 1977 con Roger Gu!llemin y Andrew V. Schally).
Puesto que los anticuerpos se marcan radiactivamente, se reconocen los lugares radiactivos relevantes en las placas de plstico si finalmente se coloca
la placa sobre una pelcula de rayos Xsensible a la
radiacin (autorradiografa).
Un clon dio una reaccin positiva: ennegreci la
pelcula. Tambin la dio cuando las placas de plstico se cargaban no con anticuerpos contra proinsulina sino con anticuerpos contra penicilinasa. Es
decir, el producto de sntesis, que se analiz con
ayuda del anticuerpo, era aparentemente una protena mezcla de proinsulina y penicilinasa. El
gen para la proinsulina se haba incorporado, pues,
en medio del gen de la penicilinasa (Fig. 3.37).

Parte de la ~-galactosldasa

Fig. 3.10 ta primera sntesis de un pptido huma


no, la hormona somatostatina, mediante
bacterias manipuladas genticamente.

Cmo se sabe si se ha unido la proinsulina y dnde? Se utiliza una disolucin marcada radiactlvamente de anticuerpos detectores (que tambin
reconocen y unen proinsulina) y se incuban en placas de PS. En caso positivo se forma una estructura
en sandwich: las placas unen el anticuerpo capturador, ste une la proinsulina, y sta une, en otro
Jugar de la molcula, el anticuerpo detector marcado radiactivamente.

Se aisl este clon. Como sus clulas crecan en un


medio de cultivo liquido, se pudo aislar la protena
mezcla de la disolucin de cultivo sin destruir las clulas. La fraccin de penicllinasa haba posibilitado que
la procefna mezcla completa atravesara la membrana
celular bacteriana para colocarse en el medio. La
secrecin de las protenas en el medio fue un gran

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EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENT ICA -

avance en comparacin con la proinsulina de rata,


que se sintetizaba en las clulas y permaneca en ellas.
La penicilinasa estaba conectada a su secuencia
seal, que posibilitaba la salida del "hilo proteico"
de la clula. En otro caso, la proinsulina se habra
quedado en la clula. El anlisis de la secuencia
nucleotdica del DNA exgeno, que estaba contenido en el plsmido bacteriano, mostr que en realidad solamente exista la secuencia exgena para la
proinsulina.

unida la doble hlice bacteriana. As!, el DNA se desnaturaliza y se separa en dos hebras simples, que
adems permanecen unidas a la nitrocelulosa.

Luego se aade la sonda de DNA. Es un oligonucle


tido de una hebra simple con al menos 20 nucletidos. La sonda de DNA se puede producir con el sin
tetizador automtico de DNA (vase Cuadro 3.5) si
se conoce la estructura (secuencia) del gen busca
do. La sonda se marca bien radiactivamente o (pro
gresivamente) con molculas fluorescentes. Tras la
hibridacin se lava la sonda marcada no unida. Slo
Para conseguir insulina pura a partir de una protefna
las secuencias de DNA buscadas han formado hbri
mezcla de proinsulina y penicilinasa, Gilbert retir,
dos con la sonda de DNA. Se coloca entonces una
con la ayuda de la enzima digestiva tripsina (Cap. 2
pelcula de rayos Xsobre el filtro de nitrocelulosa y
y Fig. 3.45), la parte ms grande de la seccin de penise observa su ennegrecimiento (autorradiograffa).
cilinasa y al mismo tiempo el segmento C central de
Las sondas hibridadas ennegrecen la pelfcula. En la
la proinsulina. Con ello obtuvo insulina activa. Los
incorporacin de las molculas de fluorescencia se
cientficos de Boston analizaron el producto y deteraplica luz de determinadas longitudes de onda y
minaron que influenciaba el metabolismo de los azentonces se iluminan. Si se ha encontrado un lugar
cares en los adipocitos como la insulina normal de
donde se ha producido una hibridacin, se vuelve
rata: las bacterias hablan producido una "autntica"
de nuevo a la placa de agary all se localiza fcilmen
insulina de rata.
te la colonia buscada.

3.17 Hibridacin de DNA:


cmo se encuentran bacterias
con sondas de DNA
En el caso de la proinsulina de rata se hall el clon
recombinante por anlisis del producto gentico
con anticuerpos mediante un radioinmunoensayo
sandwich. Frecuentemente se detectan bacterias
(tambin las no manipuladas, "naturales") con sondas de DNA.
Para ello se utiliza la hibridacin del DNA: la construccin de una doble hebra de DNA a partir de
hebras simples complementarias de diferentes orgenes, que forman una molcula hlbrida.
En una determinada secuencia de DNA bacteriano
se busca un oligonucletido complementario de
una hebra simple, una sonda de DNA (muestra
deDNA).
Las clulas crecen en colonias sobre un medio de
cultivo (Fig. 3.44). Estas colonias se marcan (principalmente con nmeros en el sentido de las agujas
del reloj sobre la tapa de la placa de Petri) y entonces se toma una huella con un filtro de nitrocelu
losa. Con ello se fija una copia imagen especular de
las colonias. Las membranas celulares se destruyen
con un detergente (un medio de lavado, como
Tween), que libera el contenido de la clula. El
DNA bacteriano se une fuertemente a la nitrocelu
losa. Ahora se aade sosa custica (NaOHJ que
destruye los puentes de hidrgeno que mantenlan

Con este procedimiento se encuentran las clulas


manipuladas genticamente, como tambin en el
diagnstico mdico se detectan las bacterias natura
les, por ejemplo la causante del clera (Cap. 6). Para
ello, sin embargo, se debe conocer una parte de la
secuencia de DNA que es tfpica del correspondiente causante.

3.18 Un pequeo desvo:


la somatostatina - La primera
protena humana de bacterias
Acontinuacin se gener en las clulas bacterianas
la somatostatina como la primera protena huma
na (Fig. 3.40). Para ello se desarrollaron tcnicas
decisivas para la posterior produccin de insulina.
La somatostatina consta solamente de 14 aminoci
dos y es una de las muchas hormonas que se produ
cenen el hipotlamo, una regin del cerebro medio.
Desde all llega hasta la glndula pituitaria con el flujo sanguneo, donde se ocupa de parar la liberacin
de insulina y del "apagado" de la hormona del ere
cimiento humana.
La somatostatina podra, por lo tanto, tener valor
teraputico. Por este motivo, en 1977 Herbert Boyer
y sus colaboradores escogieron esta sustancia para
sus investigaciones en el City of Hope National
Medica! Center y la Universidad de California, en
San Francisco. Hasta entonces no se haba consegui
do aislar el gen de la somatostatina de clulas huma
nas, pues su secuencia de bases se obtuvo del cono

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Fig. 3.11 En t975, con 27


aos, Robert Swanson
(1917-1999) conoci a
Herbert Boyer. Juntos establecieron la ingeniera gentica: "A// the academics 1
called said cammercia/ applicatian ofgene sp/icing was
ten years away. Herb didn't.

Fig. 3.12 Arriba: la primera


compaa de ingeniera
gentica no fue, como
a menudo se afirma, Genentech, sino la Cetus Corporatlon, que fundaron en i972,
en Berkeley, el mdico Peter
Farley, el bioqulmico Ronald
Cape y el ganador del
premio Nobel Oonald Glaser.
Fueron consultores el profesor del MIT Arnold Oemain
(a rriba a la izquierda y abajo
en una Imagen actual).
Joshua Lederberg y Stanley
Cohen de la Universidad
de Stanford.

Fig. 3.13 Somatostatina


humana.

71

BIOTECNOLOGA

Filtro de nitrocelulosa

cimlento del cdigo gentico a partir de la secuencia


conocida de los 14 aminocidos en el pptido.
As se construy en bloques, de tres bases cada uno,

un gen artificial {Fig. 3.40). Consta de 52 pares de


bases, de las cuales 14 x 3 =42 contenan el plan
de construccin codificado para la somatostatina.
Los diez pares de bases restantes deban garantizar
la expresin del gen {comprensin de las instrucciones de construccin) mediante el ribosoma, facilitar
el aislamiento de la hormona y finalmente liberar
"extremos pegajosos", que seran importantes para
incorporar fragmentos de DNA de doble hebra en
un plsmido (el vector). Como husped se eligi
Escherichia coll. Para llevar a cabo la transferencia
se combin el gen sinttico con un plsmido que llevaba la descripcin pBR322 (vase Cuadro 3.2), as
como un fragmento del opern lac (exhaustivamente en el Cap. 4).

lo
l

/
.. , ... .. ,__
. ...~. .....
.:~...' : _....._
~.

fll,...~:;,_;._~
' x ll .,_ x ,

' l-

lasclul~sbacterianas

se disuelven por el
detergente

Tratamiento DNA
de una sola hebra
con NaOH

Unin a la
nitrocelu losa

*"~'"')...,-{~

)~y~Y* ""'

. y~Y..J.r
'-.\
11"

)...1

Sondas marcadas
radiactivamente

'""' '""

}(JhfD
lavado para
eliminar las sondas
no unidas

Deteccin
f ig. 3.44 Deteccin de bacterias
con la ayuda de sondas de DNA
y la hibridacin del DNA.

72

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Para una expresin efectiva de un gen clonado se


requiere una seal clara que sea entendida por la
clula husped. Estos promotores vienen frecuentemente de un gen, que puede alcanzar un grado de
expresin elevado en este husped. Lo ms sencillo
es acoplar el DNA clonado al DNA de un gen propio de una clula y aprovechar al mismo tiempo sus
promotores buenos funcionales. El gen de la somatostatina se incorpor en el extremo propio del gen
bacteriano, en el cual se codifica la enzima ~-galac
tosidasa. La ~-galactosidasa es una enzima que se
encuentra en grandes cantidades y degrada lactosa.
Es una enzima inducible (Cap. 4).
Tras la transferencia con xito del plsmido en una
clula de E. co/ise produce, por lo tanto, una somatostatlna en forma de protena de fusin somatostatina-~-galactosidasa. En realidad es slo un "pptldo cola" de 14 aminocidos, ms corto, colgado a
la enzima galactosidasa.
Mediante tratamiento con el producto qumico
bromoclanuro {CNBr), la protena se rompe slo
en el lugar donde se encuentra el aminocido
metionina, dejando la somatostatina finalmente
separada de la ~-galactosidasa.
Debido a que el gen se haba producido sintticamente, era una menudencia incorporar la metionina requerida al inicio de la molcula de somatostatina. Para ello simplemente se instal el codn ATG
para la metionina. Este proceso previo no se pudo
evitar. Si no, Ja somatostatina, si se intenta producir
por s misma, se degrada muy rpido mediante enzimas (proteasas) bacterianas fragmentadoras de protenas. Esto es evidente gracias a que la "buena confidente" galactosidasa est "escondida" y no se

EL MILAGRO DE LA INGEN IERA GENTICA -

muestran apndices de la SOmatostatina, que en


otro caso se fragmentaran. Cientficamente se dice:
mediante su expresin como "protena de fusin
con accin propia de las bacterias", la somatostatina exgena de las bacterias se protege de la degra
dacin por las proteasas bacterianas.

Estructura primaria (secuencia) de la insulina humana

D
L

El resultado fue que la somatostatina sintetizada


en E. coli era completamente idntica a la natu
ral humana. Cada clula forma alrededor de
1O000 molculas de somatostatlna. Esto era una
hazaa extraordinaria, que anim a obtener otros
pptidos.
Despus de todo, el descubridor de la somatosta
tina animal, Roger Guillemin (nacido en 1924,
premio Nobel en 1977 con Andrew V. Schally y
Rosalyn Yalow, Fig. 3.38), tuvo que trabajar con
500 000 hipotlamos de cerebro de oveja para
obtener aproximadamente cinco miligramos de la
sustancia purificada de la hormona somatostatina
animal.
Solamente ocho litros de la suspensin de las bacte
rias E. coli recombinantes aportaban ahora la mis
ma cantidad de somatostatina humana.

3.19 Cmo se obtiene


enzimticamente insulina humana
a partir de insulina de cerdo
La insulina utilizada antes en la terapia de Ja dia

betes, como ya se ha comentado (vase tambin


Cuadro 3.3), se extraa del pncreas de toros o cer
dos. Su secuencia de aminocidos no coincide
completamente con la insulina humana: en el cer
do hay un aminocido distinto, en el toro hay tres.
La insulina se incorpor dos aos despus de su des-

cubrimiento al tratamiento de la diabetes. Por un


lado eliminaba el sndrome principal de la enferme
dad del azcar, pero tambin tena efectos secunda
rios indeseables. As, algunos diabticos desarrolla
ron alergia a la hormona animal, ya que era una pro
tefna exgena para el sistema inmunitario, contra la
que se podan formar anticuerpos.
La solucin sera convertir la insulina de cerdo, con

X.

....
______
-..-;: Ala ln::;;:: de cerdo

-'" @

Insulina humana

I
--------~
1

arginina. Al final de la cadena B en el cerdo se


encuentra, por suerte, la alanina, y "antes" una lisi
na ... Maravilloso!

fu:>.

~-

Fig. 3.45 Conversin enzi


mtica de la insulina de
cerdo a humana.

Asi pudo romperse la alanina final (Fig. 3.45). Pri

mero va todo "normal": la insulina de cerdo se tra


ta con tripsina. Al mismo tiempo se aade un ster
de treonina (ster terbutilo de treonina) y la reac
cin tiene lugar en un 55% de disolvente orgnico.
Entonces ocurre algo asombroso: la reaccin inver
sa de la enzima. Las proteasas pueden fraccionar
pptidos con la ayuda de agua, pero tambin los
pptidos (y steres de aminocidos) se pueden unir
en un entorno pobre en agua! Este proceso se deno
mina transpeptidizacin. El ster de treonina se
anexiona en el Jugar de rotura de la "alanina del
cerdo". Slo se debe hidrolizar mediante el aporte
de agua. Se origina as insulina activa por catlisis
enzimtica.

Insulina

Alanina

decerd~

~Jster

.1

de treonina

Este procedimiento dura aproximadamente seis


horas, pero requiere, como antes, grandes cantida
des de insulina de cerdo como materia prima.
Como era de esperar, en Hoechst se trabaj diaria
mente con casi una docena de toneladas de pn
creas de cerdo de ms de 100 000 anmales de
matadero.

la ayuda de enzimas, en insulina humana. Los


investigadores de Hoechst lnc. encontraron, a prin 3 .20 ifinalmente se consigui!
cipios de los aos 1980, una elegante solucin: el
La primera insulina humana
aminocido alanina final de la insulina de cerdo se
producida por ingeniera gentica
intercambia enzimtlcamente por una treonina. La
hidrolasa tripsina (Fig. 3.46), adems de hidrolizar En 1979 tambin se practic con xito la smtesis bac
en el estmago "todo lo fragmentable" para las pro teriana de insulina humana. Con un rendimiento de
tefnas (Cap. 2), tiene una propiedad asombrosa: insulina de 100 000 molculas por clula, la produc
hidrolizar protenas y pptidos exactamente de cin de insulina bacteriana fue an ms productiva que
modo especfico junto a los aminocidos lisina y la de somatostatina. Adems, la insulina posee una

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~:.~.

~humana
flg. 3.46 Estructuras
espaciales de la insulina
de cerdo y la humana, as
como de la tripsina (centro).

73

BIOTECNOLOGA

son un desafo para las clulas: es difcil producir una protena pequea que se pliegue
en una estructura estable. La clula solucio
na el problema formando cadenas pepdicas
ms largas, que se doblan en la forma adecuada y entonces se cona la parte sobrante
(en el caso de la insulina el pptido C) (va
se Fig. 3.36).

Cuadro 3.4 Insulina y diabetes


Ala

Thr

La insulina es una de las ms importantes


hormonas proteicas de los mamferos. Cuan
do Sanger determin en 1953 la estructura
de Ja insulina, mostr por primera vez que
una protena posee una secuencia de aminocidos precisa (estructura primaria) y que la
insulina consta solamente de Laminocidos,
que se enlazan mediante enlaces peptdicos
entre grupos Cl.amino y Cl.carboxilo.

La insulina humana (derecha. arriba) se diferencia de la de cerdo slo en un amino~cido: en la


posicin 30 hay una treonina (Thr) en tos huma
nos y una alanina (Ala) en los cerdos.
Las dos cadenas (A y B) (abajo) de la insulina
de cerdo se representan en verde y azul. Estn
enlazadas por tres puentes disulfuro (se ven
aqu en marrn).

Fred Sanger (naddo en 1918) aclar la estructura


de la insulina entre 1945 y 1955, en Cambridge,
y recibi por ello su primer premio Nobel. De vez
en cuando, desde su laboratoriostano vea
"dos formas, que pasaban hablando acaloradamente una con otra, una pareja bastante loca.
Tenan ta costumbre de gritar arriba y abajo, y
de ir subiendo de tono de manera terrorfica".
~stos eran Watson y Crick. Estaba claro que estos
dos "tocos" acabaran animando a Sanger con et
ONA. As, Sanger recibi su segundo premio
Nobel por la secuenciacin del DNA (Cap. 10).

La insulina se produce en el pncreas y lr3S


las comidas se libera a la sangre, cuando
aumenta la cantidad de glucosa. Esta seal
recorre el cuerpo: hacia el hgado, el msculo y Jos adipocitos. La insulina produce en
las clulas el aumento de glucosa en la san
grey la sntesis de sustancias de reserva,
como glucgeno, trtacilglicridos y prote
nas, para ser utilizadas. La insulina es una
molcula diminura. Las protenas pequeas

importancia mdica esencialmente mayor. Cmo se


consigui la sntesis?

Fig. 3.47 Paul Berg


(nacido en 1926) fue profe
sor de Stanford con slo
33 aos. Escribi la "carta
Berg", en la cual exiga una
moratoria para los experimentos peligrosos con DNA,
y organiz en 1975 el Con
greso de Asilomar, que apor
t las lneas maestras para
el trabajo con el DNA. Fue
premio Nobel de Qumica
en 1980 con Walter Gilbert
y Frederick Sanger.

74

La insulina consta, como se ha mencionado, de dos


cadenas peptfdicas de 21 y 30 aminocidos, respec
tivamente. Sin embargo, la informacin para el procesamiento necesario hasta la insulina activa no
est codificada en la secuencia del gen: el pptido
seal y la secuencia del pptido C deben separarse
y las cistenas deben enlazarse exactamente a los
puentes disulfuro. Esto slo puede consegurse en
los islotes de Langerhans del pncreas.

Las clulas de E. coliy las levaduras eucariticas no


poseen esta habildad (vase Seccin 3.25!). Era
cmodo, al menos para la insulina, que para su capa
cidad funcional no se tuviese que aadir ningn res
to de azcar (glicosilacin). El camino del aisla
miento del RNAm de la insulina no era fcil. Se deba
realizar una tarea como en la somatostatina. De
manera ms laboriosa, en un pequeo trabajo de tres
meses, los cientficos del City of Hope National Med
cal Center produjeron las dos cadenas a partir de los
correspondientes genes sintticos. Puesto que -gra

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Si hay una alteracin en la funcin de la


insulina (por enfermedad del pncreas, por
la edad o por un estilo de vida poco saludable), la cantidad de glucosa en sangre puede
aumentar peligrosamente. Valores de gluco
sa elevados producen deshidratacin, pues
el cuerpo intenta eliminar el exceso de glucosa con la orina. El valor de pH cambia
drsticamente en la sangre y las clulas se
ven afectadas.
La diabetes es Ja enfermedad nmero uno de
la civilizacin (Cap. 1O), con carcter de epidemia mundial. La diabetes tipo 1o mellitus
(en latn "azucarado con miel"), dependiente de insulina, causa la destruccin auroinmunJtarla de los islotes de Langerhans del
pncreas. Las personas que la padecen nece
sitan insulina para sobrevivir. Los principales
diabticos tienen una cantidad de insulina
en sangre normal o incluso elevada, pero no
responden bien a la hormona (diabetes tipo
11, detallada en el Cap. 1O).

cias a los 1Oafios de trabajo de Frederick Sanger- se


saba cmo formar insulina, se pudo elaborar la
secuencia gentica correspondiente sobre el papel.
Dieciocho fragmentos de varios nucletidos condu
jeron a los Investigadores al gen de la cadena ms
larga, y once fragmentos al gen de la cadena ms
corta. Siguieron separadas: por miedo a los posibles
riesgos, se generaron la cadena A y la cadena Ben
paralelo en diferentes microorganismos (Fig. 3.47).
La insulina activa no pudo originarse, pues, de nin
gn modo en una clula.
3.21 Asilomar:

lcul es el peligro
de la nueva ingeniera gentica?

Por qu ese miedo? El riesgo de los experimentos de ingeniera gentica se discuti acaloradamente por cientficos preocupados, como Paul
Berg (Fig. 3.47), David Baltimore, Maxine Singer
y Sydney Brenner, en 1975, en la conferencia de
Asilomar. Si se poda, por ejemplo, generar por
ingeniera gentica bacterias intestinales resisten
tes a antibiticos causantes de cncer, tendra

EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA -

Cuadro 3.5 Genes en un tubo


de ensayo: robots automticos
de sntesis de DNA

Control mediante microprocesadores

Actualmente hay mquinas que pueden sin


tetizar automticamente DNA de una nica
hebra y expresar secuencias rpidamente.
El procedimiento completo, o sea, incluyen
do la alineacin (secuencia) de las bases
individuales, se realiza mediante microprocesadores.

L Reactivos
y medios_J
de disolucin
.--

Al
colector

L_Nucletidos__J

r-~ifll!i~

Columna de sntesis

Bomba

Residuos
Bolitas de tierra
de diatomeas

~Gruposde proteccin

Ov-@v;"

~~@>

Sintetizador automtico de DNA.

En estas mquinas se da la secuencia deseada.


Los microprocesadores se ocupan de que se
bombeen los nudetidos, los reactivos y los
medios de disolucin para cada paso indivi
dual en la columna del sintetizador. La colum
na est llena de bolitas de tierra de diatomeas
(slica gel), aproximadamente con la granula
dn de la arena fina. Cada bolita proporciona
un soporte slido a una cadena de DNA.
Si se quiere sintetizar una determinada
secuencia, por ejemplo TACG, es decir, que
salga de una columna, se fija a las bolitas
el primer nucletido (en el ejemplo la base
timina)-e indudablemente con el denomi
nado extremo 3'. Los microprocesadores
permiten que se bombeen millones de mol
culas del siguiente nucletido (A) a travs de
la columna. El extremo 5' de Aest bloquea
do qumicamente, de modo que se une con

Principio de un
sintetizador
automtico de genes

la orientacin adecuada a T. El grupo de pro


teccin se separa entonces y empieza una
nueva ronda.
De esta manera se pueden sintetizar cadenas
cortas de hasta aproximadamente 50 nudetl
dos. Las cadenas de oligonucletldos acabadas
se separan de las bolitas y se eluyen de la
columna. El tiempo para la sntesis de cadenas
de nucletidos se acorta constantemente con
cada nuevo desarrollo automatizado. Se escri

como consecuencia una "epidemia de cncer


expandida por las bacterias"? Los cientficos pre
ocupados no sospechaban, sin embargo, que su
propio sentimiento de responsabilidad se conver
tira en imgenes de horror sobre Jos peligros
de la ingeniera gentica en los medios de comu
nicacin.
Qu pasara en caso de que las bacterias formasen
insulina activa y por descuido se colocasen en el
intestino de los humanos y sobreviviesen all? Podrf
an provocar una conmocin lnsulfnica mortal. En lo
sucesivo, el National lnstitute of Health (NIH) pro

be solamente la secuencia y se recoge el oligo-

nucletido acabado tras muy poco tiempo.


Los otlgonucletldos son Importantes en biotecnologa por tres motivos: pueden llegar
a formar Jos genes sintticos completos ms
grandes (como en la insulina y Ja somatostati
na), pueden utlllzarse como sondas de DNA
(Fig. 3.44) y se requleren como iniciador
(prfme~ para la reaccin en cadena de la poli
merasa (PCRJ y la secuenciacin (Cap. 10).

mulg directrices muy estrictas en materia de inge


niera gentica.
Se crearon cepas de seguridad "Usadas" de E. coli
(por ejemplo Kl2), que no podan existir fuera del
laboratorio, y se concibieron laboratorios de dife
rentes niveles de seguridad (PI hasta P3) para tra
bajos microbiolgicos.
Los genes creados artificialmente para las cadenas A
y Bde la insulina no tenan indudablemente la mis
ma secuencia que el fragmento gentico (que no se
conoca), pero representaban los polipptidos reales.

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Flg. 3.48 Microcolonia de


Escherichia coli. Detalle del
tema "Las bacterias tambin
envejecen", vase Cuadro en
elCap.10.

75

BIOTECNOLOGA

1
Extracto bacteriano
Insulina

Otras protenas

Anticuerpo monoclonal
contra la insulina

Columna empaquetada
antes de aplicar

per" para la galactosidasa respectiva. La Fig. 3.49


muestra cmo se pueden purificar despus las cadenas de insulina a partir de una mezcla de sustancias
diferentes con la ayuda de anticuerpos especiales
contra insulina, exclusivamente por cromatografa.
Esta separacin se basa en la afinidad de la insulina
por los especiales anticuerpos anti-insulina, y se
denomina cromatografa de afinidad.
Entonces se requiere slo un paso qumico: la
"sulfurlisis oxidativa". El oxgeno y un valor
de pH fuertemente bsico producen la oxidacin
de la cistefna, que lleva un grupo SH. Ahora son
altamente reactivas y se unen a grupos SH oxida
dos vecinos mediante un puente disulfuro
(unin SS) para formar insulina activa.
El rendimiento de la insulina activa se reduce, sin
embargo, por enlaces falsos de las cadenas A y B,
que se deben separar. Los puentes disulfuro son
decisivos para la estructura espacial y, por lo tanto,
para la actividad de la insulina.

La insulina debe contener tres puentes disulfuro:

Unin
de insulina

Otras protenas
se eluyen

Fig. 3.49 Purificacin de la


insulina mediante cromato
grafa de afinidad.

uno interior de la cadena A y dos entre las cadenas


A y B. La insulina recombinante microbiana
generada de esta manera condujo, en 1982, a una
revolucin en el mercado de la insulina.

Los cidos
especficos
diluyen la unin
insulina-anticuerpo

Eludo

lnsulna
purificada

Cada gen artificial, el de la cadena Ay el de la B, se


incorpor directamente (como en el caso de la soma
tostatina) detrs del gen promotor de la ~-galactosi
dasa y del gen de la galactosidasa en diferentes
plsmidos.
De forma intelgente se incorpor de nuevo, entre
los genes de la insulina y de la galactosidasa, un
"lugar de rotura", un codn para el aminocido
metionina [o sea ATG). Tras la produccin eficaz,
cada cadena A o B llevaba una metionina adicional
en el extremo Nterminal de las cadenas para la
rotura de la galactosidasa (Fig. 3.51 ).

Fig. 3.50 Estructura espacial


de la molcula de insulina con
puentes disulfuro (amarillo) y
hlices a de las cadenas A y B.

76

Tras la transferencia de dos cepas de E. col! diferen


tes y de la produccin eficaz de los polipptidos se
fragmentaron ambos pptidos con bromocianuro
otra vez exactamente en el "lugar que se deba rom-

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Por motivos de seguridal, al principio se produjeron separadamente las cadenas A y B. Los recelos
eran efectivamente grandes: la compaa Hoechst
solicit en 1984 el permiso para la construccin de
una instalacin de produccin de insulina humana
mediante ingeniera gentica. Tras interminables
idas y venidas, finalmente en 1998 - despus de
14 aos de burocracia y discusiones pblicasHoechst Marion Roussel puso en funcionamiento la
instalacin en Alemania.

Proinsulina humana a partir


de una nica cepa de E. coli

3.22

Otra mejora fue la produccin de proinsulina en


una sola cepa bacteriana. El gen completo de la
proinsulina (con el pptido e, sin embargo, sin la
secuencia para el pptido seal) se sintetiz primero artificialmente. Antes del codn para el primer
aminocido se aadi de nuevo un codn de metionina (ATG).
La ventaja era que solamente se utilizaba un nico
plsmido y una nica cepa de E. coli. En este caso se
controla el gen de la proinsulina con un potente promotor de la triptfano sintasa. Sobre el plsmido se
encontraron tambin, uno tras otro, el promotor de
la triptfano sintasa, el gen de la triptfano sintasa,
la secuencia ATG (que codifica metionina, como

El MILAGRO DE LA IN GENIERA GENTICA


Flg. 3.51 Expresin de insuli
na en dos cepas separadas
de Escherichia co/i:

Promotor
bacteriano

Gende la
cadena B
de insulina

Gen de la
cadena A
de insulina

Gen de
resistencia
a la ampicilina

Transformacin de E. coli

~.J

am
:
"# ">

!
Inyeccin a las clulas

~-6.'-~'!'."'''
Pptido

Tratamiento con CNBr

.
.....':: ........
,

~:5?.~! ..... ,.

,..

.-............
.. ........,

.. ..... .

Cadena A .._
...............
Purificacin de las cadenas A y B

~----- "'"'--0,..._
Insulina activa
NH 2
NH 2

______.

Plegamiento de las cadenas y


oxidacin de las cistenas con sulfuro

Se sintetizan qumicamente
dos oligonucletidos (cade
nas Ay B). Los fragmentos
de ONA codifican cada uno
una cadena de insulina. Cor
lados con endonudeasas de
restriccin, ambos fragmen
tos separados se incorporan
en plsmidos con DNA ligasa.
Antes del ONA de la insulina
se coloca el DNA de la 13
galactosidasa (13Gal) y un
promotor bacteriano de la
llGal. As se producen las
protenas de fusin en
E. coli, que se acumulan por
separado como j3-galactosi
dasa-cadena A de la insulina
y Pgalactosidasacadena B
de la Insulina en E. co/i. Tras
el cultivo de las clulas se
purifican ambas protenas de
fusin. El ONA que codifica la
insulina se produce de modo
que empieza con un codn
de metionina. El bromocianuro (CNBr) fragmenta la unin
peptdica en cada caso
detrs de la metionina en el
producto de fusin. As se
consiguen por separado las
cadenas de insulina natura
les. Debido a que 13-Gal an
contiene otros elementos
metionina, origina muchos
pptidos pequeos.
Genial: ilas cadenas de insu
lina no contienen metioninas
internas y permanecen intac
tas! Mediante sulfurlisis
oxidativa se activan final
mente, tras su purificacin,
las cistenas de las cadenas
A y 8, y ambas cadenas se
unen: se origina insulina
humana intacta.

:::I::::::::2~~~?-~. . . . . . Ju.~~!~.~i.~~!f~~~

lugar de partida) y la secuencia para la proinsulina


{BCA). Se forma, pues, una protena de fusin.
Tras la biosntesis se fragmenta con CNBr la metio
nina con la enzima triptfano sintasa y se consigue
la proinsulina. Los enlaces correctos de los restos de
cistena se consiguen mediante sulfurlisis. Con el
pptido C se logr una mejor unin de las cadenas A
y B. El pptido C se corta y extrae enzimticamente
mediante tripsina. Asf se consigue insulina activa,
plegada de la forma correcta, 100% idntica a la
insulina humanal Utilizando este mtodo, hoy pro
ducen insulina las compaas BerllnChemie, Sano
fiAventis (antes Hoechst) y Lilly.

DDDDDDDD~

COOH

3.23 Levaduras de coccin como


productoras de proinsulina
En lugar de bacterias procariotas, la compaa Novo
Nordisk escogi levaduras de coccin eucariotas.
Tambin utiliz un gen artificial, pero (despus de
un fracaso con el pptido C completo) con slo nue
ve nucletidos para el pptido C (o sea, nicamente
con tres aminocidos en el producto). Las proteasas
de levadura no pueden hidrolizar este pptido corto,
elegido de modo tan genial que lleva una sobre otra
las cadenas A y B a una proximidad favorable, que
puede enlazar puentes disulfuro incluso en la clula

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El CNBr fragmenta la unin


peptdica tras la metionina.

77

B IOTECNOLOGA

de levadura (y no al final del proceso). Este "gen


miniproinsulina" est controlado por el promotor
del gen de la triosa fosfato isomerasa (una enzima de
la gluclisis, Cap. 2) de las levaduras. El rasgo sobre
saliente es, sin embargo, que entre el promotor y el
gen (cadena B pptido C acortado cadena A) se
incorpora una secuencia sefial. El pptido seal
expulsa la miniproinsulina de la clula, donde el pp
tido seal se fragmenta con las proteasas de levad u
ra despus de salir.

Insulina humana

Por consiguiente, se cede al medio una proinsulina


correcta. El minipptido C se separa como en la con
versin de insulina de cerdo a insulina humana: en
un medio pobre en agua (orgnico) la tripsina se
separa en presencia del ster terbutlico de treonina
detrs de dos restos de lisina y alarga entonces, en
la reaccin inversa, la cadena B con un resto de
ster de treonina. As se consigue, tras la hidrlisis
enzimtica, insulina humana activa.

3.24 Variantes artificiales


de la insulina (mutena)
mediante ingeniera gentica
En todos estos procedimientos se consigue autn
tica insulina humana, pero ahora viene el siguien
te paso: variantes de insulina que no existen en la
naturaleza! Esto slo es posible con ingeniera
gentica.
Por un lado se demanda insulina rpida y eficaz, y
por otro se pide que sea eficaz durante 24 horas.

Insulina lispro

Insulina aspartat
Fig. 3.52 Variantes de insulina.

78

Si la insulina se inyecta bajo la piel (subcutnea), en


breve se producen altas concentraciones de insuli
na tanto en la disolucin inyectada como bajo la
piel. A altas concentraciones la molcula de insuli
na se une en hexmeros, es decir, seis molculas de
insulina se colocan juntas. Tras la inyeccin bajo la
piel, la insulina primero debe disociarse en dmeros
y monmeros antes de poder ser reabsorbida y lle
gar a sus clulas diana. Asf pues, la insulina inyecta
da subcutnea aumenta en la sangre demasiado len
tamente y permanece demasiado tiempo elevada de
manera no fisiolgica. Esto plantea un problema
para el diabtico.
Se busc intensamente elevar la disponibilidad rpi
da de la insulina: el intercambio recproco de proli
na y lisina en la posicin 28 y 29 condujo, en 1996,
al producto Humalog, la denominada insulina lis
pro (Fig. 3.52). El nombre deriva de "lisinaproli
na". Si, por el contrario, se intercambia slo lisina
por aspartato, se obtiene insulina aspar!.
Ambas variantes son rpidamente efectivas. Se
consiguen concentraciones de insulina en plasma a

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los 6090 minutos. La cada de la concentracin es


ms abrupta. Corresponde ms a la insulina natu
ral. El paciente, pues, ya no debe planificar sus
comidas con antelacin y puede abstenerse entre
comidas.
Se trabaja tambln intensamente en las lnsulinas de
eficacia retardada. La insulina glargina (HOE 901,
Lantu5) es un anlogo de la insulina humana pro
ducido por ingeniera gentica. Utiliza exactamen
te la poca solubilidad del hexmero de insulina, que
evita una insulina "rpida".
La cadena B se alarga en dos argininas en el extre
mo e-terminal y la asparagina de la posicin 21 de
la cadena Ase reemplaza por glicina (de ah "gl" en
el nombre). Con ello la insulina glargina es dificil
mente soluble en condiciones fisiolgicas (pH 7,4).
Tras la inyeccin de una disolucin clara, la insuli
na forma un asociado hexmero estable, que disuel
ve lentamente y libera la insulina durante 24 horas.
As es posible una variante one-shot, es decir, que
se puede inyectar directamente.
En todos los casos mencionados se sustituyeron los
aminocidos de forma selectiva por ingenieria gen
tica, y se produce insulina con Escherichia coli tste
es un ejemplo prctico de una ingeniera proteica
exitosa.
Desde el 15 de marzo de 2005 no se admite en Ale
mana ningn preparado de insulina de animales.

3.25 Los genes manipulados


de clulas de mamfero producen
protenas complejas modificadas
Despus de la euforia inicial con la insulina huma
na de bacterias, el ingeniero gentico esperaba
una amarga decepcin que se vea venir: no todas
las protenas se pueden producir mediante micro
bios manipulados! La insulina fue un golpe de
suerte: una pequea molcula y formada slo por
aminocidos.
La secuencia de aminocidos no es la nica caracte
rstica importante de una protena: las protenas ani
males y humanas construidas de forma complicada,
que adems de su parte proteica requieren modifi
caciones (restos de azcar, grupos fosfato o nucleotdicos) para su eficacia, no pueden producirse de
bacterias procariotas, o bien son inactivas. Una sali
da la ofrecieron primero las levaduras eucariotas,
cuyas clulas estn altamente organizadas en
estructura y metabolismo. Las levaduras tuvieron
xito en la produccin de proinsulina, de hirudina
(Cap. 9) y de las vacunas contra la hepatitis B
(Cap. 5), totalmente al contrario que E. coll

EL MILAGRO DE LA INGENIERA GENTICA -

Sin embargo, tambin las levaduras carecen de las


enzimas y los cofactores para las modilicaciones de
las protenas y las estructuras en los orgnulos celu
lares, en los cuales se pliegan las protenas sintetiza
das de nuevo a su estructura espacial y pueden for
mar puentes disulfuro para estabilizarse.
La nica solucin consista en manipular con inge
niera gentica las mismas clulas de mamferos
(Fig. 3.53) y cultivarlas en los biorreactores en grandes cantidades. Lo que pareca casi no tener esperanzas al principio, hoy ya se domina tcnicamente
bien.
Las manipulaciones genticas en clulas de mamfero requieren un gasto mucho ms alto en compa
racin con las manipulaciones con bacterias, pues
en ellas el DNA est organizado de modo ms complejo: empaquetado en cromosomas y encerrado en
un ncleo celular. El gen exgeno no debe incorporarse slo en el ncleo celular (transfeccin), sino
utilizarse en la clula para su expresin.

Primero se asla el gen del mamUero deseado y se


clona (duplica) en bacterias o con la ayuda de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
(Cap. 1O), para tener suficiente cantidad para trans
ferir. Para la transferencia a las clulas de mamferos
se requiere un sistema vector, un medio de transporte (vase Cuadro 3.2).
Los ms utilizados son los plsmidos bacterianos,
que deben llevar de manera ms conveniente y
sabia un gen de resistencia a antibiticos para seleccionar clulas bacterianas transformadas, en cuyo
plsmido primero proliferan y se optimizan. El pls
mido debe poseer un gen de resistencia contra un
anribitico txico para las clulas animales, o tambin un gen de una enzima, que compensa un
defecto del metabolismo de las clulas de mamfero
utilizadas. En ambos casos, en los medios selectivos
sobreviven slo las clulas que contienen el plsmi
do deseado.
Con las ya conocidas "enzimas tijeras y pegamen
to~, endonucleasas de restriccin y DNA ligasas, se
incorpora mediante ingeniera gentica el gen
humano en el plsmido. Es importante, para la pos
terior expresin en clulas de mamferos, la construccin al mismo tiempo de un promotor animal
directamente antes del gen.
El plsmido hbrido as originado se mezcla con bacterias, y todas las clulas que lo han tomado se reconocen fcilmente por su resistencia a un determina
do antibitico. Slo ellas crecen en una colonia de
clulas del mismo tipo, un don. Cada clula de esta
colonia contiene, pues, una copia del mismo pls

Flg. 3.53 Manipulacin genti


ca de las clulas de mamferos.
Primero se asla el gen exgeno,
clonado en clulas de bacterias
(o duplicado por PCR), y luego,
con endonucleasas de
restriccin y ligasas, se llega a
un sistema vector (representado
aqu: plsmidos bacterianos que
contienen un gen de resistencia
a determinados antibiticos).
Con ello el gen exgeno se pue
de interpretar (expresar) en las
clulas de mamferos; al mismo
tiempo, un promotor animal
(la secuencia de reconocimiento
para la unin de la RNA polime
rasa) se debe instalar directa
mente antes del gen exgeno.
El plsmido recombinante se
incorpora en bacterias. las
clulas que han introducido
con xito el plsmido son resis

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lentes a determinados antibi


ticos y as se pueden seleccio
nar. El plsmldo con el gen ex
geno se clona en las bacterias
y finalmente se asla. Se inte
gra entonces para obtenerse
en grandes cantidades.
la incorporacin en las clulas
de mamferos (transfectin)
tiene lugar mediante microin
yeccn directa en el ncleo
celular o por precipitacin
del plsmldo y recepcin direc
ta en la clula. Una pequea
parte del DNA Introducido se
estabiliza integrado en la informacin gentica de las clulas
de mamfero y se transforma en
protena exgena. Se cultivan
tipos celulares de mamferos
que preferentemente liberan
la protena exgena al medio
para una purificacin simple.

79

BIOTECNOLOGA

mido. El plsmido se duplica con ellas, clonado. Los


plsmidos se extraen luego fcilmente de las clulas
bacterianas.
La transfeccin, la incorporacin del plsmido
hbrido en las clulas de mamfero, se efecta
mediante diferentes mtodos:
La microinyeccin del vector se realiza bajo el
microscopio con una aguja de inyeccin muy fina,
cuya punta se conduce hasta el ncleo celular. El
plsmido se integra, en caso de xito, en el DNA
cromosmico de la clula de mamfero.

Fig. 3.54 Cultivo de clulas


de mamferos con medios
especiales.

Fig. 3.55 las clulas de


mamfferos crecen sobre
soportes en forma de esfera.

Fig. 3.56 Biorreactor para cul


tivos de clulas de mamferos.

'~ .

.. L;: \:.
-

Fig. 3.57 En este reactor


de cultivo de clulas de
mamferos las fibras huecas
abastecen de alimento a las
c lulas.

Posibles modificaciones de
una protena tras su sntesis
en clulas eucariotas
Grupos disulfuro entre
restos de cistena
Captura de azcares
(glicosilacin)
Bloqueo del extremo N
Farnesilacin o miristini
!acin para asociar las
protenas con la mem
brana
Hidrlisis especiales (frag
mentacin proteoltica)

80

En la precipitacin con fosfato de calcio se colo


ca el plsmido en un tampn fosfato. Se introducen
entonces iones de calcio, de manera que el fosfato
de calcio insoluble precipita y se incluye en medio
del plsmido. Este agregado se obtiene en el preci
pitado como granulado. Los iones de calcio aceleran
al mismo tiempo la adquisicin de los grnulos de
DNA mediante la membrana celular en las clulas
de mamfero. Una pequea parte del DNA tomado
se transporta a las clulas y se integra estable en el
DNA cromosmico.
En la electroporacin, las clulas de mamfero se
exponen a impulsos elctricos. Se originan en tiempos cortos grandes poros en las membranas celula
res, a travs de los cuales se pueden incorporar los
plsmidos.
Despus de la transfeccin se cultivan las clulas de
mamfero tratadas sobre un medio de seleccin pro
po (Fig. 3.54). Como ya se describi en la clonacin
de genes en E. col~ en la seleccin sobreviven slo
las clulas manipuladas genticamente. Son capa
ces de sobrevivir, por ejemplo, gracias a un gen de
resistencia situado en el plsmido resistente a anti
biticos txicos contra las clulas animales, o gra
cas al gen de una enzima que compensa un defec
to metablico de las clulas de mamfero utilizadas.
Los productos deseados se obtienen de dferentes
formas. Si los productos permanecen en la clula,
stas se cultivan y luego se abren, y su producto se
afsla y purifica (Fig. 3.49). Si por el contrario los pro
duetos se liberan (segregan) de las clulas (por ejem
plo anticuerpos), se pueden obtener del medio bom
beando, mientras que las clulas permanecen en el
reactor.
Las clulas manipuladas forman colonias. En los
medios de nutricin apropiados crecen y producen
la protena deseada en grandes cantidades.
Para su crecimiento en estado natural muchas clu
las de mamferos necesitan superficies slidas, de
cristal o plstico, sobre las cuales forman capas de

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clulas regulares (Fig. 3.55). Las principales clulas


de mamfero crecen hoy en da, sin embargo, como
clulas individuales en medios de cultivo lfquidos
en biorreactores.
Las clulas de mamfero se encierran tambin en
geles: las clulas de hibridoma que forman anticuer
pos (vase Cap. 5) crecen en cpsulas de alginato y
separan los anticuerpos a travs de las membrans
de la cpsula hacia el medio.
Los primeros productos de la ingeniera gentica,
una nueva etapa en el desarrollo de la biotecnolo
gfa, fueron productos farmacuticos producidos a
partir de clulas manipuladas.
Ya en 1940 tuvo lugar, con la produccin de la penicilina, un acontecimiento biotecnolgico.

EL MILAGRO

Bibliografa utilizada y aplicada


El libro crucial para proseguir, complementario al actual, "Biotechnologie
fr Einsteiger":
Brown TA (2002) Gentechnologie fr Einsteiger. 3. Auf\.
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.
Aunque tiene unos cuantos aos, an es la mejor introduccin a la
investigacin en ONA:
Watson JO, Gilman M, Witkowski J. Zoller M (1993) Rekombinierte ONA.
2. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.
Historia de la investigacin del ONA:
Judson HF (1980) Oer 8. Tag der Schopfung: Sternstunden der neuen
Biologie. Meyster, Wien und Mnchen.

Ocho preguntas
de autoevaluaci6n
1. En qu se diferencia el DNA
del RNA? Cite al menos tres
diferencias.

2. La secuencia de una hebra de


ONAes:
5'-AATICGTCGGTCAGCC-3'
cul es la secuencia comple
mentaria?

3. iHa descubierto usted una nueva


cepa bacteriana! Su DNA consta
de un 17% de adenina. cul es
la proporcin de guanina en el
genoma de la bacteria?

La clsica autobiografa de Jim Watson:


Watson JD (1969) Die Ooppel-Helix. RowohltVerlag, Hamburg.
El amplio y rico en ilustraciones compendio sobre ingeniera gentica y bio
tecnologa, que ahora es el trabajo estndar para farmacuticos en alemn:
Dingermann T (1999) Gentechnik Biotechnik. Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft, Stuttgart.

4. Un RNAm de eucariota tiene


la siguiente secuencia:
5'-AUGCCCCGAACCUCAAAGUGA-3'
cuntos codones contiene y
cuntos aminocidos codifica?
(Normalmente los RNAm son ms
largos. Recordar: no slo hay
codones codificadores para
protenas.)

Una buena introduccin americana, principalmente de ingeniera gentica,


con ejemplos de trabajos de biotecnologa en Estados Unidos:
Thiemann WJ, Palladino MA (2004) lntroduction to Biotechnology.
Pearson/Benjamin Cummings, San Francisco.
Bioqumica pura y muy bien ilustrada, "el Stryer":
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2007) Bioqumica 6 ed.
Editorial Revert, Barcelona.
A pesar de ser un libro antiguo, est lleno de conocimientos nuevos:
Berg P, Singer M (1993) Die Sprache der Gene. Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford.
Libro de microbiologa moderno, muy bien ilustrado:
McKane L, Kandel J (1996) Microbiology, essentials and applications.
2"d ed. McGrawHill lnc., New York.

Enlaces de Web

DE LA INGENIERA GENTICA -

s.

Qu tipo de protena se obten


dra si se cortara directamente
DNA del genoma humano con
endonucleasas de restriccin,
se incorporara en plsmidos
y se llevara a la expresin?
cmo se pueden evitar estos
resultados?

6. Qu hace que los plsmidos

Historia de la investigacin del DNA y animaciones estupendas que necesa


riamente se deben ver:

www.dnaftb.org/dnaftb
El Prof. Hans Traxel (Berna) explica en alemn las bases de la biologa
molecular:

http://ntbiouser.unibe.ch/trachseljteaching/Gentechnologie/Start.html
Fantstica animacin de DNA y cromosomas:

www.wehi.edu. au/education/wehitv/dna/wrapping.html
Contribuciones de David Goodsell al banco de datos de protenas en el
original:

www.scripps.edu/mb/goodsell/
El modelo de la insulina en imagen tridimensional, gira libremente:

bacterianos sean vectores ideales


para DNA exgeno? Cite al menos
otro vector sobre la base de un
virus.

7. por qu las sondas de DNA


deben ser siempre molculas
de una nica cadena?

8. por qu en la insulina humana


las cadenas A y B se expresaron
primero separadas en experimen
tos con E. co/i?

http://brodel.med.utoronto.ca/molecule/
El artculo clsico de Wilkins, Franklin, Avery, Watson y Crick en versin
original:

www.nature.com/nature/dna50/archive.html

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81

BIOTECNOLOGA BLANCA
Las clulas como fbricas de sntesis

4.1 El problema de la visin


general 84

4.5 Represin de catabolitos o cmo


se pesca una polimerasa 90

4.2 Adaptacin tctica: regulacin


por retroacoplamiento 86

4.6 iMohos en lugar de limones! 90

4.3 Adaptacin estratgica:


produccin de enzimas
a demanda 87

4.7 Lisina en abundancia:


la retroinhibicin de
la aspartato quinasa se burla
con mutantes 91

4.4 Un ordenador molecular


alostrico: la glutamina
sintetasa 89

4.8 L-glutamato: condimento


de sopa "levorrotatorio"
en exceso 93

4.9 lTienen que ser siempre


microbios? La sntesis qumica
contra la fermentacin 94
4.10 cido L-ascrbico,
la vitamina e 96

4.11 Aspartamo - La marcha triunfal


de un ster dipeptdico
dulce 99
4.12 Las clulas inmovilizadas
producen aminocidos
y cidos orgnicos 101
4.13 Mutaciones: un camino hacia
la programacin selectiva
de microbios 101
4.14 Penicillium notatum:
el hongo milagroso de
Alexander Fleming 1o6

4.15 Screening: biotecnlogos


a la caza de hongos 106
4.16 El men de los microbios
4.17 la biofbrica moderna

107

110

4.18 Calor, fro y sequedad nos


mantienen los microbios
en el cuello 110
4.19

Recuperacin del producto:

downstream processing 114


4.20 Estreptomicina y cefalosporina
- Los siguientes antibiticos
despus de la penicilina 115
4.21 La competencia con los
microbios: resistencias 115
4.22 Ciclosporina - Un producto
microbiano para
trasplantes 117
4.23 Hormonas esteroideas:
la cortisona y la pldora
anticonceptiva 119

Captulo 4
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BIOTECNOLOGA

4.1 El problema de la visin general


Cada clula es un sistema abierto al medio
ambiente. De ellas fluye sin cesar materia, que se
transforma extraordinariamente rpido, pero nun-

celular. Para ello utilizamos uno a dos kilogramos


de bacterias en el intestino, que nos ayudan en el
metabolismo y producen en parte importantes
vitaminas.

En una nica clula de un tamao medio de


encuentra en un equilibrio de flujos (steady 111000 a 1/100 mm se producen mltiples reacstate). El cofundador de la biologa terica, ciones del metabolismo al mismo tiempo, unas
Ludwig von Bertalanffy (1901-1972) (Fig. 4.1 ), tras otras o de manera simultnea. Estn exactalo expres as: "Si, por ejemplo, usted tiene un mente sintonizadas unas con otras. En reposo o
perro, puede creer que dentro de cinco aos an en actividad, hambre, crecimiento y reproduc
tendr el mismo perro, que siempre viene corrien- cin, calor o frfo, el estado de orden del roetabo
do cuando lo llama por su nombre; pero en reali- lismo debe defenderse y adaptarse con flexibili
dad del actual perro apenas quedar algo de l en dad a las condiciones cambiantes. En todos los
cuanto a sus componentes materiales. Despus de seres vivos existe, por lo tanto, una estrecha red
cinco aos, su perro tendr poco ms que una de mecanismos de regulacin y control, que se
molcula y muy pocas clulas de su vida anterior. basan en diferentes principios. En las clulas, las
Los resultados de esta renovacin constante de la enzimas desempean papeles decisivos en dicha
vida pueden cambiar por s mismos a sus conoc red. Como parte de una fbrica, las principales
enzimas de la "fbrica celular" a menudo se orgados humanos, y a su mujer".
nizan en cadenas ramificadas o ciclos (Figs. 4.4 y
Un individuo de 70 kg de peso toma, por ejemplo, 4.6). En el caso ms sencillo, las molculas de
en un dfa, aproximadamente 50 a 100 g de prote- enzima "cuelgan" libres en el plasma celular
na, 300 g de hidratos de carbono y 40 a 90 g de lfpi- (citoplasma).
dos, junto con agua, vitaminas, minerales y unos
500 litros de oxgeno. En su cuerpo se generan y En el plasma celular de una clula individual
degradan al mismo tiempo alrededor de 70 kg de la (Fig. 4.5) se encuentran entre 50 000 y 100 000
"moneda de intercambio de energa", la adenosina molculas de las enzimas ms importantes de la
trifosfato (ATP), y 2 kg de cido ctrico (vase ms degradacin de la glucosa (gluclisis) (vase Cap. 1).
adelante en este captulo), finalmente se libera ener- Sus pequeos sustratos y productos pueden cruzar
relativamente rpido el citoplasma en el camino des
ga y productos de residuos no utilizables.
de una enzima a las otras. Sin embargo, las distan
Slo con un aporte constante de materia se pue- cas mnimas para nuestros conceptos a menudo se
de mantener el equilibrio de flujos del sistema convierten en el autntico obstculo para las reaccio
nes del metabolismo. Los activadores o inhibidores
de las enzimas y las enzimas de otras rutas del metaMETABOLICPATHWAYS
bolismo podran afectar ligeramente las reacciones.

ca alcanza un equilibrio estacionario. La clula se

Fig. 4.1 El cofundador de la


biologa terica, Ludwig von
Bertalanffy (190M972),
provoc en parte drsticas
consecuencias prcticas
con su teora.

Fig. 4.2 La hemoglobina


(con oxgeno unido al complejo porfirina-hierro, del
grupo hemo) fue la primera
protena que mostr efectos
alostricos: la unin de
oxgeno cambia la forma de
la molcula. Se unen entonces ms fcilmente otros oxgenos.

Las enzimas altamente organizadas evitan estas


alteraciones y aumentan su efectividad unindose y
formando complejos. Estas estructuras, compuestas
generalmente de muchas enzimas diferentes, se
describen como sistemas multienzimticos.

Fig. 4.3 Jacques Monod


(1910-1976), ganador del
premio Nobel y director del
Instituto Pasteur desde 1971
hasta su muerte en 1976.
Monod escribi un tratado
filosfico muy discutido:
"Casualidad y necesidad".

El bioqumico alemn y ganador del premio Nobel


Feodor Lynen (1911-1979) investig durante
mucho tiempo el mecanismo de sntesis de los ci
dos grasos en la clula. Descubri que las enzimas
de la sntesis de los cidos grasos se unen en un gran
sistema multienzimtico. En las levaduras, este
complejo de la sintasa del cido graso consta de sie
te enzimas diferentes, firmemente acopladas unas
con otras. En estos sistemas multienzimticos, las
separaciones en el espacio son mnimas. El sustrato
pasa de mano en mano, permanece en un ciclo

Fig. 4.4 La red metablica de


la clula: desde los azcares
complejos (en azul, arriba a
la izquierda) se origina por
ejemplo glucosa, que se convierte en la gluclisis (vase
Cap. 1) (en azul, vertical en el
centro) y avanza al ciclo de
Krebs (azul, abajo en el centro). Se forman los aminocidos en las ramificaciones.

84

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

cerrado y abandona el sistema si est disponible


como producto final. As se evitan los efectos de
difusin.
Los primeros microscopios electrnicos mostraron
que una clula de un ser vivo superior (clula eucariota) no es un saco muy grande donde todos los
componentes estn movindose en confusin. Ms
bien recorren una red de canales y membranas. La
Figura 4.8 muestra cmo es el "relleno" de una
clula (aqu una clula eucariota).
La clula eucariota es como una fbrica separada
en diferentes espacios de funcin o compartimentos. Las paredes, tuberas y cables estn formadas de membranas (Fig. 4.5], que tambin
separan los departamentos especiales: el "centro
de control" en el ncleo celular, Ja "fuerza motriz"
en las mitocondrias, los ribosomas donde se produce protena ... As como en una fbrica las mquinas y los especialistas se encuentran slo en determinadas zonas de trabajo, en la clula las distintas
enzimas estn separadas en departamentos com
pletamente distintos. Aqu y all tienen lugar pro
cesos incompatibles, fuertemente separados unos
de otros, en diferentes espacios. Los cidos grasos,
por ejemplo, se forman en el plasma celular, y en
cambio - separados por membranas- se degradan
en las mitocondrias.

Adems, las membranas no slo son barreras para


las enzimas, sino que adems permiten acumular
sustratos en determinados lugares en cantidades
mayores, acoplar reacciones enzimticas, orde
narlas y organizarlas en el espacio. Cada vez
cobran ms fuerza las observaciones de que
muchas enzimas, por no decir todas las principa
les de la clula, no estn libres sino que estn dis
ponibles unidas a diferentes estructuras. Una par
te significativa de las enzimas "nada" en los lfpi
dos de las membranas.

Flg. 4.5 Las clulas eucario


tas (abalo. combinadas clu
las de plantas y animales),
las clulas procariotas
(arriba a la Izquierda) y los
virus (aqu un bacterifago).

La clula tiene dos posibilidades principales para

regular el metabolismo con la ayuda de las enzimas.


La adaptacin tctica empieza con las enzimas ya
existentes. Se activa o inhibe (inhibicin] mediante
cambios qumicos y fsicos. Todos estos procesos tie
nen en comn que reaccionan muy rpido y en condiciones cambiantes a corto plazo, a menudo en
fracciones de segundo.

Flg. 4.6 Una fascinante


impresin conjunta: el plano
de la ciudad de una clula.
Tomado de un conocido
mapa metablico (Metabolic
pathway) de Gerhard Michal
(Boehrlnger-Mannheim, aho
ra Roche) que muestra todas
las enzimas, sustratos,
cofactores, interconexiones
y retroacoplamientos conocidos.

Por el contrario, la adaptacin estratgica tiene


lugar como respuesta a las condiciones de vida gene
ralmente cambiantes, y se produce mediante el
"aparato gentico".

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85

BIOTECNOLOGA

El interruptor est bloqueado:


no hay sntesis de RNAm y enzimas
Para
J}galacto
sidasa

,
,,,,

Para
transferasa

Genes de las enzimas de degradacin de lactosa

Protena represora
alostrica activa

Fig. 4.7 Induccin de la enzi


ma degradadora de lactosa
en una clula de bacteria
mediante lactosa (o el autn
tico inductor alolactosa)
(derecha). El represor lac
se une a la regin operador
del DNA (abajo).

Para

Operador bloqueado
La RNA polimerasa
se lee (transcripcin)

...

~ga lactosidasa

El interruptor est libre:


isntesis de
RNAm y enzimas!

Sntesis de enzi~as
RNAm
Ribosoma

Fig. 4.8 Abajo: corte panor


mico de una clula eucario
ta. Izquierda: visin general
del corte.
Derecha: el panorama
empieza a ta izquierda en
la superficie de la clula y
transcurre a travs de una
parte del citoplasma. En el
retculo endoplasmtico se
muestran los ribosomas en
la sntesis de protenas. Lue
go sigue el aparato de Golgi
y una vescula. En el centro
se ve una mitocondria. A la
derecha el ncleo celular. Se
muestran todas las macro
molculas: las protenas en
azul, el DNAy el RNA en rojo
y naranja, los lfpidos en ama
rillo, los hidratos de carbono
(azcar) en verde. los ri bo
somas compuestos por RNA
y protenas se destacan en
magenta-rojo. En las clulas
reales se rellenan los espa
dos entre las macromolcu
las con pequeas molculas,
iones y agua.

86

4.2 Adaptacin tctica:


regulacin por retroacoplamiento
"Eureka! He descubierto el segundo secreto de la
vida ... ", grit el profesor Jacques Monod (191 O
1976) (Fig. 4.3) con entusiasmo tras dos dcadas
de trabajo de investigacin en el parisino Instituto
Pasteur. Desde mediados de los aos 1950, diferen
tes grupos de investigacin estudiaron el principio
de la regulacin metablica en los "animales
domsticos" del bioqumico: la bacteria intestinal

Permeasa

da de la enzima. Cmo poda, sin embargo, el


producto final de la cadena parar la primera enzima? Se propuso que poda haber una competencia por la enzima entre el sustrato y el producto
final, porque no haba ninguna similitud entre
ambos.

Eschericllta coll

Monod dedujo, tras otros experimentos, que el


"interruptor" debfa ser otro lugar de unin espacial
(estrico) separado del centro activo. El efecto conjunto se bautiz como alosterismo (del griego
al/os. otro, diferente).

Les interesaban especialmente las cadenas con


enzimas unidas unas tras otras, que hacen que el
sustrato de partida se convierta, pasando por
varias etapas, en los productos finales. Fue sor
prendente el control exacto de las cadenas enzi
mticas: si se aaden los productos finales sinte
tizados, se para enseguida su sntesis! Por el contrario, el producto final no paraba la cadena de
reaccin si se calentaba con cuidado la primera
enzima de la cadena. Segua mostrando actividad,
pero indudablemente se destrua el lugar de para

Este segundo centro alostrico influenciaba de alguna manera al centro activo. Justo en esa poca se
conoci el experimento del anlisis estructural por
rayos X de la hemoglobina realizado por John
Kendrew (nacido en 1917, premio Nobel en 1962
junto con Max Perutz). En un principio no parecieron estar muy interesados en la solucin del proble
ma del alosterismo, pero demostraron que la misma
molcula de hemoglobina cambiaba de forma si en
una de sus cuatro subunidades se una una molcu
la de oxgeno (Fig. 4.2).

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

tsa era Ja solucin! El plegamiento final para una


enzima alostrica se demostr oficialmente: la
unin de un inhibidor en el centro alostrico modi
fic Ja estructura espacial completa de la enzima, y

mo. Como describi Monod, pueden "interaccionar entre los enlaces sin afectar por otro lado la afi
nidad qumica (fuerza de unin), y con ello regular el flujo de materia y de energa a travs del sis-

con ello la forma del centro activo, de modo que no

tema conjunto, mientras necesitan muy poca ener-

se poda convertir ms el sustrato. En cambio, los


activadores deban, tras la unin al centro alostrico de la enzima, mover su centro activo a la estructura espacial ptima.

ga por s mismas". Monod y Jacob compartieron


el premio Nobel de medicina en el ao 1965 con
Andr Lwoff.

En realidad, todas las enzimas alostricas estn


formadas por varias subunidades. Cada una de
ellas ocupa principalmente un centro activo y uno
o ms centros alostricos. Las subunidades estn,
por Jo tanto, tan estrechamente unidas entre s
que la unin de una nica molcula nhibidora
alostrica no slo modifica la estructura espacial
y la actividad de la subunidad unida, sino que al
mismo tiempo tambin inhibe las otras subunidades. Esta cooperatividad de las subunidades
potencia la accin reguladora de los inhibidores (o
activadores).
Las enzimas reguladoras alostricas pueden
controlar mediante seales muy dbiles (inhibi
dores o activadores) y causar una fuerte accin en
la clula. Por eso estn colocadas en las posiciones clave del metabolismo. A menudo basta una
nica "enzima controladora" alostrica (pace
maker enzyme) al inicio de una ruta metablica
para regular la velocidad de la ruta entera. Un
ejemplo biotecnolgico importante es Ja sntesis
de glutamina en bacterias (Seccin 4.4). Si el producto final en una cadena metablica se acumula en gran cantidad, se produce un efecto de
retroacoplamiento negativo (negatfve feedback).

El producto final acta a distancia, se une aiostricamente a la enzima controladora de la cadena, lo


inhibe y detiene as el flujo conjunto. Los productos
intermedios y el producto final dejan de producirse.
El sustrato de partida puede utilizarse para otros
fines, hasta la degradacin del exceso mediante
transporte de salida o la utilizacin del producto
final.
No slo las enzimas sino tambin otras protenas
pueden regularse segn el principio del alosteris-

Veremos cmo el represor Jac y Ja sntesis de glucamina se regulan alostricamente.

,,

Lactosa

'\,-~UW~ '

poli me rasa
se bloquea

4.3 Adaptacin estratgica:


produccin de enzimas a demanda
Todas las clulas de un organismo llevan en su
ncleo, encerrada en el DNA, la misma composi
cin completa de informacin gentica. Una clula
nerviosa o intestinal altamente especializada no
necesita, sin embargo, el programa gentico conjunto. Al contrario, la unin de acetilcolina esterasa
mediante una clula intestinal no tendra sentido y
hasta podra ser mortal la formacin de enzimas de
la digestin en una clula nerviosa. Una parte de la
informacin almacenada es, por Jo tanto, sofocada
y bloqueada segn el tipo celular en diferente med
da. Sin embargo, debe haber tambin mecanismos
de control y de informacin que decidan qu informacin debe liberarse para ser leda en el momen
to justo y en el Jugar adecuado.
Jacques Monod y su colega Fran~ois Jacob (naci
do en J920) se dedicaron a esta cuestin desde prin
cipios de Jos aos 1950. Colocaron bacterias que
estaban en un medio con glucosa, su alimento preferido, en otro que slo contena azcar de la leche
(lactosa). Repentinamente se par su crecimiento.
No pudieron utilizar lactosa, pues sus clulas no
poseen suficiente enzima para ello. Tras casi 20
minutos de reposo empez un crecimiento tempes
tuoso. Entonces las bacterias haban conseguido,
obviamente, utilizar la lactosa mediante enzimas.
El fenmeno se conoca desde la dcada de 1930
como induccin. Ya entonces se sospech que
hay dos categoras de enzimas en Ja clula: enzi
mas constitutivas y enzimas inducibles. Las
constitutivas son las enzimas ms impor(antes del
metabolismo y pertenecen de manera ininterrumpida y continua a la clula, en su constitucin, y se

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t
Se inicia la sntesis
deRNAm

~-galactosidasa

Galactsldoacetll transferasa

Lactosa permeasa
Flg.1.9 Procesos en la Induccin de tac (arriba). la estructura molecular de tres enzimas degradadoras de lactosa
(abajo). la ~-galactosidasa
cataliza la degradacin de lactosa a los azcares sencillos
glucosa y galactosa. la galactsidoacetil transferasa es
una segunda enzima. la lacto
sa permeasa es una protena
en la membrana de la bacteria, que transporta lactosa al
Interior de la clula.

87

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.1 Historia de la


biotecnologa: Asperglllus nlgerEl final de un monopolio Italiano

Italia conquist muy rpido el monopolio de


la produccin, y los precios subieron. Cuando, sin embargo, durante ia Primera Guerra
Mundial, Italia descuid sus campos de ctri-

Cien al'los tras la fundacin de la compaa


en Inglaterra, John & E. Sturge (CiuicJ Ltd.,
con sede en York, combinaron en 1930 el
mtodo de Currie con la produccin qumi-

cos, el cido daico se encareci enorme-

ca convencional de citrato de calcio de

mente. Otros pases buscaron alternativas


ms favorables para su fabricacin.

zumo de limn. La compaia pas ms tar


de a pertenecer a Boehringer lngelheirn o
Haarmann & Relmer. Tras la Segunda Guerra Mundial se desarroll un proceso con
cultivo sumergido, que se poda controlar
mejor.

En 1917,J.N. Currie public en elJournal


of Biological Chemistry un articulo que en
unos pocos aiios iba a terminar con el monopolio italiano. Hablaba de una actividad
metablica especial del hongo Aspergllus
ntger. Cunie descubri que Aspergillus
ntgerproduce mucho ms cido ctrico que
otros hongos, y estudi por qu el rendimiento era superio~

La produccin comercial de cido ctrico


empez en l82 con John y Edward Sturge
en la zona del Selby ingls. Como sustancia
de partida se us el zumo de limn de los
ctricos italianos importados (limones y
limas}. De ellos se obtena citrato clcico,
que se puede transformar fcilmente en
cido ctrico.

La compaia Pfizer lnc., en Nueva York, aco


meti en 1923, con la ayuda de John Currle,
la primera produccin al por mayor de cido
ctrico, y siguieron otras instalaciones en Alemania, Checoslovaquia, Gran Br~tal'la
y Blgica.

El cultivo de Aspergillus ntgerse realizaba


en la superficie de un medio lquido. Glucosa, sacarosa y melaza de azcar de remolacha eran los sustratos.

forman en cantidad constante. Las enzimas indu


cibles se producen slo en caso de necesidad y su
aparicin (induccin) se debe a determinadas sus
tanelas. Sirven para adaptarse a condiciones
ambientales cambiantes. Su concentracin en la
clula flucta mucho.
Con la lactosa se indujo, en los experimentos
comentados, la formacin de tres enzimas
degradadoras de lactosa. Primero se descu
bri, en experimentos ingeniosos, que los genes
para las tres enzimas se encuentran uno junto a
otro en el DNA. Para formar las tres enzimas
degradadoras debe haber tambin tres genes
implicados.

Flg. 4.10 El citocromo P-450


(aqu de la bacteria que utlli
za alcanfor Pseudomonos
putido). la materia ex6gena
se desintoxica mediante
aporte de oxgeno. Algunos
sustratos, como el benzopire
no y la aflatoxina, sin embar
go, "intoxican. El epxido
que se muestra aqu (flecha)
de la aflatoxina (centro) se
une al ONA (abajo) y produce
mutaciones y cncer.

88

Cmo puede, sin embargo, una sencilla sustan


cia como la lactosa "encender" el complicado apa
rato gentico de las clulas bacterianas? En este
punto se cruzaron de pronto la clara idea de
Monod del alosterismo con el enigma sin resolver
de la induccin. La solucin era fcil y genial: el
inductor se deba asociar con una protena alos
trica, que bloquea el gen para enzimas degrada
doras de lactosa. La protena represora alostrica
se distorsiona entonces espacialmente, se inactiva y libera el DNA. La idea result ser satisfacto

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En los al'los 1960 y 1970 se intent --Oebido


a los bajos precios del aceite- sintetizar cido
ctrico con la ayuda de levaduras (cepas de
Candfda) a partir de fracciones de petrleo.
La Idea, junto con otra para la produccin de
una protena individual, se rechaz por razo
nes poco econmicas (vase tambin Cap. ,
Sfng/e Ce// Protein).

Hoy se siguen utilizando, junto con Aspergi1/us ntger, tambin ouas levaduras.
Aun con la mejor voluntad, actualmente no
se pueden obtener 800 000 toneladas de
cido cftrico de las frutas ctricas.
Para ello se deberan plantar limoneros en
toda Italia!

ria, a pesar de que Jacob y Monod no pudieron


demostrar experimentalmente ninguna protena
represora. En 1967, Walter Gilbert (vase Cap. 3)
y Benno Mller-Hill lograron aislar esta protena represora para las enzimas degradadoras de
lactosa en forma pura. Cada clula contiene slo
unas pocas molculas de represor. Con ello se con
firm experimentalmente la hiptesis de Jacob y
Monod, que dos af'ios antes haban recibido el premio Nobel.
As pues, la induccin mediante lactosa tiene lugar
en las bacterias tal como se representa en las Figuras 4.7 y 4.9.
El represor es un tetrmero de cuatro subunidades idnticas (Fig. 4.7). Se une fuertemente a una
regin especffica del DNA de la bacteria, el opera
dor, que est junto a esa regin que codifica para
tres enzimas que utilizan lactosa. Si la lactosa y los
azcares similares se unen a la protena represora,
el represor cambia su forma y entonces no se puede fijar ms tiempo al DNA. Ahora la RNA polime
rasa puede recorrer longitudinalmente el DNA y
transcribir el gen: se producen las tres enzimas. Si
apenas se produce lactosa, las enzimas degradadoras de lactosa no se utilizan ms, el represor lac asu-

BIOTECNOLOGA BLANCA -

me de nuevo su forma de partida y bloquea el DNA


otra vez.
Cerca de los genes que codifican las enzimas
degradadoras se encuentra, en una seccin de
DNA, el operador que sirve como interruptor para
el gen. El operador se bloquea mediante cuatro
subunidades de la protena represora, que encaja
exactamente en la seccin del DNA. El represor
"dobla" formalmente el DNA y origina un lazo.
Con ello la RNA polimerasa ya no puede iniciarse
mecansticamente, puesto que no pueden leerse
los tres genes para las enzimas degradadoras de
lactosa.

Otro mecanismo, la represin, impide que senci


llamente contine la produccin, a pesar de que se
encuentren montaas enormes de producto acaba
do "frente a la puerta".

En los seres vivos superiores, la induccin y la repre


sin se regulan de forma ms complicada que en las
bacterias, transcurren ms lentamente y de forma
menos drstica. Adems de los alimentos, pueden
trabajar de modo inducido tambin las hormonas
propias del cuerpo y las materias exgenas. Un
ejemplo en los humanos es la induccin de las
enzimas del hgado mediante frmacos (sistema
del citocromo P-450, Fig. 4.1O) y alcohol (alcohol y
acetaldehido deshidrogenasa, Cap. 1). Como es
Ahora aparece el inductor, en nuestro caso la lac sabido, la toma constante de somnferos produce la
tosa. El inductor se une a la protena represora alas prdida de sus efectos porque se induce el sistema
trica activa y mod ifca su estructura espacial. El del citocromo P-450. Los somnferos se degradan
sustrato a degradar no debe ser el mismo inductor. a molculas solubles en agua yse "descontaminan".
El inductor "autntico" es, aqu, la alolactosa, una Si ahora, sin embargo, el P-450 inducido entra en
modificacn que se forma al inicio de la induccin contacto con sustancias como el benzocxpireno
de la lactosa y que inactiva al represor. Ahora ya no (cigarrillos, carne asada a la parrilla), estos sustratos
encaja espacialmente con el operador y se repele se convierten en epxido cancergeno y tiene lugar
-por lo tanto el interruptor est libre! Se deshace el entonces una "intoxicacin". Lo mismo ocurre con
lazo del DNA.
las afia toxinas (Fig. 4.1 O). Est claro que la intoxi
cacin
es mayor cuanto ms fuerte sea la induccin
La RNA polimerasa ya puede ponerse en movimien
del
P-450
(por ejemplo por un abuso de pldoras).
to (Fig. 4.9). Transcribe la informacin de los tres
genes en un fragmento largo de RNAm, que ense El consumo constante de etanol induce, en cambio,
guida es ledo en los ribosomas. Ahora se producen la alcohol deshidrogenasa y la acetaldehido deshi
una tras otra las treS enzimas. Las enzimas acabadas drogenasa del hgado. Por un lado se tolera ms
de formar aceleran la captura y la utilizacin de lac alcohol, pero tambin se deben tener en considera
tosa, con lo cual entran a raudales ms molculas cin los daos al hgado.
inductoras en la clula. En un tiempo relativamen
te ms corto la clula bacteriana ha formado suf 4.4 Un ordenador molecular
ciente enzima para poder alimentarse de lactosa.
alostrico: la glutamina sintetasa
Si las bacterias en esta situacin se colocan en un
medio de glucosa pura, se desprende repentina
mente el inductor (o sea la lactosa o la alolactosa).
La protena represora inactivada por el inductor
cambia de nuevo a su forma activa, se une al ope
rador y detiene el trabajo de la RNA polimerasa y la
sntesis de las tres enzimas degradadoras de lacto
sa. Las enzimas de la utilizacin de lactosa an
existentes en la clula son entonces superfluas y
por lo tanto se degradan. Dicho brevemente: en la
induccin, el inductor solamente anula la inhibicin de la sntesis de enzimas. Se trata, pues, de un
control negativo.
Con la ayuda de este mecanismo, la clula puede
imponer completamente su rgimen de ahorro.
Sera pues tambin poco econmico si una bacteria
produjese constantemente diferentes enzimas para
todos los cambios en la vida.

Nuestro cuerpo debe poder reaccionar frente a di fe


rentes alimentos y tener preparadas las enzimas
correspondientes, de igual manera que las bacte
ras. Sin embargo, a menudo stas (a diferencia de
nosotros) no tienen eleccin: deben tomar alimento alli donde se encuentran, tomando lo que haya y
luego movilzando las enzimas correspondientes.
La glutamina sintetasa (GS) es una enzima clave
en el control del nitrgeno en la clula (Fig. 4.1 1).
La glutarnina es como aminocido no slo un componente de las protenas, sino que entrega tambin
tomos de nitrgeno a enzimas que sintetizan las
bases del DNA y los aminocidos. Por lo tanto, la GS
debe ser cuidadosamente controlada: debe conectarse en caso de necesidad de nitrgeno, de modo
que la clula no se muera de hambre, pero cuando
hay suficiente nitrgeno debe desconectarse para
evitar un "exceso de incorporacin".

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Glutamato
Amoniaco

Fosfato
inorgnico

o
Glutamlna
Fig. 4.11 la glutamina sinta
sa consta de doce subunida
des, cada una de ellas con
un centro activo, para produ
cir glutamlna. El glutamato y
el amoniaco se unen, y una
molcula de ATP libera la
energa. Todas las subunida
des se comunican entre s: si
la concentracin de los
correspondientes sustratos
aumenta, la actividad de las
enzimas en conjunto se blo
quea ms y ms. La clula
puede, sin embargo, relajar
se enseguida digamos "apre
tando el botn" de la enzima
conjunta, y entonces un gru
po tirosina en el centro acti
vo se une a una molcula de
AMP y con ello se bloquea
completamente su accin.

89

BIOTECNOLOGA

La GS acta como un ordenador molecular en el


cual se registra el contenido de molculas ricas en
nitrgeno: aminocidos como la glicina, la alanina,
la histidina y el triptfano, y nucletidos como el
monofosfato de adenosina {AMP) y el trifosfato de
citidina {CTP). Cuando hay demasiada cantidad de
ellos, la es "lo nota" e interrumpe ligeramente la
produccin. Pero si aumenta drsticamente el
nivel, los productos finales de la GS disminuyen
cada vez ms y ms. La enzima se detiene si hay
suficiente cantidad de todas estas sustancias.

Fig. 4.12 la proteina activadora de catabolitos (Catabo


lite Activator Protein, CAP)
"pesca"' entre los genes y
deja trabajar fcilmente a la
polimerasa. Si se une AM Pe
(prpura en la imagen superior), la CAP modifica su conformacin de forma insignificante y se une perfectamente al correspondiente operador del DNA-e indudable
mente en vecindad al gen de
una enzima de degradacin.
la CAP toma el DNA de modo
"brutal" y gira alrededor de
casi 90 grados (arriba). la
CAP "bloquea" entonces la
RNA polimerasa cerca del
DNA y estimula la transcripcin del gen cercano. la
RNA polimerasa (amarillo)
tiene una pequea subunidad que interacciona con la
CAP y el DNA (casi como una
caa de pescar). la imagen
muestra cmo se une la
mitad de la subunidad de la
polimerasa al DNA (rojo) y a
la CAP (azul). Las dos mitades de esta subunidad estn
conectadas por un brazo flexible. la RNA polimerasa
"pesca" activamente el gen
deseado.

Fig. 4.13 cido ctrico.

90

La glutamina sintetasa est sujeta, en conjunto, al


denominado "retroacoplamiento acumulativo":
los ocho productos finales pueden inhibir la enzima.
Cada inhibidor puede inhibir adicionalmente la
actividad enzimtica, incluso si estn unidos otros
inhibidores ya en cantidad saturante.
El aminocido glutamina es una importante fuente
de alimentacin en los cultivos celulares animales.
Se incorpora a las bebidas deportivas porque suministra energa. Junto con la arginina, es apreciada
por los culturistas.
\

4.5 Represin de catabolitos


o cmo se pesca una polimerasa
A las bacterias les gusta lo dulce, particularmente la
glucosa. La pueden digerir fcilmente y convertirla en
energa qumica. Si la glucosa se encuentra en exceso,
las bacterias suelen ignorar otras fuentes de carbono.

En E. co/thay un gran nmero de CAP que se fijan


a promotores para numerosas enzimas del metabolismo catablico. Mientras E. colicrece en glucosa,
la concentracin de AMPc permanece pequea y
casi no se producen las otras enzimas para la degradacin de azcar. Sintetizarlas sera un puro desperdicio! Pero si falla la glucosa y con ella aparecen
otros azcares, la clula cambia.
La denominada represin de catabolitos es positiva, por el contrario, para una induccin de lactosa
negativa: el complejo de AMPc y CAP incrementa
la lectura del DNA mediante Ja polimerasa aproximadamente 50 veces. En el opern lac, la expresin
gentica de las enzimas de degradacin y de rransporte de lactosa es entonces la ms potente, si la lactosa o la alolactosa han suprimido la inhibicin
mediante el represor lac y al mismo tiempo la unin
de la RNA polimerasa al complejo CAP-AMPc.

4.6 iMohos en lugar de limones!


Nada menos queJustus von Liebig {Cap. 1) fue
quien determin en 1838 la estructura del cido
ctrico. En 1893, el microbilogo C. Wehmer, en
la Universidad de Hannover, observ que los mohos
ceden citrato {estructura en Fig. 4.13) al medio
durante su crecimiento, a partir de azcar.
La necesidad de cido ctrico aument tras la Primera Guerra Mundial, y la produccin por microbios
fue una aU[ntica alternativa al complejo aislamiento a partir de frutas ctricas y al encarecimiento de la
importacin de fruta (Cuadro 4. 1). La bsqueda
intensiva de los mejores formadores de cido ctri
co condujo finalmente al moho con esporangios
negros en forma de regadera [Aspergillus nigerj,
tambin denominado moho negro del pan {Fig. 4.14
y Cap. 1, Fig. 1.9).

Las bacterias utilizan una modificacin poco comn del ATP para que la maquinaria celular sepa lo
que toma exactamente: si la cantidad de glucosa
cae, se activa una enzima unida a la membrana
como "sensor de glucosa", la adenilato ciclasa.
sta fragmenta dos restos de fosfato del ATP y comparte los extremos libres en una molcula pequea, el AMP cclico (AMPc). ElAMP cclico se des- Al principio se observ que el contenido en protocribe como segundo mensajero.
nes {H+) o el grado de acidez {valor de pH, el valor
negativo del logaritmo en base diez de la concentraLas reacciones que suministran energa a la clula
cin de protones) del medio de alimentacin tiene
se denominan reacciones catablicas o catabolisuna influencia decisiva sobre la productividad del
mo. Las contrarias, las reacciones que utilizan enerhongo. En medios muy cidos es preferible eliminar
ga, se llaman anabolismo.
el cido ctrico de Aspergillus niger. La disminucin
La protena activadora de catabolitos {Catabol- de iones de hierro libres en la disolucin de alimente Activator Protein, CAfl {Fig. 4.12) se activa tacin de 0,5 mg/L produjo un aumento de la promediante AMPc y estimula enzimas que degradan duccin posterior. Se asume que la enzima degradaalimentos distintos de la glucosa. Si se une al AMPc, dora de cido ctrico aconitasa se inhibe tanto por
la CAP cambia su configuracin de manera insigni- un pH bajo como por una deficiencia de hierro. No
ficante y se une perfectamente al operador del DNA se degrada con ello el cido ctrico formado. Se sos-en concreto cerca del gen de una enzima degrada- pecha tambin que, adems, con un contenido del
dora. La figura muestra cmo la RNA pomerasa medio bajo en protones se producen cambios en la
"pesca" activamente el gen deseado.
estructura de la membrana de las clulas de los

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

mohos, y por lo tanto puede salir ligeramente cido


ctrico fuera de la clula. Un valor de pH bajo inhi
be los grmenes indeseados remanentes en la fermentacin.

zar y, por lo tanto, deben tomar de los almentos:


fenilalanina (Phe), isoleucina (lle), triptfano (Trp),
metionina [Met), leucina (Leu), valina (Val), lisina
(Lys) y ueonna (Thr).

Aadiendo "sales alcalinas amarillas en sangre"


(hexacianoferrato de potasio) a la disolucin de
fermentacin se unen a los iones de hierro. Se forma el "azul de Berln" poco soluble. Azul es tambin el color de los residuos de las fbricas de ci
do ctrico.

Juntamente con la metionina y la treonina, la lisina


es muy importante porque estos aminocidos ape
nas se encuentran en los cereales (trigo, maz,
arroz). En el pienso, esto tiene un papel decisivo.

Los procedimientos industriales para obtener cido


ctrico acabaron, en los aos 1920, con Ja existencia de muchos campesinos italianos que vivan de
sus campos de limoneros-un erecto social negativo
de la biotecnologa (Cuadro 4.1 ).
Hoy se obtiene en las instalaciones de biorreactores con agitacin, o en torres de 100 a 500 m3 de
acero inoxidable, el 85% de la materia prima para
producir cido ctrico. Debe utilizarse acero inoxi
dable exento de corrosin, pues la disolucin es
fuertemente cida. El cido ctrico generado esqu
micamente idntico al producto natural de las fru.
tas ctricas. Se utiliza por su sabor afrutado en cara
melos, limonadas, mermeladas y otros alimentos.
El cido ctrico es tambin un posible sustituto
de los polifosfatos en detergentes y lavavajillas
(Fig. 4.15), que afectan al medio ambiente, porque
forman complejos con calcio y magnesio. Puesto
que se une a los metales pesados, el cido ctrico
tambin se utiliza en medicina de urgencias para
tratar intoxicaciones.

En el ao 2001 se produjeron 550 000 toneladas


de lisina, principalmente como aditivo para pen
so. La lisina se utiliza tambin en alimentacin
humana.

Fig. 4.14 El hongo que


suplant al lim6n,Aspergi
/tus niger. se reprodujo visiblemente sobre el pan del
autor. Cuidado: itambin
puede formar micotoxinas!

Como productor de lisina se encontr Corynebac


terium (Fig. 4.23). Tiene forma de mazo [en grie
go koryne, mazo). En primer lugar, se deba ven
cer una inhbicin enzimtica mediante retroaco
plamiento {inhibicin feedback) en la produc
cin del aminocido lisina por Corynebacterlum
glutamicum.
En las cepas salvajes se forma lisina a partir del oxal
acetato del ciclo de Krebs con piruvato por el aspar
tato mediante una cadena ramificada de reacciones
enzimticas, que empieza con la reaccin que ut
liza ATP de la enzima controladora alostrica
aspartato quinasa y se originan despus los ami
nocidos treonina y metionina (Fig. 4.21 ). Las reac
ciones enzimticas se controlan mediante inhib
cin feedback. la actividad de la aspartato quinasa
se inhbe por exceso de los productos lisina y treo

Fig. 4.15 El cido ctrico se


ai'ladi6 a los detergentes
porque forma un complejo
con el calcio y el magnesio,
y con ello ablanda el agua.
Los anlisis de sangre en el
laboratorio se realizan con
citrato para inhibir la
coagulacin.

En todo el mundo se generan cada ao unas 800 000


toneladas de cido ctrico casi exclusivamente de
microbios, con un valor en el mercado de cerca de
800 mlllones de dlares americanos. Las cepas de
produccin de Aspergll/us son, por cierto, el tesoro
mejor protegido de la industria de la fermentacin.
En otro lugar de este libro se habla detalladamente
de las posibilidades de las clulas como fbricas sin
tticas y de la gran diversidad de sustancias, de su
produccin y utilizacin (Cap. l y 2).

Fig. 4.16 lisina {Lys),


un aminocido esencial
decisivo para el pienso.

Sin embargo, directamente conectada con el ciclo


de Krebs (o del citrato) se encuentra la sntesis de
aminocidos.

4.7 Lisina en abundancia:


la retroinhibicin de la aspartato
quinasa se burla con mutantes
La lisina es uno de los ocho aminocidos esencia
les (Fig. 4.17 mapa, 4.16 y 4.18 estructuras) que
los humanos y muchos animales no pueden sinteti

Fig. 4.17 Mapa fino del meta


bolsmo de los aminocidos
(vase tambin Fig. 4-4).

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91

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.2 Opiniones de expertos:


La cistena de buena calidad no
se obtendr ms del cabello
Lo que hace tan nico al aminocido cistena
es el contenido de azufre del grupo sullhidrilo, que es qumicamente muy reactivo.

cerca de un cuacro por ciento. Sin embargo,


conseguir una mayor eficiencia y que no fue
ra contaminante fue ms de una vez el moti
vo ms importante para buscar un mtodo
de produccin alternativo.
Era an ms importante para muchas aplica
cienes la calidad del producto final en la indus
aia farmacutica Para la industria farmacuti
ca es decisivo poder descartar contaminacio
nes peligrosas -romo las causantes de la ence
falis espongifonne bovlna, el sndrome respi
ratorio agudo grave o la grtpe aViar. En los procedimientos biotecnolgicos se descartan tales
contaminaciones desde el comienzo.

As se pueden formar puentes dlsulfuro, que


contribuyen a la estabilidad de las protenas.
Con eUo se originan, por ejemplo, las hebras
fibrosas estables del cabello, la lana y las plumas, y tambin de las uas, las pezuas y los
cuernos. Su protena (queratina) contiene
cistena en gran cantidad.
Los panaderos aaden cistefna a los ingredientes bsicos del pan para descomponer el
gluten unido a la harina. La masa se amasa
entonces ms fcilmente. En la elevada reactividad de la cistefna y sus derivados, como
la acetilcistefna, se basan tambin los jarabes
contra la tos: la acetilcistefna rompe las
mucoprotenas de la mucosidad bronquial
y >licua la secrecin espesa.
En los salones de peluquera japoneses la cistena remplaza al cido tiogllcllco habitual
en Europa, que tiene un fuerte olor, cuando se
va a preparar el cabello para una permanente.
El diverso uso del aminocido que contiene
azufre genera, sin embargo, un problema con
trario. La cistefna fue hasta hace poco uno de
los pocos aminocidos que se obtena de
"materia prima" animal o humana - como por
ejemplo de cabello, plumas, cerdas o pezut'las.
En Asia hay una industria floreciente: en las
peluqueras de Chna, los recogedores profesionales barren cada ao diez mil toneladas de
cabello y lo llevan a los productores de cistef
na, que extraen los aminocidos deseados con
carbn activo y cido clorhdrico concentrado. Una tonelada de cabello produce aproxi
madamente 100 kilogramos de cistefna.
Si se considera que las industrias farmacutica, cosmtica y de alimentacin requieren
actualmente en todo el mundo hasta
4000 toneladas de cistefna por at'lo, se puede
calcular qu cantidad de materia prima se
necesita. Anualmente crece la demanda en

92

El autor en su peluquera china. Uno se siente


como un proveedor de materia prima si se sabe
para qu sirven los cabellos.

Los investigadores de la compaa Wacker


consiguieron, mediante una mutacin y una
seleccin dirigida, desconectar la protena
reguladora que normalmente obtura la produccin de cistena en E. coll Las bacterias
fabrican, por consiguiente, cistena "como
en una cinta transportadora", y pasan el
exceso de aminocidos producidos a travs
de su membrana celular al medio nutriente
del tanque de fermentacin de 50 000 lltros.
El mtodo tiene asimismo varias ventajas: el
90 por ciento de la cistefna bacteriana llega al
producto final. Con el procedimiento clsico
de la extraccin del cabello, solamente se
obtiene un 60 por ciento. Adems, para Ja
extraccin se requiere menos cido clorhldri
co: con los procedimientos biotecnolgicos se
necesita un kilogramo de cido clorhdrico
para obtener un kilogramo de cistena. Por el
contrario, si se obtiene cistena del cabello, se
requieren para ello 27 kilogramos de cdo
clorhidrlco. El bioprocedimiento eVita impu
rezas no deseadas: puesto que la materia de
partida utilizada es slo azcar, sales y ele
mentes traza, no puede aparecer, por ejem
ple, ningn causante de enfermedad en el
producto final. El producto consta al menos
de un 98,5 por ciento de cistefna pura y cum
ple todos los estndares exigidos por la indus

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Biorreactor

con la cepa
de E. coli
productora
de cistena.

tria alimentaria y farmacutica. Adems, la


cistena es ideal para alimentos vegetarianos,
por ejemplo si se quieren generar aromas de
carne artificiales. Concretamente se une cis
terna con azcar, por ejemplo ribosa, y se de
sarrolla as por calefaccin la materia aromtica, que sabe a carne. En este caso se produce
un aroma natural, que tambin aparece al
asar por ejemplo un pollo, en el cual la ciste
na existente reacciona de forma natural con
el azcar de la carne hasta una tpica molcula aromtica (reaccin de Maillard).
Tras el proceso se produjeron en el ao 2004
ms de 500 toneladas de cistena -ms de un
octavo de las necesidades mundiales. Las proporciones de crecimiento anuales para la cistena producida biotecnolgicamente se
encuentran por encima de un diez por ciento.

~
.'
El gatito Maojai est
entusiasmado con la
cisterna de la permanente y grita:
..isabroso!".

Sin embargo, los recogedores de cabello asi


tices no perdern su crabajo: todava se extraen
ms de mil toneladas de cistena por ao segn
el mtodo convencional -aunque se pospone
cada vez ms su participacin en el mercado.
Los compradores, que slo estn interesados
en los precios ms bajos y no en el origen de la
mercanca, son por ejemplo los fabricantes de
pienso para perros o gatos, que quieren "ennoblecer" sus productos con aromas de carne.
Los mercados de este tipo seguramente seguirn usando durante mucho tiempo los proced
mientos de produccin antiguos.

Et Dr. Christoph
Winterhalter es direc
tor del proyecto para
la cistena en
WACKER FINE
CHEMICALS

BIOTECNOLOGA BLANCA

nina. Ambas deben unirse a la aspartato quinasa


para bloquearla.

cianhdrico) como racemato (mezcla de o y L) (va


se seccin 4.9). En el ao 2001 se produjeron asr
370 000 toneladas de metionna.

Si se origina ms lisina y treonina de lo que requiere la clula, se inhibe la aspartato qui nasa; y al revs, Se sintetizan 30 000 toneladas al ao de L-treonisi hay deficiencia de Llsina y treonina, aumenta la na, principalmente a partir de mutantes de alto rensntesis. En la naturaleza esto es muy significativo, dimiento de Escherichia coli -a una concentracin
pero nosotros queremos tener lisina en exceso! de 80 g/L en slo 30 horas.
Hay pocas probabilidades de que las bacterias realicen una formacin de lisina notable, salvo que se El precio de los tres aminocidos flucta alrededor
burle su regulacin desconectando el mecanismo de 5000 dlares americanos por tonelada, de modo
que en conjunto proporcionan un volumen de merde control alostrico.
cado de ms de mil millones de dlares. Sobre todo
Se buscaron y encontraron dos mutantes defi- en China, el crecimiento de este campo es muy
cientes de la bacteria. Una es deficiente en treoni- dinmico. En un futuro se producirn cada vez ms
na (thr-) (Fig. 4.21 ). La enzima homoserina des- en plantas transgnicas (Cap. 7), con una gama
hidrogenasa se inactiva por una mutacin espon- de aminocidos {por ejemplo ms aminocidos
tnea. La treonina - una de las dos sustancias inhi- esenciales) en competencia con los producidos por
bdoras de la aspartato quinasa- ya no se forma. Si fermentacin.
ahora se colocan estas mutantes en un medio al que
se ha aadido treonina artificial, que garantiza el
buen crecimiento celular, pero con muy poca treo- 4.8 Lglutamato: condimento de
sopa "levorrotatorio" en exceso
nina, para cooperar en la desconexin de la aspartato quinasa (moraleja: "poco para vivir, demasiado
para morir"), entonces la produccin de lisina fun- Umami es el quinto sabor que se puede nombrar,
junto a los cuatro "de occidente" (amargo, dulce,
ciona a toda mquina!
cido y salado). Puede describirse como un "conEn la otra mutante se cambia el propio gen de la dimento" o "sabor fuerte a carne". Procede del
aspartato quinasa. La enzima, ligeramente modifi- Lejano Oriente y era desconocido en Europa Cen
cada en su estructura, no se deja ya inhibir por la lisi- tral. La cocina mediterrnea utiliza en sus ingredientes, sin embargo, una cantidad aceptable de
na -incluso con un enorme exceso.
umami.
La produccin de lisina es un buen ejemplo de
proceso industrial que fue posible gracias al cono- Tres sustancias diferentes confieren el sabor umacimiento de las reacciones enzimticas y una mf. glutamato monosdico (MSG), inosinato disseleccin racional de mutantes. Tanto las mutan- dico (DSI) y guanilato disdico (DSG), pero el glutes de Corynebacterium glutamlcum como las de tamato desempea un papel decisivo.
Brevibacterium flavum convierten en lisina ms
de un tercio del azcar aportado al medio, y La sustancia que da sabor umamlen el Konbu, el alga
logran con ello concentraciones de 120 gramos marina del Pacfico Laminariajaponica, la Identific
de lisina por cada litro de medio en 60 horas en en 1908 el japons Kikunae Ikeda (1864-1936)
(Fig. 4.20) como glutamato. La sal del aminocido
biorreactores de 500 ml.
cido L-glutmico (L-glutamato) (Fig. 4.19) potencia
Hoy se investiga para la ingeniera metablica el esencialmente el gusto de sopas y salsas. Nuestro
desarrollo de cepas con la ayuda de la ingeniera cuerpo dispone de receptores de glutamato especia
gentica. El grupo de investigacin de Alfred les para el L-glutarnato, pero no para el Dglutamato
Phler, en la Universidad de Bielefeld, y los gran- (Fig. 4.26).
des productores de aminocidos, estn descifrando
las 3,3 megabases del gran genoma de Corynebac- El L-glutamato se obtuvo en la dcada de 1920, y
an hoy se obtiene en parte, del trigo (Cap. 1). La
terium glutamicum (Fig. 4.23).
compaa lfder fue Ajinomoto Co. (en japons AjiLa tambin esencial metionina tiene una posicin no-moto, esencia del gusto) (Fig. 4.20). La necesiespecial entre los aminocidos, pues la o-metion- dad de glutamato aument enormemente tras Ja
na puede convertirse en L-metionina en el cuerpo. Segunda Guerra Mundial con la aparicin de comiEs posible, por lo tanto, producir metionina pura das preparadas, salsas en polvo y mezclas de condiqumicamente (de acrolefna, metanotiol y cido mentos. A principios de los aos 1950, el japons

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Ag. t.18 Formas estructurales


de los ocho aminocidos esen
ciales (vase tambin pag. 94).

fenilalanina (Phe}

lsoleucina (lle}

Triptfano (Trp)

Metionina (Met}

Leuci na (Leu)

93

BIOTECNOLOGA
Fig. 4.18 (Continuacin)

Valina (Va0

Lisina (Lys)

Treonina (Thr)

Los ocho aminocidos


esenciales
Phe lle Trp Met leu Val lys Thr

Kinoshita encontr unas bacterias capaces de acu


mular glutamato si crecan en presencia de gluco
sa. La bacteria - la conocemos ya como productora
de lisina- finalmente se llam, tras largas discusio
nes, Corynebacterium glutamtcum. Tambin se
encontraron otros microorganismos productores
de glutamato, especialmente de los gneros Cory
nebacterum, Brevibacterium, Arthrobacter y
Microbacterum

Cunto glutamato se tolera en las comidas? Se dice


en Asia que los malos cocineros compensan su defi
ciencia en el arte con glutamato. Nuevos estudios
La produccin de glutamato por microorganismos (doble ciegos) sobre el glutamatoy el "sndrome del
excedi, sobre todo en la bioindustria japonesa y restaurante chino" (a menudo los no asiticos prechina, los 1,5 millones de toneladas y varios miles sentan alergias fuertes tras degustar la cocina china)
de millones de dlares por ao.
indicaron, sin embargo, tambin un componente
psicolgico.
El glutamato es un buen ejemplo de cmo cam
bian los conocimientos bsicos de las reacciones Existe otro aminocido que cada vez interesa ms a
enzimticas del metabolismo con las tecnologas la industria farmacutica, cosmtica y alimentaria.
de produccin: el Lglutamato proviene, como Mundialmente se requieren cada ao hasta 4000
casi todos los 20 aminocidos que se necesitan toneladas de Lcistena (Cuadro 4.2). Se obtena del
para la sntesis de protemas, de precursores de la pelo, pero la compaa alemana WackerChemie la
degradacin de glucosa (gluclisis) y del ciclo de produce ya por biotecnologa con E. coll Mediante
Krebs.
mutacin dirigida y seleccin se desconecta la prote
na
reguladora, que obtura normalmente la producEn Corynebacterium glutamicum, por causas
cin
de cistena en E. coli. Las bacterias fabrican
genticas, la oxoglutarato deshidrogenasa en el
entonces
cistena "como en una cinta transportado
ciclo de Krebs presenta una actividad sumamen
ra"
y
transfieren
las cantidades producidas de ami
te baja. Esta enzima es la encargada de una pos
nocidos,
demasiado
altas, a travs de su membrana
terior transformacin de 2oxoglutarato en el
celular
hacia
la
disolucin
de nutrientes de los tan
ciclo de Krebs. Con ello se "obtura" el 2oxoglu
ques
de
fermentacin
de
50
000 litros.
tarato. Para que no se acumule demasiado se uti
liza otra enzima, que est disponible con una ele
vada actividad en la clula como "salida" del ciclo
de Krebs, la glutamato deshidrogenasa. El 2-oxo
glutarato se convierte en Lglutamato al incorpo
rar iones amonio (NHd .
Para formar glutamato, al proceso se le deben pro
porcionar suficientes iones amonio para la conver
sin del 2-oxoglutarato. Esto ocurre mediante un
"borboteo" de amoniaco gaseoso (NH 3), que en
agua se protona al ion NH4 +.

Fig. 4.19 Glutamato.

Fig. 4.20 Kikunae lkeda


(18641936) y los primeros
productos de glutamato
de Ajinomoto Co.

94

tiene slo cantidades mnimas de biotina, por un


lado an es posible el crecimiento celular, pero las
paredes celulares se permeabilizan para el glutamato. Otras posibilidades para la liberacin de gluta
mato son pequeos aportes de penicilina (vase ms
abajo) o el uso de detergentes.

Cmo se logra la sobreproduccin de glutamato en


la clula en el lquido de cultivo? Destruir las clu
las y aislar el glutamato de los miles de componen
tes celulares hace el proceso poco rentable. Se debe,
pues, forzar a las clulas vivas para que cedan glu
tamato al medio.
La cepa de Corynebactertum mostr afortunada
mente una rareza importante: no puede generar el
importante cofactor biotina (una vitamina) para la
formacin de la membrana celular y, por lo tanto,
depende del suministro de biotina en el medio de
alimentacin. Si el medio (por ejemplo melaza) con

4.9 Hienen que ser siempre


microbios? La sntesis qumica
contra la fermentacin
Por qu se sintetiza L-glutamato y Llisina en
microorganismos? No se puede producir de una
forma igual de econmica por purificacin qumica?
En realidad, en Japn se explot primero la sntesis
qumica de glutamato a partir de acrilonitrilo con la
ayuda de catalizadores de cobaltocarbonilo y Ja
denominada smtesis de Strecker. La lisina se produce qumicamente a partir de aminocaprolactama.
Los productos eran una mezcla (racmica) de dos
molculas imgenes especulares de glutamato o de
lisina, igual que nuestra mano derecha e izquierda
tienen la misma estructura como imgenes especulares (Fig. 4.26).

Las dos imgenes especulares del glutamato se diferencian por anlisis de su desviacin ptica (hacia la
derecha o hacia la izquierda) y se denominan segn la

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

Mutante 1
Metabolismo central

Tipo salvaje
Metabolismo central

Aspartato quinasa

>

cido
fosfoasprtico

Aspartato
semialdehldo

L. RTla
Uslna

Homoserina

Metionina

Aspartato

>

cido
fosfoasprtico

cido
fosfoasprtico

Aspartato
semialdehfdo

Aspartato
semialdehdo

Mucha
lisina

..

Homoserina
:
deshidrogenasa y
(mutada) Homoserina

Homoserina
deshidrogen

!L.

Inhibicin
mediante
retroacoplamiento
negativo

Aspartato
1 quinasa mutada

Aspartato quinasa

Aspartato

Aspart<1to

Mutante 2
Metabolismo central

Treonina

""
.:-

Poca
metionina

posicin en el espacio del grupo amino como formas


o y L Qumicamente se forman cantidades iguales de
las formas o yL, pero el sabor del condimento se debe
slo al L-glutamato, que gi.ra hacia la izquierda!
Nuestras clulas gustativas con sus receptores
-<:orno una enzima en el centro activo- slo pueden
reconocer una ordenacin espacial de la pareja de
reaccin (igual que enseguida nos damos cuenta de
s alguien nos da la mano derecha o la izquierda para
saludarnos].
Las protenas se sintetizan exclusivamente a partir
de Lamnocidos, y por lo tanto la mquina de sn
tesis de la clula est formada tambin slo por la
produccin de L-aminocidos. A propsito, se aplica el caso contrario a los azcares: en los azcares
se forman slo formas o y se reconoce, pues, por
ejemplo la ~-o-glucosa (azcar de uva].

Metionina

Corynebaderium glutomicum

Enzima
mutada
No se inhibir
debido al
exceso de
lisina

Fig. 4.21 Retroacoplamiento


negativo en la sntesis
de llsina mediante la cepa
sa lvaje de Corynebocterium
(visin por microscopa electrnica, arriba) y dos mutan
tes. En el primer mutante
est inactivada la enzima
homoserina deshidrogena
sa. En el segundo est tan
cambiada la aspartato qui
nasa que, a pesar de haber
un exceso de lisina, no puede inhibir la enzima.

convertirse. Inversamente, nosotros no serramos


interesantes para ellos como piezas de caza.
Lewis Carroll, con respecto a eso, hizo un experimento filosfico en "Alicia a travs del espejo": la
leche reflejada (Fig. 4.25) (con Llactosa en lugar de
o-lactosa) no le gustara al gato normal, pero quiz
s a un gato reflejado!
La desventaja de la sntesis qumica de aminocidos
es clara: la mitad del glutamato sintetizado qumicamente (o sea el o-glutamato) no poseera ningn
valor como condimento. En cambio, las corinebac
terias forman exclusivamente Lglutamato. De la
lisina y la treonlna hay tambin formas Lbiolgica
mente activas, que las bacterias forman al 100%. La
sntesis microbiolgica es una sntesis estereoqufmica complicada, y la conversin de la sntesis qumica va ms all, si se pueden ordenar de modo dife-

Las causas ltimas de estos hechos an no estn claras. Probablemente la casualidad desempe un
papel en el principio de la evolucin. En teora, se
podran presentar seres vivos de otro planeta, que
estuviesen construidos de L-azcares y o-aminocidos. Se podran parecer a nosotros externamente.
Ambas formas no podran, sin embargo, entremezclarse. La L-glucosa y el o-glutamato del otro planeta no tendran valor nutritivo para nosotros, pues
no "reconoceran" nuestras enzimas y no podran

Flg. 4.22 Produccin de lisi


na en enormes biorreactores
en Japn.

Fig. 4-23 Coryneboderium


glutamicum eslA depositado
en la American Type Culture
Collection (ATCO con el N
13032. El crculo, que representa el genoma, son regiones
codificadoras. Se muestran
tambin los biorreactores.

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95

BIOTECNOLOGA

rente los grupos equivalentes que se encuentran en


una molcula. Por lo dems, pueden utilizarse las
enzimas para deshacer de nuevo activamente la
mezcla o,L generada (vase Cap. 2, aminociclasas).
La capacidad de los microbios para dicha sntesis
selectiva y las conversiones tambin se utilizan en
la produccin de cido Lascrbico (vitamina C).

Fig. 4. 24 James Bond (Sean


Connery) se camufl como
hombre de negocios en
"Slo se vive dos veces"
para encontrar en Ja pn una
central de cohetes superse
creta. El espa princpal pidi
muy astutamente a un jefe
gngster japons que dele
treara " m-onOSOd+og+
u+ama+o'', para distraer
la misin de salvar el mundo.

Fig. 4.25 En su libro "Alicia a


travs del espejo", publicado
en 1871, Lewis Carroll descri
be cmo Alicia alcanza a tra
vs de un espejo un mundo
de reflexin: "Ahora, si me
prestas atencin, gatito, en
lugar de hablar tanto, te con
tar cmo es la casa detrs
del espejo. Primero est el
cuarto, que se ve en el espe
jo y que es completamente
igual a nuestro saln, slo
que con todas las cosas dis
puestas a la inversa. He gus
ta ra vivir en la casa del
espejo, gatito?y si te die
sen leche all? Pero... iQuizs
la leche del espejo no sea
sabrosa para beberla!"

4.10 cido

L-ascrbico,
la vitamina e

Nosotros, como otros primates y -sorprendente


mente- los cobayas, no podemos sintetizar vitami
na c (Fig. 4.29) y debemos tomarla de los alimentos. As pues, los cobayas y los chimpancs tambin
pueden tener el escorbuto. Atodos nosotros nos fal
ta la enzima gulonolactona oxidasa.
Hoy parece extrao que en 1900 los marineros, por
orden del emperador alemn, tuviesen que tragar
diariamente cido ctrico a cucharadas para evitar el
escorbuto. Se haba observado esta accin de la vita
mina en las frutas ctricas. El procedimiento impe
ria! produjo, sin embargo, simplemente diarreas.
No se sabia entonces que era el cido ascrbico
(vitamina C) de los limones el que prevenfa el escor
buto, no el cido ctrico. El chucrutera, sin embar
go, muy sano (mientras no se almacenara en latas
tapadas con mercurio, vase Cuadro 4.8).

Reichstein y su joven colega Grssner siguieron


entonces un nuevo camino. Queran producir pri
mero sorbosa como intermediario. Para ello reduje
ron glucosa con hidrgeno y un catalizador bajo presin con un rendimiento del 100% a sorbitol.
La siguiente oxidacin qumica del sorbitol al pre
cursor de la vitamina C sorbosa fue, sin embargo,
muy complicada. El qumico francs Gabriel Ber
trand (1867-1962) (Cuadro 4.3) ya haba descrito
en 1896 el siguiente paso: la bacteria del cido ac
tico Acetobacter suboxydans transforma concreta
mente el sorbitol en sorbosa. La bacteria se llama
hoy, segn la nueva nomenclatura, Cluconobacter
oxydans.

Reichstein hizo entonces algo poco comn para un


qumico de su tiempo: pens biotecnolgicamente
y compr a los microbilogos cultivos puros de
Acetobacter. Sin embargo, las bacterias compradas
no queran estar al servicio de Reichstein, un profa
no en microbiologa. No obstante, Bertrand haba
descrito con fortuna un mtodo descabellado para
capturar bacterias de sorbosa salvajes: moscas del
vinagre (Drosophila) !

En 1933 se produjo un gran descubrimiento en el


laboratorio del stano del politcnico en la Escuela
Tcnica Confederada (ETH), de Zurich: la sntesis
de vitamina C, el cido Lascrbico (Cuadro 4.3).

Reichstein utiliz la combinacin de sntesis qurni


ca con los pasos biotecnolgicos de la conversin de
o-sorbitol a Lsorbosa (Fig. 4.27).

En el proceso de fabricacin, el polaco Tadeusz


Reichstein (18971996) degrad glucosa qumica
mente, con ms de diez pasos intermedios, hasta L
xilulosa, y al fi nal la convirti con cido cianhdrico
(HCN) en vitamina C. Por desgracia, el mtodo era

En 1933, Reichstein ofreci la idea a la compaa


HoffmannLa Roche, en Basilea. Roche estuvo a
punto de adoptar el mtodo de Albert Szent
Gyoergyi (l 893 1986): el hngaro haba aislado
vitamina c del pimiento y haba obtenido el premio
Nobel en 1937.
El procedimlento de Reichstein [Fig. 4.27) se de
sarroll en los siguientes pasos:
Se reduca la o-glucosa catalticamente (nquel
como catalizador, 150 bar de presin} a Dsorbi
tol (sorbitol).

Fig. 4.26 Configuracin de


un aminocido. Excepto la
glicina (con R H), los car
bonos o. de los aminoci
dos poseen cuatro sustitu
yentes diferentes: COOH
(verde). H (gris), NH 2 (ama
rillo) y R (rojo). Los Lami
nocidos poseen el grupo
amino a la izquierda, mien
tras que sus im~genes
especulares (oaminoci
dos) lo poseen a la dere
cha.

96

muy complicado para una gran produccin y daba


rendimientos bajos. Precisamente, el ser humano
necesita vitamina C, en comparacin con otras vita
minas, en grandes cantidades, aproximadamente
100 mg diarios.

Entonces las bacterias tomaban el sorbitol y lo


convertan selectivamente mediante la sorbitol
deshidrogenasa de Acetobacter suboxidans.
Esto suceda en una fermentacin sumergda en
una disolucin de sorbitol al 20-30%, prctica
mente por completo en uno a dos das.
Definitivamente, la Lsorbosa se oxidaba qumicamente a cido 2-cetoLgulnico (2KLG), y ste,

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BIOTECNOLOGA BLANCA

mediante tratamiento con cido e hidrlisis, se


convera en cido L-ascrbico.

Fig. 4.27 Izquierda:


sntesis de la vitamina c
por Reichstein.

Proceso de Reichstein
Dglucosa

Tras dcadas de xito, ahora la sntesis qumica-bio


tecnolgica de la vitamina C de Reichstein y Grssner se realiza mediante un nuevo proceso de purifi
cacin biotecnolgico (Fig. 4.32 y Cuadro 4.3).
Las bacterias del gnero Erwinia (Fig. 4.33) con
vierten la glucosa en cido 2,5-dicetooglucnico
(2,5-DKG). Esto ocurre con la intervencin de tres
enzimas diferentes (enzimas l a 3, Fig. 4.32). Erwinia es una bacteria gramnegativa (como E. co/1).

Membrana
peri plasmtica
Catalizador de nquel
150 bar de presin
qumicamente

1<::=:==::J

Estas tres enzimas estn unidas a la membrana en


el periplasma, el espacio intermedio entre la membrana externa y la membrana citoplasmtica en las
bacterias gramnegativas.
Otras bacterias, como las grampositivas corlne
bacterias, tienen una estructura de membrana
sencllla (90% murefna, 10% cido teicoico), y
por eso se puede diferenciar tan bien entre bacte
rias grampositivas y gramnegativas por la coloracin! No poseen periplasma. Lo interesante es
que tienen, sin embargo, una cido 2,5-dicetoo
glucnico reductasa en el citoplasma y pueden,
por lo tanto, convertir 2,5-DKG en cido 2ceto
Lgulnico (2-KLG), que asimismo se cicla fcil
mente a vitamina C.
Erwinia une, pues, el producto de partida para
Corynebacteruml Se deban juntar Corynebacte
rlum y Erwinia en una cofermentacin. Pero tc

Fig. 4.28 G/uconobaderoxydans convierte l sorbitol,


con su sorbitol deshidrogenasa, en lsorbosa.

(~~
\. . . . . .. ~/ :fp ~ .
.

Se decidi que el gen de la reductasa de las corine


bacterias se insertara en clulas de Erwinia. Esto es
naturalmente adecuado, pues a Erwinia le falta slo
una enzima y las enzimas de Erwinia no se hallan
en la membrana periplasmtica de Corynebacte
rlum. La reductasa de Corynebacterium no traba
ja, por el contrario, en una membrana, sino que est
libre en el plasma celular.

Oxidacin
qumica

"~ ~ ~;.~

nicamente es muy difcil unirlas (diferentes pH y


temperatura ptima, velocidades de crecimiento
y eliminar las otras cepas, diferentes medios
nutrientes ... ).
Sin embargo, finalmente se logr, con mtodos de
ingeniera gentica, unir el material gentico de los
dos tipos de bacterias en un nico microorganismo:
ste toma glucosa pura y segrega el precursor de la
vitamina e directamente al medio.

t1

02

Lsorbosa

..~

...

......

cido 2-cetoL-gulnico
(2-KLG)
Fragmentacin
con agua

Tratamiento con cido

Condensacin

Ahora sucede lo siguiente en las clulas de Erwinia


recombinantes (Fig. 4.32):
La o-glucosa se toma del medio hacia el peri
plasma.

cido Lascrbico
Vitamina c

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Fig. 4.29 Cristales de cido


ascrbico (vitamina O en un
microscopio de polarizacin.
Se observan interferencias
por la doble refraccin de
la luz.

97

BIOTECNOLOGA

. l '
#>.._

"!..

,/' .
.
--~:

. ..
-

.
I

~ li

...

Fig. 4.30 El ascomiceto fila


mentoso Ashbyo gossypii
produce vitamina 8 2
(riboftavina).

Las tres enzimas periplasmticas (en la membra


na interna de Erwinia) sintetizan gradualmente
2,5DKG.
La cido 2,5-diceto-o-glucnico reductasa (de
Corynebacterium) cacaliza en el citoplasma
de las clulas de Erwinia el paso de 2,5DKG a
2KLG (cido 2-cetogulnico), y lo cede al medio.
El 2KLG se transforma, mediante un tratamien
co cido bajo hidrlisis, en cido L-ascrbico
(vitamina C).
Por lo tanto, con la ayuda de la ingeniera gentica se
logr unir elegantemente la capacidad metablica de
dos microbios diferentes. Las clulas de Erwinla
recombinantes produjeron, en 120 horas, aproximadamente 120 g de 2-KLG por litro de caldo de fermentacin. Se convierte el 60% de la glucosa.
Con la genial combinacin de sfntesis qufmica y bio
tecnolgica, Hoffmann-La Roche fue durante muchos
aos el mayor producto1de vitamina C. Mientras tan
to, se encargaba la produccin a DSM (Holanda).
Actualmente, la cifra de facturacin del mercado de
la vitamina C se encuentra alrededor de 400 millones de dlares; sin embargo, un 65% corresponde a
las compafas de biotecnologa chinas, que producen
considerablemente por debajo de los precios del mer
cado. La produccin mundiai de vitamina C aumentar, aunque sin apenas variar las cifras de ventas.
Tadeusz Reichstein obtuvo en 1950 el premio
Nobel en medicina, pero fue por su trabajo sobre la
cortisona, una hormona de las glndulas suprarrenales (pg. 119).
En 1936 la compaia Roche vendi 370 kg de vitamina e a un precio por kilo de 1140 francos suizos.
En 1938 cay el precio del kilogramo a 550 francos,
en 1940 a 390 fraucos y en 1950 a 102 francos. A
principios de los afios 1960, un kilogramo de vitamina C costaba 80 francos, y el precio se encuentra
hoy en aproximadamente 20 francos por kilogramo. 1Asf pues, la vitamina Ces hoy ms de 50 veces
ms barata que hace 70 aos!

..

Fig. 4.31 Estructuras de la


vitamina e (arriba), la vitam
na 82 (centro) y la vitamina
8 12 (abajo).

98

Aparte de como profilaxis de la salud, la mayor parte de la vitamina sirve como antioxidante natural
inofensivo, mezclada con bebidas refrescantes, para
hacerlas duraderas. B ganador de los premios
Nobel de qumica y de la paz Linus Pauling afirm
que la vitamina C era captadora de radicales libres,
que pueden causar daos en la herencia en el cuerpo. ti tomaba diariamente varios gramos de vitami
na C, lleg a los 92 aos de edad y nunca se resfri.
Aunque su teora es polmica, lo que es seguro es
que una alimentacin que contenga vitamina y sea

rica en protefnas, en lugar de grasa y carne, aumenta la esperanza de vida.


Cunta vitamina C se debe tomar en realidad? La
Sociedad Alemana para la Alimentacin recomienda 150 mg al dfa. Los partidarios del "forever
young' toman, sin embargo, uno a tres gramos diarios. Es difcil tomar una sobredosis y no es posible
intoxicarse, pues la vitamina e es soluble en agua.
No se acumula en el cuerpo como las vitaminas A,
D, E y Ksolubles en lfpidos, sino que se elimina en
orina. El cido en exceso puede, sin embargo, afectar al estmago (y al monedero!).
Las otras vitaminas principales se producen qufmi
camente puras, por ejemplo el colorante de las zanahorias ~ -caroteno para el pienso, o de plantas, por
ejemplo el tocoferol. Slo las vitaminas C, B2 y B12
(Fig. 4.31) se producen principalmente por biotecnologfa mediante microbios.
El hongo Ashbyagossypii(Fig. 4.30), un ascomiceto
filamentoso, aporta ribotlavina, la vitamina Bz. La
cepa industrial intermedia reproducida genera hoy
20 000 veces ms vitamina B2 que su tipo habitual en
la naturaleza. El proceso se llev a cabo en 1947.
Al principio, Ashbyaproducfa cantidades muy bajas
de ribolavina. MJentras tanto se empez a utilizar
tambin un hongo relacionado, Eremothecium
ashbyii, y la bacteria Baci/lus subtilis, de una cepa
determinada que sobreproduce la vitamina y la
cede al medio. B. subtilisno es, en comparacin con
ambos hongos, un sobreproductor natural e vitamina; se manipul por ingeniera gentica dirigida.
La ribolavina se encuentra en la leche, el hgado, el
pollo, los huevos, el pescado marino, las nueces y la
lechuga. lnluye esencialmente en la buena salud y
la formacin de los msculos, y participa en la pro
duccin de la hormona del estrs adrenalina.
Pseudomonas denitrijicans y Propionibacterium
shermanii unen cobalamina, el precursor de la cia-

nocobalamina (vitamina 8 12) (Fig. 4.31), incluso


en un exceso de produccin de 50 000 veces en com
paracin con la cepa salvaje. En un proceso de un
paso, Pseudomonas denitrijicans genera aerbicamente hasta 60 mg/L de cobalarnina en cuatro das
de crecimiento en una melaza de azcar de remolacha. La cobalamina se cede al medio. La melaza con
tiene betafna, que aumenta esencialmente el rendimiento. Al final se calienta el cultivo en presencia de
cianuro y se consigue asf la cianocobalamina.
La carencia de vitamina 8 12 produce anemia
(anemia perniciosa). En 1926, la anemia perni
ciosa fue tratada con xito con una a dos libras de

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

hgado de buey crudo por semana. En 1934 se con


cedi el premio Nobel de medicina a George
Hoyt Whipple, George Richards Minot y
William Parry Murphy por este descubrimiento.

Fg. 4.32 Sintesis de la vitamina econ clulas de Erwinio


manipuladas genticamente.

Proceso de ingeniera gentica

La vitamina 8 12 se utiliza para la formacin de san


gre y como preparado protector del hgado, y apro
ximadamente la mitad de las 20 toneladas que se
producen anualmente se utilizan en alimentos para
animales, para el crecimiento y la formacin de los
huesos. En los humanos promueve, adems, la
potencia nerviosa y la lucidez mental.

4.11 Aspartamo- La marcha triunfal


de un ster dipeptdico dulce
James Schlatter, qumico de la compaJa farma
cutica americana G. D. Searle Co., en 1965 analiz
pptidos, cadenas cortas de diferentes aminocidos,
como preparados contra lceras de estmago. Ms
tarde inform del hecho de que l se habla mojado
la mano inadvertidamente en el laboratorio con unas
gotas de uno de sus preparados. Cuando se humecte
ci la punta de los dedos al leer unos papeles, not
un sabor dulce en el dedo. (Las malas lenguas dicen
que le ocurri al fumar en el laboratorio a pesar de
estar prohibido!) La sustancia de anlisis posea,
como se estableci despus, 200 veces la fuerza
endulzan te del azcar de remolacha o de caf\a.

Fig. 4.33 Erwinia es en reali


dad una plaga gramnegativa
de plantas, que realiza un
ataque hmedo y seco y se
consigue a travs de la elimi
nacin de pectlnasas en las
clulas de plantas.

cido o-glucnico

El nuevo superazcar aspartamo es un pptido, un


ster de metilo de los dos aminocidos aspartato y
fenilalanina.

Oxidacin en CS

1cido 2CetoOglucnico

t1

La fenilalanina y el aspartato pueden producirse


mediante bacterias en biorreactores. Se unen a pp
tidos slo qumicamente o con la ayuda de la "reac
cin inversa" de proteasas (como la tripsina) en sis
temas de dos fases con medios de disolucin org
nicos (vase Cap. 2).
El aspartamo se fragmenta por las enzimas de la
digestin en el intestino; un gramo de aspartamo, la
necesidad diaria de un adulto, suministra sin embargo slo cuatro kilocalorfas, mucho menos que una
centsima de la energa que un ser humano gene
ralmente consume con el azcar. La segunda venta
ja del aspartamo: no slo es pobre en caloras, sino
que sabe tambin casi como el azcar (no se nota la
ausencia del "compuesto"}, y no tiene el sabor de
sus competidores sacarina y ciclamato.
El aspartamo lleg en el momento oportuno: a fina
les de los af\os 1970 se extendi la obsesin por estar
en forma en todo Estados Unidos. Los productos
light usan aspartamo puro o en mezclas (Fig. 4.35).
El aspartamo tiene tambin otra ventaja: se degrada
tras seis a nueve meses, pero para los refrescos es

Citoplasma

cido 2,5
dicetoDglucnico
(2,5DKG)

2,5-DKG reductasa
de Corynebacterium

.......
1 _ __,

1 1
1

'9

Fig. 4.34 Las corinebacterias


liberan la enzima 2,5DKG
reductasa, que se expresa en
el citoplasma de las clulas
de Erwinia.

</;.." ;f . .:

1)J-1-'&-

~......

cido 2-cetoL-gulnico (2-KLG)

Peri plasma

...___
Fragmentacin
conagua

--O

/A 'f

1 1

Tratamiento con cido

~ . . . ';-o.

~\

'F=='I.

p
Medio

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cido Lascrbico
Vitamina e

99

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.3 Historia


de la biotecnologa: Las moscas
de Relchsteln y la vitamina C

Tadeusz Reichstein
(1897-1996)

Tadeusz Reichstein fue ayudante del bri


ilante qumico de sntesis Leopold Ruzicka

( I887 1976) en el ETH de Zurich. Ruzicka


ofreci su sin tesis de hormonas a Roche. Sin
embargo, "el poco convencional y original
Ruzicka y el completamente ordenado y dis
ciplinado Bareil (de Roche} no fueron capa
ces de entenderse" (escrito de la compa'la
Roche). Ruzicka fue a Ciba, en BasUea, en
1929 (con xito!). De manera similar,
Reichstein prob con Roche en 1932.

El francs Gabriel
Bertrand (1867-1962)
describe cmo se
puede producir sor
bosa de manera bri
liante con la ayuda de
Drosophila. A Reichs
teln le funcion exac
tamente igual que al
autor en Hong Kong
120 aos ms tarde.

Despus de 50 aos, Relchsteln recordaba lo


que sucedi entones:
"No conozco el protocolo exacto. Pero
(segn Gabriel Bertrand) era algo as!: se
toma vino, se coloca algo de azcar y vina
gre dentro, y se deja en una copa. Con esta
mezcla se atraen pequeas moscas con el
nombre de Drosophila, que revolotean
hacia all. La Drosophila, tambin llamada
mosca del vinagre, posee bacterias en el
intestino, y si la mosca empieza a sorber
ese jugo, algunas bacterias salen y emple
zan a producir sorbosa. Cuando yo quise
probarlo por primera vez, el afio ya estaba
muy avanzado, pero la temperatura an
era templada, y no vi ninguna Drosophila.

100

No poda esperar un ao y aun as lo


intent.
Introduje sorbitol en el vino en lugar de az
car, algo de vinagre, como se ha descrito, y
tambin caldo de levadura. Me dijo un bac
terilogo que dentro del caldo de levadura se
encuentra todo lo que necesita una bacteria.
No es cierto que lo cuviese. Coloqu cinco
vasos de esta disolucin frente a la ventana
de mi laboratorio del stano, desde donde
an se poda ver el sol. Era sbado, y yo
haba pensado que si las moscas venan esta
rfa bien, pero si no, no se habra perdido
nada. El lunes volv, y todo estaba seco. Pero
dos vasos estaban llenos de cristales. Mira
mos esos cristales: era sorbosa pura! Dentro
de un vaso an haba una Drosophila,
borracha.

Experimento realizado por el autor con sorbitol:


la flecha roja seala la mosca

Yde esta Drosophila salan los cristales de


sorbosa en forma de rayos. Estas bacterias
salvaes hicieron sorbosa en dos das, mien
tras que las compradas no la podan producir
en seis semanas, o sea, las mas deban ser
las bacterias buenas. Inoculamos entonces
con estas bacterias, que proliferaron rpida
mente y, en efecto, tambin en el segundo
experimento se obtuvo sorbosa en 24 a 48
horas. Por este mtodo se pudieron generar
en pocos das aproximadamente 50 gramos
de sorbosa. Era, claro est, una mezcla salva
je de bacterias la que tenamos en la disolu
cin. Pero esto no hada ningn dao.
A pH 5, o sea una reaccin cida, alcanzaron
su eficacia ptima. Yen una reaccin tan
fuertemente cida, las otras bacterias u hon
gos crecieron poco. De la sorbosa se pudo
obtener vitamina C de manera muy senciila,
en seguida a gramos, y se pudo decir verda
deramente que sera posible producirla a
toneladas.
Yo creo que hemos conseguido, a partir de
100 gramos de glucosa, 30 a 40 gramos de
vitamina C. Pero no hemos pulido an la sin

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tesis; se deben lograr, pues, resultados ms


seguros, optimizados y todava mejores."

Redoxofl"', antiguamente y en la actualidad como


tableta efervescente, ahora tambin en China.

La compa'IIa Roche, en Zurich, obtuvo la


licencia de Relchstein, a pesar de que el jefe
de la compaa, de la entonces an muy
pequea compaa, crey que esta reaccin
microbiolgica con bacterias no era conve
nlente para ella, ya que era muy impopular
entre los qumicos. Reichsteln le contest:
"... impopular o no, yo no lo puedo cambiar,
esta bacteria es el nico trabaador que a par
tir de sorbitol puede hacer sorbosa con un
90% de rendimiento. Esto no imita a ninguna
persona. Yla bacteria lo consigue en dos das,
con casi nada, slo con aire. Se le debe dar
simplemente un poco de levadura para
comer".
En el escrito del 100 aniversario de la com
pa!a Roche, en 1996, se dice: "el aislamien
to de esta vitamina antiescorbuto cuvo xito
tras los largos estudios del hngaro
A. SzentGyorgyi, y Roche se planteaba
adoptar este mtodo de obtencin de la vita
mina Ca partir del pimiento. l...] Puesto que
la sntesis genial de Reichstein demostr ser
muy prometedora, con ella empez en reali
dad la produccin de la vitamina por Roche.
.. .1 Sin embargo, Barre! uzg entonces la
vitamina C como un producto bioqumico
utilizado raramente, del cual se podan vender como mximo 1Okg por ao, y fue muy
sorprendente que despus de unos meses
resultara ser un producto muy codiciado".
El preparado de vitamina C lanzado en
1934, Redoxo~, se encuentra an hoy en
el mercado.

Drosophilo me/anogoster

BIOTECNOLOGA BLANCA -

irrelevante, pues segn las estadsticas el 95% de las


bebidas no estn en los estantes ms de tres meses.
Actualmente el aspartamo todava es ms caro que la
sacarina y que el jarabe de fructosa producido enzimticamente (Cap. 2). Sin embargo, si se consigue
producir microbios por ingeniera gentica, para
hacer en cierto modo el aspartamo ms barato, "completo" o sus dos componentes en mayores cantidades, el aspartamo podra ser el vencedor. Puesto que
su valor nutritivo es extremadamente bajo, se avecinaban malos tiempos para las bacterias de la caries,
como Streptococcus mutans. Los expertos en alimentacin, sin embargo, dudaron si se aplicaba tambin para la reserva grasa: las bebidas light proporcionan al cuerpo una espera de energfa, que Juego no lle
gay se produce un hambre feroz, que se calma de otra
manera. Hay verdaderas advertencias sobre el aspartamo por parte de Jos cientficos de la alimentacin.
En Estados Unidos se critica el aspartamo por parte de
algunos colectivos, porque en su digestin se origina
metano! que puede provocar ceguera; pero para eso
se deberan ingerir grandes cantidades de aspartamo.
Mundialmente se producen 14 000 toneladas de
aspartamo al ao. En 2004, el asparcamo parece que
tuvo una faccuracin de 850 millones de dlares.
Otras dos protenas an ms dulces se descubrieron
en unos arbustos del oeste de frica: la taumatina y
la monelina (Fig. 4.38). Constan de 208 y 94 aminocidos, y son aproximadamente 2500 y hasta
100 000 veces ms dulces que la caa de azcar.
Puesto que los costes para la obtencin de estas materias dulces de plantas son elevados, se est intentando producirlas genticamente a partir de microbios.

aspartasa de las bacterias coli a la mitad. Las clulas


libres tienen, en cambio, una "vida media" de slo
diez das. El proceso con clulas inmovilizadas supo
ne un 60% del coste de produccin en comparacin
con la aplicacin de clulas libres: los costes del catalizador se reducen desde aproximadamente un 30%
en las clulas libres a un 3%, los costes en personal
de servicio y la energa en un 15%. Un reactor en
columna de 1000 litros de capacidad libera aproximadamente dos toneladas(!) de L-aspartato por da.
Un proceso similar con clulas inmovilizadas de
Brevibacterium gener 180 toneladas de Lmalato
{cido mlico) por ao a partir de cido fumrico.
Ambos procesos utilizan slo una nica enzima del
microorganismo (aspartasa o fumarasa), que por
consideraciones econmico-prcticas se deja en las
clulas. Se destruyen con precaucin en parte las
membranas celulares antes del uso, de modo que ya
no estn disponibles como clulas vivas. Los sustratos no se sostienen por la membrana celular, pero
las enzimas son estables.
Los microorganismos se utilizan en su forma natural ms bien para procesos de varias etapas. Un
buen uso es el ejemplo de la produccin de alcohol
con levaduras inmovilizadas (Cap. 1), que sin
embargo ya no es lo suficientemente econmico.
Las posibilidades de las clulas inmovilizadas son
grandes. En comparacin con las clulas libres,
vivas, las inmovilizadas se separan claramente
mejor en la mayora de los casos.

Un proceso de Tanabe Seiyaku utiliz en 1982 dos


microorganismos inmovilizados "colocados en fila"
para la conversin de materia: primero las clulas
Muchos gatos adoran la taumatina. Existe el rumor inmovilizadas de Escherichia col/formaron, a parinsistente de que la taumatina o determinados ami- tir de cido fumrico en un biorreactor de 1000 L,
nocidos hacen a los gatos prcticamente adictos a L-aspartato, que posteriormente se convirti en L
las marcas de comidas para gatos (Cuadro 4.2).
alanina con clulas de Pseudomonas dacunhae
inmovilizadas en un reactor de 2000 L. La instalacin
piloto produjo mensualmente l 00 toneladas
4 .12 Las clulas inmovilizadas
de
Laspartato
y diez toneladas de Lalanina.
producen aminocidos

y cidos orgnicos
Japn est especialmente muy avanzado en el campo de las clulas inmovilizadas (Cap. 2). lchiro Chibata y Tetsya Tosa (Cap. 2, Fig. 2.23), en la compaa Tanabe Seiyaku en Osaka, pioneros en la
inmovilizacin de enzimas, utilizaron en 1973 un
proceso mediante el cual las clulas congeladas de
Escherichia coliincluidas en gel sintetizaron anualmente 600 t del aminocido aspartato (cido aspr
tico, un componente del aspartamo) a partir de cido fumrico. Tras 120 das baj la actividad de la

4.13 Mutaciones: un camino hacia


la programacin selectiva
de microbios

Fig. 4.35 iCmo cambian los


tiempos y los gustos! Hay 10-0
aos entre los dos anuncios.
Arriba: la original rica en calarlas en Estados Unidos.
Abajo: el producto "bio" bajo
en caloas en Asia.

...

,_

~3. '
. n.,
. .

~{'_
~

Fig. 1.36 En la lata de la


Coca-Cola light, junto a la lista de ingredientes hay un aviso para enfermos de fenilce
tonuria de la presencia de
aspartamo.

Flg. 4.37 El aspa rtamo es,


actualmente, por su gusto
similar al del azcar, uno de
los edulcorantes ms
populares.

Para obtener un microorganismo a medida para su


uso industrial, se deben eliminar las propiedades
indeseadas de una cepa salvaje y conseguir una
propiedad utilizable reforzada o completamente
nueva.
Hay varios caminos adecuados: utilizar las mutaciones espontneas o desarrollar mutaciones artificiales.

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Fig. 4.38 La taumatina se


obtiene de las frutas del
arbusto Ketemfe africano.

101

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.4 Por qu la luz UV


mata los microbios

Mediante radiacin UV se origina un dmero TT


(violeta) en la doble hlice de DNA. Se forma un
anllo de ciclobutano entre las dos bases de
timina (arriba). El dmero produce una torsin
en la hlice (abajo) y debilita la Interaccin con
la correspondiente pareja adenlna; se rompe
ligeramente el esqueleto de DNA.

La luz ultravioleta se absorbe por un doble


enlace en una base pirimidina (timina y cito
sina en el DNAI, abre el enlace y permite que
reaccione con las molculas vecinas. La reac
cin ms frecuente es una interaccin directa
con otra base, la timidina. Se produce asf un
enlace qumicamente estable (covalente) y se

origina un fuerte cuarto anillo. Cada clula


irradiada sufre aproximadamente 50 a 100 de
estas reacciones por segundo (!) con la luz
solar; as se orig)nan mutaciones.

La luz UV se utiliza para la esterilizacin de las


campa nas de cultivo (Ciean Bench).

Por suerte para nosotros, estos daos desaparecen en general en segundos tras su formacin. Docenas de protenas cooperan para
ello. Cortan en el llamado nuc/eotide exci
sion repair un segmento de 30 pares de
bases de longitud, que de nuevo se rellena
con los nucletidos correctos. sta es nues
tra nica proteccin contra los rayos UV
(adems de las cremas solares). Si esta repa

En el caso ms sencillo, una mutacin puntual


reemplaza un par de bases del DNA por ocro par. En
otros casos se puede perder o insertar un par de
bases o un fragmemo corto del DNA. Tales cambios
ocurren en la naturaleza en todos los DNA: seguramente se deslizan al copiarse.
Las mutaciones espontneas en una determina
da base son, sin embargo, muy raras: la proporcin
de mutacin media en E. colipara una base reescri
ta (replicada) se encuentra en IQ- 10, es decir, de
diez mil millones de bases muta como media una
base! Tales mutaciones permanecen en general
"mudas" o se reparan sencillamente mediante enzi
mas (Cuadro 4.5).

Fig. 4.39 Placas de Petri con


colonias de microorganismos.
Screening de nuevos productores de antibiticos en Jena.

102

La proporcin de mutacin aumenta aproximada


mente en un factor de 1000 si se tratan microorganismos con mutgenos. Entre ellos se encuentran
la radiacin ultravioleta (UV) (produce por ejemplo
la formacin de dmeros de dos timinas vecinas del
DNA, Cuadro 4.4), la radiacin ionizante (rayos X,
gamma o de neutrones) y una enorme cantidad de
molculas qumicas relacionadas que reaccionan
con las bases del DNA (por ejemplo, el cido nitroso reacciona con grupos amino) o interrumpen el
proceso de la copia. Tales molculas activan en pri
mer lugar, mediante enzimas del hgado (como el

racin no se consigue con xito, se produce


cncer de piel. Los microorganismos, en
cambio, utilizan endonucleasas, que senci
llamente en un paso cortan y eliminan la
baSe daada. La endonucleasa V del bacte
rifago T4 envuelve muy fuertemente al
DNA, y lo corrige. Se une al lugar que con
tiene un dmero TI.

Cmo una enzima


reparadora de DNA
(verde) encuentra el
dmero TT (violeta),
lo corrige y transporta la adenina
a su bolsillo, a la
izquierda cerca
del DNA.

Asombrosamente, la enzima no reconoce el


dfmero sino la reduccin de la hlice por el
dmero. La enzima se enrosca (kink) al DNA
en el lugar de la lesin y coloca una base adenina complementaria en su bolsillo.

citocromo P-450), a los mutgenos (por ejemplo


afia toxina de mohos sobre cacahuetes) (Fig. 4.1 O)
formando epxidos altamente reactivos, que entonces reaccionan con guanina del DNA para generar
enlaces estables. El cncer en los humanos y otros
mamferos se origina por mutaciones en genes que
participan en el control del crecimiento y mediante
una reparacin del DNA defectuosa (en muchos
tipos de cncer intestinal).
En general, es imposible mutar un nico gen da
na. Para mejorar una cepa microbiana mediante
mutacin se debe disponer de un test sensible, con
el cual se reconozcan los mutantes raros casuales
"exactos".
Ya hemos visto en la produccin de aminocidos
cmo se programan los microorganismos de la
manera deseada mediante mutaciones (4.7): con la
ayuda de mutaciones naturales y lecturas dirigidas
se forma una cepa bacteriana que sobreproduce
grandes cantidades del aminocido lisina, tan
importante para la vida.
La situacin es otra en los hongos y las bacterias productores de antibiticos: la cantidad producida de
antibitico depende de una docena de genes. Asf, es
imposible encontrar una nica mutacin que haga

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BIOTECNOLOGA BLAN CA -

Cuadro 4.5 El screening (cribado),


la mutagnesis y la seleccin
logran potentes productores
de antibiticos

Nueva
combinacin

40000 ............................. .

Primero se toma una muestra del hbitat de


inters.
Puesto que en 1 cmJ de tierra se encuen
tran millones de microbios, la muestra debe
diluirse con agua. Se vierten muestras ms
o menos diluidas sobre placas y se dividen.
fstas son las placas de Petri, que contienen
un nutriente. Entonces se incuban las pla
cas de Petri a 25 C o 37 C en incubadoras
durante seis das, hasta que los microorga
nismos individuales forman acumulaciones
(colonias) pequeflas bien visibles. Si se
encuentran colonias, forman antibiticos
si no hay material inhibidor en el entorno.
Si entonces se Introducen, por ejemplo,
estreptococos en las placas con las bacterias
a analizar, stas forman sobre las placas
un csped espeso. Slo las colonias produc
toras de antibiticos originan una zona
muerta.

Screening visual de "zonas muertas" formadas


por los productores de antibiticos

De estas colonias se toma una muestra con


un hilo delgado, compuesto del metal noble
platino y previamente hervido para dejarlo
libre de grmenes, y con l se hace un test
de rayado realizando una lnea sobre una
nueva placa con nutriente. Tras una breve
incubacin se colocan verticalmente sobre la
primera lnea otras nuevas para realizar dife

Unidades por ml

30000 ......................... .
20000
10000

Cepa salvaje

rentes tests microbianos, por ejemplo para


estafilococos, estreptococos, Escherichia coli
o levaduras del gnero Gandida. Las cepas
de prueba que se inyectan sobre el nuevo
antibitico no crecen cerca de la primera
lnea de inoculacin, mientras que las cepas
no inyectadas cerca pueden crecer.
Ahora se cultiva el productor de antibiticos.
Si crece bien, se intenta obtener el antibiti
co en forma pura. Entonces se analiza la efi
cacia del antibitico en animales de experi
mentacin.
Mediante una mutacin y una posterior
seleccin de microorganismos productores
de antibiticos se puede mejorar el rend
miento. Se eligen las colonias hijas, se
selecciona otra vez un mucgeno y final
mente se analiza su productividad. Tras
muchos ciclos de mutaciones y selecciones
se pueden cruzar los mejores mutantes
entre si. Mediante una nueva combinacin
(recombinacin) de genes pueden resultar
miles de descendientes genticamente
diferentes, muchos de ellos con una mayor
produccin de antibiticos. La penicilina
es el mejor ejemplo satisfactorio de scree
nng (cribado), mutagnesis y seleccin,
una moderna "evolucin en la placa de
Petri".

que una cepa salvaje d enseguida un rendimiento


eficiente, con valores econmicos de quizs algu
nos mligramos por litro. Las cepas industriales altamente desarrolladas proporcionan hoy, por litro de
medio nutriente, 20 o ms gramos de antibitico
como resultado de varios pasos de mutaciones y
selecciones (Cuadro 4.5).
En cada paso se trata un cultivo con un mutgeno y
se analizan las colonias resultantes. Si entre miles de
colonias se encuentra una mutante que desarrolla

Mutacin
y seleccin

Se eligen las mejores colonias hijas (coloreadas)


de la derecha. Aumento del rendimiento en penicilina mediante mutacin y seleccin, asf como
la fermentacin mejorada de la primera produc
cin de penicilina, hasta los anos 1990

Hoy las cepas industriales de Penicillium


chrysogenum producen lSO 000 unida
des/ml (aproximadamente 100 mg), en
comparacin con las 4 unidades/mL del
hongo de Fieming.
Mientras que a principios de los aos 1940 se
posean 1200 cepas de mohos, la ARS Culture
Collection, en Peora, tiene hoy ms de
80 000 cepas microbianas. A finales de la
dcada de 1990, el microbilogo Stephen W.
Peterson, en Peoria, descubri 39 nuevas
especies de Penicillium, que se sumaron a las
102 especies de Penicillium antes conocidas,
incluyendo la famosa cepa de los melones.

una productividad claramente elevada, sta sirve


como punto de partida para un nuevo ciclo de muta
ciones y selecciones. De esta manera se conduce la
evolucin de un organismo en una direccin no
natural, hasta que se crea una cepa que garantiza el
rendimiento econmico. Estos mtodos son muy
largos, requieren trabajo intensivo y sus resultados
no son previsibles en ningn caso.
No slo Jos genes, sino tambin las condiciones de
cultivo, influyen en el rendimiento en antibitico.

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o ,....:;....--...---,,--.---,
.,,o~ .,,"!n .,,e!oo .,,<\:l...,eg,O ..,of'lo

Fig. 4.40 En el biorreactor de


laboratorio se optimizan las
condiciones del cultivo para
cada microorganismo.

103

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.6 Historia de la


biotecnologa: Fleming,
la penicilina y el inicio de
la industria de los antibiticos
En un da de otoo del ao 1928, el microbilogo Alexander Fleming (1881-1955)
revis en su pequeo laboratorio del St Mary's Hospital, en Londres, diferentes cultivos
de pus producido por bacterias (estafilococos).
El laboratorio estaba lleno a rebosar de placas
de Petri, en las cuales las bacterias crecan
sobre un nutriente de agar-agar. Pero el desorden puede ser provechoso!
Fleming haba infectado algunas placas con
bacterias antes de sus vacaciones de verano.
Ahora estaban cubiertas de colonias bacteria
nas claramente visibles. En algunas placas de
Petri tambin crecieron, sin embargo,
mohos. Haba sido un verano fresco, y las
bacterias no haban crecido lo suficientemente rpido.
Melvin Pryce, colega de Aeming, fue testi-

go ocular del momento estelar de la ciencia.


La historia est escrita en el libro de Andr
Maurois "Alexander Fleming".
Fleming, durante la charla, cogi con la mano
un par de placas con cultivos viejos y abri
la tapa. Varios de los geles estaban cubiertos
con moho. Algo cotidiano. "Se necesita slo
abrir una placa -dijo Aeming-y aparece una
alteracin. Siempre entra algo de aire dentro". De repente la devolvi dentro, sigui
un momento de observacin en silencio, y
entonces dijo con voz ms indiferente: " That
is funny... ". En la placa que tenia delante
creca una colonia de moho especialmente
magnfica.
Era extrao que alrededor de la colonia del
hongo hubiera una zona libre de bacterias.
Ah no asentaba ninguna bacteria, o es que

moran? Evidentemente, Jos mohos preveni


an la expansin del estafilococo.
Cuando Pryce percibi el inters de Fleming,
dijo: "As descubri usted la lisozima en su
momento, verdad?" Fleming no dio ninguna respuesta. Cogi una muestra del moho
con unas pinzas de platino y la traslad a un
tubo con gelatina como nutriente.
Reming coloc la placa de Petri a un lado.
La deba proteger durante toda su vida como
un tesoro. "Mire usted esto, es interesante.
Me gustan estas cosas: podran ser importan
tes." Aerning la mostr a otros colegas. Vista

104

la placa, la devolvieron educadamente: "S,


muy interesante".
En los das siguientes Fleming reprodujo el
hongo sobre el nutriente, que haba libera
do de microbios mediante calefaccin.
Acto seguido sembr, alrededor del moho,
diferentes bacterias grampositivas: cadenas
formadas de estreptococos, estafilococos
en forma de racimos y neumococos. En
realidad no se extendieron todas hasta
inmediatamente cerca del hongo. Las bacterias gramnegativas, como Escherfchia
coliy tipos de Salmonella, siguieron creciendo ms all. Aeming denomin a "su"
moho, representante de los mohos con
esporangio en forma de pincel, del gnero
Penicillium, ms exactamente como

En 1938, Emst Boris Chain (1906-1979),


en la Universidad de la ciudad inglesa de
Oxford, conoca el hongo. Con el comienzo
de la Segunda Guerra Mundial, en 1939 se
present de pronto una necesidad enorme
de remedios para luchar contra las infecciones bacterianas de las heridas. En Oxford, el
emigrante ucraniano-judo Chain empez,
bajo la direccin del australiano Howard
Florey (1898-1998), un trabajo febril. Obtu
vo penicilina, la purific de Jos materiales
acompafiantes del medio nutriente y evalu
el polvo amarillo en ratones que haban sido
infectados antes con bacterias causantes de
enfermedades.

Penicil/ium notatum.

Reprodujo entonces el hongo en un


recipiente mayor, con un medio nutriente
lquido. Una mancha verdosa de hongo
cubri pronto, como un csped, Ja superficie del medio, que tras algunos das se
colore de amarillo dorado. En los nuevos
experimentos con bacterias se vio que el
medio nutriente solo tambin inhiba la pro
Jiferacin de las bacterias. El moho con
esporangio en forma de pincel deba, pues,
de alguna manera, liberar al entorno materia hostil para las bacterias. Fleming la llam
penicilina por su productor.
Los estreptococos, los estafilococos, los causantes del carbunco (antrax), la difteria, la
fiebre glandular de Pfeiffer y el ttanos se
inhiben con penicilina.
Fleming no sospechaba que haba hecho
un importante descubrimiento con la penicilina, que iba a salvar la vida de millones
de personas. Otros experimentos demostraron, sin embargo, que la penicilina slo
daa bacterias, pero no conejos vivos. Fle
ming no intent por s mismo obtenerla en
forma pura y luchar contra las bacterias
causantes de enfermedades en animales de
laboratorio.
Asu articulo en el British Joumal of Experimental Pathologyno se le dio apenas importancia. En 1940, Fleming todava escribi
que no vala Ja pena producir penicilina.
Su inters principal por la penicilina era el
aparente efecto selectivo de diferentes tipos
de bacterias. Con su ayuda se pudieron clasificar mejor los tipos. En esa poca, otros
investigadores ya eran conscientes de la sustancia inhibidora de bacterias.

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Ernst Boris Chain


(1906-1979)

Howard Florey
(1898-1998).

Segn la opinin
de su bigrafo
australiano,
ha sido el nico
australiano que
proporcion
algo til para la
humanidad.

Los ratones sanaban en un tiempo breve.


Esto era sensacional! Los gobiernos de Gran
Bretaa y de Estados Unidos apoyaban ahora
los esfuerzos para obtener penicilina en cantidades suficientes. Debido al significado
militar, el proyecto se mantuvo absolutamen
te secreto.
En verano de 1941 se prob por primera
vez la penicilina en un paciente de 43 aos
que sufra una peligrosa infeccin por estafilococos y estreptococos. Aunque primero
consigui mejorar brevemente, el paciente
muri un mes ms tarde. La cantidad de
penicilina disponible era demasiado baja,
aunque se obtena de nuevo de la orina del
enfermo, que la mujer de Florey llevaba
cada da al laboratorio. Florey y Chain deban producir primero grandes cantidades de
penicilina antes de poder curar con xito a
los primeros enfermos.

BIOTECNOLOGA BLANCA -

En julio de 1041 los britnicos Howard


Aorey y Norman Heatley empezaron con
el trabajo conjunto en Peora, en lllinois.
Pronto se llam a compaas como Merck,
Squibb, Lilly y PHzer, slo pocos meses
antes de que Estados Unidos entrara en
la guerra.
Cuando Heatley y Aorey fueron a Estados
Unidos, en 1941, no tuvieron grandes
resultados para mostrar: 4 unidades/ml
(1 unidad (unl~ = 0,6 mlcrogramos). Con
sultaron a la Academia Nacional de Cien
cas y Charles Thom, un experto en Pencl
l/lum, les recomend que fueran a la nueva
unidad de fermentacin del recin fundado
Northern Regional Research Laboratory
(NRRL), en Peorla, llllnols. Charles Thom

Norman Heattey (1911-2004) es en la pr~ctica el


hroe silencioso de la historia de ta penicilina.
Heattey inyect a ocho ratones, el 25 de marzo
de 1940, 110 millones de estreptococos a cada
uno, y a la mitad de ellos les inyect penicilina
una hora ms tarde: isobrevivieron! El comenta
rio del jefe Florey, con cierta Indiferencia ante
los ratones vivos, rue "Looks quite promlslng"
(parece muy prometedor).
Heattey no recibi el premio Nobel, pero en
1990 fue el primer doctor galardonado de la
Universidad de Oxford en su historia de
Sooai'ios.

Laboratorio
en Peora.

(1872 1956) fue el primero en tener


Penlcllllum roquefortly P. camembertf, los
hongos activos en la elaboracin del queso
(vase Cap. 1).
Un problema: la cepa de Aeming creca slo
en la superficie (emergente). En el mundo
entero, el ejrcito americano buscaba ahora
P. chrysogenum, causante de fiebre, que
podla crecer sumergido.
Una simple ama de casa [la colaboradora
del laboratorio Mary Hunt, la legendaria
Mou/dy Maryj llev en l 043 un meln
del mercado de Peoria enmohecido con
Penlcl/llum chrysogenum. Sumergido, este
hongo produjo 7080 unidades/mL un
mutante aislado de un nico conldlo, incluso
250 unidades/mL. La cepa de Penicilllum
chrysogenum NRRL, aislada del meln can
taloupe en 1951, fue la madre de las princi
pales cepas modernas.
El equipo de Ja penicilina invent, en lugar
de un cultivo superficial, la tecnologa
deeptank para la produccin masiva de
penicilina. ste fue el momento del naci
miento de la industria de los antibiticos. A
finales de noviembre de 1941, Andrew J.
Moyer, experto en alimentos para mohos,
con Norman Heatley pudo elevar el rend
miento 1O veces utilizando como sustrato
agua de maz (com steep liquotj. El maz
fue, para la economa americana, una plan
ta dominante (vase tambin Cap. 3 para el
jarabe de fructosa) .
El laboratorio de Peora se habla creado,
entre otros motivos, para encontrar una
forma de eliminar estos desperd icios de
maz lquidos que en la produccin del
almidn de los granos de maz se acumula
en cantidades enormes como molesto producto colateral. El agua de maz es una
mezcla de almidn, azcar y sustancia
mineral.
Ms tarde se estableci que la nueva disolu
cin de alimentacin, adems de azcar,
contiene una sustancia que es un precursor
qumico de la penicilina. Esto facilita la produccin natural del moho.

CharlesThom
(1913-1955)
Identific la cepa
de Penlcll/lum.

La War Production Board de Estados Unidos


empez como proyecto en todas partes, por
ejemplo en la Universidad de Wisconsin
Madison, dondeJ.F. Stauffer y Myron Bac
kus analizaron miles de mutantes inducidos
por radiacin UV (vase Cuadro 4.5).

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Backus y Stauffer lograron elevar la produc


cln de 250 a 900 unldades/mL. La mutag
nesls adicional produjo 2500 unidades/rol.
Otras universidades se involucraron:
Stanford, Minnesota y la Camegie lnstitu
tion en Cold Spring Harbor.

Produccin de penicilina en Oxford en 1940.

Afinales de 1942, en Estados Unidos trabaja


ban con la penicilina 17 compailas.
El 1 de marzo de l 044 se inaugur la prime
ra gran Instalacin con cultivo sumergido en
Brooklyn, NY. La produccin salt de 21 O
millones de unidades en el ao l043 a ms
de 6,8 trillones de unidades en el ao 1945.
En mayo de 1943 se trataron con penicilina
en un hospital 1500 militares. Slo un ao
ms tarde se salvaron
innumerables heridos del da D(6 de junio
de 1944) gracias a la penicilina. Las propor
dones haban aumentado desde botellas de
1 litro con menos de un 1%a tanques de
1O000 galones (un galn son 3,8 litros) con
un contenido en penicilina del 80 a 00%.

Cliente satisfecho: la penicilina se venda en


1945 en todas las farmacias de Estados Unidos.

A partir del 15 de mayo de l 045 se tuvo


libre acceso a la penicilina en todas las far
macias de Estados Unidos.
Aeming, Aorey y Chain recibieron en 1045
el premio Nobel. Hasta el da de hoy se
lamentan los britnicos de haber persuadido
a Aorey de no registrar ninguna patente de
la penicilina por motivos ticos.
La Universidad de Oxford no consigui nunca
una parte de la antstica obtencin de la penicilina de los americanos. Ms grave an: el
Reino tuvo que pagar durante aos la cuota de
licencia a las compaas de Estados Unidos!

105

BIOTECNOLOGA

Al principio se encuentran fcilmente mutantes


ventajosas, cuyo rendimiento se mide segn las
colonias individuales crecientes sobre las placas.
Pero finalmente se mejoran las cepas en el laboratorio, tambin si es posible analizando condiciones
similares a las de los enormes reactores. A pesar de
estas dificultades se producen hoy ms antibiticos,
como la penicilina, a partir de cepas altamente pro
ductivas, que se desarrollaron en 20 o 30 ciclos de
seleccin - un trabajo que dur dos o ms dcadas.

4.15 Screening: biotecnlogos


a la caza de hongos
En el mundo entero se busc con gran esfuerzo un
mayor productor de penicilina que el PeniciUium
notatumde Fleming. Se cultivaron los hongos encontrados en medios de nutricin y se analiz la capad
dad de producir penicilina. Para la bsqueda selectiva de microorganismos se desarroll un programa de
screening. La palabra inglesa screeningsignifica fil
trar con un colador (cribado) (Cuadro 4.5).

4.14 Penicillium nototum: el hongo


milagroso de Alexander Fleming

8-.,... -!'--"' ..... ..,.,,,._


":! J.:.:-;:.:!::-"':. :::..
..,-""141-- .,..._.

.-..u tAf

..-..v,_ ..

fig. 441 Alexander Fleming y


sus notas de laboratorio sobre
las placas de Petri con bacterias lsadas con penicilina.

La bsqueda de los mejores productores empez a


avanzar despus de que el gobierno estadounidense participara en el proyecto de la penicilina decisivo para la guerra. En el laboratorio de investigacin
americano de Peora, Florey encontr el soporte
activo. Hasta 1943, sin embargo, no se haba podido encontrar un mejor productor de penicilina que
el hongo de Fleming.

La mayora de nosotros no hemos vivido la poca


en que los mdicos se enfrentaban casi sin recur
sos a las infeccones bacterianas graves. Una dermatitis bacteriana provocaba casi inevitablemente la muerte. Los pocos casos de meningitis causadas por meningococos que sobrevivan, sufran
discapacidades mentales. Las infecciones pulmonares producidas por neumococos se conocan
con el nombre de "amigo del viejo" porque con
cedan una "muerte misericordiosa" a las perso
nas ancianas.

Precisamente en la puerta de casa, en la misma Peora, se encontr el moho que ms tarde se denomin Penicillium chrysogenum, o sea, de otro tipo
que el hongo de Fleming. Se encontr sobre el
meln cantal upo (cantaloupe} (Fig. 4.42) y result
ser un moho enormemente productivo. Actualmente se cultiva este moho. An hoy, la mayor parte del moho con esporangio en forma de pincel utilizado para fabricar penicilina procede del meln de
Peo ria.

Con este trasfondo, la penicilina debi aparecer


como una medicina milagrosa, con su elevada eficacia contra un gran nmero de bacterias patgenas y su bajsima toxicidad. En 1928, el conocido
microbilogo Alexander Fleming (1881-1955),
al cual conocamos por la lisozima (Cap. 2), observ que Penicillium notatum inhiba determinados
cultivos bacterianos (Fig. 4.41 )-

Fig. 4.42 Sobre un meln


cantalupo (canta /aupe) se
encontr el hasta entonces
ms potente productor de
penicilna (experimento realizado por el autor).

La penicilina marc el principio de una nueva era


en la lucha contra la enfermedad. El Cuadro 4.6
describe detalladamente este descubrimiento, que
al principio infravalor el propio Fleming, y la contribucin de Florey, Heatley, Chain y otros. Las
posteriores curaciones de infecciones bacterianas
lindaban con el milagro. Pero la preparacin de la
penicilina era demasiado difcil y demasiado cara.
Para tratar solamente un nico paciente se deban
obtener y procesar aproximadamente 1000 litros
de "mezcla de hongo".
Se deban solucionar tres problemas:

fig. 4.43 Moderna produccin de penicilina en cultivo


sumergido.

106

haba que encontrar un tipo de moho con esporangio en forma de pincel con la mayor produc
cin de penicilina (Cap. 4.15}
generar el hongo en enormes cantidades (4.16)
definitivamente, se necesitaban procedimientos
para separar la penicilina pura del medio
nutriente (4.17).

De modo similar a la reproduccin de anmales y


plantas, siempre son los mohos de mayor eficacia
los que proliferan, y durante generaciones se han
venido obteniendo hongos de gran eficacia.
En la dcada de 1920 se determin que la composi
cin gentica se cambiaba artificialmente. Los rayos
X y determinados productos qumicos provocan
grandes mutaciones en las clulas. En los mohos
con esporangio en forma de pincel, los investigadores utilizaron los rayos X, la radiacin ultravioleta y
el tratamiento con productos qumicos [gas mostaza), y se eligieron entonces los mejores formadores
de penicilina. En conjunto, estos mohos se sometieron a tales procedimientos ms de 20 veces (Cuadro 4.5). Los mejores mutantes de los hongos produjeron finalmente siete gramos de penicilina por litro.
El hongo de alta eficacia actual se diferencia
mucho de su predecesor de principios de los aos
1950. Forma como media 100 g de penicilina en
un litro de caldo nutriente, que es 2000 veces ms
que la que poda formar el hongo unido al meln.
Se producen 20 000 veces ms que la que produ-

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B IOTECNOLOGA BLAN CA -

Cuadro 4.7 Cmo funciona


la penicilina: inhibidores de
enzimas que actan como
molculas sucedneas
El desarrollo de la penicilina fue una etapa
muy importante para el nacimiento de una
bioindustria moderna. Sin embargo, por qu
la penicilina mata a determinados microbios
permaneci durante mucho tiempo sin acla
rarse.
Hoy sabemos que las bacterias, al crecer,
toman penicilina junto con los medios nu
trientes. Las bacterias deben unirse durante
su divisin a las nuevas paredes celulares
mediante cadenas laterales de aminocidos
con la ayuda de sus enzimas especiales cons
tructoras de paredes. La penicilina inhibe
estas enzimas durante su trabajo. Es una
"molcula sucednea", es decir, la penicilina
ve su sustrato engaosamente similar, se une
e impide as! la transformacin del sustrato
"autntico" en un elemento de la pared.
Esto se denomina inhibicin competitiva.
El mecanismo de accin lo aclar en 1957 el
posteriormente ganador del premio Nobel
Joshua Lederberg !nacido en 1925).
Mediante un experimento se demostr que
la penicilina simplemente impide la unin de
la pared celular bacteriana. En la disolucin
nutriente, que tenla un elevado contenido
en sal, las bacterias pudieron crecer a pesar
de la presencia de penicilina, pero no se for
m ninguna pared celular. Se obtenan as
protoplastos de bacterias "desnudas", sin
pared celular, que si se transferan a un

medio nutriente normal explotaban porque


les faltaba la proteccin de la pared celular.
En 1965 James Park yJack Strominger des
cribieron el mecanismo de accin exacto de la
penicilina: la pared celular de las bacterias
consta de largas cadenas de azcar (murena)
que estn conectadas mediante cadenas polipeptdicas (peptidoglicanos). Esta fonnadn
de puentes se cataliza con la enzima glicopptido transpeptidasa. La penicilina bloquea esta enzima, ofrecindose como perfecta
imitacin de un puente proteico y causando
de este modo el final de la produccin de la
pared celular de las bacterias. El resultado de
la accin perturbadora de la penicilina es catas
trfico para las bacterias: se originan lugares
no estancos en las paredes celulares y stas ya
no pueden mantener la presin osmtica de la
clula, que se hincha y explota.

Pared celular bacteriana (grampositivo)


Esqueleto de murefna
: (conectado por cadenas peptdicas)

Membrana citoplasmtica

Cadena peptdica,
que conecta el esqueleto de mureina

'

La penicilina inhibe, pues, la proliferacin de

las bactertas, pero no mata las bacterias adultas.


Por ello no es suficiente tomar penicilina sola
menee durante el tiempo en que uno se siente
enfermo! En el momento en que se divide una
bacterta, la penicilina puede ejercer su accin
inhibidora sobre el crecimiento bactertano. Por
ello, la penicilina se administra durante varios
das y es muy peligroso interrumpir el trata
miento arbitrariamente, en contra de la pres
crtpcin mdica, en cuanto uno experimenta
una cierta mejora. Los microbios supervivien
tes se recuperan entonces rpidamente, proliferan, y el paciente puede sufrir una grave recada. Los microbios supervivientes incluso se han
hecho en parte resistentes y aceleran la lucha
entre humanos y microbios.

ca el hongo de Reming! Los grupos de microbios


de un tipo que se diferencian fuertemente en sus
propiedades, y tambin las heredan, se denominan
cepas. Las cepas de alta eficacia son generalmen
te tan delicadas y tan mimadas por los biotecnlo
gos que no podran sobrevivir en condiciones nor
males naturales (al igual que muchos de nuestros
animales domsticos].
El supermoho no utiliza su propia capacidad de for
mar 1000 veces ms penicilina que su predecesor.
Esta sobreproduccin la fuerzan los humanos, modi
ficando su programa hereditario y cambiando sus
condiciones de vida, de la misma forma que un ani
mal domstico moderno puede existir y reproducir
se slo en un mundo artificial, a temperaturas agradables, con alimentacin suficiente y apropiada, y
protegido de competidores y enemigos naturales.

Cefalosporina

Pared celular que ha explotado tras la accin


de la penicilina
Accin de los antibiticos con un anillo
de lactama: ambos impiden por su similitud
a la cadena peptldica las conexiones cruzadas
de las cadenas de murelna.

4.16 El men de los microbios

Qu necesita un microorganismo para encontrar


se bien? Primero, comida. Preferentemente los
microbios "comen" las sustancias orgnicas fcil
mente digeribles, elementos bsicos como glucosa,
cidos grasos y aminocidos. Las sustancias comple
as, como almidn, celulosa, pectinas y proteCnas,
en general no pueden utilizarlas directamente. Se
deben preparar fuera de la clula. Para ello slo hay
un camino para los microbios: las enzimas extra
celulares (Cap. 2). Por ejemplo, para degradar
almidn a glucosa, las clulas deben segregar amila
sas a su entorno (el medio). Se podra ver como un
tipo de digestin externa.

Flg. 4.11 Pequeo fermenta


dor para la produccin de
antibiticos en un trabajo
preliminar de Jenapharm.

En el medio, las amilasas fragmentan el almidn


hasta que los microbios estn rodeados de glucosa,

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107

B IOTECNOLOGA

Cuadro Lf.8 Historia de la


biotecnologa: El calor, el vaco
y el fro - Conservas estriles
Ya 50 aos antes del descubrimiento de
Pasteur, el cocinero francs Nicolas Appert
invent -sin el conocimiento de los micro
bios vlvos - la esterilizacin por calor.

presin del aire. Para demostrar la capacidad


de crabajo de la presin del aire, en 1657
Guericke intent separar, hasta con 16
caballos, las dos mitades de una esfera vaca
por bombeo. l no saba que habfa descu
bierto con ello una parte esencial del proceso
de preparacin de conservas: el cierre al
vaco de los frascos.
Las conservas de Appert duraban meses;
tambin las prob la marina francesa.
En 1809, Appert consigui 12 000 francos
de oro, una fortuna! Hoy seran, segn
los clculos de algunos historiadores,
250 000 euros). Divulg su mtodo y con
ello fue el fundador de la moderna lndus
tria de conservas.

El cocinero Nicolas Appert (1749-1841),


fundador de la industria de conservas con
Napolen.

En 1795, Napolen fij un precio por encon


trar un proceso utilizable para poder hacer
duraderos du rante largo tiempo los alimen
tos de la campaa de su ejrcito. Appert tra
baj 14 aos en ello. Calent los alimentos
en botellas y vasos, y tap el contenido
impermeable al aire con corchos. El princi
pio obturador de vaco se consigui con los
experimentos realizados por Otto von Gue
ricke (1602-1686) yDenis Papin (1647
17121.
Otto von Guericke se hizo famoso con el
experimento histrico ante el Parlamento
Alemn, en Regensburg, el ao 1654, con
los denominados "hemisferios de Magdebur
go", con los cuales demostr a sus asombra
dos espectadores el tamao y la fuerza de la

En 18 1O, el britnico Peter Durand solu


cion el problema de la rotura del cristal en
las conservas: fabric latas de acero forradas
con estao. Haba nacido la lata de conser
vas. Los britnicos llamaron a la carne en
conserva embalmed meat{carne embalsa
mada).
El 19 de mayo de 1845 parti de Londres
una expedicin. Abordo de dos embarcacio
nes se encontraban los 134 mejores oficiales
y equipos de la marina britnica bajo el ma n
do del experto polar Sir John Franklin. Su
objetivo era explorar el paso norte-oeste.
Nunca antes se haba equipado a una exped
cin de este tipo con tanto lujo: calderas de
agua caliente para la calefaccin, hlices de
barco accionadas por presin de vapor, pla
cas de hierro como protectores para el hielo,
y conservas y combustible para al menos tres
anos. Nadie poda sospechar que ninguno
volvera vivo de ese viaje. Una cragedia
incomprensible del slglo XIX: cmo no se
pudo salvar un equipo tan experimentado?
En 1986 se liberaron del hielo tres de los
marinos enterrados en l y se investigaron
cuidadosamente. La tripulacin de Franklin

que puede ser captada fcilmente. Si utilizan prote


nas, las clulas liberan las proteasas fragmentado
ras de protena, y de la degradacin de la celulosa
en el medio se ocupan las celulasas (Cap. 2).

Fig. 4.15 El autoclillle utiliza


vapor a presin para esteli
zar medios nutrientes.

108

En la industria se utilizan, junto con la glucosa, taro


bin el almidn y el azcar de remolacha. El almi
dn proviene de los cereales, el azcar del maz o de
la melaza. La melaza es un residuo oscuro, viscoso,
que se acumula en la produccin de azcar y contie
ne aproximadamente la mitad de azcar de remola

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no muri, como se habfa supuesto, de ham


bre, fro o escorbuto, sino de un masivo
envenenamiento por plomo. Los asesinos
fueron las latas de conserva de las provisio
nes, en ese momento todava un nuevo des
cubrimiento. Se hablan cargado 8000 latas
en las embarcaciones, que estaban soldadas
con plomo y, segn el Fabricante de estos
suministros haba confesado, debido a una
obvia presin de tiempo, en el interior de las
latas se haban hecho juntas de soldadura.
Una gran cantidad del infinitamente venenoso plomo fue captado por los marinos con la
alimentacin diaria y produjo el envenena
miento. Los metales pesados descruyen tos
puentes disulfuro en las protenas y actan
con ello como inhibidores de enzimas (vase
Cap. 3). Los sntomas tpicos de la enferme
dad eran anorexia, agotamiento, irrh:abili
dad, paranoia, prdida de concentracin,
incapacidad para tomar decisiones claras...
Se encontr la prueba en los anlisis de los
tejidos en los cadveres encontrados: una
sobredosis de plomo de aproximadamenre
diez veces.

Propaganda para el aparato de enlatar y un


frasco de vid ro con pia del ao 1897.

Casi 100 anos tras la expedicin de Franklin,


el estadounidense Clarence Birdseye
(1886 l 956) fue a una expedicin al Labrador
para el Servicio Geogrfico de Estados
Unidos.

cha. El almidn insoluble en agua se cuece prime


ro y con ello se hace soluble, y con la ayuda de las
amilasas, que se obtienen de los microbios, se degra
da a azcar. Otros alimentos, como Jos aminocidos,
provienen de la harina de las habas de soa, del agua
de maz (com steep liquorj o del concentrado, el
producto residual de la fabricacin de cerveza.
Finalmente, para su crecimiento los microorganis
mos tambin necesitan sales minerales {sales de
amonio, nitrato, fosfato) y, segn el tipo, ms o

BIOTECNOLOGA BLANCA -

Not que el pescado y la carne de carib,


expuestos al helado aire rtico, an estaban
frescos meses despus de su coccin. Lleg
a la conclusin de que la congelacin rpi

1892. Su esposa escribi ms tarde a la


compaa Weck: "han pasado SO aos desde
que mi difunto marido, el Dr. Rudolf Rem
pel, qufmico en la compaa para destilacin

da a temperaturas extremadamente bajas

del carbn en Gelsenkrchen, hizo los pri

era el secreto de la frescura. Desarroll


entonces en Estados Unidos su Multiplate
Qufck Freeze Machine, patentada, y conge
l en un Instante carne a 40 Fahrenheit.
En 1925 se produjo el primer filete de pes
cado congelado, y luego vinieron otros ali
memos. Tras el desastre inicial, ya no era
posible Imaginar la vida de los americanos
sin comida congelada.

meros experimentos para esterilizar los pro


duetos alimentarios. En ellos utiliz vasos
de los laboratorios qufmicos, cuyo borde
haba pulido. Equip los vasos con un anillo
de goma y una tapa de hojalata y cocin el
alimento al bao Mara, colocando un obje
to pesado {piedra o peso) sobre la tapa del
vaso.
La leche esterilizada, que l abri meses

Johann Weck (izquierda) y Georg van Eyck


(derecha).

En la Segunda Guerra Mundial, el estao era


escaso debido al control inicial de los apone
ses sobre el Pacfico. Adems, todas las latas
de estao disponibles se desviaban en Esta
dos Unidos para el consumo por parte del
ejrcito - un inicio ideal para Frozen Food
de Birdseye, pues no se necesitaban lacas de
estao!
Una forma "muy alemana de conserva es
el enlatado; los inquietos americanos nunca
habran dedicado tiempo a eso.
En Alemania, Rudolf Rempel (1859-1893)
consigui una patente de su mtodo en

ms tarde cuando fue de visita a! laborato


rio, para preparar caf, saba maravillosa
mente fresca. Entonces empezaron los
experimentos en casa, los domingos en que
no trabajaba, con fruta y verduras, que
recogamos en nuestro gran jardn. Yo pul
los vasos en el fregadero con la ayuda de
polvo esmerilado, lo que no me dio poco
trabajo, y probamos a esterilizar todos los
posibles tipos de fruta y verdura con buena
apariencia. Algunos vasos no cerraron, pero
!os cerrados mantuvieron fantsticamente
su contenido. Ahora trataba de fabricar un
aparato que mantuviese la tapa del vaso
mientras se coca. Un aparato en el que se
enroscaran los vasos al cocer se aplic en
unos pocos casos. Construy entonces un
aparato que sostena los vasos bajo presin
elstica. (... )

el 1 de enero de 1900, la compaa J. Weck


&Co.
El mismo Weck dijo: ~No hubo paciencia,
la compaa abandon por razones personales y familiares pronto tras su fundacin, en
el ao 1902, con un gran acuerdo" (citado
de un escrito de la compaa]. Georg van
Eyck entren a sus compaeros de trabajo y
organiz en todo el pas con ahnco la Introduccin y la venta del vaso de Weck y del
aparato de Weck. Introdujo profesoras de
economa domstica, que daban conferen
cias en escuelas de cocina, parroquias y
hospitales con instrucciones prcticas sobre
!os vasos y aparatos, y mejor constante
mente los vasos de coccin, los anillos de
goma, los aparatos de coccin, los term
metros y aparatos auxiliares, que se vendie
ron bajo la marca Weckl'. Sus agradecidas
destinatarias fueron las ahorradoras e indus
triosas amas de casa alemanas - un xito
completo!
Con la marca Weck!', Van Eyck cre uno de
los primeros arcfculos de marca en Alemania
y estableci un anuncio sumamente progre
sista, en el que como indicativo de marca
(Trademark) se utiliz una fresa con la pala
bra Weck escrita.

Entre los primeros clientes haba un tal seor


Johann Weck. l mostr un gran inters
por el material y pidi un vagn entero de
vasos. En el ao 1895, Weck, tras comprar
la patente de Rempel, se traslad a la fronte
ra suiza, hacia llingen, cerca de
Sllckingen, en Baden."
Un comerciante muy capacitado, Georg
van Eyck, fund junto con Johann Weck,

menos oxgeno. Algunos microbios, como las meta


nobacterias, deben protegerse completamente del
oxgeno, porque es txico para ellas.
Cuando se empez a cultivarlos durante la Segunda
Guerra Mundial, primero se utilizaron medios nutrien
tes que contenan glucosa y tambin sales minerales.
Los hongos utilizaban el azcar y crecan rpidamen
te. Sin embargo, formaban poca penicilina. Casual
mente se encontr, en el laboratorio de Peoria, un
medio nutriente ideal, que es ms barato y bueno

Anuncio de la
compaia Weck
para preparados
almentarios.

para la produccin de penicilina: el agua de maz. Las


ironas de la historia: en Peoria se haba creado especialmente un departamento para buscar formas de
eliminar el agua de maz sin producir contaminacin.
Igual que para los mohos con esporangio en forma de
pincel, para cada tipo de microbio se debe encontrar
la mezcla de alimentacin apropiada; adems, debe
ser lo ms barata posible. En realidad se dejan para el
pienso todos los productos residuales que contienen
azcar, por ejemplo residuos de la agricultura o aguas

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Fig. 4.46 Para cada microor


ganismo (aqu bacterias)
debe encontrarse la apropia
da mezcla de nutrientes.

109

BIOTECNOLOGA
Plruvato

'u't'u'
A

residuales de las fbricas de celulosa. Los microorga


nismos especiales son capaces incluso de utilizar
Aceto1actato
sintasa
materias difcilmente digeribles, como residuos del
petrleo y productos de desecho plsticos. Con ello
es posible utilizar materiales que, de lo contrario,
Acetohidroxicldo
ismero
alcanzaran las aguas residuales o intoxicaran de otra
manera nuestro entorno. Estas materias no son slo
reductasa
e[)
baratas sino que sera muy caro conseguirlas de otra
manera. La biotecnologa explota reservas de pienso
1Dihdroxicido
t deshidrogenasa que de lo contrario no se utilizaran, y ayuda al mis
mo tiempo a mantener limpio el medio ambiente.
A

+
+
t

1Valina amino

ttransferasa
Valin{)

1
cido
amino ACV sintasa

adipnico~

~
l
t

lsopenitillnaNsintasa

lsopenicilina
N-amidohi
drolasa

Acil-CoA:
6-APA-acil
transferasa

~
Penicilina G

4.17 La biofbrica moderna


Ninguna chimenea humeante! Contenedores de
acero inoxidable colocados verticalmente en un
espacio claro, soldado, de la medida de una cister
na, que estn rodeados de un laberinto de gasoduc
tos, vlvulas y aparatos indicadores. Fuera, a cielo
abierto, se encuentran otros colosos de acero, gran
des como altos hornos. Los contenedores de acero
se denominan biorreactores o fermentadores.
Los biorreactores modernos (Cuadro 4.1 O) son ver
daderos prodigios de la tcnica y el resultado de
dcadas de trabajo de investigacin. Para su de
sarrollo, la "caza" de la penicilina fue un impulso
decisivo. Cuando Florey, Chain y Heatley buscaron
recipientes para reproducir los mohos con esporan
gio en forma de pincel, empezaron con un pequeo
frasco plano de cristal.
En la superficie de la solucin nutriente (cultivo
Emmer) nadaban los hongos. Con ello nunca se
pudo producir tanta penicilina como para cubrir la
demanda para curar a personas enfermas. Los fras
cos de vidrio necesitaban un espacio. Los cientficos
se dijeron que el hongo no debfa crecer solamente
en la superficie, sino prosperar en el conjunto de la
solucin nutriente sumergidos, pues su reproduc
cin sera sencilla y ahorrara espacio.

Fig. 4.47 Biosntesis de


penicilina en la clula a
partir de piruvato.

Sin embargo, la cepa salvaje de Penicillium nota


tum de Fleming se poda multiplicar solamente en
la superficie. Por fortuna, se encontr en Peora una
nueva cepa de Penicllium chrysogenum que, al
mismo tiempo, era buena "buceadora"!
Crece tambin en un cultivo sumergido si se con
sigue enriquecerlo con oxgeno, como cuando se
bombea oxgeno para los peces en un acuario. Para
bucear, el hongo necesit a Andrew Moyer en
Peora (vase Cuadro 4.6).

Fig. 4.48 Los paquetitos de


masa chinos (Dim sum) se
cocinan en cestos de bamb
sobre vapor de agua, y con
ello los microbios mueren de
modo efectivo.

11 o

Para la produccin de penicilina hoy se utilizan prin


cipalrnente biorreactores con l 00 000 a 200 000
litros de capacidad. En los reactores de laboratorio
slo caben algunos litros de solucin nutriente, para

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producir nuevos descubrimientos sobre los micro


bios. El xito depende del trabajo conjunto de cien
tficos, ingenieros y constructores; un proceso bio
tecnolgico que genera buenos resultados en el
laboratorio, tambin funciona en biorreactores
industriales 1O000 veces ms grandes. Pero la
ampliacin del patrn (scaling up) suele ser un pro
blema complicado (Cuadro 4.10).
Naturalmente, para que los microbios se encuentren
bien tambin es importante la temperatura del
medio. La "temperatura de confort" de los organismos
principales se encuentra en un intervalo de 20 a50 C;
se producen pues, preferentemente, a temperaturas
desde normales hasta tropicales. Por ello descubrimos
pocas chimeneas en la biofbrica. Por el contrario,
para la produccin de sustancias en la industria qumi
ca se requieren temperaturas de ms de 100 C.
No obstante, los procesos biotecnolgicos a menu
do requieren refrigeracin, y a veces sta es ms
cara que la calefaccin. As, como muchos seres
humanos en un pequeo espacio, los mohos y otras
clulas en el biorreactor producen por su metabolis
mo un exceso de calefaccin. Las paredes del bio
rreactor deben refrigerarse con agua para evitar un
sobrecalentamiento mortal.

4.18 Calor, fro y sequedad nos


mantienen los microbios en el cuello
En los biorreactores, las perturbaciones invisibles
causan grandes preocupaciones al biotecnlogo
(Cuadro 4.10).
Qu necesitan las mejores cepas de penicilina, si
en el biorreactor los microbios indeseados se ali
mentan del medio nutriente, inhiben el crecimien
to del hongo o ceden materias txicas a la disolu
cin de alimentacin? Todos los medios nutrientes
y tambin el aire bombeado hacia dentro deben
calentarse durante un corto tiempo y as hacerlos
libres de microbios (estriles).
Los biorreactores tambin se esterilizan antes del
inicio del crecimiento de los microbios. Tambin el
caldero se esteriliza con vapor. Hay otra estrategia
para reducir el peligro de infeccin: si en el caldero
existe una sobrepresin baja, a los grmenes les es
difcil entrar desde fuera. Especialmente grande es
el peligro de infeccin en las vlvulas de salida y
entrada. Para garantizar aqu unas condiciones
libres de grmenes, se insufla vapor de agua calien
te a travs de los tubos de apertura de las vlvulas.
El calor se aplica tambin al metabolismo (Fig. 4.48)
y en la industria de alimentos para matar grmenes,

BIOTECNOLOGA BLANCA

Cuadro 4.9 Preparacin


biotecnolgica de antibiticos
- Cmo y dnde actan

na. Se aplica sobre todo como ltimo recurso


en infecciones por Staphylococcus aureus
resistentes.

Hasta ahora se han aislado ms de 8000 anti


blticos de microorganismos y ms de 4000
de organismos superiores.

2. lnhibidores de la sntesis de protenas


Las tetraciclinas son antibiticos de amplio
espectro, y despus de los Plactama son los
principales antibiticos que se utilizan. Tienen
una cotizacin en el mercado de ms de tres
mil millones de dlares. Se unen a la subuni
dad 30$ de los ribosomas (vase Cap. 3) y se
rorman exclusivamente de estreptomicetos.
Las antraciclinas, como la doxorrubicina,
inhiben la replicacin del DNA, sobre el cual
se unen en el "surco" de la hlice e inhiben
las topoisomerasas (las topoisomerasas modi
can la ''espiralizacin" de la hlice del DNA
y desempean, por lo tanto, un papel decisi
vo en la replicacin, la transcripcin y la
recombinacin).
El cloranferticol de Streptomyces venezue
lae es el primer antibitico histricamente
de amplio espectro y bloquea la
peptidil transferasa de los ribosomas.
La griseofulvina es un antibitico fungicida
producido por fermentacin que inhibe la
divisin celular de hongos y la formacin del
huso celular. Se utiliza contra dermatosis y
en plantas contra los hongos.

Segn su mecanismo de accin, los antibiti


cos pueden clasificarse a grandes rasgos en
tres grandes grupos:

1. lnhibidores de la pared celular


Los antibiticos Plactama (penicilina,
cefalosporina y sus derivados), con un
anillo lactama de cuatro miembros, son los
ms importantes. Se producen anualmente
30 000 t. Impiden el cruzamiento pepdico
en la pared celular bacteriana. Los represen
tantes ms lmp<,rtantes son Ja penicilina e
y la cefalosporina C, que se producen de for
ma semisinttica.
Sobre la membrana celular de levaduras
y hongos (no en bacterias) trabajan los
polienos, que se unen preferentemente a
estreptomicetos. Algunos, como la nistatina
y Ja anfotericina B, se utilizan en las infeccio
nes por Candida, y la pimaricina en Ja elaboracin de queso. Tambin el glucopptido
vancomicina, de Amycolatopsis orientales,
inhibe la sntesis de la pared celular bacteria

3. lnhibidores del DNA


Los antibiticos macrlidos inhiben las bac
terias grampositivas unindose a la subunidad
SOS de los ribosomas bacterianos, y con ello
interrumpen la cadena polipeptdica crecien
te. La eritromicina y Ja espiramiclna se uti
llzan en infecciones de las vas respiratorias.
La eritromicina Ja produce Streptomyces
erythreus(ahora Saccharopolyspora erythrea).

La relacionada tilosina (contra micoplasmas) se

o sea microbios perjudiciales: pensemos slo en el


simple proceso de heIVir o pasteurizar la leche, la
elaboracin de mermeladas de fruta o les procesos
de conservas -en todos se matan bacterias y una
gran parte de esporas de hongos mediante calor
(Cuadro 4.8). Puesto que Jos recipientes estn cerra
dos hermticamente al aire, no pueden entrar
microbios ni tampoco el oxgeno que requieren los
principales microorganismos para su crecimiento.
Tan pronto como entra aire, se estropea el conteni
do. Nuestros padres recuerdan an los tarros de
conserva que no estaban bien cerrados y cuyo con
tenido se enmoheca.
Aparte de Ja temperatura elevada se puede utilizar
tambin el fro (Fig. 4.49) para detener la prolifera

utiliza en la disentera porcina !prohibida en la


UE, pennitida en China). Tienen una cotiza
cin en el mercado de 2600 millones de dla
res americanos.
Las ansamicinas, como Ja rlfampicina, un
derivado semisinttico, son los principales
antibiticos contra la tuberculosis y la lepra.
Inhiben Ja RNA polimerasa de las bacterias
(pero no la de eucariotas, vase Cap. 3)
mediante la unin a su subunidad p. La
materia prima para Ja rifampicina se produce
mediante Nocardia mediterranei(hoy Amycolatopss). Los antibiticos peptdicos,
como la bleomicina de Streptomyces vertici
llus, son importantes antibiticos cancerlge
nos. Para conseguir Ja inmunosupresin se
utiliza Ja ciclosporina, que se forma en
Tolypocladium injlatum. Anualmente se pro
ducen tres toneladas, con una cotizacin de
l 30 millones de dlares americanos.
Cada ao se convierten cuatro toneladas de
bacitracina de Bacillus Jicheniformi, por
100 millones de dlares, para curar heridas,
y ms de 200 toneladas por 20 millones de
dlares para aditivos de pienso.

En el ribosoma se colocan la tetraciclina, el


cloranfenicol y los antibiticos macrlidos. lnhi
ben la biosntesis de protenas de las clulas.

cin indeseada de microorganismos. Puesto que los


principales microbios requieren calor, los alimentos
se protegen en la nevera o se congelan en el conge
lador. As se inhibe el crecimiento de los microbios
slo temporalmente, pero no se matan. Muchos
microorganismos sobreviven incluso a la tempera tu
ra del nitrgeno lquido, -196 C, sin daarse. Las
comidas descongeladas deben utilizarse de inmedia
to para no ser un medio de alimentacin ideal para
los microbios que han despertado del sueo del fro.
Puesto que los microbios necesitan siempre agua
para vivir, se puede impedir su crecimiento tambin
mediante el secado (ciruelas secas, rosquillas, pesca
do seco). En la conserva en sal (arenques) o en una
fuerte disolucin de azcar [jarabe) se extrae tam

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Fig. 4.49 Se usa el congela


dor {el que aqu se muestra
alcanza-So O para el alma
cenamiento durante largo
tiempo de muestras bioqu
micas infectadas. Para las
c~lulas se utiliza nitrgeno
lquido (-196 Q.

11 1

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.10 Biorreactores:


Espacio para vivir y buenas
condiciones para los microbios
En principio, el biorreactor, ncleo de toda inscalacin de produccin biotecnolgica, es una
continuacin del antiguo tanque de fermentacin, con una periferia tcnicamente compleja. El desarrollo del biorreactor empez con
sencillos fosos para desperdicios, y ms tarde
se utilizaron como contenedores recipientes
de cuero, madera o cermica, cubiertos, para
la produccin de alcohol y cido actico. El
autntico avance se produjo primero con el
trabajo de Pasteur y los conceptos de cultivo
puro, esterilidad y producto puro.
Histricamente es significativo el reactor
superficial para la produccin de cido ctrico y el reactor de membrana, que utilizan
cuerpos de goteo en la purificacin de aguas
residuales aerbicas. Ambos son fciles de
manejar, pero tienen un rendimiento espacio-tiempo bajo. Para la produccin con leva
duras de coccin de productos qumicos
orgnicos (acetona, butano!), y finalmente,
de penicilina, fueron importantes en el siglo
XX los biorreactores, que posibilitaron un
control preciso del desarroUo del proceso. El
modelo habitual es el reactor de agitacin.
Est termostatizado, tiene agitacin y gasificacin, tuberas estriles y vlvulas de entra
da de muestras.

Hoy se diferencan dos grandes grupos de


procedimientos en los biorreactores: en
el procedimiento discontinuo (procedimiento Batch o de cargas) se llena la calde
ra al principio con el material de partida
completo y con los microorganismos.
Entonces empieza Ja conversin bioqumi
ca, que puede durar algunas horas o varios
das. Finalmente se vaca el tanque y se
purifica el producto de sustancias exgenas.
Luego puede empezar un nuevo ciclo de
produccin.
En el procedimiento continuo se proporcionan constantemente al reactor los materiales de partida y se saca la cantidad correspondiente de la mezcla de reaccin con el producto. Incorporacin y salida deben igualarse
una con otra, de modo que formen un equilibrio de flujo. Los procesos de produccin
continuos se parecen a los de una refinera de
petrleo. La explotacin por cargas se podra
comparar, en cambio, con los mtodos de
produccin en la coccin del pan.

ms apropiados para grandes volmenes de


produccin (por ejemplo en instalaciones de
aguas residuales) que los discontinuos, a pesar
de preferirse a menudo la explotacin por cargas porque slo se requieren pequeas canti
dades de producto. El biorreactor no se modifica en la fabricacin de otros productos y
puede mantenerse estril fcilmente.
Hay diversos tipos de biorreactores, que pue
den clasificarse de manera diferente.
En cuanto a su capacidad, los biorreactores
se dividen en:
Reactores de laboratorio (< 50 L)
Reactores de investigacin (50- 5000 L)
Reactores industriales (>50 Lhasta
1500000 L).
Segn la relacin altura:dimetro se diferencia entre reactores de tanque (A:D = 3) y
reactores en columna (A:D > 3).
Segn el tipo de rendimiento de energa, los
reactores se pueden clasificar en:

Hay tambin una combinacin de ambas:


en la produccin semicontinua los microbios permanecen hasta 90 das en el biorreactor, pero el medio se cambia a diario.

Reactores agitados mecnicamente (reactores de calderos de agitacin o reactores


de tanques agitados), que son los ms verstiles, por ejemplo para la produccin de
antibiticos

Finalmente, en la eleccin del procedimiento


es crucial el punto de vista econmico. En
principio, los procedimientos continuos son

Reactores con bomba de flujo colocada en


el exterior (reactores de chorro de buceo),
Motor
...........................................................................

Material de alimentacin

Bomba

-- - ------ -------

..../ ................................R.~.~~~Y..~c_i_~!!l.~.~~~~_il

:~.~F'::.::.!. . .:...............................:
/
........... i..............~.DR!TI!!.~(!!

_...,..m-1~u. -

Vapor

Toma de muestra

----------------
....

Filtro de aire

.................

--Control
--------------- ------IIl
de temperatura
Agua de refri eracin
Envuelta de refrigeracin

Aire

Biorreactor de tanque de agitacin


Aparato para la "cosecha"

112

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BIOTECNOLOGA BLANCA -

Desarrollo histrico de los


biorreactores
(fermentadores)
a Hoyo con cubierta
(deshechos humanos,
biogs)

.....

b Contenedor sencillo de
madera, cuero, metal, plst.ico (vino, cerveza, alcohol,
vinagre, leche agria)

e Reactor abierto (fabricacin de cerveza) con control de temperatura

. ...

d Reactor estril para la


fermentacin controlada
(levaduras, productos
qumicos especiales)

.....
e

J....
f

por ejemplo para la produccin de levadu


ra como pienso
Reactores con produccin de energa
mediante compresin de gas (reactores de
ascensin de aire con circulacin interna y
externa), por ejemplo para la produccin de
protemas unicelulares (levadura de petrleo, bacterias de metanol) y la purificacin
de aguas residuales ("torre de biologa").
Un problema crucial al cultivar clulas libres
es la mezcla Ininterrumpida del producto
de fermentacin conjunto. Normalmente se
necesita tambin una buena ventilacin
pues los procesos son en general aerbi~os.
El reactor de agitacin es el biorreaccor utilizado con ms frecuencia. La mezcla se consigue mediante agitacin o bombeo. El reactor de agitacin puede tener hlices o turbi
nas para agitar, que insuflan aire y lo dispersan. A menudo se combinan ambas. Especialmente si la relacin de la altura del fermenta
dor respecto a su dimetro es mayor de l 4
se deben utilizar varios agitadores.
' '
Las fermentaciones "toscas" (proceso de
sumergir vinagre o levaduras y estacin
depuradora) utilizan biorreactores sin dis
tribucln activa de aire. El agitador (hlice
o turbina) se ocupa entonces de las turbulen
cias y separa el aire al mismo tiempo. Para

Cultivo de bacterias: Escherlchia col/ y


Klebsiel/o pneumonloe en agar de
Levine

e Reactor de tanque
agitado (antibiticos)
Reactor en torre tubular
(cerveza, vino, vinagre)
g Reactor de ascensin de
aire .:on circulacin interna (levadura para componentes de petrleo)

Instalacin para el cultivo de


microorganismos

h Reactor de ascensin de
aire con circulacin externa (bacterias de metanoO
(Segn Greenshields y
Rothman, 1986.)
Desarrollo de procesos en una tcnica
de fermentacin

clulas de mamfero sensibles no son apro


piados tales reactores (Cap. 3). En la fabrica
cin de cerveza y la produccin de levadura
se utiliza la fermentacin de los mismos
gases (C02) . El producto de la fermentacin
se mezcla neumticamente mediante el C02
producido y el aire introducido. En los reactores agitadores hidrulicos se usan bombas
para la mezcla.
Todos estos biorreactores trabajan con mezclas homogneas de medio y clulas. En cam
bio, en los reactores de membrana se
separa el catalizador (clulas o enzimas) del
producto mediante una membrana, que no
es permeable para el biocatalizador. Esto lo
hemos visto en la produccin enzimtica de
aminocidos en el Cap. 2. De forma especial,
en el reactor de fibra hueca las enzimas o
las clulas se encuentran Inmovilizadas sobre
la superficie exterior de las fibras. El medio
pasa a travs de las fibras huecas por el bloca
talizador. Utilizando haces de fibras huecas se
obtiene un rendimento elevado y, de este
modo, una gran productividad en un espacio
ms pequeo. Los reactores de Jecho fijo
contienen un relleno de material de sopone
(por ejemplo vidrio poroso o celulosa) con
una mayor superficie. Se utilizan como reactores de enzimas (Cap. 2) y de clulas delicadas de formas de vida superiores (Cap. 3).

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Las molcula.sde diferente tama~o se


separan unas de otras en una instalacin
de ultrafiltracin a travs de membranas

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Separacin de clulas del medio de


fermentacin mediante centrifugacin

Embotellado libre de grmenes al final


del proceso de produccin

113

BIOTECNOLOGA

Cuadro 4.11 Productos del


metabolismo principal
y secundario
En el Cap. 1 hemos visto los productos
finales clsicos del metabolismo, como
el etanol y el cido lctico. Se originan
"por necesidad" en los procesos de fer
mentacin. Los productos del metabolis
mo primario esenciales se sintetizan,
sin embargo, en las clulas, porque son
innecesarios para su crecimiento. De
importancia econmica son los aminoci
dos y sus derivados (treonina, lisina, renil
alanina, triptfano, glutamato), las vita
minas (B2 y B12) y los nuclesidos (inosi
naSmonofosfato, IMP, guanosinaS
monofosfato, GMP).
Por naturaleza, los microbios no producen
estos materiales en cantidades enormes,
pues eso sera, debido al elevado consumo
de energa y de carbono, una desventaja
de seleccin contra ellos, que slo los producen por necesidad. Se deben cambiar a
la fuerza los mecanismos de regulacJn.
Los productos secundarios de las clulas se
forman primero en una fase tarda del
crecimiento; no son necesarios para el propio crecimiento y su funcin natural a
menudo no es conocida. Muchos de estos
productos secundarios, por ejemplo los
antibiticos, inhiben otros microbios como
ventaja propia. Se forman tambin otros
materiales, como micotoxinas y colorantes.

Fig. 4.50 El proceso de purifi


cacin requiere sumo cuidado.

Metabolito
. - - - - - - - - - - - - - principal
Meta bolito
secundario

i
Nmero
de clulas

Tiempo
Fase (lag)
de inicio

Fase (log)
exponencial

Fase estacionaria

Los productos primarios del metabo


lismo (por ejemplo etanol y amino
cidos) se enriquecen en el biorreac
tor en la medida en que crecen las
clulas, mientras que la produccin
de los productos secundarios (por
ejemplo la penicilina) alcanza su
mximo en la fase de crecimiento.
Para la produccin, esto tiene canse
cuendas decisivas.
Pa ra los metabolitos primarios
(como los aminocidos) "slo" se
deben alcanzar las condiciones de
crecimiento ideales.

bin el agua (smosis inversa) de las clulas del micro


bio, que se arrugan, se secan y por ello no crecen ms.
La liofilizacin es uno de los modernos mtodos de
conserva ms habituales (Cuadro 4. 7). El alcohol con
centrado no aumenta slo Ja permeabilidad de la
membrana citoplasmtica de las bacterias (vase
Cap. 1] y con ello inhibe su crecimiento, sino que
extrae tambin agua de las clulas de los microbios.
Finalmente, el ser humano ha desarrollado tambin
una larga serie de desinfectantes inhibidores de
microbios.

4.19 Recuperacin del producto:


downstream processing
Fig. 4.51 Selman Abraham
Waksman (18881973) descu
bri la estreptomicina y cre
el concepto "antibitico".

114

Si los grmenes se mantienen bajo control y el pro


ceso tiene xito, el biorreactor puede aplicarse. Con
ello, Ja espesa mezcla de Jos mohos segregara mate

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Fase de mu erte

En la medida en que las bacterias o


levaduras proliferan aumenta tam
bin la concentracin de metaboli
tos primarios. Si en cambio se pro
duce penicilina. producto secunda
rio de un moho, la concentracin de
sta alcanza su nivel mximo cuan
do se ha detenido el crecimiento
del hongo.
Se debe encontrar, pues, un equili
brio ideal entre cada una de las con
diciones de crecimiento y de
produccin.

ria! de alimentacin y penicilina. Puesto que Ja peni


cilina est separada de los hongos en el entorno, su
obtencin es muy sencilla: se filtran las clulas de
microorganismos. De la solucin nutriente clara se
hace precipitar la penicilina disuelta y se pueden
separar fcilmente los cristales.
Anlogamente a la preparacin de un sustrato para
el biorreactor (upstream processinfj, se realizan
todos los pasos que son necesarios desde la disolu
cin de fermentacin hasta el producto final, como
downstream processing.

La mayora de los productos (por ejemplo muchas


protenas) son eliminados por los microbios al
medio. Por lo tanto, hay que romper a la fuerza las
clulas de los microbios y los productos deseados se
deben separar arduamente del contenido remanen
te de las clulas (por ejemplo mediante cromatogra
fa de afinidad, Cap. 3). Por ello, Ja produccin de
estas sustancias es obviamente ms cara.

BIOTECNOLOGA BLANCA -

4 .20 Estreptomicina y cefalosporina

- Los siguientes antibiticos


despus de la penicilina
La penicilina es muy eficaz contra un amplio espectro de bacterias grampositivas. Despus de la introduccin de la penicilina en la prctica clinica se
observ que muchas infecciones bacterianas comunes se curaban de forma rpida y por completo,
como la inflamacin del cuello (faringitis) causada
por estreptococos, la inflamacin de los pulmones
provocada por neumococos y las principales infecciones por estafilococos. Tambin se curaba la infeccin de las meninges, a menudo mortal, producida
por meningococos, y algunas formas de infecciones
bacterianas del endocardio que antes eran mortales.
Estos espectaculares resultados clnicos desencade
naron una bsqueda intensiva de otros antibiticos
naturales.

Haba dos motivos detrs de estos esfuerzos. La


penicilina no acta sobre las bacterias gramnegati
vas como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomo
nasy Mycobacterium. Por otro lado, se observ que
tambin determinadas bacterias grampositivas son
o pueden llegar a ser resistentes a la penicilina.
Con la ayuda de una nueva tcnica, con la que se
revisaban sistemticamente en los microorganismos de la tierra sus productos de metabolismo para
observar su eficacia como antibiticos, en 1943
Selman Abraham Waksman ( l888-1973)
[Fig. 4.51) y sus colaboradores consiguieron, en
la Universidad americana de Rutgers, aislar un
nuevo antibitico de actinomicetos del gnero
Streptomyces. Los actinomicetos son bacterias
grampositivas, irregularmente unidas e inmvi
les, que forman filamentos y ramificaciones.

En 1945, el profesor Giuseppe Brotzu {1895


1976) [Fig. 4.54), del Instituto de Higiene italiano
en Cagliari, se ocup de un problema que ha alean
zado hoy una dimensin gigantesca con la polucin
del mar Mediterrneo. En las proximidades de la
salida del sistema de alcantarillado de Cerdea se
tom una muestra de agua. Brotzu especul: si las
bacterias de las aguas residuales pueden provocar
infecciones del aparato digestivo, no deberan
incorporarse al medio sus enemigos naturales? Asf
Brotzu descubri, en el moho Cephalosporium
acremonium (hoy renombrado Acremonium
chrysogenum, Fig. 4.53), la sustancia inhibidora
para una enorme cantidad de bacterias.
La publicacin de Brotzu, en una revista de la Uni
versidad italiana a la que se prestaba poca atencin,
lleg por una feliz casualidad a un grupo de Oxford
de "cazadores de antibiticos". Estaba establecido
que el hongo generaba varios anticuerpos relacio
nados. Uno de ellos, la cefalosporina C, demostr
ser especialmente efectivo contra microorganismos
grampositivos de enfermedades resistentes a la
penicilina (vase Cuadro 4.9).
La penicilina, la cefalosporina y la estreptomicina
fueron los descubrimientos ms importantes en los
primeros tiempos de la investigacin en antibiti
cos, pero no los nicos. El nmero de nuevos anti
biticos encontrados anualmente creci, entre fina
les de los aos 1940 y principios de los 1970, de for
ma casi lineal, hasta casi 200. Hacia finales del siglo
pasado se alcanz el rcord de 200 sustancias al
ao. Hasta hoy se han aislado 8000 antibiticos de
microorganismos y 4000 de organismos superiores
(Cuadro 4.9). Se producen mundialmente 30 000
toneladas de penicilina y cefalosporina. Las cefalos
porinas se utilizan slo en humanos; las penicilinas,
en cambio, tambin en la mayora de los animales
tiles {a veces de modo inadecuado).

La estreptomicina es un amlnoglucsido, y por


lo tanto consta de azcares y aminocidos. La
estreptomicina acta, de forma diferente a la peni Poco despus del primer xito de la estrategia de
cilina, tambin contra algunas bacterias gramne- humanos contra microbios, stos iniciaron su des
gativas. Por primera vez fue eficaz una terapia quite masivo. En realidad, demostraron cmo pro
contra la tuberculosis. Los antibiticos aminoglu- sigue an hoy la evolucin.
csidos tienen un amplio espectro de accin, pero
son ligeramente txicos. El tpico olor a tierra fres- 4.21 La competencia con los
ca lo proporcionan los estreptomicetos habitantes
microbios: resistencias
del suelo.
El gran Louis Pasteur escribi: uLas bacterias ten
Walksman y sus colaboradores descubrieron otros
drn la ltima palabra, seores!" Qu verdad en
nuevos antibiticos: la actinomicina (1940), la clatantos sentidos!
vacina, la estreptotricina {1942), la grisena (1946),
la neomicina (1948), la fradicina, la candicidina, la La penicilina se vena aplicando desde haca unos
candidina y otros. Dos de ellos, la estreptomicina y aos con xito. En 1972, sin embargo, se produ
la neomicina, todava se utilizan mucho hoy en dfa. jo una epidemia de disentera en Mxico, y en

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Grampositivo?
Grampositivo, gramnegativo
y tincin de Gram deben su
nombre al dans Hans
Christian J. Gram

Fig. 4.52 Hans Christian J.


Gram (1853-1938)
En 1884. parece que ms bien
por casualidad, en un laboratorio de medicina berlins se
descubri que las bacterias
grampositivas y gramnegativas poseen paredes celulares
y en mayor o menor medida
son capaces de retener el vio
leta de genciana despus de
lavarlo con una disolucin de
yodo en yoduro potsico y
alcohol. El color azul oscuro
(grampositivo) aparece principalmente en las bacterias
en forma de esfera (neumococos, estreptococos), y el
rosa plido o rojo (gramnegalvo) en los bacilos (E. coli y
salmonelas).

Fig. 4.53 Acremonium


produce cefalosporina.

Fig. 4.54 Giuseppe Brotzu


(1895-1976) descubri la
cefalosporina.

115

B IOTECNOLOGA

Cuadro 4.12 Opinin de expertos:


Biotecnologa blanca en Alemania
La biotecnologa blanca o industrial no es
una nueva dlsciplina, sino que slgnlfica
"recurrir a Ja caja de herramientas de la
naturaleza", como la define la Unin Euro
pea de Biotecnologa. Utiliza material
renovable y aplica los mecanismos de accin
de eficacia probada de la naturaleza. Con
ella se cuidan los recursos, bajan las cargas
para el entorno y se producen procesos convencionales pero mucho ms eficientes. Adems, la biotecnologa blanca proporciona
soluciones a problemas tcnicos y permite
obtener productos completamente nuevos.
Actualmente, los productos blotecnolgicos
tienen una participacin en la facturacin
mundial de la industria qumica del 5%. Los
estudios de McKinsey, as como los de Festel, indican que esta influencia crecer ms
en el futuro: en el ao 201 Ose producir por
biotecnologa hasta un 20% de todos los productos qumicos, con una magnitud de alrededor de 31 O000 millones de dlares ameri
canos. La biotecnologa blanca ser la clave y
Ja causa principal para la potenciacin de Ja
competitividad de Ja industria qumica. Nue
vas materias primas, nuevos procesos de pro
duccin, nuevos productos: stos son facto
res de xito esenciales de la biotecnologa
blanca. Las crecientes materias primas
secundarias sustituyen a muchas materias
primas fsiles. Los procesos de produccin
eficientes son superiores, tanto econmica
mente como en cuanto a ecologa, por biocatlisis, biotransformacin o fermentacin,
reemplazando a la sntesis qumica. Con la
ayuda de nuevas rutas de sntesis se desarrollan productos innovadores y as aumentan
las ventajas de la Innovacin -un beneficio
decisivo en la competicin Internacional.
Ejemplos de xito de la industria qumica
La blotecnologa blanca hace mucho que ha
abandonado Ja fase del trabajo en el laborato
rio. Hoy tiene xito una creacin ms inteli
gente, de molculas tiles para Jos humanos,
utilizando la combinacin de una serie de
bacterias modificadas genticamente a partir
de una sola pala de tierra del parque municipal. De este modo, la empresa Henkel tiene
hoy, entre otros productos, los detergentes
ms eficaces y lderes en el mercado mundial,
porque ha investigado con excelentes resulta
dos sistemas enzimticos optimizados para
diferentes tipos de suciedad, los ha trasladado
a Ja escala de Ja produccin y los ha integrado

116

en sus productos. La industria farmacutica y


agraria no se concibe ya sin Ja biotecnologa
blanca. Las sustancias activas con centros quirales pueden producirse con frecuencia de
modo econmico slo con mtodos biolecnolgicos, rindiendo enantimeros puros. Esto
es muy importante, ya que el 50%de los primeros cien medicamentos contiene sustancias
activas como enantimeros puros y tiene una
facturacin de ms de 100 millones de dlares americanos. De este modo crece el nmero de enantimeros puros en las sustancias
activas farmacuticas.

E. co/i, el bu rro de carga de la Industria

En las especialidades qumicas ocurre algo


parecido. Aqu se menciona la sntesis de la
vitamina B2 de BASF AG basndose en materias primas reproducidas: un proceso de sn
tesis qumico de ocho etapas se sustituye por
un proceso de fermentacin de una etapa uti
!izando un hongo especial sobre la materia
prima (aceite de soja) inicial para convertirlo
en el producto final. La vitamina B2 se obtie
ne en forma de cristales amarillos directa
mente de la mezcla de fermentacin.
En el proceso biotecnolgico disminuyen Jos
costes de produccin (overa/l costs) en un
40%, y tambin los efectos sobre el entorno
(environmental mpac~ en un 40%. McKinsey utiliz, de acuerdo con BASF, la biocatli
sis o fermentacin para producir alrededor de
un tercio de sus productos qumicos finos.
En DSM, segn McKinsey, aumenta la porcin incluso un 50%. As, por ejemplo, en
la produccin del antibitico cefalexina realizada en DSM se sustituy un proceso de
sntesis de 1Oetapas realizado a gran escala
por un proceso biotecnolgico consistente
en una combinacin de fermentacin y una
reaccin enzimtica posterior. La nueva
ruta de sntesis se posibilita mediante ingeniera metablica. Los costes variables

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relacionados con el proceso se reducen


alrededor del 50%, mientras que el uso de
energa y la utilizacin de material se reducen en un 65%. La ruta de sntesis qumica
tiene Jugar en un medio de disolucin orgnico que realiza un proceso biotecnolgco
en un medio acuoso.
Degussa AG se dedica en todo el mundo a
la produccin de aminocidos esenciales,
que contribuyen en gran medida a garanti
zar una alimentacin sana para humanos y
animales. Los aminocidos se producen por
fermentacin, es decir, con la ayuda de la
biotecnologa blanca. Junto a la "gran"
industria qumica ha habido al frente jve
nes compafias biotecnolgcas que han
marcado el desarrollo de forma decisiva.
Muchas innovaciones en las empresas qu
micas no son posibles sin Ja asociacin de
las compaas biotecnolgicas o las instituciones acadmicas. Estas compaas de biolecnologa industrial, como Maxygen,
Codexis, Diversa, Genencor o BRAIN, disponen de una amplia red de sociedades
que, segn el proyecto, desarrollan estratgicas alianzas o joint ventures. A menudo,
los modernos modelos de cooperacin son,
en la biotecnologa blanca, precisamente la
clave del xito.
Nuevas perspectivas en Alemania
Despus de la biotecnologa roja, orientada
a la medicina (Cap. 9), y la biotecnologa
verde, destinada al sector agrario (Cap. 7),
apuntamos con Ja biotecnologa blanca al
principio de una tercera ola biotecnolgca.
Sin embargo, la biotecnologa industrial y
su potencial cientfico, pero sobre todo
econmico, an no han quedado anclados
en nuestras cabezas, ni en las de los inves
tigadores y cientficos, ni en las de los
ejecutivos o jugadores del mercado de capi
tales, y mucho menos en la gran opinin
pblica.
En una alianza, poco comn a primera vista,
de las mayores organizaciones medioambientales de Europa, Ja Fundacin Federal
Alemana del Entorno (DBU), una asociacin
industrial, la Asociacin Industrial de Biotecnologa Alemana en colaboracin con la
Industria Ouimica (DIB/VCI) y de
Empresarios Biotecnolgicos, de BRAIN AG,
allanaron el camino para que todos los gru
pos sociales utilizasen bien las oportunidades
nicas de la biotecnologa blanca. Con Ja ini
ciativa de DBU, DIB/VCI y BRAIN se esta
bleci, a finales de febrero de 2005, una

BIOTECNOLOGA BLAN CA -

"Plataforma Nacional de Biotecnologfa Blan


ca", cuya meta es enrocar las actividades y
fuerzas nacionales en el campo de la blotec
nologfa blanca y comunicarlas al pblico. Al

mismo tiempo se intensifica la interaccin


con la correspondiente plataforma europea y
se facilita el dilogo entre investigadores en
la Comisin Europea. Mediante un acuerdo
conjunto de lneas de accin y objetivos debe
conseguirse una contribucin ms contun
dente a la seguridad y al desarrollo competiti
vo de la capacidad futura de ubicacin de la
industria en Alemania.

Bibliograa:
Bachmann R, Budde f, Riese J (2004):
Die dritte Welle - Die Biotechnologie erobert
die Chemieindustrie. Chemie lngenleurTechnlk
76: 1155-1158.
Festel G, Knlltl J, Gtltz H, Zinke H (2004):
Der Einflu8 der Biotechnologie au Produktionsverahren in der Chemieindustrie. Chemle
lngenieurTechnik 76: 307-312.

1975 una extensin epidmica de gonorrea de las


Filipinas se propag mediante la creciente prostitucin. Para la gonorrea (en griego, flujo de esper
ma) se utiliza en alemn la palabra Tripper, que
viene del bajo alemn drippen (" trop/en ~ gotear).
Ambos nombres demuestran los sntomas caracte
rsticos.
La gonorrea, una enfermedad venrea conocida desde haca siglos, pudo curarse por primera vez con los
antibiticos.

Se estableci, sin embargo, que las prostitutas


tomaran penicilina profilctica en grandes cantida
des durante un largo tiempo, para protegerse de la
gonorrea. As, Neisseria gonorrhoeae se encontr
en una situacin que condujo a la seleccin de clu
las capaces de sobrevivir. Pronto aparecieron
cepas de bacterias resistentes a la penicilina.
La "insensibilidad" de las bacterias se bas en la
produccin de enzimas que inactivan la penicilina
(fHactamasas). Estas hidrolasas rompen el llama
do anillo ~-lactama de la penicilina y de la cefalos
porina (Cuadro 04.7) mediante hidrlisis enzim
tica, y lo convierten en el inefectivo cido penlcilf
nico. Sobre todo en los hospitales, los pacientes se
infectan con frecuencia con estas cepas bacterianas
(hospitalismo). En Alemania mueren por ello
20 000 pacientes al ao.
Se investiga ahora cmo engaar a los microbios.

El Dr. Rainer Erb, del


Centro para Comunkaclo
nes Ambientales de la
Fundacin federal de Ale
manla GmbH, Osnabrck.

la Prof. Ora. Steranle


Helden, de la fundacin
federal de Alemania,
Osnabrck.

El Dr. Ricardo Gent, de la


Unin Industrial Alemana
de Biotecnologa (018) en
conexin con la lndustrla
Qumica e.V. (VCQ,
frankfurt/Main.

Del tipo Penicillium se produce principalmente en


la industria farmacutica la denominada penicilina
G, que lleva una cadena lateral de bencilo. Se rom
pe esta cadena lateral con enzimas inmovilizadas
(penicilina amidasas), se acoplan entonces nuevos
grupos y se obtienen asf nuevos tipos de antlbiti
cos semisintticos, contra los que no son resisten
tes los microbios [an!) (Cap. 2).
Es una lucha entre las bacterias y los masivos anti
biticos generados que consiguen la mejora del ere
cimiento y la profilaxis en los animales tiles o
humanos. Hemos visto ya que las bacterias nter
cambian plsmidos, que llevan genes que codifican
resistencia a los antibiticos (Fig. 4.56).
Bsicamente, en las bacterias y los antibiticos
vemos cmo funciona tambin hoy la evolucin en
el sentido de Darwin y Wallace: mutacin, seleccin
y supervivencia del mejor y del ms adaptado.

Flg. 4 .55 Propaganda esta


dounldense de los aos i950
sobre el abuso de antibiticos: los antibiticos actan
slo en enfermedades bacterianas, no en las virales. Es,
pues, absurdo recetar anti
biticos para infecciones
virales.

Flg. 4.56 Las bacterias


pueden intercambiar plsmidos mediante los pili
sexuales, y as se transfieren las resistencias.

Fig. 4 .57 Estreptomicina.

Flg. 4.58 Cloranfenicol.

4.22 Ciclosporina -

Un producto
microbiano para trasplantes

El Dr. Holger Zlnke,


deBRAINAG,
Zwlngenberg.

Desde 1957, siempre que los colaboradores de Sandoz Ltd. de Basilea se iban de vacaciones, o por
asuntos de negocios, se les peda que trajeran bol

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Flg. 4.59 Tolypoc/adium


in{lotum.

117

BIOTECNOLOGA

~-sitoesterol

Cuatro
etapas
qumicas

Cinco etapas qumicas

HO
Progesterona

!
_r(\ ~

Colza

Degradacin
microbiana de la
cadena lateral

o~con

esporangio
en forma de pincel

Hidroxilacin
microbiana

Androsta-4-en
3,17-diona (AD)

Hormona sexual

OH

o
HO.

T Varias

.........................

etapas
qumicas

Deshidrogenacin
microbiana

Varias etapas qumicas

T Varias

11-a.
Hidroxiprogesterona

f
t

Varias
etapas
qumicas

etapas

qumicas

OH

Deshidrogenacin
microbiana

Hidroxilacin
microbiana
Molcula S

Hidroxi
cortlsol

'
t
t

Prednisolona

Varias
etapas
qumicas
OH

OH

Deshidrogenacin
microbiana
Cortisona

Prednisona

sas de plstico con muestras de suelo de todas las


partes del mundo. 'bstas se catalogaban y se "revisaban" buscando nuevos productores de antibiticos. Hasta marzo de 1970, sin embargo, los cientficos no hallaron ninguno: Tolypocladium infla
tum (Fig. 4.59) se aisl en tierra de Wisconsin,
Estados Unidos, y Hardanger Vidda en Noruega.

Fig. 4.60 Participacin de


los microorganismos en la
produccin terap~utica de
los esteroides ms Importantes (arriba). Estructura espacial de la cortisona (abajo a
la derecha).

En principio, los investigadores de Basilea slo


descubrieron, para su decepcin, una sustancia
que era eficaz simplemente contra unos pocos

118

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BIOTECNOLOGA BLAN CA -

Cuadro 1.13 Historia de la biotecno-

loga: La dlospnlna de la rafz de


ame y la pRdora antlconceptJva

carl Ojerassl (segundo


por la derecha) en
19~1 con la ralz de
llame durante la slnte
sis de la "pldora
(a la Izquierda George
Rosenkrantz).
Al lado: Carl Ojerassl.

El "padre de la pldora anticonceptiva" y hoy


conocido escritor de denclallccln Car!
Djerassl (nacido en 1923), trabaj en la
dcada de 1950 en Mxico. En la importan

1e compaa Syntex se aisl diosgenina, un


esteroide con propiedades de jabn, de la
raz del llame silvestre (Discorea) incomesti
ble. Esta raz se haba utilizado por los indios
para lavar la ropa y matar peces. RusseU
Marker haba transformado qumicamente
diosgenina en la hormona sexual femenina
progesterona, y Georg Rosenkrantz con
virti diosgenina en testosterona. Ellos man
tuvieron un duro combate con los qumicos
ms importantes del mundo para producir
qumicamente la deseada cortisona a partir
de la raz de ame. AJ final lo consiguieron
con arduo trabajo, y entonces recibieron una
carta de la compai'lfa Upjohn. En ella preguntaban si Djerassi podra suministrar diez
toneladas (1) de progesterona. En todo el
mundo se produda entonces un 1% de esa
cantidad.
Pareca un pedido totalmente sin sentido!
Despus de noches sin dormir, Carl Djerassi
pens que Upjohn probablemente planeaba
tJtllzar la progesterona como producto
in1ermediario. En realidad, dos cientficos,
Durey H. Peterson y Herbert C.

Murray, haban hecho el sensacional descu

brimento de que una cepa del moho del

hongos -y ni siquiera era especialmente buena


para ellos. El antibitico producido por el hongo,
con el nombre de laboratorio 24556, tena sin
embargo una propiedad extraordinaria: por un
lado era poco efectivo contra hongos, pero de baja
toxicidad contra los animales de experimentacin.
Slo se deba proseguir, por lo tanto, el anlisis
completo.
En 1972 se observ algo inesperado en el anlisis:
el nuevo material, un pptido de once aminocidos
cerrado en forma de anillo, Inhibi el sistema in mu
nitario de los humanos, actu como inmunosupresor, impidiendo asr las reacciones de rechazo
naturales contra los rganos trasplantados de
donantes. Si un inmunosupresor est en accin
durante largo tiempo, destruye el sistema de defensa entero. Con ello, cualquier pequea infeccin
puede ser mortal.
Pero no ocurra as con la sustancia 24-556, la
actualmente conocida en todo el mundo como
ciclosporina (Fig. 4.61 ). Si la ciclosporina se captura por el cuerpo, se acumula en determinados
receptores de los linfocitos T. Las clulas T son las
ms importantes en la defensa especfica del cuerpo
(vase Cap. 5). La sustancia activa, en varias etapas

pan Rhlzopus "hlzus era capaz de colocar


un grupo hidroxilo en la pJslcin 11 del anl

llo e de la proges1erona.

Raz de ame
(Dioscoreo) salvaje,
tubrculo incomes
tibie lleno de
diosgenlna.

Lo que nosotros, qumicos en la ciudad


de Mxico, Cambridge y Rahway, habamos
alcanzado mediante una complicada secuen
da de conversiones qumicas, lo conseguJan
los microbios de Upjohn en horas con unas
pocas reacciones." Como l escribe en su
autobiografa, "La madre de la pldora", Carl
Djerassl encontr consuelo unos meses des
pus al sintetizar con xito el primer
anticonceptivo oral, Junto con George
Rosenkrantz. La ~pldora lo hizo mJilonario
y patrocinador de arte.

de reacciones, hace que la importante interleuqui


na 2 no se produzca en las clulas T. La interleuqui
na 2 es un mensajero (linfoquina) y se requiere para
activar el sistema inmunitario. Participa en la gene
racin de la respuesta inflamatoria.
La cidosporina A produce finalmente una inhibi
cin de los linfocitos T y un bloqueo de la produc
cin de interleuquina 2, y evita asf la supresin del
sistema inmunitario.

Gracias al producto microbiano ciclosporina aumen


taron desde los inicios de los afios 1980 los versti
les trasplantes de corazn, riones y pulmones con
. buenos resultados. La ciclosporina es uno de los
pocos pptidos que se traga cmodamente, o sea,
que se puede administrar por vfa oral.

Flg. 4.61 Estructura de la


clclosporina.

4.23 Hormonas esteroideas: la


cortisona y la pldora anticonceptiva
Mientras que en la produccin indusUial de antibi
ticos los microorganismos son los burros de carga
para todos los trabajos, tambin se utilizan en la ela
boracin de otros frmacos slo para algunos pasos
de un proceso de produccin mucho ms largo, que
consiste predominantemente en sntesis no biolgi

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Flg. 4.62 Edward Kendall


(sentado) y su equipo de la
cortisona.

119

BIOTECNOLOGA
Fig. 4.63 Plantas y microor
ganismos para la obtencin
de esteroides.

Soja

cas. Un ejemplo pico es la produccin de hormonas esteroideas.


Aprincipios de los aos 1930, Edward C. Kendall
(1866 1972), de la Fundacin Mayo, y Tadeusz
Reichstein (que tambin desarroll la sntesis de la
vitamina C; vase ms arriba), de la Universidad de
Basilea, aislaron la cortisona, una de las hormonas
estero1deas, de las glndulas suprarrenales del toro.
Este hallazgo fue recompensado en 1950 con el premio Nobel. Aproximadamente un ao ms tarde se
descubri que la cortisona alivia el dolor en las personas que sufren artritis reumatoide. Enseguida surgi la cuestin de cmo obtener una considerable
cantidad del medicamento.
A la vista del gran mercado esperado, se procedi a
desarrollar una sntesis qumica. Sin embargo, era
bastante inadecuada. La compaa Merck & Co. lo
haca en 37 pasos, de los cuales muchos se produc
an slo en condiciones extremas, para obtener cortisona del cido biliar de los toros. De esta manera
se produca cortisona que costaba casi 400 marcos
alemanes por gramo! (Cuadro 4.12).

Raz deiiame

Colza

Rhizopus

Curvularia

Penicil/ium

120

Con la ayuda de una hidroxilacin microbiana,


para la cual se utiliz industrialmente el hongo
Rhizopus arrhizus (Fig. 4.63), se acorta la sntesis
de 37 a 11 pasos. El precio de la cortisona baj con
ello a aproximadamente 15 marcos alemanes por
gramo.

La hidroxilacin microbiana no slo produjo un


acortamiento de la sntesis. Antes eran necesarias
elevadas presiones y temperaturas, as como caros
medios de disolucin no acuosos. Ahora la sntesis
se realizaba a 37 C y a la presin atmosfrica habi
tualmente en agua. Esto tambin contribuy de for
ma decisiva a reducir los costes de produccin. En
1980, gracias a una mejora en la productividad, el
precio baj por debajo de dos marcos alemanes por
gramo.
Slo la raz del ame (Discorea) mejicano proporciona la materia prima para la cortisona: la diosgenina. Hasta 1975, las cantidades eran superiores a
2000 toneladas cada ao. El gobierno de Mxico
quera, por ello, poseer el monopolio para la materia prima. Inspirada en el xito de los entonces
miembros de la OPEP con los precios del petrleo,
la empresa mejicana Proquivenex decidi en 1975
subir diez veces el precio de la diosgenina. Los
acuerdos farmacolgicos internacionales contraata
caron con la ayuda de sus biotecnlogos: desarrollaron mtodos alternativos, sobre todo la degradacin microbiana de los residuos acumulados en la
produccin de aceite de habas de soja. stos son

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ricos en los esteroides sitosterol y estigmasterol


(Fig. 4.60). Con ello se pudo sustituir muy rpidamente la diosgenlna.
Dos aos despus del aumento de precio, los meji
canos tuvieron que baarlo de nuevo drsticamen
te. Pero ya nadie quiso depender ms de esta fuen
te: el mercado para la diosgenina se haba desploma
do. Esta experiencia muestra que ninguna materia
es insustituible en biotecnologa!
El caso de la cortisona muestra tambin claramente, como ya pas con la vitamina C, que la biotecnologa y la qumica son alternativas una a la
otra. Precisamente. la combinacin de procesos
biolgicos y qumicos experimentarn un fuerte
crecimiento en la siguiente dcada. Para ello, los
microbios o sus enzimas realizarn algunos pasos en
la sntesis que qumicamente seran muy caros o
inadecuados (Flg. 4.60).

Plegaria secreta de un qumico orgnico:


iOh, Seor!,
concdeme el honor,
mediante mi noble labor,
de nuevas molculas crear.
iNo dejes a las bacterias triunfar!
Hanswerner Dellweg, uno de los mentores de biotecnologa
en Alemania; segn O.E. Eveleigh.

B IOTECNOLOGA BLANCA -

Bibliograffa utilizada y aplicada


El clsico alerr.n de biotecnologa:
Dellweg H (1987) Biotechnologie. VCH, Weinheim.
La biblia de bolsillo de la biotecnologa:
Schmid RD (2002) Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik. Wiley
VCH, Weinheim.
Antiguo, pero bueno; una buena introduccin:
Gruss P, Herrmann R, Klein A, Schaller H (Hrsg.) (1987) lndustrielle Mikro
biologie. Spektrum der Wissenschaft, Heidelberg.
Especialmente para interesados en tecnologa:
Crueger W, Crueger A (1989) Biotechnologie - Lehrbuch der Angewandten
Mikrobiologie. 3. Aufl. Oldenbourg, Mnchen.
Sucinto y muy didctico, especialmente para universitarios:
Leuchtenberger A (1998) Grundwissen zur mikrobiellen Biotechnologie.
B.G. Teubner Stuttgart, Leipzig.
El mejor libro de bolsillo de microbiologa:
Schlegel HG (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7. Aufl. Thieme, Stuttgart.
Informacin presentada como lxico:
Wiley-VCH (eds.) (2002) Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. 6th
Edition, Wiley-VCH, Weinheim.
Precioso y slido:
Ratledge C, Kristiansen B (Hrsg.) (2001) Basic Biotechnology. 2nd ed.
Cambridge University Press, Cambridge, New York.
Una visin completa y muy interesante de las biotransformaciones enzim
ticas y microbianas:
Lese A, Seelbach K, Wandrey C (2005) Industrial Biotransformations.
2nd ed. Wiley-VCH, Weinheim.
La autobiografa cautivadora del padre de la pldora:
Djerassi C (2001) Die Mutter der Pille. Heyne, Mnchen.
La historia completa de Fleming, y tambin de la lisozima, algo idealizada:
Maurois A (1962) Alexander Fleming. Paul List Verlag, Leipzig.
Dos presentaciones realistas del descubrimiento de la penicilina:
Goldsworthy PD, McFarlane AC (2002) Howard Florey, Alexander Fleming
and the Fairy Tale of Penicillin. The Medica/ Journal ofAustralia 176,
4: 176-178.
Emsley J (2003) Sonne, Sex und Schokolade. Wiley-VCH, Weinheim.
Magnficas miniaturas histricas de microbiologa, ies necesario leerlo!
Dixon B (1998) Der Pilz, der John F. Kennedy zum Prasidenten machte.
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.
Michal, G (1998) Biochemical Pathways. Spektrum AkademischerVerlag,
Heidelberg.

Ocho preguntas
de autoevaluacin
1. Qu es el umami y por qu no se

puede generar significativamente


por sntesis qumica?
2. Cmo un sencillo moho negro
del pan pudo arruinar la industria
del limn en poco tiempo?
3. We qu manera ayud la lisozima
(Cap. 2) al descubrimiento de la
penicilina?
4. lMediante qu fenmeno puede
una simple lactosa "utilizar y dete
ner" la produccin del transporta
dor de lactosa y de las protenas
degradadoras de lactosa en Esche
richia coli?
5. lCmo consigui la compaa
Roche en Basilea hacer de la mos
ca del vinagre Drosophi/a la mayor
productora de vitamina c del mun
do? Puede alguien envenenarse
con vitamina C?
6. cmo acta realmente la penicili
na? lCmo puede luchar una bac
teria contra la penicilina? lPor qu
se debe tomar la penicilina segn
la prescripcin y no interrumpir el
tratamiento antes de tiempo?
7. lCmo se llaman los ocho amino
cidos esenciales? lPor qu son
esenciales?

8. lPor qu mueren los microbios


con luz ultravioleta y por qu sta
puede producir cncer de piel en
los humanos?

Enlaces de Web
Informacin en alemn del Secretariado de Informacin de Biotecnologa:
www.isb.org
Buscador de Biotecnologa en Internet: www.biotechfind.com
Todo sobre microorganismos: www.microbes.info
Una mina para las estructuras de protenas de este libro:
www.scripps.edu,.tnb/goodselljJdb
La historia de la penicilina para seguir jugando en el ordenador:
http://nobelprize.org,.tnedicinejeducationaljJenici//infindex.html

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121

VIRUS, ANTICUERPOS
Y VACUNAS
5.1 Virus- La vida prestada 124
5.2 De qu forma atacan los virus
a las clulas 124
5.3 Cmo se defiende el cuerpo
de las infecciones: respuesta
Inmunitaria humoral mediante
anticuerpos 127
5.4 Respuesta Inmunitaria celular:
clulas T asesinas 129

5.5 La primera vacuna:


la viruela vacuna contra la
viruela humana 134
5.6 Las vacunas modernas 137
5.7 Las vacunas vivas 139
5.8 Anticuerpos monoclonales:
balas mgicas de un biorreactor
altamente especficas
y uniformes 140
5.9 Anticuerpos catalticos 141
5.10 Anticuerpos
recombinantes 142
5.11 Bibliotecas de anticuerpos
combinatorias 143
5.12 "A cuestas" o visualizacin
de fagos - La prxima
revolucin 144
5.13 Visualizacin de fagos para
la hormona del crecimiento
de alta afinidad 144
5.14 Nuevas esperanzas en el cncer:
rituximab, un anticuerpo
recombinante 145

Captulo
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BIOTECNOLOGA

5.1 Virus - la vida prestada


Los virus no son seres vivos, no tienen un metabolismo propio y utilizan para reproducirse la maquinaria celular de los animales, las plantas o las bacteiias,

que ellos atacan. Bsicamente slo pueden multipliFig. 5.1 los nuevos virus amenazan la humanidad global.
la epidemia de SARS paraliz
la ciudad de Hong Kong durante dos meses. Los habitantes
de Hong Kong derrotaron el
virus con la mayor disciplina
y tambin con encanto.

. ,-

'
,.

- ~ ~
, . . . . .1.
i.

'

'

"

.~ . +n- -- .
' : i

Fig. 5.2 iEI SARS se ha erra


dicado! Pero las conferencias
sobre biotecnologa conti
nuaban en Hong Kong; naturalmente, el tema era la
"deteccin de virus".

Fig. 5.3 El virus del SARS


(Severe Acute Respirotory
Virus) es un coronavirus.
Acta de forma diferente
a por ejemplo el virus del
sida. El virus lleva su hebra
individual de RNA a la clula
husped y la copia con una
RNA polimerasa dependiente de RNA en copias imagen.

carse en una clula husped y por lo tanto no pueden sobrevivir por s mismos. Por ello no cumplen
las propiedades de la definicin de "vida".
En principio los virus son un pequeo "programa"
que se instala en los genes de sus huspedes y utili
za su maquinaria para producir nuevos virus.
Los programas de interrupcin de los "virus de
ordenador" tienen un mecanismo muy similar.
Debido a que los virus no tienen un metabolismo
propio, lamentablemente tampoco se puede luchar
con inhibidores como los antibiticos ni paralizar su
metabolismo. Simplemente se les puede atacar en
el momento de las interacciones con el husped.
Se distingue entre virus "con envoltura" (enveloped) y virus desnudos. Los virus desnudos, sin
cubierta, encierran su genoma slo en una cpside
(en ingls core) formada de protena. Los virus con
envoltura poseen en cambio una cubierta cortada de
la membrana celular del husped mediante brotes
( buddintJ, o sea, una membrana lipdica en la que
se encuentran las protenas adicionales codificadas
por el virus. Esta membrana de lpidos y protenas que recubre a los virus envuelve tambin,
pues, la cpside existente en ellos (Fig. 5.8).
Los virus se diferencian de los microorganismos en
que, para su multiplicacin, en realidad slo necesitan su cido nucleico y una clula del husped.
Algunos virus llevan, sin embargo, tambin algunas
enzimas que son necesarias para la replicacin, por
ejemplo los retrovirus, que liberan transcriptasa
inversa (Cap. 3) en su cpside.
Para la duplicacin de los cidos nucleicos y la sn
tesis de las protenas, un virus siempre necesita una
clula husped (hosrj. Se diferencia un ciclo ltico
(del griego lysis, deshacer; la misma raz que utiliz
Fleming para la lisozima, Cap. 2), en el cual en la
liberacin de virus se destruye la clula husped
y pasa a uno no ltico, en que los virus se unen
mediante brotes de la membrana celular (de aqu la
regulacin de la envoltura de los virus, como por
ejemplo los virus de la gripe o el VIH).

Fig. 5.4 Puede producirse


una nueva amenaza global
con la combinacin de gripe
aviaria y humana.

124

Todos los virus contienen un nico tipo de cido


nucleico (RNA o DNA). Los tipos de virus conocidos actualmente se clasifican segn su cido nucleico, su envuelta proteica y su especificidad frente a
los huspedes (Fig. 5.5).

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A los virus RNA pertenecen, entre otros, el VIH


(virus de la inmunodeficiencia humana) causante
del sida, el virus de la gripe, el virus del sarampin
y el virus de la rabia, as como el que ataca a las plantas, virus del mosaico del tabaco {VMT, Cap. 3; los
dos ltimos mencionados tienen forma de palo), y
los picornavirus (por ejemplo el virus de la polio,
que causa parlisis infantil, y los rinovirus que producen el resfriado comn [Figs. 5.3 a 5.5). El virus
del SARS (Severe Acute Respiratory Syndrom),
que provoc pnico en Hong Kong y China especialmente en el ao 2003 {Figs. 5.1 a 5.3), es tambin
un virus RNA, el denominado coronavirus, porque
su superficie recuerda a una corona.
Alos virus DNA pertenecen, por ejemplo, los papovavirus (virus de verrugas y otros que producen cncer), el virus de la viruela (variolaviros) y de la viruela vacuna (vacciniavirus), los virus herpes (causantes de diferentes enfermedades de la piel), los adenovirus (que producen enfermedades de las mucosas),
los bacterifagos (del griego phagein, comer; por
ejemplo T4 y Ml3, Cap. 3) que atacan a las bacterias, y los baculovirus que slo atacan a insectos.

5.2 De qu forma atacan los virus


a las clulas
Los virus siempre se unen primero a la superficie de
las clulas (Fig. 5.6). Los virus DNA, como los bacterifagos, inyectan su material hereditario (DNA
de doble hiice) en las clulas bacterianas (Fig. 5.6,
izquierda). Entonces con la colaboracin de las
clulas bacterianas produce enzimas (DNA polimerasa de T4) que son utilizadas para sintetizar DNA
y RNAm. El RNAm del virus producido del RNA
bacteriano se expresa en los ribosomas bacterianos.
Las clulas bacterianas forman con ello, a partir de
sus propios componentes, tanto la envoltura proteica como tambin el DNA de los nuevos bacterifagos. Las "partes individuales" se colocan juntas en
los bacterifagos terminados (aproximadamente
cien) y stos Usan la clula.
El virus DNA inyectado puede, sin embargo, incorporarse sin lisis en el DNA de la bacteria; se habla
entonces de un virus DNA "durmiente" {dormanrj.
En las siguientes generaciones bacterianas los
virus integrados pueden liberarse para multiplicarse de nuevo. En el ataque a las clulas animales
(Fig. 5.6, derecha) los virus se unen a los receptores sobre la superficie celular. La envoltura proteica se funde entonces con la membrana celular y el
virus penetra.
En los virus RNA del grupo de los retrovirus (como
el VIH) se coloca la hebra sencilla del RNA en la clu-

VIRUS, AN TICUERPO S Y VACUNAS

la. Se convierte en una doble hebra de DNA median


te una enzima introducida con el virus [transcripta
sa inversa, Cap. 3). El DNA del virus reescrito se
introduce en el DNA cromosmico del ncleo de la
clula. La maquinaria de transcripcin de la clula
husped (RNA polimerasa) copia al principio un
RNAm. Tras esta presentacin se sintetizan las prote
nas virales con la ayuda de los ribosomas. Adems, se
forman tambin protenas no estructurales, que en
muchos virus son las que les confieren la patogenici
dad. Los nuevos virus RNA formados y las protenas
de la cpside se unen para formar nuevos virus com
pletos y abandonan finalmente las clulas.
Slo en unas pocas familias de virus tiene lugar una
integracin del genoma viral. Entre ellas se
encuentran los virus herpes y los retrovirus. Me
diante la Integracin, el virus puede permanecer
estable en la clula husped durante generaciones
de divisiones celulares, o sea, quedarse hasta que se
activa de nuevo. En Jos virus que consiguen una
integracin en el genoma del husped hay una "inte
gracin abortiva", como ocurre por ejemplo en el
virus de la hepatitis B y en el papilomavirus, causa
da en el origen del tumor. La integracin produce en
estos casos la prdida de la capacidad de replicacin.
Se buscan intensamente estrategias contra el ata
que de los virus (Cuadro 5.1 ). Por ejemplo, los
anticuerpos especficos (ver en un apartado poste
rior de este captulo) pueden neutralizar virus me
diante una red entrecruzada incluso antes del con
tacto celular y la introduccin en la clula diana. Los
anticuerpos tambin pueden actuar por enmascara
miento de los lugares de unin correspondientes de
los virus para dificultar que reconozcan sus clulas
diana (Fig. 5.9). Los anticuerpos tambin marcan los
virus para los fagocitos (macrfagos, granulocitos),
y as pueden eliminarlos.
En los virus RNA, los inhibidores de la transcripta
sa inversa (Cap. 3) impiden la copia del RNA viral en
DNA. Muchas de estas sustancias inhibidoras que se
aplican actualmente en el tratamiento de la infec
cin por el VlH son, sin embargo, txicas. Si las clulas forman nuevos virus RNA, se podran inactivar
mediante RNA antisentido (antisense-RNA, que
se corresponde qumicamente al RNA como una
imagen en el espejo, Cap. 10).
Una nueva estrategia es la aplicacin de fragmen
tos cortos de la doble hebra de RNA (RNAi,
donde "i" se utiliza por interferencia; detallado en el
Cap. 1O). Con RNAi generado artificialmente de 21
a 23 nucletidos de longitud, el investigador alemn
Tom Tuschl consigui paralizar por primera vez
genes de mamfero sin disparar la respuesta del in ter

Fig. 5.5 Virus ONA y RNA


(no a escala). De arriba abajo y de izquierda a derecha:

vocan, por ejemplo, la formacin de verrugas. y algunos pollomavlrus, como


SV40,puedencausarcn
cer en animales.

Virus del sida (VIH), un


retrovirus con envoltura y
una hebra simple de RNA,
y largo tiempo de latencia.
Virus de la gripe, un orto
mixovirus, con varias
hebras de RNA y envoltura.
Hay tres tipos: A. By C.
Virus de la rubola (Rube1/o), pequeos y rojos, con
una hebra nica de RNA y
envoltura. Es un togavirus.
Papovavlrus (J>apllomavl
rus y poliomavirus), con
ONA de doble hebra, desnudo. los papilomavirus pro

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Virus del herpes, con ONA


de doble hebra y envoltura.
Virus de la.s paperas. con
RNA de una nica hebra, de
la familia de los paramixovi
rus. Ataca las membranas
de las mucosas, asf como
los sistemas inmunitario y
nervioso.

Virus de la rabia (Rabies),


con RNA de una nica
hebra, es un rabdovirus.
Virus del mosaico del
tabaco (VMT), con RNA de
una nica hebra, en forma
de palo. Cultvos enteros de
chiles y pimentn se pierden por el VMT, con las tpicas manchas marrones
sobre las hojas.

Baderl6fago Tlf, con ONA


de doble hebra. Ataca las
bacterias como E. col/.

Virus de la pollo, perteneciente a los picornavirus.


con RNA de una nica hebra
y desnudo. Produce poliomielitis, una grave enfermedad del sistema nervioso.

Adenovlrus, con ONA de


doble hebra, desnudo. Pro
ducen enfermedades del
sistema respiratorio.

Virus de la viruela (Vario/o),


con ONA de doble hebra y
envoltura. Es un virus muy
grande.

125

BIOTECNOLOGA

Cuadro 5.1 Medicamentos contra


virus
Pueden utilizarse muchas estrategias para
prevenir la extensin del VIH. Se intenta ata
car al virus en todas las rases de
replicacin:
1. En el acoplamiento a las clulas no
infectadas: el virus se une con la gp 120 de
su envoltura al receptor CD4 de la superfi
ce celular de los linfocitos T colaboradores.
Si se tuviesen anticuerpos contra CD4, los
lugares de anclaje de la clula podran estar
saturados. Por otro lado, se pueden sintetizar
molculas CD4 que, si se Inyectan en la san
gre, se unen a la gp J20 de la envoltura del
virus y con ello podran impedir una infec
cin. En el laboratorio funcionan ambos
mtodos. Sin embargo, son de esperar com
plicaciones inmunitarias porque cada CD4 o
antiCD4 tmplde la interaccin del CD4 con
su ligando natural.
2. La inhibicin de la transcrlptasa lnver
sa es un mtodo erectivo. El VlH es un
retrovirus y su RNA debe, en principio,

reescribirse a DNA. Las sustancias como


la azidotimidina (AZT, tambin denomina
da zidovu~ina), la lamivudina y la dideso
xiinosina (DDI) se desarrollan anlogamen
te a los nucletidos y se instalan "errnea
mente" por las enzimas en la cadena de
polinucletido.
La primera sustancia activa potente contra
el herpes, el aciclovir, tambin acta como
Inhibidor, anlogo a los nucletidos, de la
transcriptasa inversa. Aplicado en crema es
muy efectivo en el herpes simple y el herpes
zster (cinturn rosa), y es relativamente
poco txico. Otros inhibidores bloquean
el centro activo de la transcriptasa inversa
(como la neviragina y la delavirdina).
3. El RNA antlsentido (antisense-RNA) es
una copia del RNA que es exactamente com
plementaria al genoma del VIH. El RNA anti
sentido no codifica para protenas y por ello
no tiene funcin en la clula. Puesto que
el genoma del virus es un RNA de una nica
hebra, que se libera en una infeccin, el
RNA viral se puede unir rpidamente con

Diseo de f6rmacos asistido por ordenador


(Computer aided drug design): los frmacos
pueden disearse por ordenador y analizarse.
Los mtodos de anclaje automticos se utilizan
para encontrar los mejores lugares en la biomo
lcula para anclarse. Si la unin anteriormente
comentada es lo suficientemente fuerte, se pue
de sintetizar la molcula y analizar su actividad.
El mejor lugar para el saquinavir se indica aqu
en rojo.

Proteasa del VIH (arriba) y frmacos contra el


sida: indinavir, saquinavir, ritnaviry nelfinavir
(de arriba abajo y de Izquierda a derecha).
3. lnhibidor integrasa

el RNA antisentido "esperado" para formar


un hbrido RNA/RNA estable "sin sentido",
que no puede formar ningn provirus. Esto
se podra lograr mediante terapia gnica o
clulas madre (Cap. 1O).
El frmaco antisentido fomivirsen ya se utili
za hoy con xito en pacientes con sida para
el tratamiento de una infeccin ocular viral
que si no se trata produce siempre ceguera.

.\. lnhibidor de la protnsa

Virus infecciosos
formados

126

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4. Inhibicin de la proteasa del VIH. Los


medicamentos que bloquean la proteasa del
VIH son un triunro de la medicina moderna
y del diseflo molecular. La proteasa fragmenta el pollpptido producido por el virus en
largas cadenas, exactamente en el tiempo
correcto, en trozos cortos que se utilizan
para el empaquetamiento de nuevos virus.
Si los frmacos se unen fuertemente a la pro
teasa y se bloquea su accin, el virus no puede madurar a la rorma contagiosa.

VIRUS, ANTICUERPOS Y VAC UNAS

fern modificado (esto conduce a la degradacin de


cada RNA). Desde entonces se ha conseguido, por
ejemplo, parallzar determinados genes especficos
{nef, rev, gag, poi) en elVIH, el causante del sida. Los
primeros xitos se estn obteniendo en la lucha contra el virus de la gripe y el de la hepatitis C.

Cap. 9). El interfern liberado o el introducido artificialmente en el cuerpo se une a una molcula
receptora especfica en la superficie de otras clulas
y cambia la actividad celular. Se llega a la sntesls de
protenas, que hacen resistentes a las clulas frente
a las infecciones virales.

Los iohibidores de las proteasas codificadas por el


virus, que desempefan un importante papel en la
maduracin de las protenas virales, se utilizan tambin en el tratamiento contra el VIH. Todas estas
estrategias de defensa se siguen actualmente en Ja
investigacin del sida (Cuadro 5.1 ).

Al igual que la linfoquina interleuquina 2 (IL-2),


los interferones tambin se recibieron con gran entusiasmo como medicina maravillosa del futuro que
podra sanar muchas enfermedades, desde el habi
tual resfriado hasta el cncer. Estas expectativas,
poco realistas, no se cumplieron. El efecto curativo
es en general slo dbil, y los efectos secundarios a
menudo son graves. Los interferones son, igual que
la IL-2, valiosos para el tratamiento de algunas enfermedades humanas, pero normalmente slo en combinacin con otros tratamientos (Cap. 9}.

Puesto que el VlH ataca principalmente a las denominadas clulas T cooperadoras, que son importantes para la defensa del organismo, se podra forcalecer el cuerpo produciendo por ingeniera gentica citoquinas (por ejemplo interleuquina 2). Primeramente, el virus "darla mate" por medios qumicos y slo despus se estimularan las clulas
inmunitarias mediante el aporte de interleuquina 2.
En otras infecciones virales se producen interferones. Las clulas infectadas por virus producen interferones de forma natural y los eliminan (secrecin,

5.3 Cmo se defiende el cuerpo de las


infecciones: respuesta Inmunitaria
humoral mediante anticuerpos
En un principio, las bacterias y los virus fueron, sin
saberlo, las armas biolgicas de los europeos en la

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Flg. 5.6 Cmo los virus ata


can las clulas. Izquierda:
los bacterifagos atacan
Escherichio coli. Derecha:
el VI H ataca una clula
humana.

Flg. 5.7 Cmo el cuerpo se


opone a las infecciones.
Descripcin detallada
en el Cap. 9. Aqu se ven
macrfagos, anticuerpos
y clulas T.

127

BIOTECNOLOGA

nvoltura proteica del virus

RNA

En la respuesta inmunitaria humoral (del latn


humor, lquido) actan las protenas solubles, los
anticuerpos (inmunoglobulinas, Cuadro 5.2), co
mo elementos de reconocimiento. Adems, hay fac
tores de defensa humoral, como la lisozima (Cap. 2)
y los interferones. Los anticuerpos unen molculas
o clulas ajenas al cuerpo, que se identifican de este
modo como invasores y se produce la fagocitosis por
los fagocitos. Se forman los anticuerpos a partir de
las clulas plasmticas, que asimismo aparecen
como clulas B.

Fig. 5.8 Arriba: cmo las


subunidades forman
una cpside de virus a partir
de cadenas peptdicas. Arriba
a la derecha: el virus
de la polio, que bsicamente
se sintetiz por completo
en 2002, consta de una larga
hebra de RNA en una cpside
de protena hueca.

Fig. 5.9 Cmo los anticuer


pos neutralizan un virus:
aqu se muestran en verde
claro slo los brazos de
unin (fragmentos Fab),
no el "pie" del anticuerpo.
Claramente se cubren con
el anticuerpo los pinchos del
virus y con ello se neutraliza.

Fig. 5.10 Cmo los anticuer


pos se unen al antgeno:
una cavidad profunda une una
pequea molcula por com
pleto (arriba, totalmente intro
ducido); una superficie gran
de, plana, del lugar de unin
del antgeno, une la protefna
lisozima (abajo).

128

tario diferencia entre lo "propio" y lo "no propio" .


Puede formar cien millones (108) de diferentes
anticuerpos especficos y ms de un billn (10 12) de
diferentes receptores de clulas T. Consta de dos
sistemas que trabajan en paralelo, pero relacionados estrechamente: la respuesta inmunitaria hu
moral y la celular.

conquista de Amrica: consiguieron la mayor parte


del trabajo homicida. Del siglo XV1 al XIX, los conquistadores y colonos de Amrica, y tambin de las
islas ocemicas, llevaron consigo el sarampin,
la viruela, la gripe, el tifus, la difteria, la malaria, las
paperas, la tos ferina, la peste, la tuberculosis y la fiebre amarilla, mientras que los indios americanos (con
excepcin de la sfilis, de origen poco claro), "por su
lado", no tenan ni un solo patgeno. En el continente americano no haba antes ninguna epidemia evidente. Segn Jared Diamond, esta "descompensa
cin de armas" entre los indianos (osea los indios) y
los europeos se debi a los grandes rebaos de gana
do de los campesinos de Eurasia, que desarrollaron
enfermedades agudas y endmicas que eran propias
de animales y que ms tarde tambin atacaron de
manera similar a la poblacin humana.
Asombrosamente, los brotes de las enfermedades
infecciosas conocidas hoy datan de hace poco tiempo: la viruela se produjo por primera vez en el
ao 1600 de nuestra era, las paperas y la peste en el
400, y el clera y el tifus en el siglo XVl! Los pueblos
eurasiticos pudieron desarrollar durante siglos
la inmunidad contra ellas y forzaron "tablas" en el
juego contra las epidemias. Los habitantes del Nuevo
Mundo, en cambio, no tuvieron tiempo para crear
"genes de resistencia" y, sin preparacin, cayeron vfc
timas de los grmenes en masa.
Cmo nos protege el sistema inmunitario?
Debemos contentarnos con una respuesta simple:
el sistema inmunitario es tan complejo, que su
representacin supera el marco de un libro para
principiantes en biotecnologa. El sistema inmuni

El nombre de las clulas B (linfocitos B) proviene de la bursafabricii, que se encuentra slo en las
aves -un rgano linftico en el segmento final de la
cloaca (Fig. 5.11 ). En la bursa los linfocitos madu
ran a linfocitos B. Si se extraa la bursa de los
pollos, stos quedaban extremadamente expuestos
a las infecciones bacterianas. Ya no eran capaces de
formar anticuerpos.
Una macromolcula ajena al cuerpo (o una clula
o un virus) se denomina antgeno. Los anticuer
pos se dirigen con su fuerza de unin (afinidad) no
contra el antgeno entero sino slo contra un
lugar la molcula, que se conoce como eptopo
o determinante antlgnico.
Una infeccin moviliza varias poblaciones de clulas inmunitarias en cooperacin. Los linfocitos Blle
van anticuerpos como molculas de reconocimien
to sobre su superficie (receptores de superficie). En
general, sin embargo, no se activan por los antgenos
circulantes. Primero el antgeno debe ser recogido
por una clula presentadora de antgeno. Esta
funcin la reallza un macrfago o una clula den
drtlca. El antgeno es procesado (procesamiento)
por estas clulas, aparece entonces sobre la superfi
cie celular y se "presenta" a una clula T colabora
dora. tsta se une mediante el estimulo de la interleuquina 2 y activa con ello las clulas B, que antes
tambin haban tenido contacto con el antgeno.
Ahora estas clulas Bproliferan mucho, se unen a un
cien celular (seleccin clona!) y se diferencian:
algunos descendientes llegan a ser clulas de
memoria, las cuales posibilitan una reaccin inmu
nitaria ms rpida en una nueva infeccin, y otras se
desarrollan hasta convertirse en clulas plasmticas
productoras de anticuerpos.

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VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS

Cuadro 5.2 Anticuerpos

Las dos cadenas ligeras (ocre) forman, con las


dos cadenas pesadas (oscuro y rosa), un domi
nio variable (frogment vorloble) que se une al
antgeno, por asl decirlo, como dos manos que
pudieran agarrar al antgeno. En ta regin varia
ble los 20 aminocidos son hlpervariables y per
miten billones de combinaciones para el recono
cimiento de antgenos.

Los anticuerpos son componentes del slste


ma inmunitario de los vertebrados, que debe
defender contra los invasores. Su funcin es
identificar y unir especficamente los patge
nos y con ello marcarlos para el sistema
inmunitario, as como neutralizar toxinas.
Muchos patgenos daflan por liberacin de
toxinas.

El "pie" es Igual para todos los anticuerpos,


y se denomina tambin regin constante
( Fc,jragmentconstan~. Con la parte Fe
el anticuerpo se mantiene fijo en la superfi
ce de la clula B.
Cmo puede el organismo fabricar anticuer
pos especfficos contra prcticamente cualquier
material exgeno? Cmo es posible reconocerlos a todos, con ese nmero tan increlblemente grande de antgenos? Sera demasiado
complejo tener preparado un gen para cada
uno de los aproximadamente cien millones de
anticuerpos diferentes. El sistema inmunitario
utiliza, por lo tanto, un truco genial.
Los ingenieros inmunlogos Frank Brei
tling y Stefan Dbel lo describen de este

lnmunoglobulina G (lgG)
~~~!~~~---

Puente

~!~~-~~~-~?............/ '

Eptopo

Cadena ligera
. ..................................
Cadena pesada

... <..

Regi~>;.:::v
variable ...,

~)

Regin
constante
(Fe)
Cmo se unen al mismo tiempo tres fragmentos
(Fab) del anticuerpo al eptopo de un antgeno
(verde). Aqu se ilustra nuestra conocida enzi
ma lisozima (vase tambin Cap. 2). El segundo
Fab y el "pie" del anticuerpo (parte Fe) se mues
tran sombreados.

Las molculas de anticuerpos constan de


cuatro cadenas proteicas: dos cadenas Lllge
ras (light, peso molecular de 25 kD) y dos
cadenas H pesadas (heaiy, MW 55 kD).
Se mantienen unidas por puentes disulfuro.

modo: "Asf como con unos pocos componentes normales se puede llegar a construir
diferentes casas, las clulas consiguen for
mar con los componentes polipepdicos
los anticuerpos modulares. Para ello se
deben codificar en el genoma slo un par
de cientos de esos componentes polipep
dicos. Unos pocos componentes (grandes)
codifican para la zona constante del anti
cuerpo. La especificidad de unin del an
geno a un anticuerpo, sin embargo, est
mediada slo por una pequea parte de la
protefna conjunta, las regiones variables.
Tambin sta consta de nuevo de tres a
cuatro mdulos diferentes, que se agrupan
de distinta manera en cada clula durante
la diferenciacin de los linfocitos B."

1
<

..

Fabricacin de un anticuerpo Ozquierda) a partir de


un fragmento Fab (arriba a la derecha) y fragmentos
scFv (single choin Fv {rogment) (abajo a la derecha).

Los anticuerpos circulantes libres se unen al antige


no y con ello lo marcan para su destruccin por
otros componentes del sistema inmunitario.
Junto a estos mecanismos comentados acta el
sistema del complemento propio del cuerpo,
una cascada de aproximadamente 30 protenas.
Estn disueltas en el plasma sanguneo o unidas
a las clulas, y sirven para la defensa contra los
microorganismos (bacterias, hongos, parsitos... ).
Tienen propiedades fuertemente destructoras de
clulas y pueden, si no estn bien reguladas, causar
daos tisulares en muchas enfermedades (infarto

\... tag

cardiaco, lupus eritematoso sistmico, artritis reu


matoide). Mediante el sistema del complemento se
destruye entonces la membrana celular, y con ella
las bacterias o las clulas dafiadas y degeneradas
(Cap. 9).

5.4 Respuesta inmunitaria celular:


clulas T asesinas
Si se separa en mamferos jvenes el timo (molle
jas, glndula pectoral) se provoca, igual que en la
separacin de Ja bursa en los pollos, la predisposi
cin a las infecciones. Despus de una timectomfa

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Flg. 5.11 Las clulas B (linfoci


tos B) recibieron su nombre
de la burso fobricii, que
se encuentra en las aves
(es un rgano en la seccin
final de ta cloaca).

129

BIOTECNOLOGA

Pplido del virus

Fig. 5.12 Arriba: receptor


de clulas T (TCR). Abajo:
estructura de una protena
MHC de clase 1presentada
con el pptido del virus
(rojo).

Fig. 5.13 Izquierda: clulas T


con CDS (verde) y receptor
de clulas T (TCR, azuO.
Derecha: clulas T colaboradoras con CD4 y receptor
de clulas T. Ambas se
anclan a una clula husped
infectada, que presenta
en su superficie un pptido
del virus (rojo) y lo "notan
tas clulas Ty las clulas T
colaboradoras (arriba).

MHCdawl

130

disminuye en gran medida el nmero de linfocitos


(glbulos blancos). Puesto que las clulas T se desarrollan en el timo, se denominaron linfocitos To
clulas T.

cuerpos extraos unidos a pptidos son la "seal asesina" y causan la apoptosis, la muerte celular programada, un "suicidio" en inters del organismo
completo.

Los anticuerpos solubles (Seccin 5-3) actan muy


bien contra los patgenos que se encuentran fuera
de las clulas, pero apenas ofrecen proteccin contra los virus y las micobacterias (como la lepra y la
tuberculosis). stos se protegen de los anticuerpos
mediante las membranas de sus clulas husped.
Por ello, Ja evolucin ha desarrollado una estrategia
de defensa refinada: la respuesta inmunitaria
mediada por clulas.

Las clulas T citotxicas poseen adicionalmente


una protena, conocida como CDS (CD significa
cluster o/dif/erentiation), que sirve para reconocer
el complejo de la protena MHC de clase 1y el pptido que se presenta. En el reconocimiento de este
complejo se entrega la protena perforina, que forma poros de 1O nm de dimetro en la membrana
celular diana y la hace permeable. Entonces las proteasas (granzimas) se seccionan. Las clulas diana se
agujerean, mueren y rompen con ello el DNA propio y el del virus. Las mismas clulas T se despegan
y se estimulan para proliferar, despus de haber
demostrado ser armas apropiadas contra el invasor.

Los linfocitos T citotxicos (tambin denominados


clulas T asesinas) buscan constantemente la superficie de todas las clulas accesibles y matan aquellas
que llevan seales de reconocimiento ajenas al cuerpo (Fi~. 5.12 y 5.13). Esto no es tan fcil, pues los
invasores no quieren dejar ninguna pista. Las clulas
husped han desarrollado, para los invasores camuflados, un mecanismo genial para cortar (mediante
proteasomas) y presentar: en su superficie hay un
control sorpresa con pequeos pptidos, que se crean por una degradacin proteica del invasor en el
citosol de la clula husped. Estos pptidos se condu
cen hacia fuera y se presentan a las protenas de la
membrana celular (Fig. 5-12), que codifican por el
complejo principal de histocompatibllidad

No todas las clulas T son citotxicas, o sea asesi


nas. Las clulas T colaboradoras son imprescin
dbles para la defensa contra agentes patgenos,
tanto extracelulares como intracelulares. Estimu
lan linfocitos B y clulas T citotxicas para su proliferacin.

Tambin las clulas T colaboradoras se activan al


reconocer antgenos exgeaos sobre la superficie de
las clulas presentadoras de antgenos, en general
por clulas dendrticas. El antgeno est disponible, pues, como fragmento peptfdico, se produce
(procesa) a partir de protenas exgenas en las clu(Major Histocompatibflity Complex, MHC).
las presentadoras de antgeno por degradacin y slo
Principalmente existen protenas MHC de clase 1 se presentan en la superficie de las clulas T colaboy de clase Il {Fg. 5.13). Las protenas MHC de cia- radoras. El reconocimiento del antgeno depende
se 1, unidas a las clulas en la membrana plasmtica decisivamente de las protenas MHC de ciase Il
del virus atacante, se "agarran" con obstinacin a sus sobre las clulas presentadoras de antgeno.
pptidos unidos, de modo que los receptores de una
clula T asesina se pueden "tocar y examinar". Los La funcin de un pptido mediante las protenas
MHC de clase 11 es sealizar una llamada de ayuda:
"las clulas entran en contacto con el patgeno!"
Las de clase 1, en cambio, llevan el mensaje: "las
clulas matan al patgeno! Presentan un mecanismo de autodestruccin!"

MHCclasell

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Las clulas T colaboradoras se sirven de sus receptores de clulas T y de una protena (CD4) sobre su
superficie, que lleva un dominio (construido como
anticuerpo) similar a una inmunoglobulina extracelular (Fig. 5.13). El reconocimiento del complejo no
desencadena procesos que conducen a la muerte de
la clula, sino que estimula para ello a las clulas T
colaboradoras, segregando linfoquinas -entre ellas
la interleuquna 2 y el interfern y. La IL-2 estimula
las clulas B, que tambin antes tenfan contacto con
el antgeno, para proliferar y fonnar clulas plasmticas que unen anticuerpos. Las clulas plasmticas

VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS

Cuadro 5.3 Historia de la


biotecnologa: Vacunas
"Una persona que no es mdico utiliza
material de composicin y toxicidad deseo
nocidas y trata con ella a pacientes, entre
otros un nio, que posiblemente sufren
una enfermedad mortal. Intenta no slo
obtener la comprensin de sus pacientes,
sino que publica su nombre y direccin
para divulgar algunas afirmaciones asom
brosas. Adems, al igual que hacen generalmente los curanderos, oculta a los afee
tados las particularidades del tratamiento,
de modo que su sentido y valor no se pue
dan juzgar por separado. Tal vez lo peor de
todo es que esta persona poco escrupulosa
inyecta un microbio extraordinariamente
virulento antes de haber realizado un anll
sis en animales. Algunos pacientes mueren
y un mdico involucrado se distancia de las
maquinaciones de su colaborador. El hom
bre asumi estos riesgos, para luego dejar
celebrar a voz en grito su xito en la lucha
contra la rabia. Fue Louis Pasteur!"
~ta es la cita de Bemard Dixon, historiador
de Biotecnologa en el libro de Spektrum
"El hongo que convirti en presidente a
John F. Kennedy". Pasteur tuvo mucha suer
te, como l mismo dijo: "la suerte favorece
al esp!rltu preparado -exactamente como
en sus otros aspectos pioneros. Viol -como
anteriormente Edward Jenner en la vacuna
de la viruela- algunos principios ticos. Pos
tul que el causante debla encontrarse en
la mdula espinal, a pesar de que el microbio
an era desconocido. Lo pudo debilitar, "atenuar", extrayendo la mdula espinal de Ue
bres y dejndola envejecer.

El 6 de julio de 1885 administr al pequeno


Joseph Melster mdula espinal de liebre
envejecida sin saber si el virus poda encon
trarse en ella. Hoy se puede ver el virus de
la rabia, en forma de proyectil, que pertenece a los rabdovlrus, con el microscopio elec
trnico (Fig. 5.5). En los tiempos de Pasteur,
sin embargo, el virus era Invisible. Al contra
rlo que la vacuna de Jenner, la de Pasteur se
cre en el laboratorio.
Jenner estaba en realidad "en el lado segu
ro": habla notado que la viruela de las
vacas era inofensiva. En el siglo Xl, los
mdicos chinos observaron que las personas que hablan superado una enfermedad
de viruela eran resistentes a una nueva
infeccin. En la antigua China se Infectaba
ya a los nit'ios pequet'ios artificialmente con

viruela, para que en su vida posterior estu


vieran protegidos contra la enfermedad.
Los altos riesgos unidos a esta vacuna pare
dan soportables, dada la mortalidad infan
til. En China exista la diosa viruela Chuan
Hsing Hua Chien, para los hindes Shlta/a
mata. Las reacciones a la vacuna de
la viruela ms leves aparecan cuando la
vacuna de la viruela se aislaba de casos
de viruela especialmente leves. Esta tcni
ca de vacunacin contra la viruela se
extendi ms tarde tambin a Europa. En
la segunda mitad del siglo XVIII la "varloli
zacin" estaba ampliamente extendida.
Lady Mary Wortley Montagu dej

"varlolizar" a su hija en 1721, y de este


modo fue la primera persona en Inglaterra
vacunada oficialmente. Experimentos con
presos y hurfanos (! ) dieron a los mdicos
britnicos la seguridad, e incluso los mlem
bros de la familia real se vacunaron contra
la viruela. En 1756 el Colegio de Mdicos
recomend la variolizacin. Pero antes,
Edward Jenner demostr un mtodo en
gran parte inofensivo. ~te fue uno de los
motivos para la diSminucin de la viruela
y finalmente uno de los requisitos esencia
les para la revolucin industrial. El signlft
cado especial del descubrimiento de Jenner,
sin embargo, solamente fue considerado
por Pasteur. Trabaj en experimentos con el
causante del clera de las aves (Pasteurel/a
multocida). Pasteur us, en pollos, un culti
vo con el patgeno, que se habla dejado
durante varias semanas en el laboratorio,
y observ que los pollos del experimento de
infeccin no slo sobrevivan sino que tam
bin eran inmunes a posteriores infecciones
del clera de las aves.
Antes, sin embargo, Pasteur habla demos
trado abiertamente en 1881 la eficacia de
una vacuna protectora de las ovejas contra
el carbunco (Bacil/us anthracis), la protec
cin de la reproduccin del gusano de seda
y la fermentacin del vino segn los princi
pios cientficos. Pasteur tuvo xito! El xi
to contra la rabia fue la base del Instituto
Pasteur en Pars. La reaccin inmunitaria
del organismo, que concluy Pasteur, con
dujo al desarrollo de diferentes tipos de
vacunas.

su desarrollo de los estudios sobre la tuber


culosls, Koch obtuvo en 1905 el premio
Nobel de Medicina o Fisiologa.
De numerosas expediciones de investiga
cin a India, Japn y pases africanos se rea
lizaron experimentos higinicos trpicos y
parasitolglcos, que permitieron el conoci
miento del patgeno de la peste, la peste
vacuna, la malaria, la enfermedad del suello
y el clera.

Emll von Bebring ( 1854 l9 l 7) llev a


cabo entonces el proceso de inmunizacin
puiva mediante la administracin de anti
sueros (seroterapia). Desde 1880 hasta
1889 Behrlng estuvo trabajando en Berln
como director mdico, antes de que en 1888
pasara al Instituto de Higiene y a partir de
1889 finalmente al Instituto para Enfermedades Infecciosas como asistente de Robert
Koch. Aqu trabaj en estrecha colaboracin
con el mdico y microbilogo japons Sbi
buaburo Kitasato (1856 l 931 ).

Emil von Behring


(18541917).

Behrlng obtuvo en 1890 los primeros xitos


en el tratamiento de la difteria en animales.
La difteria era entonces una terrible enfermedad Infecciosa, el "ngel exterminador
de los nltlos . Mediante el trabajo de cooperacin con Paul Ehrllch, Behrlng consigui
finalmente el antisuero, en 1893, y con ello
salv la vida de muchos nit'ios.

Robert Kocb ( 1843-191 O) fund la bacte

En 1895 Emll Behrlng fue nombrado direc


tor del Instituto de Higiene de Marburg.
En el atlo 1901 obtuvo (cuatro a11os antes
que su admirado maestro Robert Koch)
el premio Nobel de Medicina o Fisiologa
y se le concedi un ttulo nobiliario por
el desarrollo del anticuerpo y la produccin
de vacunas.

rlologa mdica. ti fue el primero en demos


trar (en controversia con el belicoso Pasteur)
que el clera, el carbunco, la tuberculosis
y la peste las causan bacterias especiales. Por

ti fund en 1904 la "factora de Behrlng~


en Marburg, que produca sueros contra
la difteria y el ttanos en grandes cantidades.

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131

BIOTECNOLOGA

Cuadro 5.4 Opinin de los


expertos: Por qu no hay an
una vacuna contra el VIH?
Aprimera vista parece que una vacuna
segura, eficaz y barata puede ser realmente
el instrumento ideal de la medicina epid
mica para lograr oponer resistencia al sida.
Por qu no existe an este instrumento? El
sida nos acompaa desde hace casi
20 aos, y en los ltimos aos se han inver
tido 300 millones de dlares en la investiga
cin de vacunas.

que los diversos primates se protegen mejor


contra el VIH que contra su homlogo VIS
(que provoca en los monos un sndrome
similar al sida), sus expectativas, mejores
que las que se despiertan mediante experi
memos en ratones, no estn confirmadas
( mice tells lieS', es mientras tanto el
comentario estndar, si de nuevo se publi
can nuevos datos de experimentos con
roedores).
Al investigador le falta an una etiqueta
-<> sea un marcador que pueda leer, con
un simple procedimiento de prueba, el
efecto de proteccin de una vacuna. Esto
hace difcil de nuevo el estudio de la vacu
na en humanos, lo que significa una res
puesta Inmunitaria potente de la vacuna
no significa que la vacuna en realidad sea
capaz "en casos serios" de prevenir una
infeccin.

Campaa contra el sida en China.

La respuesta banal es que el VlH plantea al


investigador de Ja vacuna problemas nunca
conocidos. No hay slo uno, sino dos "tipos"
de virus (VIH I y VIH2) y al menos diez
subtipos de VIH i (con diferente distribucin
geogrfica). El causante parece tener tam
bin una prcticamente inagotable capacidad
de modificar importantes caractersticas
superficiales constantemente, y asr deja que
"se produzca un vaco" en el sistema inmu
nitario. Es evidente que las vacunas conven
cionales, que tienen como objetivo crear
anticuerpos contra una caracterstica fija del
causante, en este caso no pueden conseguir
nada. Es indiscutible, mientras tanto, que
una vacuna eficaz contra el VIH debe activar
los dos brazos del sistema de defensa - la for
macin de anticuerpos y los denominados
mecanismos Inmunitarios mediados por
clulas.

Sin embargo, an no se sabe qu anticuer


pos y qu clulas representan la "tropa" ms
fuerte. La situacin es an ms complicada
porque los mecanismos de defensa que son
eficaces en sangre y los que deben atacar en
el tracto genital, en primera lnea de com
bate", estn constituidos de manera total
mente diferente. Por desgracia, los modelos
animales utilizados hasta ahora reflejan el
curso de la infeccin en humanos de forma
poco fiable. Mientras que los estudios con
vacunas en monos tienen el problema de

132

Ninguna vacuna pa1'11 todas las ocasiones

Partiendo de la observacin de que las perso


nas que se lnrectan con un VIH "lisiado" no
desarrollan sida durame mucho tiempo (en

un caso durante 17 aos), se tuvo la esperan


za de conseguir una vacuna viva atenuada.
Efectivamente, las variantes del virus a las
que les faltaba el denominado gen nef (u
otras secciones del gen que son importantes
para la prolireracin del virus) protegen a los
monos, en un elevado porcentaje, contra las
habituales variedades de los causantes de la
enrermedad porVIH.
Sin embargo, desde principios de 2006 est
claro que las variantes propias a las que fal
tan tres secciones de genes esenciales pue
den representar una bomba de tiempo biol
gica en las vacunas. Asf, Ruth M. Ruprecht
y sus colegas del Dana Faber Cancer lnstitu
te, en Boston, demostraron que tambin las
variantes del VIH modificadas artificialmente
podan hacer enfermar y finalmente matar a
los animales de experimentacin. La vacuna
viva debilitada est, por lo tanto, excluida
definitivamente.
Tambin considerada durante mucho tiempo
la vacuna non plus ultra, la vacuna
DNAgp 120 se est revelando cada vez ms
como una sofisticacin que consume mucho
tiempo. Los planos constructivos de no menos
de 20 000 variantes de las molculas gp 120,
por ejemplo, los quiere dirigir al organismo
Mlchael Schreiter, del Instituto Bernhard
Nocht de Hamburg, mediante la vacuna DNA.

Arriba: el procedimiento del test rpido en el


banco de sangre de Guangzhou (China).
Abajo: todos los donantes de sangre deben ser
analizados para el VIH y diferentes formas de
hepatitis, para obtener sangre segura. Anuncio
en un autobs de donantes de sangre en China.

Otros investigadores tambin estudian, ade


ms de la informacin especfica de Jos virus,
determinados genes para provocar la defi
ciencia celular del sistema inmunitario con
sustancias transmisoras activadas en la vacu
na sinttica. El nmero casi Ilimitado de
posibilidades de combinacin exige una
prueba de eficacia igualmente amplia en
estudios experimentales en animales, y ello
hace que la introduccin en la prctica de
tales vacunas se vaya retrasando.

Los investigadores del sida tienen, pues, que


corregir tambin sus objetivos con el trans
curso de los aos. As, una vacuna que con
fiera un 60% de proteccin se considera ya
un gran xito. Como comparacin, la vacu
na contra el virus de la hepatitis B, que se
transmite tambin mediante productos de
la sangre y relaciones sexuales, acta en casi
el 100% de los casos.

Infeccin de una clula por el VIH.

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VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

La vacuna del VIH para "todas las ocaslo


nes", por lo tanto, presumiblemente nunca
podr existir. Se puede pensar en una gama
de vacunas que se ajusten a las necesidades
de diferentes grupos de riesgo: para los
homosexuales no infectados, para jvenes
en zonas endmicas de sida o para los por
tadores del VIH como una vacuna frente al
desarrollo de sida. En el mono Rhesus ya
se ha probado con xito una vacuna concebible, que por un lado Impide la Infeccin
por el virus y por otro potencia tanto el sis
tema inmunitario que se puede mantener
controlado el virus sin que se observe la
enfermedad.

tadas por unidad de tiempo-<> sea, en los


pases en vas de desarrollo. Sin embargo,
esto lleva implcitos problemas ticos que
hasta ahora slo se estudian de manera adi
cional.

Problemas ticos sin resolver

Con ello est claro que las expectativas del


presidente Clinton de tener, en el afio 2007,
una vacuna en funcionamiento, no eran realistas. Tambin el clculo aproxlmado del
productor farmacutico, de ocho a diez
aos, es presumiblemente demasiado opti
mista. Actualmente slo hay una vacuna en
ensayo clnico, y dos estn en la etapa previa
a los ensayos de fase 11. Casi otras 30 sustan
das estn en "proceso de investigacin"
-tras 15 aos de investigacin de la vacuna
del sida no exactamente satisfactorios. Entre
la ilusin y la realidad, el hecho es que se tar
da once aJ'los en llegar desde una fase 1de
estudio (exclusin de los efectos secundarios) hasta un "autntico uso en clnica"
(fase III].

La verdadera eficacia de una vacuna y los


efectos colaterales graves, que sin embargo
aparecen raramente, pueden calcularse o
determinarse exactamente si se vacunan
ms de 1O000 personas en diferentes regio
nes. Estos estudios se denominan multicn
trlcos, y se deben planear, dar el visto bueno,
realizar y valorar. Lo que significa de nuevo
que an debemos tener paciencia durante
15 a 20 aflos hasta disponer de una vacuna
contra el VIH realmente segura y exenta de
efectos secundarlos.
Incluso si los problemas biomdicos se llegan
a solucionar ms deprisa de lo esperado, hay
otra clase de obstculos que no siempre
dejan el camino Ubre mediante nuevos tru
cos inmunolgicos en laboratorios de alta
tecnologa. Para que la duracin del estudio
sea lo ms breve posible, as como por moti
vos estadsticos y de coste, los estudios con
vacunas deben realizarse donde significativa
mente se encuentren muchas personas infec-

Virus del sida en sangre rodeado de anticuerpos


en forma de y.

En realidad, es obvio que los pases cuyas


personas "muerden" primero la "manzana"
de prueba de una vacuna son tambin los
primeros en aprovecharse de ello, suponien
do que la vacuna resulte eficaz.
La experiencia muestra, sin embargo, que
las nuevas vacunas desarrolladas estuvieron
disponibles con un retraso de 1Oa 15 aflos,
cuando se requeran con ms urgencia. Adems, las compaflas farmacuticas quieren
ganar dinero con sus vacunas, pero ni las
personas en los pases en vas de desarrollo
ni tampoco su sistema de salud pueden
pagar su precio habitual en el mercado. La
mayor irona sera, segn Jos Esparza,
director del Departamento de
Vacunas de VIH y Sida de la ONU, que una
vacuna que ha llegado al mercado mediante
estudios en un pas en vas de desarrollo,
por motivos financieros slo se entregue
para su uso en pases Industrializados. Esto
hace an ms grande el existente "abismo
del sida".
Otro problema tico es que personas sin
informacin del principio -ni del riesgo asociado- participen en estudios doble ciego
(en los cuales ni el mdico ni el paciente
saben quin ha recibido la vacuna y quin
el placebo].

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lQuln debe p1pr esto?

Para que los pases pobres con los AIDS


hot-spots no favorezcan Jos "Jugares de
anlisis" baratos para la vacuna del sida, los
institutos de investigacin de los pases en
vas de desarrollo se involucran por igual
en los estudios de las vacunas. En muchos
pases del tercer mundo, sin embargo, se
debe crear primero la infraestructura
correspondiente, y no se ha establecido
de dnde deberan provenir los medios
financieros requeridos. Las compaas farmacuticas no tienen inters en unos "costes de produccin que superen el 10% del
precio lfmlte", como se exige de los paises
desarrollados. Para dar forma a la investiga
cin en una vacuna contra el VIH lucrativa
para la Industria farmacutica, se propuso
desde diferentes mbitos organizar unas
reservas de varios miles de millones de las
vacunas de todo tipo para poder comprarlas
en los pases en vas de desarrollo a un pre
co del mercado habitual. Pero quin debe
aportar estas reservas - y mantenerlastampoco est claro.
Incluso si los diversos obstculos se solucionan durante el largo camino hacia la vacuna
del VIH, esto no significa an que las personas se infectan tambin, por ejemplo, en lo
ms profundo del Congo. Por lo tanto, Ja
riqueza de los pases se agota ya al cuidar su
poblacin con las vacunas estndar.
Finalmente, los expertos advierten que
centrarse en la maravillosa arma de
la vacuna del VlH" puede hacer fracasar
estrategias de otro tipo que podran contra
lar la epidemia. El dinero destinado a la
vacuna dejara de utillzarse en las medidas
de lucha favoritas hasta ahora. "La extensin del VIH puede disminuir ya maana
con los conocimientos actuales", se
coment en la revista The Lanceten
un artculo de fondo, "y con un gasto
financiero claramente Inferior que con
la vacuna del sida."

El Dr. Hermann
Feldmeier es director de departamento en el Instituto de
Medicina Infecciosa
de la Caridad
en Berln.

133

BIOTECNOLOGA
Fig.5.14 Derecha: cmo
se fabrican, en un paso,
las modernas vacunas contra
la viruela y ta hepatitis.

Gen para el antgeno de superficie


..........................................................P.r~~-~!P.~.~~~~-~!~-~~-d-~.!?._h_~P.?.!!!!~.~-

Protena del virus de la hepatitis B

1nyeccin del
virus vaccinia
recombinante

Virus vaccinia
recombinante

E)''"
Virus vaccinia

Fig. 5.15 Edward Jenner


vacunando a un paciente
(arriba). Dibujo de Jenner del
brazo infectado de viruela
vacuna de la granjera Sarah
Netmes (abajo).

.......

El sistema inmunitario sintetiza


anticuerpos contra vaccinia
y la proteina de la hepatitis B

Anticuerpo
antivacclnia

Fig. 5.16 El ltimo enfermo


de viruela del mundo:
el somal de 23 aos
Ali Maow Maalin en 1977.
Se invirtieron 200 a
300 millones de dolares
en el exterminio de la virue
la de la Tierra. Maow Maalin
no habra sobrevivido a la
enfermedad de la viruela
sin antibiticos.

Pases
30

15

segregan sus anticuerpos a la sangre. El VIH se infil


tra en el sistema inmunitario mediante la destruccin de las clulas T colaboradoras. Una nueva sus
tancia seal para la infeccin viral es la neopterina,
de bajo peso molecular, que se segrega por los macr
fagos al plasma sanguneo si se estimula con interfe
rn y. Como pudo demostrar Dietmar Fuchs con
su grupo de trabajo (Fig. 5.22) en Innsbruck, con ella
se puede realizar un test rpido de infeccin viral.
Una alta concentracin de neopterina en sangre
indica que tiene lugar un ataque viral, independien
temente de cul sea el virus. La neopterina puede,
por tanto, ser importante para el diagnstico tempra
no de virus desconocidos! Para los bancos de sangre
sera una ayuda incalculable conocer todas las infecciones virales recientes de los donantes. Todos los
bancos de sangre austriacos utilizan el test de la
neopterina.

5.5 La primera vacuna: la viruela


vacuna contra la viruela
humana
Fig. 5.17 Nmero de pases
con viruela hasta su
erradicacin.

134

Si el mdico rural ingls Edward Jenner (1749


1823) hubiera repetido hoy su experimento, que lo

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hizo famoso en 1796 (Fig. 5.15), seguramente


habra ido a parar a la crcel. Su experimento, inyec
taren la piel del nio de ocho anos James Phipps una
muestra de una pstula de viruela vacuna de la granjera Sarah Nelmes [Fig. 5.15) y dos meses ms tarde
una dosis de viruela autntica potencialmente peli
grosa, infringe los patrones actuales de las pautas de
seguridad mdica y lo tacha de negligente. Esto an
fue superado nada ms y nada menos que por Louis
Pasteur (Cuadro 5.3). Sin embargo, el nio sobre
vivi y Jenner ayud a revolucionar la medicina: se
haba descubierto la primera vacuna de la historia.
No obstante, se ha dicho que ya haba vacunaciones
activas contra la viruela alrededor del afio 1000 a. C.
La biotecnologa promete ahora una nueva revolu

cin para las vacunas: el desarrollo de nuevas


vacunas [del latn vacca, vaca) en periodos breves

con un descenso vertiginoso del riesgo de la vacunacin. Jenner haba observado que la supervivencia a
una enfermedad de viruela vacuna no slo aporta
inmunidad contra la viruela vacuna, sino tambin
contra la autntica viruela humana. Lo que Jenner
no saba es que los virus de la viruela vacuna estn
estrechamente unidos a los virus de la viruela huma
na. Como ya hemos comentado, el cuerpo posee en

VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

la sangre linfocitos que dan la alarma si aparecen


invasores (antgenos) autoinvitados. Dan orden a
otras clulas de formar material de defensa (anticuerpos) contra los patgenos, y con estos anticuerpos se marca el patgeno y es destruido por las clulas fagocticas (macrfagos) (Fig. 5.7).
Ya hemos dicho que las clulas B proliferan tras el
contacto con el antgeno y la activacin por las clulas T colaboradoras. Una parte de la descendencia
de estas clulas forma anticuerpos contra los invasores en mayor cantidad, y otra parte se desarrolla
a clulas de memoria, que ante infecciones renovadas permiten una reaccin inmunitaria ms rpida.
Estas clulas de memoria pennanecen parcialmen-

te a lo largo de la vida, y con ello consiguen y confieren la inmunidad del organismo contra el correspondiente antgeno.
Jenner tuvo suerte, porque debido a la similitud de
la estructura superficial de los antgenos de la viruela vacuna y de la viruela autntica, se gener inmu-

nidad no slo contra la inofensiva viruela vacuna


sino tambin contra el peligroso virus de la viruela
humana. Con patgenos inofensivos se puede reforzar el sistema inmunitario del cuerpo frente a un ataque de patgenos que amenazan la vida. El ltimo
enfermo de viruela del mundo, el somalf Ali Maow
Maalin (Fig. 5.16), abandon el hospital el 26 de
octubre de 1977. Despus de dos aos de control
mundial intensivo de la viruela, finalmente fue erradicada del mundo. Slo dos laboratorios en todo el
mundo an mantienen (esperemos!) el virus de la
viruela: los laboratorios internacionales de referencia de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
en Atlanta (Estados Unidos) y cerca de Novosibirsk
(Rusia). La aniquilacin de las reservas es motivo de
duras discusiones. A la vista del bioterrorismo, las
naciones industrializadas acaparan vacunas contra
la viruela. Quin puede hoy afirmar con seguridad
que el virus de la viruela no pueda caer en malas
manos o estar ya en ellas? Por primera vez, gracias
a la vacuna se extermin una enfermedad de la Tie-

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flg. 5.18 Cmo se producen


las vacunas.

Fig. 5.19 En las infecciones


virales, tos antibiticos no
sirven de ayuda. Las pastillas de analgsicos antiinfta
matorios son a menudo los
nicos medicamentos ade
cuados.

135

BIOTECNOLOGA

rentes, esto se denomina anticuerpo poli-

Cuadro 5.5 Cmo se obtienen


los anticuerpos

de antgeno, o se diferencian a clulas plasmticas o clulas de memoria. Cada linfocito B


produce slo "su" anticuerpo, con una especificidad completamente propia.

clonal.

Desde el trabajo de Behring y Ktasato, en


1890, se sabe que las molculas de unin
especficas se pueden obtener de la sangre.
El mtodo clsico es la inmunizacin de
animales de investigacin con un antgeno.
Despus de repetidas inmunizaciones con
xito, se pueden obtener anticuerpos del
suero de los animales. La cabra de Shangai,
que se muestr en la Fig. 5.24, se inmuniz con una protena altamente purificada
de msculo de corazn humano (la h-FABP,
heart Fatty Acid-Bindlng Protein). Al final
se purificaron de su sangre los anticuerpos
contra hFABP. stos son una mezcla y se
unen a diferentes lugares de la superficie
del antgeno (eptopos) con diferente fuerza (afinidad). Puesto que cada anticuerpo
de determinada especificidad siempre se
une en sangre a un nico clon de linfocitos
By la respuesta inmunitaria se basa en la
duplicacin de varios clones celulares dife-

Otro mtodo es el desarrollado por Kohler


y Milstein, que utiliza la tcnica del hibridoma. En primer lugar tambin se inmuniza
el animal de investigacin, generalmente un
ratn. El ratn forma anticuerpos contra el
antgeno en el bazo, que entonces circulan
en la sangre y en la linfa. Debido a que se trata de una variedad de anticuerpos contra
diferentes epftopos del antgeno de diferen
tes clones celulares, se consiguen anticuerpos policlonales. El objetivo es conseguir, sin
embargo, grandes cantidades de un anticuer
po "uniforme", homogneo, que slo est
dirigido hacia un nico eptopo.

Se funden ahora en un tubo de ensayo los


linfocitos Bcon clulas mieloides (clulas
tumorales, que crecen bien en cultivo celular) y se obtienen clulas de hibridoma.
La descendencia de una clula, un clon, produce entonces anticuerpos uniformes: los
anticuerpos monoclonales.

Segn la seleccin se encuentran clones con


la inmortalizacin de clulas de cncer y la
produccin de anticuerpos de los linfocitos
B. Se pueden producir, en principio, cantidades ilimitadas. La seleccin (screening) es,
por lo tanto, complea. Miles de clones
deben cultivarse por separado en condiciones estriles y analizarse.

Para ello, los anticuerpos no se obtienen de


la sangre, sino ms bien se toma el bazo del
ratn y se aslan de l los linfocitos Bexistentes. En realidad, los linfocitos Bse originan en
la mdula sea, de las clulas madre. En el
bazo o en los nodos linfticos proliferan los
clones de los linfocitos Bexistentes especficos

Los anticuerpos recombinantes son un tercer camino. Los anticuerpos no se producen ya


en animales de investigacin (in vivo) sino en
cultivos de bacterias o de clulas (in vitro).
Reconocimiento del antgeno
y unin mediante anticuerpos
o fragmentos

Obtencin de anticuerpos policlonales

@."'"""'
Algunas semanas

..
Inmunizacin

Repeticin de la inmunizacin (refuerzo)

Suero

Obtencin de anticuerpos monoclonales

Screening
Clulas B
Bazo

Inmunizacin
repetida

Fusin celular
(clulas de hibridoma)

ELISA

Sobrenadante del
cultivo celular

Clulas tumorales
(clulas de mieloma)

Obtencin de anticuerpos recombinantes


AGCCGTGACGTA
CGAGCTTACGAC
ACAGGCTGATCG
Repertorio
sinttico

ij
136

Sangre de
/
donante (con o
sin inmunizacin)

PCR
(ampliacin)

Proceso de setecci6n evolutivo


Screening de la
Clonacin de E. coli
(recombinacin)
visualizacin del fago
(seleccin)

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Fraccin de
E. co/i

VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

rra. A principios del siglo XIX enfermaban de virue


la en Alemania ms de medio milln de personas al
ao, y uno de cada diez morfa. Las caras con marcas
de la viruela no eran ninguna rareza.
Desafortunadamente, sin embargo, tos causantes de
enfermedades menores poseen "familiares" tan
estrechos yal mismo tiempo tan inofensivos como los
autnticos virus de la viruela. Slo con Louis Pasteur,
que haba nacido un ao antes de ta muerte de
Jenner, empez la bsqueda selectiva de vacunas
[Cuadro 5.3).

Fig. 5.20 Un ELISA


(EnzymeUnked lmmuno
Sorbent Assay) demuestra si
el paciente ha formado anti
cuerpos contra el virus invo
h."rido, si se ha Infectado.

Cultivo
de virus

Cosecha de virus
Protena de la
envoltura
del virus
(determinante
antignico)

5.6 las vacunas modernas


Hoy usamos para vacunar esencialmente toxoides, Test ELISA
patgenos muertos y patgenos vivos debilitados.
Despus de los xitos ms recientes de la ingeniera
gentica, se trabaja en vacunas vivas modificadas y
en vacunas peptdicas.
Los toxoides son extractos de los venenos {toxinas)
suministrados por los patgenos. tstos se neutra
!izan (en parte con formalina) y tras inyectarlos son
estimulados por el sistema Inmunitario en et cuer
po (por ejemplo en el ttanos y ta difteria).
El causante del ttanos, Clostridium tetani(que se
encuentra en el suelo), contagia por ejemplo una
herida y desprende una protena neurotxica al
torrente sanguneo. Provoca una parlisis espstica,
escenas atroces en los heridos que sobrevivan
a combates en el pasado.

: Placa de microtitulaci6n

'

Est el paciente
infectado?

~t~odela

~;._.
,,-- 'W

protena del
virus no unida

Anticuerpo contra la protena


de la envoltura del virus

La vacuna del ttanos debe renovarse de vez en


cuando para mantener la concentracin suficiente
de anticuerpos circulantes contra la toxina.
En el clera, la parlisis infantil (polio) y el tifus se
utilizan como vacuna, en cambio, bacterias muertas qumicamente o virus. La vacuna del clera no
puede, pues, causar Ja enfermedad, pero contiene
el veneno daino (toxina) fabricado por la bacteria
del clera.
Esta vacuna es activa por va oral. El cuerpo, tras ta
vacunacin, forma anticuerpos propios contra las
bacterias muertas y el txico.
La seguridad de la vacuna del clera es aproximada
mente del 90%. Los adultos y los nios a partir de
6 aos reciben dos dosis de la vacuna con una sepa
racin mnima de una semana y mxima de seis
semanas. La proteccin de ta vacuna empieza ocho
das despus de administrarla y dura aproximada
mente dos aos.
Se utiliza el patgeno atenuado (debilitado}en ta
rubola y tas paperas. Lamentablemente, ocurran

Adicin del sustrato


Oncoloro)

~~~~~~~~

~ unido
~

El sustrato incoloro se convierte


mediante la enzima en un producto azul

Resultado del test: ipositivo para el virus!

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Fig. 5.21 Una placa de ELISA


de poliestirol contiene
8 x i i = 96 pocillos (wells)
para la inmunorreaccl6n
y se rellena con una pipeta
multicanal (con ocho puntas
de pipeta de plstico
cambiables).

137

BIOTECNOLOGA

Cuadro 5.6 Historia de la


biotecnologfa: Anticuerpos
monoclonales
George KlSbler estudi en Freiburg. Despus de sus estudios y la promocin
en el Instituto de Inmunologa, en Basilea,
en 1974 fue a realizar una estancia como
Invitado durante dos anos al laboratorio dirigido por Cesar Milstein en Cambridge.
Los linfocitos normales, por desgracia, no

pueden proliferar en cultivos celulares, y por


lo tanto no pueden mantenerse como proveedores de anticuerpos. Sin embargo, en el laboratorio de Milstelo se pudieron mantener
durante tiempo en cultivo las clulas de meloma de ratones. Son descendientes degenerados de linfocitos, que se comportan sin restricciones como clulas cancerosas
y proliferan, y a partir de entonces poseen
la capacidad de producir anticuerpos.
Qu pasa si se "casan" ambas con astucia
y alevosa? Ocurre una de tales fusiones
celulares con especificidad desconocida tambin con una clula mieloide y un linfocito
normal? Las clulas hijas sumlnlstran, adems de anticuerpos de mielomas de especificidad desconocida, tambin anticuerpos de
especificidad conocida de los linfocitos? Para
este experimento Kohler utiliz eritrocitos
(glbulos rojos) de oveja como antgeno y los
inyect en un ratn. Despus de que se desarrollara Ja reaccin inmunitaria por l cau-

Fig. 5.22 Arriba:


Dietmar Fuchs (Universidad
de lnnsbruck), el principal
experto en la neopterina.
Esta molcula seal la forman los macrfagos tras
el ataque activo del virus.
Enseguida, despus
de la inyeccin con cada
uno de los virus, se puede
detectar la neopterina. Abajo: molcula de neopterina.

138

sada en el cuerpo del animal, le extrajo el


bazo. En el bazo se forman linfocitos, que
permanecen alli en grandes cantidades. El
tejido de bazo reducido se puso en cultivo
con clulas de mleloma, junto con la sustan
ca qumica para la fusin celular (polietilen
glicol). Esper a que se generara la mezcla
celular con las propiedades adicionales deseadas.
En realidad, este "matrimonio celular" produjo los sensacionales frutos esperados. Con
la ayuda de eritrocitos de oveja, que entonces
siJVieron como prueba del antgeno, George
Kohler identific una proporcin mayor de
clulas hbridas. Se produjeron anticuerpos
contra los eritrocitos reconocidos como ex
genos. Tales clulas se reprodujeron entonces
por separado en cultivo y proliferaron. Hab
an heredado la inmortalidad de las clulas de
mleloma, y al mismo tiempo producan anticuerpos con la especificidad conocida de los
llofocitos, sus otras clulas paternas. Se denominan clulas hbrldomas.
Despus de obtener el premio Nobel, se pregunt a George Kohler en una entrevista por
qu l y Milstein no haban patentado su
mtodo, pues podran haberse hecho multimillonarios con los miles de millones de entregas
de anticuerpos monoclonales. Kohler: "El
set\or Milstein infonn a las personas responsables en el Medica! Research Council de que
habamos encontrado algo que se poda paten-

una serie de accidentes de vacunacin si el patgeno no estaba completamente muerto o debilitado.


Desde 1985 existen diferentes vacunas de ingeniera gentica para humanos y animales, por ejemplo contra la fiebre aftosa de las vacas (peste bovina).
Desde 1986 se ha admitido - primero en Estados
Unidos- una vacuna producida por ingeniera gentica para humanos: protege contra la hepatitis B.
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus DNA.
Con casi 350 millones de humanos infectados crnicamente es, junto con la tuberculosis y la infeccin por el VIH, una de las enfermedades infeccio
sas ms frecuentes del mundo. Hasta el 25% de los
enfermos mueren a causa de las secuelas de la enfermedad por el VHB (cirrosis heptica, carcinoma
heptico). Estos virus se presentan endmicamente
en el Sudeste de Asia y en frica tropical. Gracias a
la campaa de vacunacin, la aparicin de portadores crnicos del virus ha disminuido en el norte y el
este de Europa por debajo del O, 1%.
La produccin convencional de la vacuna contra la
hepatitis B se encontr con un gran problema: en

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George Kijhler

Cesar Milstein

tar. Sin embargo, no recibimos ninguna res

puesta. A nosotros nos daba igual, y por eso


hemos publicado nuestro mtodo. Somos
clentflicos, no hombres de negocios. Los cientfficos no deberan patentar nada. No hemos
refleXlonado mucho sobre ello; nuestra deci
sin fue espontnea, digamos que nos
sali del corazn. Si me hubiera ocupado del
dinero, debera ocuparme ahora de los negocios de la patente. Habra sido con ello una
persona completamente diferente. Eso no
habra sido bueno para mi.

contraste con los microorganismos principales, el


virus de la hepatitis B se cultiva bien en medios de
nutricin o en embriones de animales (por ejemplo
en huevos de gallina incubados). Las vacunas tuvieron que producirse, por lo tanto, con protenas de las
envolturas del virus, que producen una respuesta
inmunitaria al antgeno superficial de la sangre infec
tada del portador de la enfermedad. Por ello, los virus
se destruyen primero y las protenas de la envoltura
se disuelven mediante sustancias activas superficiales (detergentes) y luego se purifican. Sirven de vacuna y provocan, pues, una respuesta inmunitaria.
Naturalmente, la sangre infectada es peligrosa para
las personas, que deben interactuar con ella. Los trabajadores que la utilizan deben, por lo tanto, inmunizarse, o sea vacunarse. El trabajo tiene lugar en
laboratorios aislados y seguros. Cada dosis de esta
vacuna se debe probar en chimpancs (se pueden
utilizar solamente de modo restringido por razones
ticas) para excluir impurezas de virus vivos.
La produccin de una de estas vacunas dura casi un
ao. Resultado: una vacuna natural en cantidades

VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

restringidas, o sea, slo disponible para grupos de


riesgo.
La nueva vacuna biotecnolgica contra la hepatitis B
se produce ahora con levaduras (eucariotas) manipuladas por ingeniera gentica o con clulas de mamferos. Se basa en una protefna superficial de este virus.
Una vacuna en E. colino era tan efectiva. Las clulas
bacterianas manipuladas no pueden realizar todas las
modificaciones en las protenas, especialmente glicosilaciones (vase final del Cap. 3).

En realidad, las vacunas de DNA son los subproductos de la investigacin gentica. Se haba visto
y determinado en los experimentos de transferencia de DNA que las protenas producidas provocan
a menudo alergias (reacciones de defensa). Sin
embargo, cmo se podra crear una virtud de Ja
necesidad, despus de descubrir qu antgenos
superficiales conducen al sistema inmunitario
humano a producir la reaccin inmunitaria?
Debido a que estos antgenos son protenas, se pueden producir mediante aislamiento de los genes
correspondientes de la herencia de los virus y su
incorporacin en microorganismos inofensivos
(como levaduras de coccin) o clulas de mamfero
en grandes cantidades. Asf, nunca hay peligro de
una contaminacin de la vacuna con virus.

5.7 Las vacunas vivas


La razn de la tradicional caza anual del zorro en
Inglaterra tambin se ha convertido en obsoleta en
trminos cientficos. El Parlamento Britnico prohi
bi Ia caza del zorro a partir de febrero de 2005. El
"zorro Reinecke", el animal simblico de las fbu
las alemanas, se haba cazado despiadadamente
hasta entonces, no tanto por ladrn de gallinas sino
ms bien por ser portador de la rabia.

En los bosques de Europa, los zorros se protegieron


slo biotecnolglcamente mediante ia preparacin
de un cebo con vacunas vivas. Para las vacunas
vivas se utilizan virus inofensivos, por ejemplo el
virus de la viruela vacuna (vaccinla) que Jenner utiliz como vacuna de la viruela. El virus sirve aqu
simplemente como vector, como medio de transporte para genes exgenos. Su cido nucleico es un
DNA de doble cadena con 180 000 pares de bases.
En 1982 se pudo demostrar que, como mnimo, no
se necesitaban dos fragmentos mayores del DNA
para la proliferacin. tstos se pueden ampliar con
DNA exgeno, bien completo o en parte. Los genes,
que codifican para la interaccin de las protenas
de la envoltura con el antgeno, se incluyen de forma estable en el material gentico del virus, de modo
que el virus no posee su habilidad para atacar las clu-

las de mamferos. Se pueden introducir al mismo


tiempo hasta 20 genes exgenos. Si se acoplan con
un gen promotor (como "interruptor"), se expresan
en las clulas de mamferos juntamente con los genes
del virus vacunal, es decir, se convierten en protenas
(Fig. 5.14). Esto tuvo xito en experimentos con ani
males para los antgenos superficiales del virus de la
hepatitis B, el virus de la rabia, el virus del herpes simple y tambin el virus de la gripe.
Para la vacuna del VIH empezaron a principios
del ao 2005 los ensayos clnicos de fase 11 para la
denominada vacuna trivalente "MRKAdS VIH-1
gag/poVnef'. Se basa en un virus del resfriado (adenovirus) modificado, de modo que no causa ningn
resfriado, pero como vector sirve para los tres genes
del VIH producidos sintticamente. Las protenas del
VIH formadas son absolutamente inofensivas y causan una reaccin inmunitaria en el organismo.

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Flg. 5.23 Cmo se originan


las clulas hlbridomas para
los anticuerpos monoclonales: los linfocitos se aslan
del bazo de un ratn
y mediante tcnicas de
fusin celular (por ejemplo
polietllenglicol o electrofusin) se unen con clulas
de mieloma (clulas cancerosas degeneradas del sistema
inmunitario) para formar
clulas hbridas (clulas
hibridomas), que renen en
ellas la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos y la inmortalidad
de las clulas cancerosas.
las clulas hibridomas ere
cenen medios de alimentacin en colonias del mismo
tipo de clulas (clones), que
sintetizan todas el mismo
anticuerpo (monoclonaO
y lo liberan al medio.

139

BIOTECNOLOGA

Las "vacunas comestibles" generan grandes controversias. En el Cap. 7 veremos que se crean como
plantas transgnicas. Especialmente los pltanos
o las patatas marcadas (por ejemplo coloreadas
de azul), como una vacuna por va oral, podran
introducir la vacuna en el cuerpo a travs del tracto
gastrointestinal.

5.8 Anticuerpos monoclonales:


balas mgicas de un biorreactor
altamente especficas y uniformes

Flg. 5.24 Los anticuerpos policlona!es se obtienen en conejos (arriba) y en cantidades


mayores con cabras (aqu una
cabra de ShanghaO. Se forman por inyeccin del correspondiente antgeno para
la produccin de anticuerpos.
Determinadas lneas de ratones sirven, tras la Inmunizacin, como productoras
de clulas de bazo (abajo).

Fig. 5.25 Multitud en la


recepcin del banco de sangre de Guanzhou en China.
Los donantes son analizados
previamente con un test
rpido de sfilis y hepatitis.
As se descubren de manera
rpida los infectados y no se
les permite donar.

140

sido infectado (Cap. 1O, test ELISA para virus).


Los tests de este tipo son ya habituales para el VIH
y la hepatitis (Figs_ 5.20 y 5.21 ).
A menudo, sin embargo, no se detecta el propio
virus; para ello las pruebas no suelen ser lo suficientemente sensibles, slo si se han formado anticuerpos en el paciente. La desventaja: los anticuerpos
antivirus se producen tras semanas en cantidades
analizables. Si alguien tiene una infeccin reciente
por el VIH, no se pueden analizar an los anticuer
pos en sangre.

En la epidemia de SARS en Hong Kong se tuvo un


El 7 de agosto de 1975 apareci un trabajo revolucioproblema con la reaccin en cadena de la polimenario. Csar Milstein (1927-2002, Cuadro5.6), de
rasa (PCR, vase Cap. 1O) para detectar el virus de
la Universidad de Cambridge, natural de Argentifonna rpida y segura. Aello se aadi que la PCR es
na, que habfa huido de su patria antes de la dictatan sensible que slo con el aire del laboratorio se
dura militar, y Georges Kohler (1946-1996), de
refuerzan las impurezas de los cidos nucleicos. Los
Alemania, describieron en su publicacin un propacientes sanos se identificaban falsamente ("falsos
cedimiento con el que se generaban "anticuer
positivos") como casos de SARS, y entonces realmenpos monoclonales", es decir, molculas de dete se infectaban en el hospital con SARS.
fensa con una estructura y especificidad uniformes. Para la analtica bioqumica y el diagnstico Lo que funciona para los virus es vlido tambin
mdico amaneci con ello una nueva era. En para otros tipos de patgenos; ms an, tambin pa1984, los dos cientficos obtuvieron el premio ra clulas corporales afectadas de cambios en Ja
Nobel por su trabajo.
estructura de su superficie. En determinados tipos
de cncer, por ejemplo, aparecen estructuras de proEl significado revolucionario de este procedimiento tenas muy especiales en las clulas tumorales invoes que tras la inmunizacin de un animal, la obten- lucradas. stas ayudan, por regla general, a que el
cin de tejido del bazo, el cultivo mezcla de clulas sistema inmunitario reconozca un tumor. Tambin
de mieloma y de bazo, la fusin, la seleccin sinto- contra ellas, los denominados marcadores tumonizada y el cultivo de las clulas de hlbridoma (Cua- rales producen anticuerpos monoclonales. Si se
dro 5.5), se aslan los anticuerpos monoclonales diagnostica un tumor de este tipo, se puede deterselectivos, de la especificidad deseada, en grandes minar exactamente su tamao y longitud en el cuercantidades.
po con la ayuda de anticuerpos monoclonales. stos
La capacidad nica del sistema inmunitario para pueden mejorar considerablemente las posibilidareconocer determinadas estructuras de forma selec- des de tratamiento - por ejemplo la extraccin quitiva y con la ms alta sensibilidad -concretamente rrgica o la irradiacin del tumor.
molecular- puede utilizarse luego en personas.
El seguimiento del cncer transcurre de la siguienLas balas mgicas del guardabosques Max, fundidas te manera: el anticuerpo monoclonal se "marca" en
en el Valle del Lobo, buscaban certeramente su dia- el tubo de ensayo mediante una reaccin qumica
na, por lo menos en la pera "El cazador furtivo" de con una sustancia radiactiva y se inyecta en el
torrente sanguneo del paciente_
Car! Maria von Weber (Fig. 5.27).
Tambin Paul Ehrlich busc sus magic bullets,
balas mgicas, que son los anticuerpos monoclonales para la medicina de hoy. En el diagnstico,
los anticuerpos monoclonales conquistan hoy
otras reas.
Tomemos por ejemplo una enfermedad viral. El
cuerpo forma anticuerpos como reaccin al ataque
del virus. Si se dispone de anticuerpos monoclona
les contra el virus implicado, se puede observar en
los fluidos corporales de los pacientes que ste ha

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Los anticuerpos se reparten en principio por todo el


cuerpo. Las molculas de anticuerpos que encuentran el tumor se unen a l de forma estable. Con ello
se concentra durante un tiempo la radiactividad en
el tumor. Para mantener baja la carga de radiacin
del paciente se utiliza, obviamente, una dosis muy
baja de radiactividad. A pesar de ello, la fuente de
radiactividad se localiza exactamente en el cuerpo
con mtodos de medicin sensibles. Esto aporta al
mdico datos exactos sobre el tamao y la posicin
del tumor.

V IRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

La herramienta princpal para una terapia tumoral


se encuentra hoy en los anticuerpos monoclonales.
En conjunto, la tcnica tiene como objetivo remediar o reducir un problema principal de la quimioterapia: incluso los mejores medicamentos tienen una elevada toxicidad que no se dirige slo a
las clulas cancerosas, y los efectos colaterales no
deseados son, por lo tanto, inevitables. En esta
situacin, acoplados con txicos celulares, los anticuerpos monoclonales pueden desempefiar el
papel de balas mgicas teraputicas, que alcanzan
por separado e infaliblemente su lugar de accin.
El primer gran xito se logr con el anticuerpo
monoclonal rtuximab contra el llnfoma no Hodgkin (vase ms abajo). Este anticuerpo se produce
por ingeniera gentica.
Tras cien afios pareci realizarse el suefio del gran
mdico Paul Ehrlich (Flg. 5.36). ti compar lama
nera de interaccionar de los anticuerpos (que l
denominaba "receptores" o "cadenas laterales")
con las balas mgicas. Pau1 Ehrllch esper poder
convertir este principio, en algn momento, en la
base de una nueva generacin de medicamentos
altamente selectivos.
Otros descubrimientos fascinantes se estn preparando. Ya se ha conseguido producir anticuerpos
biespecficos, en los cuales cada uno de los lugares de unin une un antgeno derente. Se experimenta tambin con anticuerpos que contienen partes de diferentes seres vivos (por ejemplo anticuerpos "humanizados", vase ms abajo). Se abren
perspectivas completamente nuevas con los anticuerpos con actividad enzimtica: anticuerpos
catalticos o abzimas, que agrupan la selectividad
de los anticuerpos con la fuerza catalftlca de las
enzimas.

Reaccin qumica deseada:

@-0:0
~

tster ~

cido

Agua

Alcohol

Estado de transicin Onestable)

Construccin de un
modelo de unin estable

to

o . ........................................
Clulas B de bazo..

Clulas tumorales
(clulas de mieloma)

..

~ .... ............................................
G
Clulas hibridomas
.. Q

Anticuerpo cataltico

5.9 Anticuerpos catalticos


Pueden servir los anticuerpos tambin como enzi
mas? Puesto que tanto las molculas de anticuerpos
como las de enzimas se unen de manera similar
(principio llave-cerradura o ajuste inducido, Cap.
2), Richard Lemer y su colaborador en la Clnica
Scripps de Calornia tuvieron la Idea de construir
anticuerpos con propiedades catalticas.
Las enzimas rebajan la energa de actlvacn re
querida, en tanto que no unen con ms fuerza los
sustratos sino que forman un estado de transi
cin del sustrato (Cap. 2). El estado de transicin
(en ingls, transitfon state) se estabiliza de este
modo y, como resultado, se necesita menos ener

Fig. 5.26 Cmo se producen


los anticuerpos catalticos;
aquf los anticuerpos catalticos para ta hidrlisis de ster
Qzquierda, esquema).
Abajo: la reaccin qumica
de Oiels-Alder no puede ser
cataliza da por enzimas naturales, y sin embargo tiene
un significado esencial para
la sntesis qumica. Las dos
materias de partida forman
un complejo intermedio inestable (en rojo), que entonces
se degrada a dixido
de azufre y el producto final.
la enzima acta estabilizan
do el producto intermedio.
Para convertir un anticuerpo
en una enzima se debe inten
tar establllzar qumicamente
et estado intermedio del producto, Imitndolo.

Conversin cataltica del ster

La molcula verde es una lmi


tac.i6n estable. La imitacin
se inyecta entonces a rato
nes, y se obtienen anticuer
pos contra ella. Estos anti
cuerpos se comportan catalf
tic.amente, es decir, convierten en realidad el producto
de partida, aunque no con
ta efectividad de una enzima
"autntica". Aqu se mues
tran (en una visin desde
arriba) slo ambas "manos"
del anticuerpo.

ga para formarlo; lograr el equilibrio de reaccin


se acelera a menudo en miles de millones de
veces.
La idea era entonces que, si se poda desarrollar un
anticuerpo contra un estado de transicin de la
materia, este anticuerpo tambin debera catalizar
Ja correspondiente reaccin. Pero para formar un
anticuerpo se necesita el antgeno que provoca una
respuesta inmunitaria en un animal de investiga
cin. El estado de transicin de un sustrato es, sin
embargo, inestable, de modo que prcticamente no

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Flg. 5.27 El demonio Samiel


en la pera "El cazador furtivo" habrfa separado hoy
los monoclonales como
las balas mgicas.

141

BIOTEC NOLOGA

existe en forma libre y no se pueden generar anti


cuerpos contra l en animales de investigacin.
La solucin consisti en construir modelos qumicos que se parecen de manera engaosa y espacial
mente al autntico estado de transicin de un sustrato, pero que son estables (Fig. 5.26).

Linfocitos
de ratn inmunizado

................................................................

Transcriptasa inversa

~-~!:-.~............................~ /

./

./

Un ejemplo es que en la hidrlisis de un ster


(rotura mediante incorporacin de agua en un
ster} transcurre la reaccin desde Ja molcula de
ster planar (los tomos se encuentran en un plano},
pasando por un estado de transicin con ordenacin
tetradrica de los tomos (tomos colocados en las
esquinas de un tetraedro), para formar otra vez un
producto planar (cido y alcohol). El ster es elctri
camente neutro; en cambio, el estado de transicin
est polarizado por cargas positiva y negativa.

-~~~---"YA.YAV/\VA.

PCR +

vcR

,V.J\.V.J\')c
YA.V/\"Y
Y/tV/\.x

Y/'-Y/'\.X
,y/~

,y.A)O\.)c

,y..A)O\X

~AYA.x

ONAc de las

:ONAc de las cadenas

_c~~~-~-~.H..?.m.P.~!~~~~?.i

i~.?.ITlP.'~~~~~?. ...........

Instalacin de los ONAc de las cadenas


H y Len un vector de expresin

Se encontr entonces un modelo molecular estable, en el cual el fsforo sustitua al carbono central
del ster (Flg. 5.26). Asf se imita la geometra y la dis
tribucin de cargas del estado de transicin inestable. La sustancia modelo, tras su unin a una prote
!na portadora, produjo como antlgeno una reaccin
inmunitaria en ratones. Entre las clulas hibridomas
originadas se seleccionaron algunos clones que se
unieron a la sustancia modelo.

Empaquetamiento en fagos A.

9 '

~iblioteca

Entonces se aadi ster a Jos anticuerpos monoclonales asf originados. Algunos no mostraron ningn
efecto; posiblemente eran especificos para una parte de la molcula que no era significativa para el
estado de transicin. En cambio, otros anticuerpos
aceleraron la reaccin unas mil veces.

de

~ ~agoscombinatoria

Mediante E. coli, las protenas


unidas de las cadenas H y L
de anticuerpos se acumulan
en las molculas Fab

+1

Preparacin de
un filtro rplica

5.10 Anticuerpos recombinantes

Los Fab se unen al filtro

* -+*
r." * . . .

o.~~

f2

jj

lavado

El Fab se une

--------~ alantgeno

Aislamiento del ONA del fago de la placa original


r~

Clonacin de DNAc para las cadenas H y l del anticuerpo


Fig. 5.28 Preparacin
de una biblioteca de anticuer
pos combinatoria.

142

Una reaccin qumica muy interesante es la reaccin de Diels-Alder, para la cual no existe ningu
na enzima en la naturaleza. Sin embargo, se consi
gue construir anticuerpos catalticos para ella
(Fig. 5.26, derecha).

Para muchas aplicaciones se requiere una estructura unida a un posible antgeno pequeo. Antes del
desarrollo de la ingeniera gentica, slo se podan
originar anticuerpos convencionales mediante la
inmunizacin (anticuerpos policlonales directa
mente a partir del suero del animal) o mediante la
tcnica del hlbridoma (anticuerpos monoclonales) (Cuadro 5.5).
Ahora hay, desde hace poco, anticuerpos in vitro,
o sea generados fuera del cuerpo del animal, en cultivos celulares o de bacterias -principalmente slo
las partes que unen antgenos, es decir, un fragmento (fragmento Fab, jra.gment antigen bindin!f.
Antes, los fragmentos Fab (Cuadro 5.2) slo se po

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VI RUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

dfan obtener a partir de anticuerpos completos


mediante la fragmentacin con proteasas. Hoy se
pueden conseguir por Ja ruta recombinante.
Los lugares ms importantes para la unin de anti
cuerpos son las regones variables (Fv). A stas les
falta, sin embargo, el enlace estabilizante mediante
los puentes disulfuro de las cadenas constantes. Se
deben estabilizar de forma adicional: se unen gene
ralmente mediante un enlace peptfdico a una hebra
simple. Adems, contienen an una "etiqueta" (en
ingls tag), una extensin para un cambio de propiedades bioqumicas o para unirse a superficies. As
se ortginan fragmentos Fv de cadena simple
(fragmentos scFv; Cuadro 5.2, a la derecha, abajo).

Promotor
Biblioteca de ONAc
generados por casualidad
~;

Gen 111

p),

n,
J~,

Ugasa

l..

Por qu entonces anticuerpos recombinantes sl


el sistema Inmunitario posee una reserva casi lnago
table? Una buena noticia para los amigos de los anl
males es que ahora se pueden generar anticuerpos
completos sin la ayuda de animales o humanos. En
los tiempos de la encefalitis espongifonne bovina, la
hepatitis y el sida es una ventaja!

Vector display de fago

l\lr

,,

'\~!"'

Transformaci6n

Muestra
renovada

E.coU

Los anticuerpos obtenidos son naturalmente tam


bin monoclonales, es decir, se fonnan de un
nico don, son altamente especficos y se unen
exactamente a un epftopo.

10' mutantes de fagos

Si se pueden producir anticuerpos, por ejemplo, con


la ayuda de las bacterias col, es mucho ms barato
y ms rpido que Ja produccin en cultivo celular
animal con clulas hibridomas. Ms importante an
es el hecho de que la ingeniera completa de E. coli
est disponible: la secuenciacin, el anlisis y las
modificaciones se simpJifican enormemente.

Protena.............
buscada.
..................

5.11 Bibliotecas de anticuerpos


combinatorias
Incluso en una fusin exitosa de mieloma [cncer)
y clulas de bazo a clulas hibridomas pueden gene
rarse solamente docenas o como mximo cien anti
cuerpos diferentes -no demasiados, si se piensa
que nuestro sistema inmunitario puede producir
100 000 000 de anticuerpos de diferente especifici
dad! Cmo se puede desarrollar este gigantesco
potencial?
Se evita el paso de la fusin (que en realidad es bas
tante poco eficaz), se inyecta el antgeno a un
ratn, se toman entonces tras la inmunizacin
clulas de bazo y se oligina el RNAm maduro
(Cap. 3). Con ello se produce slo el material
gentico de los exones; los intrones ya estn cor
tados. Con la transcriptasa inversa se sintetiza, a
partir del RNAm de una hebra simple, un copy
DNA (DNAc) de doble hebra. Con la PCR (Cap. 1O)

Clonacin
+ de un fago individual los fagos d~bilmente
unidos corren a travs
de la columna,
no se utilizan ms tarde

1Aislamiento
+ del ONA del fago
~

Oetermlnacl6n de la secuencia
del mutante fuertemente unido

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Flg. 5.29 Cmo se busca,


mediante la visualizaci6n
de fagos, la hormona de ere
cimiento (hGH) que se une
fuertemente, y c6mo se
encuentra.

143

BIOTECNOLOGA

Fig. 5.30 George P. Smith


utiliz el bacterifago M13
para el display de fago.

Fig. 5.31 Las clulas de E. co/i


se infectan con fagos.

Fig. 5.32 Hormona del


crecimiento humana (hGH,
arriba) y cmo se une la hGH
(abajo, en rojo) al receptor.

potellgent.com,

Fig. 5.33 Ingeniera de prote


nas en los anticuerpos, pre
sentada mecnicamente por
la compaa Biowa Oapn),
una sucursal de Kyowa Hakko.

144

se producen millones de copias del DNAc para las


cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo (Fig. 5.28).
Entonces se cortan las copias de DNAc con endo
nucleasas de restriccin para obtener "extremos
pegajosos" e incorporarse a continuacin con
DNA ligasa a vectores para los bacterifagos/.... Se
consiguen as dos bibliotecas (librarles) diferentes: una con DNA de cadenas H (para las cadenas
pesadas, heavy) y una con DNA de cadenas L
(para las cadenas ligeras, lght) (vase Fig. 5.28).
Seguidamente se recombinan las dos bibliotecas
de fagos en una tercera "biblioteca de fagos recombinante". Estos fagos aleatorios poseen ahora pares de DNAc de una cadena Ly una cadena H. Esta
biblioteca de fagos (phage library) se siembra
sobre una capa de bacterias, es decir, se infecta
E. coli con fagos.

El sueo del ingeniero gentico es que se pudiese


ver en las bacterias, por "el nmero externo de la
casa'', si el gen est "dentro" de ella!
George P. Smith (nacido en 1941, Fig. 5.30) hizo

realidad este sueo en 1985, en la Universidad de


Missouri en Columbia. Aunque no lo encontr en
bacterias, s lo hizo para el bacterifago Ml3. ste
es un fago filamentoso como A. (Cap. 3), pero tiene
un genoma mucho ms pequeo. Consta de una
hebra simple de DNA en forma de anillo aglomerado y tiene slo pocos genes para la protena de la
cpside, y un ciclo de infeccin ms sencillo: los
genes para la construccin no son necesarios en el
genoma del husped.

De "manera refinada", el Ml3 penetra a travs del


"rgano sexual" (pilus} de las bacterias co!i: se
incorpora a la clula a su DNA de una hebra a traLas clulas coliproducen pares aleatorios de cade- vs de un pilus (F). El DNA sirve entonces como
nas H y L. En caso de que las cadenas peptdicas matriz y forma en la clula un DNA de doble hebra.
encajen entre s, forman fragmentos Fab. Tras la ste no se incorpora al genoma bacteriano, sino que
separacin en placas de Petri se toma una huella del se replica hasta disponer de 100200 copias. Si la
fragmento Fab unido sobre un filtro de nitrocelulo- bacteria se divide, cada hija consigue copias del
sa. Los fragmentos Fab se unen fuertemente al fil- DNA del fago.
tro, como todas las protenas. Si se aade ahora un
antgeno marcado radiactivamente, y se elimina por "Generosamente'', el M13 no mata a su husped,
lavado el antgeno no unido, se puede ver en el slo ralentiza su crecimiento. Los cientos de parennegrecimiento de una pelcula fotogrfica dnde tculas del fago se liberan tras construir copias de
se ha unido el antgeno. Por lo tanto, se puede inves- DNA de una hebra, que se empaquetan en envol
tigar en qu coloruas bacterianas se unen los frag- turas de protenas filamentosas. Dos mil setecienmentos Fab "reales". Se buscan estas colonias, se tas protenas del tipo pVIII forman el tbulo. Sin
asla su DNA y se puede incorporar en vectores de embargo, la particularidad son cinco molculas de
protenas del tipo pVII y p!X en un extremo y pIII
bacterias o de mamferos.
y p!V en el otro extremo del fago (Fig. 5.29).
As se pueden valorar por lo menos ml veces ms
Es interesante que el plII tambin funciona si estn
anticuerpos que con la tecnologa de hibridomas.
integradas en l las secuencias exgenas! Qu significa esto? Si se incorpora un gen exgeno al gen
5.12 "A cuestas" o visualizacin
pIII en los fagos, se puede mostrar (dsplayed' el gen
de fagos-La prxima revolucin
exgeno aparecido como protena (o pptido}en la
cubierta del fago. Funcion!
Los linfocitos Bdel sistema inmunitario utilizan un
La visualizacin de fagos para encontrar,el gen de
truco para la seleccin: "presentan" sobre su
una hormona de crecimiento fuertemente unida se
superficie un anticuerpo unido a la membrana
prob en la prctica.
[vase ms arriba). Seguidamente, la unin de un
antgeno {por ejemplo un virus) e IL-2 de clulas T
colaboradoras de los Unfocitos B estimula que se 5.13 Visualizacin de fagos
para la hormona del crecimiento
dividan [seleccin clonal). El anticuerpo es, por as
decirlo, el "nmero de la casa" del gen corresponde alta afinidad
diente en linfocitos. Dicho de otra manera: el anticuerpo lleva su gen "a cuestas" en una mochila Se queran encontrar variedades de la hormona de
crecimiento humana (hGH, human growth hormogigante.
ne) con una unn ms fuerte para el receptor de
Por lo tanto, a partir de grandes cantidades de linfo- hGH (Fig. 5.32), y ya se saba qu cortes de la
citos Bse pueden encontrar fcilmente los produc- secuencia peptdica producen la unin al receptor.
tores de anticuerpos deseados.
Es decir, se sintetizaron oligonucletidos "dege

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VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

nerados", que codifican todos los aminocidos en


estas posiciones. Estas variantes del gen de la hGH
se incorporaron a un vector M13 de forma que estu
viesen junto al gen para plll. De este modo pueden
construir una protena de fusin pIII-hGH. Esta
biblioteca se introdujo en E. coli.

tras que los tejidos normales sanos no son alcanzados. Sin embargo, an no existe tal arma maravillo
sa, aunque todo habla a favor de que pueda estar dis
ponible en un futuro prximo." Esto se escribi en
el ao 198 l en el Wallstreet joumal, un peridico
ms bien serio y moderado.

En realidad se crearon fagos M13 infecciosos con


protena plll "normal" en la envoltura, en la cual iba
colgada una variante hGH, y se present sobre la
superficie celular slo una variante por virus. Se consigui una cantidad increble de variantes de fagos.
Cmo se puede, ahora, encontrar los mejores?

Hoy se dispone de anticuerpos monoclonales con


tra algunos antgenos de superficie de clulas cancerosas. Muy similar al diagnstico tumoral, se utiliza tambin su capacidad en teraputica para reconocer antgenos superficiales de la clula especficos
de tumores. Esta vez, sin embargo, no se utillza un
istopo radiactivo incorporado al anticuerpo mono
clona!, sino un txico celular altamente efectivo,
por ejemplo la toxina del ricino - Ja protena riclna.
De esta ricina basta una nica molcula para matar
una clula entera (Fig. 5.34).

Se pasaron los fagos a travs de una columna de separacin con bolas de plstico, a las cuales estaba
unido fuertemente el receptor hGH (una protena
aislada, Fig. 5.32) (para el mtodo vase Cap. 3,
purificacin de insulina con anticuerpos unidos).
Los fagos sin hGH en la superficie "pasan" enseguida, sin unirse, por la columna {Fig. 5.29). Tambin
los fagos que se unen dbilmente se eliminan como
desperdicios del laboratorio. Slo los "buenos~ se
unen fuertemente a los receptores y ms tarde son
eluidos con cidos dbiles.

En relacin con los anticuerpos monoclonales, la


ricina forma, en cierto modo, un "veneno celular
con cdigo postal". El anticuerpo solamente es el
vehculo con que el veneno celular altamente especfico se transporta hacia el lugar de destino, el
tumor. Los primeros resultados en algunos tipos de
tumores especiales son muy prometedores. Sin
Los fagos seleccionados de esta manera se colocaron
embargo, an estamos muy lejos de una aplicacin
otra vez sobre las clulas co/ y se seleccionaron de
sistemtica de la tcnica en el tratamiento del cnnuevo en la columna. Se repiti el procedimiento un
cer. Hay numerosos problemas por solucionar: todatotal de seis veces. Con ello se pudo disponer del
va no se conoce una molcula de toxina que se
fago con la afinidad ms alta de las variantes hGH
transporte con seguridad a una clula tumoral, que
para el receptor hGH. Se clon un nico superfago
entre en la clula en cuestin y ejerza allf su efecto
y se determin su secuencia de DNA. Entonces se
mortal. La recepcin de los complejos anticuerpo
pudo producir una hormona del crecimiento "mejotoxina (inmunotoxinas} a travs de las clulas y la
rada", un caso de diseo de protenas (Cap. 1O).
liberacin de la toxina en la clula an no se comLas consecuencias de la visualizacin de fagos son re- prenden en gran medida. Adems, todava no se
volucionarias. Se puede utillzar tambin para los conocen marcadores de membrana celular especffl
anticuerpos? Sf, a decir verdad con xito! Los genes cos para todos los tipos de cncer, o no se tienen
para el fragmento del anticuerpo scFv se empaqueta- anticuerpos monoclonales contra ellos.
ron en una biblioteca en M13. Los fagos unidos a E.
colllevaban su fragmento como el "nmero de casa"
.. f.!!!&'.'.1.~!!!!!.~!?!!~\~D~~. h~!'(l.~D!?
en su superficie! El proceso de seleccin se denomi
Fragmento
na, por cierto, panning (por la batea, en ingls pan,
variable
de ratn
......................
del buscador de oro). Ha estallado una nueva fiebre
del oro! El cncer es el objetivo.

5.14 Nuevas esperanzas


en el cncer: rituximab,
un anticuerpo recombinante
"Imagnense un nuevo mtodo para el tratamiento
del cncer que se basa en el principio de los misiles
de crucero (crvise missiles). Se inyecta en el cuerpo un pequeo cohete microscpico con una cabe
za de bsqueda automtica, que persigue de modo
selectivo las clulas cancerosas y las destruye, mien-

Flg. 5.34 La inmunotoxina en


accin. Una inmunotoxina
(representada en rojo}, com
puesta de ricino y un anti
cuerpo en forma de Y, se une
a un receptor celular CD
de una clula B leucmica
(en azul). La inmunotoxina
unida penetra entonces
en la clula (a travs de una
estructura en jaula de datrinas de tres brazos) y se libe
ra al citoplasma.
Anticuerpo recomblnante

ldmltldo por la FDA


Hoy en da se realizan 400 estu

dios sobre terapias con anticuerpos, de tos cuales 42 son de fase


111 y 111111. y 74 de rase u o 1111
(segln Steran Dube~ mayo 2oos).

Anticuerpos humanizados
Avostin: cncer de intestino
Herceplin: cncer de mama
Humlra: artritis reumatoide
Leucos/te: leucemia de
clulas B
Ml/otarg: leucemia mieloide
aguda
Rapslva: psorlasis
S/nagis: infeccin VSR
Tysabrl: esclerosis mltiple
Xolair: asma alrgica
Zenapax: rechazo del
trasplante de rin
Anticuerpos quimricos
Cotara: diferentes tipos
de cncer
Erbltwc: cncer de intestino
Remicade: artritis reumatoi
de. enfermedad de Crohn
Reopro: profilaxis de la tronr
boembolia
Ritwcan: linfoma no Hodgkin
Simuled: rechazo del tras
plante de riiln
levo/in: linfoma, artritis
reumatoide
Flg. 5.35 Cmo puede actuar
el rituximab.

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145

BIOTECNOLOGA

Sin embargo, en el ao 2002 se obtuvieron ya


1300 millones de dlares americanos con anticuerpos recombinantes, y 300 000 pacientes se
han tratado con ellos hasta ahora. El rituximab
(mab viene de monoclonal antibodj es actualmente el tratamiento nmero uno del cncer.
Su meta: el linloma no Hodgkin (LNH).

Flg. 5.36 El ganador del


premio Nobel Paul Ehrlich
desarroll la teora de las
cadenas laterales de la inmu
nidad. Sus ideas tericas se
parecen asombrosamente
a las formas hoy conocidas
de los anticuerpos.

El linfoma no Hodgkin es una enfermedad grave


del tejido linftico, que puede afectar a muchos
lugares diferentes en el cuerpo, por ejemplo a los
nodos linfticos, el bazo, la glndula del timo, las
glndulas adenoides, las amgdalas y la mdula
sea.
El rituximab es un anticuerpo preparado qumicamente en el laboratorio, que va dirigido contra
una determinada protena de superficie que se forma en ms de un 90% de las clulas tumorales de
las clulas Bde un linfoma no Hodgking. Esta pro
tefna de superficie se llama antgeno CD20. El
rituximab interacciona exclusivamente con las
clulas que poseen el antgeno CD20 en su super
ficie. La unin del rituximab al CD20 produce,
mediante diferentes mecanismos en los que se
activa el propio sistema inmunitario, la muerte de
la clula (Fig. 5.35).
Asf, el mecanismo de accin del rituximab se dife-

rencia fundamentalmente de las restantes terapias


del cncer. El rituximab slo ataca las clulas que
son portadoras del antgeno CD20; todas las restantes clulas del cuerpo no resultan daadas.
Gracias a esta accin dirigida, el rituximab es muy
bien tolerado. El rituximab es un conocido anticuerpo recombinante humanizado. Sus "manos" variables que unen CD3 se crean mediante la
inmunizacin de ratones, el resto (90%) viene de
los seres humanos. Por ello, el rituximab no es reconocido como "extrao" y no se combate.
Entre tanto, la inmunotecnologa moderna ha
creado un mercado de mil millones de marcos alemanes para el diagnstico y la teraputica. La visin
de Paul Ehrlich se ha convertido en una realidad
(Fig. 5.37).
Fig. 5.37 Produccin de
anticuerpos monoclonales
en un reactor de cultivo
celular de 2000 litros
de la compaa Celltech.

146

Cmo continuar la historia? Los biorreactores de


cultivos celulares (Fig. 5.37) llegan a Jos lmites de
su capacidad, y cada vez ms se producen anticuerpos enteros o fragmentos con animales o plantas
transgnicos (plantibodieS' (Caps. 7 y 8).

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VIRUS, ANTICUERPOS Y VACUNAS -

Bibliografa utilizada y aplicada


Excelentemente escrito, se espera en breve una nueva edicin:
Breitling F und Dbel S (1997) Rekombinante Antikarper.
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.
"El Janeway", el trabajo estndar ("el Stryer" de la Inmunologa):
Mahlke K (Red.), Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M (2002)
lmmunologie. Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.
Todo sobre farmacobiotecnologa, posiblemente algo difcil para principiantes:
Kayser O, Mller RH (2004) Pharmaceutical Biotechnology.
Wiley-VCH, Weinheim.
El artculo original del padre de los monoclonales:
Milstein C (1980) Monoclonal antibodies, Sci. American 243 (4): 66-74.
Una buena base:
Wink M (2004) Molekulare Biotechnologie, Konzepte und Methoden.
Wiley-VCH, Weinheim.
Una introduccn a la Inmunologa con bonitas ilustraciones:
Van den Tweel J (Hrsg.) (1991) lmmunologie. Das menschliche
Abwehrsystem. Spektrum derWissenschaft, Heidelberg.
iHay que leerlo! Escrito de forma emocionante por el Jefe de la DFG:
Winnacker El (1999) Viren. Die heimlichen Herrscher.
Eichborn Verlag, Frankfurt am Main.
lo ms nuevo sobre tecnologa de anticuerpos:
Hollricher K, Dbel S, Zahringer H, Koppelle W (2005)
Antikarpertechnologie. Laborjournal 6: 45-58.
lo ltimo, actualizado por expertos:
Vollmar A, Dingermann T, Zndorf 1(2005) lmmunologie:
Grundlagen und Wirkungen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,
Stuttgart.
Virologa de huspedes:
levine AJ (1993) Viren. Diebe, Marder und Piraten.
Spektrum AkademischerVerlag, Heidelberg.

Ocho preguntas
de autoevaluacl6n
1. lPor qu no se pueden curar las
infecciones virales con antibi6ticos?
2. lCmo pueden los virus RNA
interaccionar con el DNA de las
clulas husped?
3. lQu ocurrira si Jenner y Pasteur
realizaran hoy sus famosos experi
mentos de inoculacin?
4. lCmo reconocen las clulas
asesinas si una clula est atacada por un virus?
5. lCmo se obtienen anticuerpos
monoclonales y policlonales?
lCul fue la idea genial de Milstein
y K()hler?

6. lSe puede combinar la alta especificidad de los anticuerpos con la


fuerza cataltica de las enzimas?
7. lC6mo se puede colocar un
nmero de casa gentico sobre
la superficie de los virus y utilizarlo para optimizar las protenas?

8. lCmo pueden utilizarse los anti


cuerpos en la lucha contra el cncer?

Enlaces de web
Pgina web de medicina alemana:
www.m-ww.de/

Todo sobre infecciones:


www.m-ww.de/gesund_leben/impfungen/impfungen2.html

Gran coleccin de imgenes de virus:


www.viro/ogy.net/Big_ Virology/BVDiseaselist.html

Todo sobre anticuerpos:


www.antibodyresource.com/educational.html

lnterfern:
http://hepatitis-c.de/i{nimun.htm

Pgina web de Mike Clark con animaciones de anticuerpos:


www.path.cam.ac.uk/-mrqfnikeimages.html

Ms enlaces a web y anticuerpos en alemn:


www.lexikon-definition.de/lmmunglobuline.html

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147

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE


Adis a los caminos de una direccin, bienvenido a los circuitos

6.1 Agua limpia -Un


bioproducto 150
6.2 Depuracin aerbica de los
vertidos: campos de aguas
residuales, tanques
depuradores por filtracin
y lodo activado 152
6.3 Biogs 153
6.4 iEI biogs podra salvar
bosques! 154
6.5 El biogs en los pases
industrializados: explotacin
del estircol lquido 155
6.6 El alcohol que crece
en los campos 156
6.7 Los devoradores de petrleo
de Ananda Chakrabarty 157
6.8 Azcar y alcohol a partir
de la madera 158
6.9 Materias primas qumicas
de biomasa? 160
6.10 Minera silenciosa 164
6.11 Wna nueva vida para los pozos
de petrleo agotados? 164
6.12 Bioplstica: icircuitos
en lugar de caminos
de una direccin! 165

Captulo

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BIOTECNOLOGA

Cuando las aguas residuales no depuradas van


a parar a ros y lagos, de forma muy simplificada
"De todas las epidemias, el clera es tal vez la que ocurre lo siguiente: en primer lugar, los aerobios
ms miedo nos inspira: se extiende tan rpido que eliminan la suciedad orgnica y para ello consumen
un hombre completamente sano al amanecer pue- rpidamente el oxgeno. Aparecen zonas pobres en
de estar enterrado antes de que anochezca" oxgeno (sobre todo en el suelo), en las que slo
-escribi Harold Scott, en 1939, en A hstory o/ pueden actuar las bacterias anaerbicas.

6.1 Agua limpia -Un bioproducto

Tropical Medicine.

Fig. 6.1 Robert Koch,


descubridor del patgeno
del clera, la tuberculosis,
el carbu nco y otras enferme
dades infecciosas, premio
Nobel en 1905.

Los peces y otros organismos dependientes del oxge


no
empiezan a morirse. Los anaerobios forman los
Encualquier caso, en 1892 los habitantes de Hamburgo an crean que podan beber directamente el agua txicos amoniaco (NH3) y cido sulfhdrico (H25),
de los ros Elba yAlster. En Hamburgo, 8605 ciudada- que causa el olor a huevos podridos. Ambos matan
nos pagaron este error fatal con su vida. Haca tiempo entonces a los organismos acuticos restantes que
que el agua del ro era un caldo de cultivo ptimo para han sobrevivido a pesar de la falta de oxgeno: aparelos microbios -y por consiguiente, tambin para los cen los canales de agua y los canales pestilentes.
causantes del clera. En cambio, la ciudad vecina de En agronoma, un animal bovino genera tanta cantiAltana sali indemne. All depuraron el agua del ro
dad de vertidos como 16 habitantes de una ciudad.
mediante una simple filtracin con arena. En las gran 1400 millones de bovinos en el mundo entero prodes ciudades, la depuracin de las aguas residuales era
ducen tantos vertidos como 22 000 millones de seres
inaccesible.
humanos! An ms preocupantes son las enormes
RobertKoch (1843-1910) (Figs. 6.1y6.2)descubri
la bacteria productora del clera, Vibrio cholerae,
pero las mejoras en el suministro de agua y el tratamiento de las aguas residuales acababan de empezar.
Sin embargo, el clera y el tifus experimentaron un
avance importante. La grfica del Cuadro 6.1 indica
la relacin entre la cantidad de muertos por tifus
y la higiene del suministro de agua.

Fig. 6.2 Epidemia de clera,


una visin espantosa
de la muerte masiva.

Fig. 6.3 lnfusorios (ciliados),


representados de forma
artstica en "Kunstformen
der Natur" de Ernst Haeckel,
en 1904. Los ciliados fijos,
como la vorticela (Vorticella),
son un indicador de la presencia de buenos lodos activados. Cada mililitro de agua
residual puede contener hasta 10 ooo. Si ellos dominan,
el proceso funciona bien.

150

Agua limpia! En la actualidad consumimos cada da


de 200 a 300 litros de agua limpia por persona, y en
das calurosos incluso hasta 1000 litros. Restos de
comida, grasas, azcar, protenas, excrementos ... ,
todo va a parar a las cloacas, incluso el detergente
procedente de las lavadoras.
El "grado de biodegradabilidad de la suciedad"
tiene un nombre: DBO. La demanda bioqumica
de oxgeno a los cinco das (DB05 ) se calcula en
el laboratorio (Cuadro 6.2) e indica cuntos miligramos de oxgeno disuelto en agua consumiran en
cinco das los microbios de las aguas residuales para
eliminar por completo la carga orgnica de una
muestra de agua. El agua para uso domstico contiene una carga orgnica media de 60 g DB05 por
habitante y por da. Esto tambin se ha denominado habitante equivalente (HE).
En nuestro caso, se deberan consumir 60 g de oxgeno por persona y por da para eliminar 1 HE.
Cuando la solubilidad media del oxgeno asciende
aproximadamente a 1O miligramos por litro de
agua, se necesitara la cantidad de oxgeno disuelta
en 6000 litros(!) (es decir, seis metros cbicos) de
agua limpia para eliminar la suciedad diaria creada
por cada ciudadano.

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cantidades de vertidos procedentes de la industria.


Adems de las sustancias orgnicas degradables, contienen grandes cantidades de sustancias inorgnicas,
desde sal comn hasta cido sulfrico, y tambin productos txicos como mercurio y otros metales pesados que los microbios degradan con mucha dificultad
o que matan a los microorganismos. Las industrias
papeleras producen, por cada tonelada de papel, de
200 a 900 HE, y las fbricas de cerveza de 150 a 30
HE por cada mil litros de cerveza.
Ya hace tiempo que la capacidad depuradora natural de los microbios en los ros no es suficiente;
por ello, los vertidos se deben degradar mediante
microorganismos en instalaciones purificadoras
enormes, de modo que puedan volver a conducirse
a las aguas sin peligro. Las instalaciones de vertidos
son las mayores biofactorfas de la actualidad; utilizan aguas residuales y suministran un producto
biolgico en grandes cantidades: agua potable.
Los microorganismos efectan el trabajo ms duro
en la depuracin de vertidos. Con la ayuda del oxgeno del aire descomponen el azcar, las grasas y las
protenas de las aguas residuales en dixido de carbono y agua, a la vez que crecen y producen nuevas
clulas. En las instalaciones depuradoras se crean
las condiciones ideales para la multiplicacin y el
trabajo de degradacin de los microbios.
Puesto que para la degradacin de un gramo de azcar se consume ms de un gramo de oxgeno, pero
en el agua slo se pueden disolver diez miligramos
de oxgeno por litro, los microorganismos consumen muy rpidamente el oxgeno del agua. Por consiguiente, es necesario que los vertidos estn en

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE -

Cuadro 6.1 Historia


de la biotecnologa: Campos
de aguas residuales y evacuacl6n
de vertidos en BerUn
Hasta el afio 1878, en Berln se evacuaban
las aguas pluviales y las residuales, los desechos domsticos y, en parte, las aguas fecales,
a travs de las acequias. Estos fosos abiertos
estaban situados entre la acera y la calzada,
y desembocababan en una zanja de desage.
Cuando las acequias no conducan directa
mente a cursos de agua pblicos, desembocaban en canales subterrneos, los cuales se
instalaban en su mayor parte con unas secciones demasiado grandes y sin sufkiente pen
diente, en funcin de las necesidades del
momento y sin seguir ningn mtodo.
Asf pues, se generaban toneladas de residuos
putrefactos que desprendlan un olor enormemente desagradable. Adems, las acequias
constituan un enorme obstculo para el
trfico. Los residuos fecales se recogan en
estercoleros que normalmente se vaciaban
a mano. El contenido se ttanspOrtaba despus
con vehculos. Puesto que ni las calles ni las
ac~ ni~ vehf~ eran lo sullcientemen
te estancos, el suelo y las aguas subterrneas se
ensuciaban enormemente. Los ciudadanos
extraan el agua de pozos propios. Estas aguas
contaminadas con gnnenes fecales fueron la
causa de la propagacin de enfermedades.
En 1816, el gobierno decidi por primera vez
lavar las acequias y las calles con agua para
eliminar la basura y el hedor. Sin embargo,
esta idea nunca se puso en prctica, ya que no
se dispona de tanta agua que saliera a la pre
sin necesaria. Una comisin de estudios contratada por el rey Federico Guillermo IV
decidi, en 1846, crear una empresa de abas
tecimiento de agua. Tambin se autoriz la
instalacin de retretes. En 1856 se fund esta
empresa en Stralauer Tor.

a que era ms fcil extraer agua, y a que se ex


tendi mucho el uso del retrete, la cantidad
de aguas residuales aument de forma dramc\
tica. Las acequias, ampliadas a un metro y
cavadas a ms profundidad, fallaron. Aunque
el problema de las aguas residuales en Berlfn
aumentaba tanto, seguan producindose las
protestas masivas utradicionales" de los berli
neses crticos con el gobierno en contra de
una canalizacin. Exista la idea de que con
la canalizacin tambin se producira putrefaccin y hedor, como en los canales subterrneos que haban existido hasta el momento.
En 1860 se encarg al Consejero Privado para
la Construccin Wiebe que realizase un viaje
de estudio a Hamburgo, Parls y Londres, yque
elaborara un plan para acabar con el problema
de las aguas residuales. Durante ese ao, Wlebe
viaj junto con el Jefe de Construccin de Vfas
Auvtales y Ferrocaniles, James Hobrecht
Wlebe quera recoger las aguas residuales de
forma subterrnea y Juego verterlas sin depurar
al ro Spree para conducirlas fuera de la ciudad.
El proyecto suscit grandes desacuerdos entre
ingenieros, mdicos y polfticoo. En febrero
de 1867 se cre una Diputacin, dirigida por
el famoso mdico y microbilogo Di: Rudolf
Virchow. Se fund una "oficina especial diri
gida por James Hobrecht al objeto de gestionar
los trabajos de la Diputacin. Rudolf Vrrchow
resumi loo resultadoo obtenidos en un informe
general y lo present en noviembre de 1872
ante la Asamblea de Concejales de la ciudad.

RudolfVlrchow (1821-1902), a la Izquierda, fun


dador de la patologa celular, historiador de la
medicina e higienista, y el conde James
Hobrecht (1825-1903), a la derecha.

Muertes portlrus/io.ooo habtt.atlte Conexin Inmobiliaria

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(!>

Berln mejor su abastecimiento de agua.


De este modo disminuy la mortalidad por tifus
de forma inversamente proporcional.

En 1873, la dudad de Berln se hizo cargo de


la empresa de abastecimiento de agua. Sin
embargo, el "lavado en profundidad de las
acequias" no cumpU las expectativas. Debido

~decidi, en mayo de 1873, empezar a


construir tuberas para aguas residuales. Para
ello se dividi la ciudad en varia.5 zonas de desage y se las dot de un sistema de canales
independientes (sistema radial). tste tena la
ventaja de que, cuando se produca una avera,
no se deban dejar fuera de servicio todos ~
canales, sino que ~ restantes poclfan recoger
el agua del canal averiado. Se conduca el agua
por tubos de barro cocido y esmaltado, y se evacuaba fuera de la ciudad, mediante estaciones
de bombeo con fuerza de vapoi; a loo llamados
"campos de aguas residuales" situados fuera de
la dudad. La gran innovacin de este sistema

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consista en que las aguas residuales ya no se


conduelan a las zanjas de desage, sino que el
suelo las depuraba y se podan utilizar posterior
mente como abono para la agricultwa
Hobrecht diVldl la dudad en doce zonas a&
iguales. Para cada zona estaba prevista una gran
zona de aguas residuales.
La puesta en servido del sistema de desage
liber de golpe a ~ habitantes de la ciudad de
la plaga contra la higiene y la esttica que suponan las acequias hediondas y los fosos colectores de estircol lquido. Las superficies que se
acababan de adquirir deban modificarse mu
cho para la explotacin de las aguas residuales.
Se planific una gran parte del paisaje y se construyeron presas. Aparecieron, segn la inclina
cin, bancales horizontales o terrenos en pen
diente que se regaban uniformemente. Gracias
a los campos de aguas residuales se desarroll
un paisaje peculiar creado por la mano del
hombre: adems de evacuar las aguas residuales de la ciudad de Berln, los campos de aguas
residuales tambin se podan utilizar en la
explotacin agrcola.
En 1905 se construy la primera planta depuradora en Wllmersdorf, y en 1930 las de
Stahnsdorf y WaBmannsdorf. ~ras deban des
cargar a ~ campos de aguas residuales. Sin
embargo, la cantidad de vertidos sigui aumentando. Por tanto, 60 al\os ms tarde se convtr
tieron 1133 hectreas de campos de aguas resi
duales en instalaciones de funcionamiento in
tensivo por filtros. Los campos, constantemen
te Inundados, ya no permitan que se explotara
la agricultura en esas zonas. Apartir de 1974
se instalaron cubas de oxidacin. ~tas deban
aadir oxgeno a las aguas residuales estancadas. En 1984 se construy en Schonerlinde la
planta depuradora "Norte", con una instala
cin de biogs (ver Ag. 6.10), yen 1985-1986
se suprimi la explotacin de las aguas residuales en el norte de Berlfn porque las plantas depuradoras podan depurar el agua por completo. En ese momento, los campos de aguas residuales se convirtieron en intiles y pudieron
convertirse en zonas de recreo.

Estructura esquemtica de un campo de aguas


residuales. En los bancales de aguas residuales
se cultivaban cereales, verduras y tubrculos.
Por ese motivo, el encargado de las aguas resi
duales deba procurar que los campos se inundaran de forma uniforme y regular.

151

BIOTECNOLOGA
Pulverizador giratorio

.................P.~~~..?.i~~~i~~ir_lo.s.~_er~i.?!J~.
Zona

l >;iollir,.,.-.;!.Jilott'JiSQll::CJ....9.e.1~~..!~?.~.Y.~!.~.e~
Productos de relleno
del dispositivo de goteo
(escotia u otros)

Zona de las bacterias


y devoradores
-- ...............~~-~.~~~e.~i-~.s

Zona
de extraccin

ria mucilaginosa procedente de las bacterias. Estos


copos de lodo simbiticos constituyen la sustancia
de soporte de los microbios y se hallan en suspensin
en enormes cubas de lodo activo (Figs. 6.7 y 6.8)
con paletas giratorias ocepillos que introducen aire en
el agua de fonna convencional. De este modo, los
microbios que consumen oxgeno se pueden reproducir bien. El caudal es considerablemente mayor que
en los tanques depuradores por filtracin, sobre todo
gracias a la mejora en el suministro de oxgeno.
Una parte de este lodo se deposita en una cuba
de depuracin posterior. La desventaja es el olor
producido por estar sta abierta.

Fig. 6.4 Tecnologa


de un dispositivo de goteo.

recirculacin constante y se ventilen con oxgeno


-un proceso que consume mucha energa.

6.2 Depuracin aerbica


de los vertidos: campos de aguas
residuales, tanques depuradores
por filtracin y lodo activado

Fig. 6.5 Seres vivos en aguas


residuales dulces (vorticelas,
paramecios y dafnia).

Fig. 6.6 Un indicador de


nitratos en el proceso de tratamiento de vertidos: el ciliado Aspidisca costata. Con frecuencia, un mililitro de agua
residual puede contener hasta 25 ooo ejemplares. Adems
de su cantidad, Aspidisca costata ofrece una segunda posi
bilidad de anlisis: la longitud
de los seis cilios depende del
contenido en nitratos. Cuantos ms nitratos se formen,
mayores sern los cilios.

152

Entre los procedimientos ms antiguos se encuentra el de los campos de aguas residuales (ver
Cuadro 6.1) de las grandes ciudades europeas,
como Berln en el siglo x1x. Con este mtodo, las
aguas residuales previamente depuradas mecnicamente se filtran por el suelo, donde se degradan las
sustancias orgnicas contaminantes mediante mi
crobios.
Adems de los campos de aguas residuales se buscaron variantes que proporcionasen un ahorro de
espacio: otra tecnologa de vertidos, los tanques
depuradores por filtracin (Fig. 6.4), desarrolla
dos en Inglaterra en 1894, trabajan como un biorre
actor de lecho fijo (ver Cap. 4) y utilizan material
fino con grandes poros (lava, escoria, vidrio aglome
rado, cuerpos de plstico), que se apila en recipien
tes tipo caldera, y sobre el que se pulverizan aguas
residuales, previamente depuradas mecnicamen
te, mediante regaderas giratorias.
El requisito necesario para la actividad de los organis
mos de las aguas residuales es que las sustancias de
relleno tengan una gran superficie. En los tanques
depuradores por filtracin se desarrolla un "csped"
formado por bacterias, hongos, cianobacterias (algas
azules), algas, protozoos, rotferos, caros y nemato
dos (gusanos cilndricos). Una excelente comunidad
acutica de seres vivos (biocenosis) (Figs. 6.3 y 6.5).
Un tercer procedimiento ms moderno es el proceso
del lodo activado (Fgs. 6.7 a 6.9), que tambin se
introdujo hace cien aos. En ste, las bacterias aerbi
cas, los hongos ylas levaduras construyen, despus de
la depuracin mecnica, grandes copos con los
nutrientes, los cuales se mantienen unidos con mate-

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En Alemania, por lo general, an se usa en la mayor


parte de los casos la tercera etapa de eliminacin
qumica de fosfatos o nitratos. Para el agua potable
se realiza cloracin u ozonacin posterior para
matar los microbios. Una pequea parte del lodo
activo vuelve a conducirse a Ja cuba para que exista suficiente cantidad de bacterias para los nuevos
vertidos que fluirn por la cuba.
La eficacia de los microbios del lodo activo es asom
brasa: un metro cbico de la cuba puede depurar
20 veces su volumen en vertidos altamente conta
minados. El lodo activo constituye hasta un 20%
del total de la cuba.

El Iodo depositado se trata en torres spticas espe


ciales sin contacto con el aire. De este modo, las
metanobacterias (ver Fig. 6.14) pertenecientes
a las arqueobacterias (Archaea) convierten las sustancias orgnicas restantes en metano. :tste puede
suministrar energfa como biogs (ver ms abajo).
Las cubas de las instalaciones de purificacin requie
ren mucho espacio, yste suele ser escaso, en especial
en las zonas industriales. Por ello, Bayery Hoechst han
desarrollado diversos biorreactores de torre que
ahorran espacio, con una altura de 15 a 30 metros,
para la purificacin qumica de vertidos (Fig. 6.9). En
total, la industria del Rin depura aproximadamente
15 000 millones de metros cbicos de vertidos al ao.
Tambin hay reactores de pozo profundo que se
construyen en la tierra. Gracias a la altura o profundidad de la construccin se consigue, por una parte, que las burbujas de gas se mantengan en el lquido durante ms tiempo, y por otra parte, una mayor
solubilidad del oxgeno debido a una presin mayor.
Ambos tipos de reactores funcionan haciendo fluir oxgeno desde el suelo, disuelven el oxgeno al 80% (en
comparacin con el 15% de los procedimientos normales), proporcionan un mayor rendimiento de degradabilidad, necesitan poco espacio yreducen las molestias por ruido, pero an son caros y complicados.

BIOTEC NO LOGA DEL MEDIO AMBIENTE

6.3 Biogs
Es cierto que existen los "fuegos fatuos" en los pan
tanos. En el antiguo libro chino I Chingya se men

cionaban, hace 3000 aos, "fuegos en los pantanos".


En Europa, el fsico Italiano Alessandro Volta des
cribi en 1776 el "aire en combustin sobre los pan
tanos". Tambin la predileccin por los "platillos
volantes" en zonas pantanosas la aclaran los detrae
tores de los OVNI con el mismo fenmeno natural:
el gas ptrido ascendente contiene metano combus
tibie. Una burbuja de metano inflamada constituye
la base, totalmente terrenal, de los "fuegos fatuos"
y de los OVNI. Sin embargo, no est claro cmo
se produce la combustin espontnea del gas.
Al agitar el lodo de un lago, cualquiera puede ver
y oler que se ha fo rmado metano. En el estmago
de los rumiantes tambin funciona una fbrica de
biogs en miniatura: en el estmago de un bvido,
los microorganismos convierten diariamente entre
un 8 y un 10% del pienso en 100 a 200 litros del
combustible domstico metano, que se fuga como
"gas" de eructos o con los gases intestinales de los
animales. Enormes manadas de bvidos para las
cadenas de comida rpida procedentes de zonas selvticas reducidas a cenizas contribuyen de forma
sustancial a las existencias de metano en la Tierra.
Los "inquilinos bacterianos tiles del intestino
humano producen, adems de vitaminas, gases que
el intestino grueso slo puede reabsorber en parte.
En funcin de la alimentacin, el intestino extrae
diariamente hasta medio litro de gas. La mayor parte es hidrgeno inodoro. Sin embargo, salen despedidas pequeas cantidades de cido sulfhdrico,
cuyo olor vara de incmodo a muy pestilente,
y otros compuestos que contienen azufre que se
generan en la descomposicin de las protenas.
Cada ao, los mlcroorganismos de la Tierra forman
entre 500 y 1000 mlllones de toneladas de metano;
ms o menos la cantidad de metano que se extrae
anualmente de las fuentes de gas natural. Adems,
aproximadamente un 5% del carbono asimilado utl
lizado en la fotosntesis es transformado en metano
por los microbios -una parte importante del ciclo del
carbono. En el fondo del mar hay enormes yacimientos de metano de la Era Prmlca, material
para planificadores de energa y thrillers medioam
bien tales: si este metano se liberara, se producira una
catstrofe. Al contrario de otros combustibles domsticos, segn el Premio Nobel Paul Crutzen (Fig.
6.14), la concentracin de metano en la atmsfera no
ha aumentado de una forma sorprendente en los lti
mos tiempos. Excepcionalmente, esta vez los gran
des productores de metano no somos nosotros sino
los insectos: las termitas. Por una parte, cada terml-

Aguas
residuales

___..

Cuba de sedimentacin .---------~

Cuba de activacin

Cuba de decantacin posterior

Hacia tas
aguas
residuales

Agua con grava

j Gasmetro j

Precalentamiento

Bancal de todo seco


-

Aguas residuales no tratadas

l.odo
Gas
Aguas residuales depuradas
biolgicamente

ta (Fig. 6.22) produce con sus microorganismos del


intestino (principalmente flagelados unicelulares)
slo medio miligramo de metano al dfa. Pero a pesar
de la increblemente gran cantidad de insectos, de
esta forma slo se producen anualmente 150 millo
nes de toneladas de gas.
Cmo se produce la metanognesis? Diversos
grupos de bacterias se encargan de la conversin
anaerbica de grandes biomolculas, como la celu
losa, las protenas o las grasas, en metano y dixl
do de carbono. En primer lugar, los clostridios
anaerbicos y las enterobacterias anaerbicas fa
cultativas (es decir, que tambin pueden vivir con
oxgeno), y los estreptococos con la ayuda de las
enzimas que aportan al medio en la fase hidroliti
ca, producen la degradacin enzimtica de las sus
tancias de peso molecular elevado en los compo
nentes bsicos azcar, aminocidos, glicerina y cl
dos grasos (ver Fig. 6.1 3). Seguidamente, estas sus

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Flg. 6.7 Esquema de una


Instalacin depuradora con
etapa de pu rificacin mec
nlca y biolgica (cuba de
activacin con lodo activado)
y aprovechamiento del lodo
en una instalacin de biogs.

fig. 6.8 Cuba de activacin


de la moderna instalacin
depuradora del aeropuerto
Kai-Tak en Hong Kong.
En primer lugar, antes de
alimentar ta cuba de lodo
activado, la instalacin tiene
que separar del agua aceites
y lquidos de lavado.

153

BIOTECNOLOGA

Fig.6.9 la "biologa de torre"


de Bayer logra un buen abas
tecimiento de oxgeno y un
gran rendimiento de degrada
cin sin olores molestos.

Flg. 6.10 Instalacin


de biogs en Schtlnerlinde,
junto a Berln.

Fig. 6.11 Arriba: el gran pre


sidente Mao Tse Tung lnspec
ciona personalmente, en los
aos 1950, el quemador de
una instalacin de blogs;
en la pizarra se alaban
los beneficios del "gas
de los pantanos.
Abajo: 30 aos despus,
el biogs es ms actual que
nunca. El gran reformador
Deng Hsiao Plng frente a una
instalacin de biogs.

tanelas fermentan, en la fase acidgena, princi


palmente en hidrgeno, dixido de carbono, cido
actico y otros cidos orgnicos y alcohol. Los ci
dos orgnicos y los alcoholes se descompondrn
posteriormente, en la fase acetgena, en cido
actico (acetato), hidrgeno y dixido de carbono.
Finalmente se sintetiza metano a partir de hidrgeno, acetato y dixido de carbono.
Los productores de metano son los seres vivos ms sen
sibles al oxgeno que conocemos. Puesto que a estas
"bacterias primigenias" les faltan citocromos y la enzima catalasa que descompone el perxido de hidrgeno, cuando penetra oxgeno en las clulas se genera el
veneno celular mortal llamado perxido de hidrgeno
(Hp2), que destruye las estructuras celulares.
En la actualidad, los productores de metano se
cuentan, junto con las halobacterias que adoran la
sal y las bacterias termfilas que reducen el azufre,
entre las primitivas arqueobacterias. Todas ellas
se diferencian, tanto en su composicin como en su
metabolismo, de las bacterias "normales" (eubacte
rias) de forma drstica, yse encuentran por lo general en ubicaciones extremas (Fig. 6.14). Las condi
ciones de vida se parecen a las de los tiempos arcai
cos, es decir, a las de los albores de la Tierra, cuan
do tambin haba falta de oxgeno.

'

cido actico

o-ffi

~0:"'

,. .#

Fig. 6.12 Instalacin


de biogs del programa
del medio ambiente de las
Naciones Unidas (UNEP)
en fase de construccin.
Fig. 6.13 Derecha: fases
de formacin del metano.

154

't

Alrnhol

Aminocidos, azcar, glicerol, cidos grasos


Bacterias

Aproximadamente 2000 millones de seres humanos


en el mundo an tienen que obtener su energa
mediante la combustin de biomasas (madera, resi
duosagrnomosyabonoseco)-unaformamuydirecca e ineficaz de aprovechar las biomasas para obtener
energa. Adems, este sistema tiene consecuencias
catastrficas para la agricultura y el medio ambiente:
en los pases del tercer mundo, la madera se ha convertido en un bien tan escaso como los alimentos.
Por el contraro, el bogs se obtiene fcilmente en
pequefiOs reactores en la tierra a partir de excrementos humanos y de animales, y tambin de residuos vegetales, y proporciona, adems de energa
para cocinar, abonos naturales en forma de lodo
podrido. ste contiene nitrgeno, fsforo y sales
potsicas, y de esta forma ayuda a ahorrar abonos
sintticos. En los biorreactores cerrados hermtica
mente (Flg. 6.12) se matan tambin agentes patge
nos. En muchos paises en vas de desarrollo, el biogs podra salvar los bosques.
Por tanto, el denominado proyecto Gobar en Ja india
(en hind gobar, estircol de vaca) debera constituir
un descubrimiento en este sentido. Sin embargo, las
estimaciones hablan de 2,5 millones de instalaciones
de biogs. El padre de la nacin, Mahatma Gandhi,
haba soado con pueblos que se autoabastecfan.
Al igual que en tiempos anteriores, sigue existiendo
el obstculo de la estructura social semifeudal del
pueblo hind: slo los agricultores ricos pueden permitirse comprar un reactor de biogs de acero inoxidable y luego explotarlo con la cantidad suficiente de
residuos. Los agricultores pobres, que muchas veces
no tienen ni una vaca, no podran explotar reactores
ni aunque se les facilitaran gratuitamente.

t
/

6.4 iEl biogs podra salvar bosques!

Hidrlisis

Los agricultores ricos compraban estircol de vaca seco


para sus reactores a precios bajos, pero actualmente los
pobres ms pobres siguen sin tener el combustible ms
econmico y ms sencillo, el cual antes se encontraba,
como quien dice, por la calle. Adems, en la lnda, los
excrementos humanos son tab por motivos religio
sos. Consecuencia: como calefaccin se utilizan todas
las existencias de madera que puedan obtenerse.
En opinin de las Naciones Unidas, China presenta
una alternativa. Parece que alli existen 100 000 ins
talaciones de biogs en funcionamiento (Fig. 6.11 ).
A menudo, los pueblos explotan grandes instalaciones comunitarias que se han construido con tecnologa barata a base de biorreactores de cemento.
Tanto las masas de desechos como la energa y Jos
abonos se procesan de forma rentable y se distribuyen de forma racional.

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BIOTECNOLOGA DEL MED IO AM BIEN TE

6.5 Biogs en los pases


industrializados: explotacin
del estircol lquido
En los pases no tropicales, naturalmente es ms
dificil producir biogs. A pesar de todo, existe una
amplia gama de proyectos muy prometedores,
incluso en Europa. En Europa y Amrica del Norte,
los reactores de biogs pueden ayudar a solucionar
los problemas de los desechos en grandes instalaciones de produccin pecuaria. El estircol lquido
procedente de explotaciones pecuarias industriales
se produce en cantidades tan grandes que cargara
demasiado el suelo si se utilizase como abono, o su
transporte sera demasiado costoso. Una vaca leche
ra produce diariamente 75 litros de estlrcol lqui
do. En Suiza, los granjeros construan instalaciones
de biogs a partir de antiguos tanques de aceite, que
proporcionan un contravalor de 300 litros de fuel
oil anuales por cada vaca. En la explotacin de ver
tidos, a partir del lodo que se genera tambin se pue
de obtener un biogs muy econmico.
Una nueva instalacin de tratamiento de vertidos al
norte de Berln que depuraba diartamente 170 000 m3
de agua, en la poca de la ROA ya produca, en cuatro
reactores enormes, 150 000 m3 de biogs diaos, que
en primer lugar abastecan de energa propia a toda Ja
instalacin (Fig. 6.1 O). Actualmente, en Alemania slo
se utiliza una milsima parte de las posibilidades del
biogs.
Los nuevos "Lander" de Alemania iban incluso adelantados en lo que a biogs se refiere: cuando en los
aos 1970 se tena que luchar con las consecuencias
de la crisis del petrleo y empez a sustituirse el fue!
oil por el carbn vegetal, se descubri tambin el bio
gs: las grandes producciones.agropecuarias ofrec
Fig. 6.14 El rbol genealgian suficiente combustible. De este modo, la ROA co
convencional de la vida,
poda matar dos pjaros de un tiro: desapareca el tal como era antes de descu
olor incmodo de muchas Cooperativas Productivas brir las arqueobacterl as, con
tenla dos lfneas principales
Agrcolas (CPA) y al mismo tiempo se cuidaban las de desarrollo: las procariotas
divisas de las costosas importaciones de energa. De y las lneas eucariotas que
derivaban de stas. En un
este modo, en la dcada de 1980 surgieron numero- principio,
despus se hallasas instalaciones de blogs. Tres de estas instalacio ban las bacterias anaerbines pioneras (FrankenfOrde/ Brandenburgo, Rip- cas, las cuales obtenan ener
gfa mediante la fermenta
pershausen/Thringen, Zobes/ Sajonia) an siguen cin. Despus de concentrarfuncionando en la actualidad. Otras tres "centrales se oxgeno en la atmsfera,
clulas anaerbicas
elctricas de granja", incluida la que en su dfa fue ciertas
que haban perdido su pared
la mayor del mundo, la de Nordhausen, en el extre celular (micoplasmas) absor
mo oriental del Harz, que produca diartamente blan bacterias ms pequeilas
e iniciaban una relacin
1O000 m3 de gas, han dejado de funcionar (al igual endosimbitica con ellas.
A partir de las bacterias "traque las producciones pecuarias correspondientes).
Incluso se podra pensar en utilizar biogs para el funcionamiento de vehculos agrcolas. En Alemania,
antes de la Segunda Guerra Mundial ya se haba expe

gadas", probablemente una


bacteria aerbica (que respira oxgeno) se desarroll hasta una mitocondria, una cianobacteria fotosinttica has-

ta un cloroplasto y una espl


roqueta posiblemente hasta
un flagelo. De este modo surgieron los antepasados de
las clulas eucariotas.
Por lo que se sabe, el dendo
g111ma (rbol genealgico)
de las bacterias reales o
eubacterias se divide en cinco ramas principales.
las bacterias grampositivas,
a las cuales pertenecen espe
cies de bacilos, estreptomicetos y clostridios, poseen
una pared celular gruesa.
las bacterias fotosinttlcas
purpreas (por ejemplo
Alcoligenes) y algunos
parientes cercanos de stas
que no realizan la fotoslntesis, como Escherichlo cal/,
constituyen otro grupo. Las
espiroquetas son bacterias
largas y en forma de espiral.
Las clanobacterias, activadas
a partir de la fotosntesis y

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que liberan oxgeno, han desarrollado con toda probabilidad los cloroplastos de las
plantas. Algunas bacterias en
forma de bola con una pared
celular atpica (Mlcracoccus)
destacan por su especial sensibilidad a las radiaciones.
Las bacterias verdes fotosintticas (Chlorobium) son
organismos anaerbicos.
En los aos 1970 se descubri que las arqueobacterias
procariticas se diferencian
considerablemente en su
estructura celular de todos
los dems seres vivos. es
decir, representan una
"tercera forma de vida*, forman un grupo especial que
tuvo un papel dominante
en la biosfera primitiva. pero
posteriormente, debido a
su sensibilidad al O)(geno,
fueron desterradas a pequeilos nichos ecolgicos.

155

BIOTECNOLOGA

Cuadro 6.2 Demanda bioqumica


de oxgeno a los cinco das
(DB05)- Una medida para
las sustancias biodegradables
de los vertidos
El oxgeno es poco soluble en agua A 15 C se
disuelven aproximadamente 1Omg de oxgeno
por cada litro de agua; a 20 C slo 9 mg.
Cuando se vierten aguas residuales a los lagos,
Jos ros yel mar, el oxgeno disuelto en el agua
disminuye de forma drstica: las bacterias aerbicas y los hongos lo necesitan para descomponer las sustancias orgnicas all contenidas.

mixto de microbios de aguas residuales).


Seguidamente se determina el contenido en
oxgeno, normalmente con un electrodo de
oxgeno Clark. Acontinuacin se cierran los
frascos y se agitan a 20 C durante cinco das
en la oscuridad. Despus de la incubacin se
vuelve a medir el contenido en oxgeno.
La diferencia entre el primer da y el quinto
(multiplicada por la dilucin de la muestra)
da como resultado el valor de DB05

Por consiguiente, las plantas depuradoras,


biofbricas para producir agua limpia, necesi
tan un suplemento adicional de oxgeno.
Con el proceso de la "demanda bioqumica
de oxgeno" (Biochemical Oxygen Demand,
DBO), inventado en 1896 en Inglaterra, se
puede determinar la carga orgnica del agua.
La DB05 sirve para calcular aproximadamen
te la proporcin fcilmente degradable del
contenido total orgnico del agua. A partir
del oxgeno requerido se cuantifican los
microorganismos hetercrofos.
La cantidad de oxgeno extrada del agua
en la degradacin a 20 C se refiere a un
determinado nmero de das, en el caso de
la DB05 a cinco das. Se diluyen muestras
de agua, se "burbujean" en matraces de agita
cin con aire (para alcanzar la saturacin con
oxgeno) y se les afaden seeds (un cultivo

Fig. 6.15 El premio Nobel


Paul Crutzen (centro),
codescubridor del agujero
de ozono, despus de una
conferencia en abril de 2005
en Hong Kong: Existen
1400 millones de bvidos
en el mundo que excretan
metano de forma masiva ...

Fig. 6.16 Superficie cerrada


al paso debido a una carga de
herbicida en 1990 en la anti
gua franja deJ muro en Berln.

156

Cmo se mide el valor


DB05: electrodo
de oxgeno Clark en
un frasco de cultivo.

Si en el agua no hay ninguna sustancia bio


degradable, los microbios no tienen nada
para consumir, no se multiplican ni absorben
nada. No se habr consumido oxgeno.
La diferencia entre el primer da y el quinto
equivale a cero. Por consiguiente, la DB05
es de Omg oxgeno/L El agua no contiene
sustancias fcilmente biodegradables!
Si, por el contrario, el agua hubiera sido rica
en sustancias biodegradables, los microorga
nismos afadidos se habran multiplicado
y habran consumido el oxgeno.

Si, por ejemplo, la diferencia asciende


a 9 mg/L (para un consumo total de 0 2)
y la dilucin es de 100 veces, el valor de
DB05 es de 900 mg/L

Es decir, se necesitaran 900 mg de oxgeno


para degradar por completo un litro de esta
agua residual. Dicho de otra forma, se nece
sitara el oxgeno de 900 litros de agua limpia
para degradar un litro de agua residual!
El contenido de DB05 de las aguas residuales
producido diariamente por una persona se
indica mediante el llamado valor habitante
equivalente (HE). Un HE corresponde aproxi
madamente a 60 g DBO/da. La DB05 slo
se ve influida, por ejemplo, mediante la nitri
ficacin, respiracin de algas o sustancias
txicas que inhiben a los microorganismos.
El valor DB05 es importante para establecer
comparaciones entre las aguas residuales;
las tasas en concepto de aguas residuales
tambin se rigen por l. Sin embargo, este
valor no da ninguna informacin acerca del
contenido en compuestos no degradables.
La desventaja de la determinacin de la DBO
es que el periodo de prueba dura mucho tiem
po. Un tiempo de medida de cinco das no
garantiza un aprovechamiento efectivo de
la prueba para controlar las instalaciones.
Por el contrario, los biosensores microbianos
(Cap. l O) miden la DBO de las aguas residua
les en slo cinco minutos, pero slo indican
sustancias de bajo peso molecular que pueden
penetrar por una membrana de proteccin.

rimentado con biogs procedente de instalaciones


depuradoras para proporcionar calefaccin a grupos
de viviendas situadas al lado. En aquel entonces, en
Stuttgart funcionaban 155 vehculos de la empresa
municipal de transportes con biogs -populannente
denominados con cario "Furzelino". Los coches tenan una gran ventaja: el metano se convierte en agua
y dixido de carbono, respetando el medio ambiente.

material de partida son limitadas. Sin embargo, para


el suministro local de energa, el biogs tiene un
gran significado en las zonas rurales de todo el mun
do. Actualmente, no slo el suministro de energa
est cobrando ms relevancia, sino cada vez ms
la evacuacin de desechos que daan el medio
ambiente; finalmente, la proteccin de los suelos
y bosques constituye un problema ecolgico global.

Los desechos domsticos podran ser otra fuente ms


de biogs. En los depsitos de desechos tambin se
forma metano (en parte peligroso), yse puede obtener
biogs si se cubre de forma adecuada. Segn estima
ciones americanas, en depsitos de desechos se puede generar aproximadamente un 1%de la energa que
se necesita en Estados Unidos. Este porcentaje no
parece muy elevado, pero habra que pensar que este
1% de Estados Unidos corresponde al consumo total
de energa de algunos pases en vas de desarrollo.

6.6 El alcohol que crece

En los pases industrializados, el biogs slo puede


cubrir entre un 1 y un 5% de la energa total nece
saria, por el mero hecho de que las cantidades de

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en los campos
El automvil arranca: en lugar de los gases de escape
de olor nauseabundo, despide un ligero olor a alcohol.
En Brasil esto es un hecho cotidiano [Cuadro 6.3).
Hoy existen en Brasil 4,2 millones de automviles que
slo funcionan con etanol y aproximadamente 10,2
millones de automviles que funcionan con una mez
cla de gasolina y etanol. La produccin estimada de
etanol en todo el mundo ascendi en 1998 aproxima
damente a 33 300 millones de litros. Entre los gran
des productores figuraban Brasil (14 500 millones de
litros), Estados Unidos (5700 millones de litros), Asia

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE -

(5900 millones de litros) y Europa (4600 millones de industria del alcohol deben utilizarse en circuitos
litros). El disparo de salida para la enonne produccin cerrados, los restos de azcar deben convertirse en
de alcohol combustible se produjo en Brasil a conse alimentos y abonos, y el lodo fino en biogs. El procuencia de la crisis del petrleo de los aos 1973 blema del bioalcohol demuestra hoy dfa cules son
1974. La segunda crisis, en 1979, activ an ms la los aspectos socioeconmicos y polticos que hay que
produccin. En aquel entonces existan grandes can- tener en cuenta en el desarrollo de nuevas tecnologtidades de la materia prima de partida, la caa de az- as, como la biotecnologa. Lester Brown, director
car. Debido a los elevados precios del petrleo en el del Instituto Worldwatch, dice que las plantas ener
mercado mundial, a finales de 1975 se lanz el pro- gticas aumentaran la presin sobre las superficies
grama estatal Proalcool para generar etanol como de cultivo frtiles limitadas, que en muchos lugares
combustible. Los motivos polticos y econmicos fue del mundo ya es excesiva y ha provocado una mayor
ron determinantes para el proyecto (detalles en Cua- erosin y deterioro del suelo. Brown estableci una
dro 6.3). Sin embargo, el proyecto tambin es muy comparacin: para la alimentacin anual de un ser
polmico: adems de la problemtica de "combustible humano basta con la cosecha de 1000 m2 de tierra
en lugar de alimentos", otro problema es la contami- cultivada, y para cubrir las necesidades correspon
nacin del medio ambiente con aguas residuales y dientes de combustible de un coche estadounidense
la erosin del suelo.
se necesitaran 30 000 m2 Por tanto, parece que un
La produccin de alcohol genera por cada litro de eta- coche quita el alimento de 30 personas!
nol 12 a 15 litros de residuos de azcar y 100 litros
de agua para lavar, que por motivos econmicos prin- 6.7 Los devoradores de petrleo
cipalmente se vierte a los ros sin depurar y los conde Ananda Chakrabarty
vierte en cloacas, aunque se podra obtener abono Pueden contribuir los "supennicrobios a salvar el
a partir de los residuos del azcar. La carga de sucie medio ambiente? El biotecnlogo hind afincado en
dad orgnica de estos vertidos que se generan para Estados Unidos Ananda Mohan Chakrabarty
producir un litro de alcohol corresponde a la carga de (nacido en 1938, Fig. 6.18) haba cultivado bacterias
vertidos de cuatro ciudadanos. Una sola fbrica de en General Electrfcque podan descomponer el ani
alcohol, con una produccin diaria de 150 000 litros, quilador de plantas (herbicida) 2,4,5-T. Este herbicise puede comparar con una gran ciudad de 600 000 da se utiliz en grandes cantidades durante la Guerra
habitantes en trminos de cantidad de vertidos.
del Vietnam como componente esencial del agente
Es decir, los procesos biotecnolgicos no proporcio- naranja (adems, contena impurezas mutgenas de
nan "automticamente" productos que respetan dioxina) para "desforestar" grandes superficies selvti
el medio ambiente!
cas (Rg. 6.17), y tuvo consecuencias catastrficas
-malfonnaciones
y cncer-en los vietnamitas yen los
Durante la poca del alcohol hubo que suspender
hijos
de
los
soldados
estadounidenses implicados.
temporalmente el suministro de agua potable de ciudades enteras. Ahora, el gobierno brasileo ha pues- Apartir de los devoradores de herbicidas, Chakrabarty
to el freno de emergencia: las aguas para lavar de la cri devoradores de grasas en toda regla (Fig. 6.19):

La cepa A
degrada alcanfor

La cepa B
degrada octano

La cepa C
degrada xilol

Cruce y nueva
combinacin de plsmidos

La cepa O
degrada naftalina
Cruce
Plsmido NAH
Plsmido XYL
Cepa F

Plsmido CAM/OCT

Plsmido NAH

Plsmido XYL
la cepa G
degrada alcanfor, octano, xilol y naftalna

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Fig. 6.17 Jungla vietnamita


Intacta (arriba) y despus
de una "accin de desforestacin con el agente herbi
clda naranja (2,4,5-T)
(abajo). Ananda Chakrabarty
cultiv bacterias que degradaban el agente naranja.

Flg. 6.18 Ananda Chakrabarty


obtuvo en 1981 su patente
en Washington. Actualmente,
Chakrabarty, titulado por la
Universidad de Calcuta,
es Distinguished Professor
de la Universidad de lllinois,
en Chicago.

Fig. 6.19 Fabricacin de un


"supermicrobio" (superbug)
que puede degradar las sus
tanelas hldrocarbonadas
pesadas del petrleo. En pri
mer lugar, se integr un pls
mido que degrada el alcanfor
(CAM) en una bacteria que ya
contenia un plsmido que
degrada el octano
Ambos plsmidos se fusiona
ron. De este modo, un plsmido codific enzimas para
ambas rutas de degradacin.
Por el contrario, para los pls
midos del xllol (l<YL) yla nafta
lina (NAH) ocurri de otro
modo. En este caso, ambos
plsmidos coexistfan en una
clula. Finalmente, Chakrabarty junt todos estos pls
midos en una cepa. tsta creci
bien en crudo y utiliz alcanfor, xilol, octano y naftalina
como fuente de hidrocarburos.

cocn.

157

BIOTECNOLOGA

Fig. 6.20 La catstrofe


del Exxon Valdez de 1998.
Dfas 15: el petrolero Exxon
Valdez en el arrecife Bligh,
26 de marzo de t989; playas
muy contaminadas de crudo
(isla Smith, abril de 1989);
intentos de limpieza de
las playas; contaminacin
incluso a una distancia
de 350 millas en la pennsula
de Alaska (agosto de 1998).

Balance de la catstrofe
del petrolero Exxon Valdez
38 ooo toneladas de crudo
(iel contenido de i25 pisci
nas olmpicas!) se vertieron
al mar; se contaminaron
1300 millas de costa.
Clculo de vctimas:
250 ooo aves marinas,
2800 nutrias marinas,
300 focas,
2 50 guilas de cabeza
blanca,
22 ballenas asesinas
y una cantidad incalculable
de peces.

158

extrajo de cuatro cepas de Pseudomonas que degra


dan respectivamente el octano, el alcanfor, el xilol
y la naftalina, los plsmidos, y por vfas separadas cre
el "superplsmido" y lo volvi a introducir en las bacterias. De este modo cre un Superbug [supermicrobio) que puede descomponer los cuatro productos.
Las bacterias transformadas de este modo atacaron
con un "hambre canina" los restos de petrleo txicos.
Aparentemente, cuando se producen catstrofes con
petroleros (Rg. 6.20) y hay enormes superficies del
mar en peligro por la marea negra, stas degradan rpi
damente el petrleo. Los microorganismos, que crece
ran masivamente, seran devorados a su vez por otros
seres marinos, yde este modo volveran adesaparecer.
Sin embargo, los devoradores de petrleo de Chakra
barty nunca se utilizaron en el medio ambiente, por
que en aquel momento no se permitir liberar bacte
ras manipuladas genticamente.
En la avera del petrolero Exxon Valdez, en 1989,
frente a las costas de Alaska, se aspir y se filtr la
masa principal del petrleo espeso (Fig. 6.20). Sin
embargo, la capa situada sobre las rocas y en la arena se degrad con bacterias cultivadas "normales".
Aadiendo "abonos" (fosfato y nitrato), el crecimiento de los microbios mejor considerablemente. Hasta el momento no se permite nada ms.
Cmo seguir la "mejora del medio ambiente"?
El bilogo y escritor berlins Bernhard Kegel, en su
novela Sexy Sons, no slo describe al fracasado clon
del jefe de una empresa multinacional de temas
medioambientales, sino tambin lo que ocurre
cuando microbios de nueva creacin por manipulacin gentica acaban, primero, como era de esperar,
con la contaminacin por el petrleo, pero despus
se llevan malintencionadamente a pozos de petrleo activos. Una catstrofe, pero de momento slo
existente en la ciencia-ficcin.
Sin embargo, las espectaculares catstrofes de petro
!eros slo causan un pequeo porcentaje de la con ta
minacin por el petrleo. Anualmente siguen vertindose millones de toneladas de petrleo al mar,
una cuarta parte de ellas procedentes de la limpieza
ilegal de los tanques vacos en mar abierto, y un tercio de las aguas residuales que se echan a los ros.
Los suelos contaminados con petrleo (bajo las
gasolineras, por ejemplo) son ms complicados: des
pus de la reunificacin, en Alemania Oriental hubo
un gran auge de la limpieza de los suelos. Se infectan dos metros de profundidad de suelo con micro
bios especficos, se airean y mezclan. A menudo,
despus de dos semanas ya se ha eliminado el 90%
de las sustancias txicas.
Las llamadas "franjas del muro" de Berln se estuvie
ron rociando con herbicidas durante aos para que los

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vgilantes de la frontera tuvieran buena visibilidad.


Sobre todo se aplicaban hidrocarburos dorados, como
el 2,4D (Fig. 6.16). Despus de 16 aos, las sustan
cias txicas se han eliminado mediante microorganismos del suelo que han surgido de forma natural.
En 1980, el Tribunal Supremo estadounidense dio
la razn a Chakrabarty en el juicio Diamond contra
Chakrabarty 447 U.S. 303 (1980). En 1971 haba
inscrito una patente para un ser vivo y desde entonces haba estado pleiteando. Su cepa bacteriana
devoradora del petrleo fue el primer ser vivo
"creado" de la historia para el que se concedi una
patente en Estados Unidos (Fig. 6.19). De este
modo se cre un precedente para la industria
biotecnolgica.

6.8 Azcar y alcohol


a partir de la madera
El almidn es la materia prima ideal para producir
azcar y etanol, as como para producir otros pro
duetos qumicos industriales, pero para tales usos
entra en conflicto con la demanda de ms alimen
tos. La antigua Ojfice of Technological Assessment
(OTA) del gobierno estadounidense ha calculado
que slo de un 1 a un 2% del consumo de combustible podra cubrirse con el alcohol procedente del
almidn de maz sin necesidad de aumentar los pre
cios de los alimentos en Estados Unidos.
Por el contrario, la lignocelulosa se presenta
como la materia prima regenerable ms importante
y tampoco se puede utilizar como alimento!
La lignocelulosa est constituida por tres compo
nentes: la celulosa (un polmero lineal que consta
de componentes de glucosa}, la hemicelulosa
(asimismo un polisacrido, pero que consta de cade
nas largas de la pentosa xilosa) y la lignina, una
molcula compleja aromtica. En la paja del trigo
y en la madera, estos componentes se encuentran
en una proporcin aproximada de 4:3:2.
Aunque la biomasa de la celulosa por tonelada de
masa seca es claramente ms barata que el almidn
de cereales, no puede competir con el almidn en el
azucarado: la estructura fija de la lignocelulosa,
imprescindible para la vida de las plantas, constituye
en este caso un inconveniente. El motivo es que la
celulosa se encuentra en forma cristalina, incluida en
la hemicelulosa y la lignina, y-como sabe todo el que
todava tiene muebles antiguos de madera autnticaal contrario que el almidn no es soluble en agua.
La mayora de los microbios no pueden degradar la
madera sin un pretratamiento enzimtico. ste es
uno de los motivos por los que la madera es un material de construccin tan apreciado. S es cierto

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE


Flg. 6.21 Degradacin
enzimtica hipottica
de la lignocelulosa.

Lignocelulosa

Celobiosa

que Ja madera se debe proteger contra la carcoma, las con vapor y Jos procesos de explosin congelando con
termitas y Jos productores de la putrefaccin blanca amoniaco lquido pueden reducir los costes.
y la azul (enfermedad de los hongos), pues todos ellos Pero existe una esperanza: hace unos pocos afies,
producen celulasas que degradan la celulosa en az- la larga bsqueda de microbios que degradan
car y, por tanto, dafian la madera. En el caso de las ligninadio un giro imprevisto. Los expertos esperaban
termitas, que producen metano, los protozoos de sus que las sustancias de elevado peso molecular fueran
intestinos poseen celulasas (Fig. 6.22).
siempre las primeras separadas por las enzimas hldroEl hongo Trichoderma virlde, que fue renombrado lfticas (hldrolasas}, formadas por los microorganismos
por el especialista en celulasa americano E.T. Reese y liberadas al medio. Ejemplos conocidos son las ami
como Trichoderma reesei, es actualmente el favori- lasas y las celulasas. Para la degradacin de la lignina
to a la hora de desprender celulasa de forma extra se descubrieron Jos hongos causantes de la llamada
celular. Se descubri en Nueva Guinea en una car putrefaccin blanca de la madera. Descomponen
tuchera de algodn podrida durante Ja Segunda entre un 60 y un 70% de la lignina y generan fragmen
Guerra Mundial (Flg. 6.23). En aquel entonces, los tos, dixido de carbono y agua, y liberan celulosa blan
microbilogos se crean las noticias alarmantes ca (de ah la denominacin de putrefaccin blanca).
que llegaban de las zonas de combate tropicales y
decan que el equipamiento del ejrcito estadouni- El mecanismo de descomposicin de la lignina es
dense se descompona con una rapidez alarmante. sensacional: los hongos Phanerochaete chrysospo
rium y Coriolus verscolorno desprenden hidrola
Mientras tanto se encontraron mutantes que con- sas sino peroxidasas extracelulares al medio!
vertan La celulosa en azcar de forma diez veces ~stas destruyen, sobre todo, los enlaces fenlicos de
ms productiva que las cepas salvajes. Yhasta ahora
la lignina (Fig. 6.21).
el proceso no resulta costoso. El mejor candidato
para degradar la lignina, el hongo Chrysosporium La procedencia del perxido de hidrgeno, sin el
pruinosum, an deja un 40% de lignina intacta des- cual no funcionan las peroxidasas, sigue siendo un
enigma. Probablemente las oxidasas extracelulares,
pus de 30 das en el biorreactor.
como la glucosa oxidasa, desprenden Hp2 cuando
Los productos de degradacin de la lignina son venese oxida la glucosa. La participacin inesperada de
nosos para muchos microbios (evidentemente, es un
las peroxidasas en los procesos de degradacin indi
agente protector natural de la madera en los rboles) y,
ca claramente que, incluso en el caso de las enzi
lamentablemente, no se conocen aplicaciones adecuamas, slo se ha descubierto la punta del iceberg,
das para la lignina hasta el momento. El pretratamieny todava estn por descubrir mbitos de aplicacin
to de Ja lignocelulosa con cido tambin sigue siendo
sorprendentes y muy tiles.
necesario para una buena descomposicin enzimtica
de la celulosa sin embargo, La eliminacin del cido es El segundo problema de Ja degradacin de la made
cara. No obstante, Ja investigacin de las explosiones ra es la inhibicin de las celulasas por sus propios

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Fig. 6.22 Arriba: las termitas


(hormigas blancas) producen
biogAs con la ayuda de celulasas de sus Hagelados
del intestino.
Centro: Hagelados que devoran bacterias en el intestino
de la termita. Abajo: cajn
no utilizado en el armario del
autor en Hong Kong, con una
considerable plaga de termitas. Producen metano
a partir de la madera del
armario.

Fig. 6.23 En la Guerra


del Pacfico contra Japn,
los objetos de algodn y las
cartucheras de los GI se deshacan con una facilidad pasmosa: los hongos productores de celulasa. como Trichoderma, fueron la causa.

159

BIOTECNOLOGA
Fg. 6.24 Materias primas
qumicas a partir de la bioma
sa (frmulas estructurales)

Etanol

cido actico (acetato)

nbutanol

Acetona

productos (inhibicin por productos), la glucosa


y su dmero, la celobiosa, y su actividad relativamen
te baja. De todas maneras, la actividad enzimtica de
las mejores celulasas es slo una milsima parte de
la actividad de las amilasas de uso corriente. Tal vez
mediante la ingeniera de protenas, es decir, la
fabricacin de nuevas enzimas modificando sus
componentes aminocidos, se pueda conseguir que
las celulasas abandonen su "autocontrol voluntario".
Los ingenieros genticos ya han clonado genes de
celulasa a partir de diversos microbios en bacterias
para producir celulasas de forma econmica y en
grandes cantidades. Otra posibilidad para mejorar
los procesos es la transmisin de la capacidad para
aprovechar las pentosas de la hemicelulosa mediante consumidores de celulosa.
Finalmente se podran aplicar microbios que utilizan la lignocelulosa directamente, por ejemplo
Clostridium thermocellum. Las cepas salvajes forman una gran gama de productos a partir de la lignocelulosa, especialmente etanol y cidos orgnl
cos. Mediante manipulacin gentica parece que
se forma uno de estos productos en concentraciones elevadas y, por tanto, de forma econmica.
Una empresa norteamericana utiliza el hongo de la
putrefaccin blanca Ophiostoma piliferom para el
pretratamiento de las virutas de madera (putrefaccin o biopulpin/). Despus de unas semanas, con
cien toneladas se obtuvo una cosecha mayor de celulosa. Las virutas a las que se ha inyectado Ophiosto
madegradan la lignina y, al mismo tiempo, eliminan
a los competidores de la putrefaccin azul.

cido ctrico

cido lctico (lactato)

cido Dglucnico

160

6.9 Materias primas qumicas


de biomasa?
Slo unos cien productos qumicos industriales repre
sen tan en la actualidad el 99% de todos los productos
qumicos. Unas tres cuartas partes de stos se fabrican
a partir de cinco materias bsicas: etileno, propileno,
benceno {benzol), tolueno (toluol) y xileno (xilol).
Todas estas sustancias se producen actualmente a par
tir del petrleo y el gas natural. Los precios fluctuan
tes del petrleo influyen considerablemente en el sector qumico. Adems, se deben aadir Jos elevados
costes de energfa necesarios para extraer el petrleo
y para evitar problemas medioambientales. Los ex
pertos calculan que, en principio, la mitad de los cien
"productos qumicos ms importantes" puede fabricarse a partir de materias primas renovables. Cul es
la situacin en la actualidad? El etanol, el cido ctrico y el cido actico pueden fabricarse por biotecnologa a un precio econmico (Fig. 6.24).
El etanol es un producto qumico industrial impor
tante (Cap. 1). Sirve como medio de disolucin,

extraccin y anticongelante, y como materia prima


para la sntesis de otros compuestos orgnicos que
se utilizan como colorantes, pegamentos, lubricantes, frmacos, detergentes, explosivos, resinas artificiales y cosmticos.
La sntesis qunica del etanol a partir del etileno
{mediante almacenamiento de agua a elevadas temperaturas con catalizadores) desbanc al alcohol de
fermentacin gracias a un descenso de Jos precios
del petrleo y del gas natural, y a un aumento de los
precios del almidn y los azcares. Ahora comienza
un renacimiento del proceso biolgico ms antiguo
del mundo. Un proceso continuo, unos microorganismos termfilos y resistentes al etanol, junto con
tcnicas de destilacin que ahorran energa, pueden
hacer que el proceso biolgico sea competitivo.
Actualmente, el cido actico slo se produce para
fines alimentarios mediante Ja oxidacin del etanol
con Acetobacter(Cap. 1). Para el cido actico industrial de elevada concentracin la carbonilacin qumica del metano! an es ms econmica. En todo el
mundo se fabrican aproximadamente 200 000 toneladas de cido actico por fermentacin del etanol.
En Estados Unidos se est probando una aplicacin
del cido actico que protege el medio ambiente.
El acetato, la sal del cido actico, se produce mez
ciando carbonato clcico con cido actico. El cido
actico se obtiene previamente a partir de la bioma
sa. El punto de fusin del acetato de calcio y mag
nesio (CMA) es de - 8 C y se utiliza en invierno
como sal de deshielo protectora del medio ambien
te. Esto alegra a los automovilistas americanos, ya
que, adems, protege la chapa contra la corrosin.
Por el contrario, la "sal de deshielo alemana" (el clo
ruro sdico puro, NaCl) mata los rboles porque elimina importantes nutrlentes de las plantas. El Club
Automovilstico de Alemania inform que en el
invierno 20002001 se utilizaron 2,8 toneladas de
sal de deshielo por cada kilmetro de Ja hermosa (en
aquellos momentos an lo era) carretera de Bran
denburgo, es decir, 2,8 kilos de sal por metro!
Un disolvente orgnico importante es el nbutanol
o 1butanol (n significa normal y quiere decir que se
trata de un compuesto sin ramificar de cadena lineal). El n-butanol se aplica en la fabricacin de ablandadores, lquidos de freno, aditivos de combustible,
resinas sintticas, agentes de extraccin y para producir pinturas. En todo el mundo se producen
1,2 millones de toneladas de forma industrial a partir del petrleo. La produccin de butano! surgi a
partir de las necesidades de Inglaterra durante Ja
Primera Guerra Mundial y contribuy directamen
te a Ja formacin del estado de Israel (Cuadro 6.4).

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BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE -

Cuadro 6.3 Historia


de la biotecnologa: El programa
Proalcool de Brasil
Brasil se vio especialmente afectado por el
aumento de los precios del petrleo de los
aos 1970, puesto que el gobierno, a imita
cin del modelo estadounidense, en el tema
de servicios de transporte haba invertido
mayoritariamente en el trfico por carretera.
La red de ferrocarriles se qued paralizada,
el transporte en barco tambin. Grandes proyectos como la autopista Transamaznica
abrieron zonas del pas hasta entonces inacce
sibles a los automviles.
En 1975, a iniciativa del gobierno militar dio
comienzo el programa nacional Proalcoolcon
el objetivo de sustituir la mayor parte de las
importaciones de petrleo por alcohol. El eta
no! para los "coches de alcohol"se obtiene
de la cafia de azcar, que contiene un 12% de
azcar, o de la cassava (mandioca), una planta
que proporciona almidn, por fermentacin
del azcar. Las dimensiones del proyecto biotecnolgico aparentemente ms importante
del mundo eran poco habituales: desde 1975
a 1980, las superficies de cultivo de caa de
azcar crecieron en un 70%. En 1981 se produjeron 4,6 millones de litros de alcohol y en
1985 nueve millones de litros. Los mayores
problemas se podan solucionar tcnicamente.
La adicin de un 22%de alcohol a la gasolina
no requiere ningn tipo de modificacin tcni
ca en los motores. Sin embargo, en los vehfcu
los que slo funcionan con alcohol, segn afir
maciones de los expertos, hay que tener en
cuenta el mayor Indice de compresin; se
deben instalar las llamadas bujas de encendl
do fras y se necesita un racor de aspiracin
calentado, una proteccin especial anticorrosin para el depsito y el carburador, as como
un sistema de arranque en frfo.

Coche de etanol en medio de la materia prima


regenerable de la caa de azcar.

Se foment el cultivo de la caa de azcar


y otras plantas energticas mediante crditos
extremadamente ventajosos; la nueva cons
truccin y la expansin de las destilenas reci
bi apoyo estatal, se garantiz el precio del

producto, se ampli la investigacin y el de


sarrollo. En 1982, los costes del programa
Proalcool ya se elevaban a 8000 millones
de dlares; con seguridad contribuyeron
a la enorme deuda enerior de Brasil y a
la inflacin del 200%. En contra de eso, el
gobierno se escudaba en los siete mil millones de dlares que se habfan ahorrado hasta
el momento en importaciones de crudo.
Entre 1975 y 1980 se redujo la superficie de
cultivo de arroz en Brasil en un 28%. Aproxi
madarnente 200 plantaciones gigantescas
de caa de azcar haban expulsado de las
mejores tierras a los pequeos campesinos
y arrendatarios que producan mafz, arroz y
judfas negras para los sectores ms pobres
de la poblacin. Los dos millones de puestos
de trabajo recin creados constituyen un
argumento muy gastado para el proyecto del
alcohol: a los trabajadores slo se les necesita
durante la temporada y reciben sueldos
miserables -nicamente de este modo se
puede producir etanol de forma rentable.
En asociacin con multinacionales madereras
se talaron y se siguen talando bosques tropica
les de forma radcaL Como ahora ya sabe todo
el mundo, es un error fatal suponer que los
bosques tropicales se van a recuperar debido
a que crecen de forma exuberante. AJ contra
rio: junto con los arrecifes de coral constituyen
los sistemas ecolgicos ms sensibles.

ero de alcohol como combustible. En 1990 se


liberaliz en parte el mercado del azcar. La
fabricacin de azcar cobr significativamente
un mayor atractivo. Adems, el Estado se vio
obligado a recortar los pagos de subvenciones
por un Importe aproximado de 1500 millones
de dlares americanos. Afinales de 1997,
estos problemas desembocaron en el programa
Proalcoot ll Sin embargo, la cantidad de veh
culos nuevos adquiridos que funcionaban con
etanol se redujo de forma drstica.

Motor de 1,6 L del VW Golf brasileo, apto para


el uso con gasolina o con mezcla de gasolina
y alcohol.

En 2002 Brasil reactiv de nuevo su programa


Proalcool Debido al aumento de los Ingresos

en Brasil, los expertos cuentan con que se


incremente la venta de automviles en general. Con ello debera quedar asegurado el uso
de la mezcla de gasolina y etanol, y por tanto
tambin la fabricacin de etanol anhidro.

Para el proyecto fue ventajoso producir caa


de azcar I si~ as se evitaron los elevados
gastos de a-ansporte y almacenamiento. Ade
ms, el Estado asegur en 1979 a la industlia
automovilstica que en todas las grandes eluda
des se podra comprar etanol como combusti
ble en todo momento. Por ese motivo, las
empresas de automviles estaban dspuestas a
fabricar vehculos con motores especiales que
funcionaran exclusivamente con etanol hidra
tado. Al contrario que el etanol hidratado, el
etanol anhidro se mezcla con la gasolina.
El gobierno brasileo y el Banco Mundial
fomentaron la produccin de etanol y la venta
de automviles que funcionasen exclusiva
mente con etanol. Para eUo, respaldaron ind
rectamente la produccin de etanol hidratado.
A pesar de los programas atractivos y las ayu
das financieras estatales, el proyecto Proalcool
no se logr imponer: dado que los precios del
crudo descenderon en los aos 1980, la produccin de alcohol como combustible se vio
sometida a presin. En 1981y1989, el mer
cado de etanol brasileo se colaps. Los precios fijados por el Estado para el azcar y el
etanol se acoplaron para garantizar el suminis

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Calla de azcar.

Ventas de automviles nuevos (en miles)


1500 ..................................... ..... ............. .

1997

El fracaso del proyecto, visible por la disminucin


de las cifras de ventas de coches de alcohol
frente a los coches de gasolina.

161

BIOTECNOLOGA

Cuadro 6.4 Historia


de la blotecnologfa: Una bacteria
fundadora de un Estado
Cbaim Weizmann (1874-1952lse vio

obligado en su juventud a abandonar su


patria rusa occidental impregnada de senti
miento antisemita. Despus de estudiar en
Suiza y Alemania, en 1904 empez a traba
jar en Londres con el famoso profesor de
qumica William Perkin.
A principios de 1915, el entonces ministro
de la Guerra David Uoyd George repar en
l. Habla una gran falta de cordita altamente
explosiva, una mezcla de nitroglicerina
y nitrocelulosa. La acetona que se necesitaba
para sta, destilada a partir de la madera, era
especialmente escasa.

Cmo se puede obtener acetona por fermen


tacin? Weizmann se acord de las investiga
dones de Pasteur para convertir el azcar en
alcohol por fermentacin. Busc en la tierra,
en el maz y otros cereales, para encontrar
las correspondientes bacterias o levaduras.

La bacteria "fundadora de un Estado",

C/ostridium acetobuty/icum.

Al cabo de pocas semanas de su encuentro,


Welzmann aisl el C/ostrdium acetobuty/1cum, el cual no slo produjo milagrosamente
acetona sino tambin otra sustancia muy
valiosa: el butano!!
El butano! se utiliza para fabricar el caucho
sinttico y tambin para neumticos de auto
mvil, de importancia estratgica.

Chaim Weizmann y Albert Einstein.

Uoyd George se encontr con Weizmann


y ambos quedaron ascinados mutuamente.

Fig. 6.25 Glicerol.

Fig. 6.26 Las algas diatomeas se utilizan como tierra sil


cea para fabricar dinamita.
Ilustracin de Ernst Haeckel
de Kunstformen der Natur.

162

a Primer Ministro, discuti este deseo de


Weizmann con su ministro de Asuntos Exteriores, el conde de Balfour. Esto desemboc
directamente en la declaracin histrica de
Baifour del 2 de noviembre de 1917 y, final
mente, en 1948 en la creacin del Estado de
Israel, cuyo primer presidente fue Weizmann.
Weizmann no slo descubri un mtodo
genial para fabricar dos productos qumicos,
sino que tambin presagi el crecimiento
de la industria de la fermentacin y, con
ello, de la biotecnologa moderna, mucho
antes del descubrimiento de la penicilina

Uoyd George estaba absolutamente fascinado


y ofreci proponer al Primer Ministro que le
concediese a Weizmann una distincin elevada, pero ste la rechaz categricamente y, en
lugar de ello, habl de la necesidad de dar una
patria a los judos del mundo. Cuando el pro
po Uoyd George lleg posteriormente

Como subproducto, C!ostridium acetobutylicum


formaba el disolvente acetona, del cual hubo una
gran demanda durante la Primera Guerra Mundial:
en Gran Bretaa se utilizaba para fabricar el explosivo cordita. Por el contrario, posteriormente, despus
de la guerra, se necesitaba acetato de butilo para
esmaltes de nitrocelulosa, y el inters se volvi a des
plazar al n-butanol. En los aos 1940 y 1950, cuan
do cayeron Jos precios de los productos petroqumi
cos por debajo de los del almidn y la melaza, la pro
duccin microbiana de nbutanol se reduo de forma
drstica. Slo en la Repblica Sudafricana, donde el
petrleo era escaso debido al embargo internacional,
se sigui realizando el proceso en biorreactores de
90 metros cbicos. Se obtuvieron rendimientos de
un 30% en disolventes con seis partes de butano!,
eres partes de acetona y una parte de etanol.

Caricatura de
Lloyd George,
ministro de la
guerra ingls.

Chaim Weizmann, hasta la fecha el nico


biotecn61ogo que ha aparecido en un billete
de banco.

nuo se logr aumentar 200 veces la produccin


de butano!.
El glicerol (glicerina), un disolvente y lubricante
de mltiples aplicaciones (Fig. 6.25), ya se fabric en
Alemania durante la Primera Guerra Mundial me
<liante levaduras para producir dinamita, al igual que
en Inglaterra se prod ucfa acetona con bacterias para
la cerdita. Para fabricar dinamita se hace gotear glicerina enfriada continuamente sobre nitronio (cido sulfrico y cido ntrico); en pequeas cantidades se que
ma sin peligro, mientras que en grandes cantidades
explota sbitamente si se calienta de repente o con un
golpe. El posterior fundador del premio Nobel, Alfred
Nobel, estabiliz la nitroglicerina mediante la absor
cin con tierra de diatomeas. En este caso se trata de
sedimentos naturales de la estructura de cido sillcico
de las algas diatomeas (Fig. 6.26), con grandes poros
Con los precios del crudo en aumento y los avan- y una elevada capacidad de absorcin.
ces biotecnolgicos, en los aos 1980 volvi a A los cultivos de levadura que producen etanol se
aumentar el inters por los procesos biolgicos. les aade sulfito de sodio, el cual forma un producHasta ese momento, la toxicidad del n-butanol para to intermedio importante en la sntesis del etanol.
las bacterias constitua un problema para el aumen De este modo, finalmente se produce glicerol ade
to de la efectividad. Con la ayuda de microorganis- ms de etanol. De todas maneras, con este mtodo
mos inmovilizados y de un procesamiento conti se producan mil toneladas al mes. Sin embargo,

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BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE

despus de la guerra se suprimi este proceso por la


saponificacin qumica de grasas o la fabricacin a
partir de propileno y propano.
El cido dtrico (Fig. 6.24) se produce a partir del
hongo Aspergllus. El cido ctrico se utiliza como
saporizame completamente Inocuo, como conser
vame y en detergentes, a escala mundial, con aproximadamente 700 000 toneladas y con un valor de
mercado de 700 millones de dlares americanos.
El cido lctico (lactato) lo descubri en 1780
el qumico sueco Scheele en la leche agria, y
C. Wehmer lo sintetiz en 1895 de forma muy efi
caz a partir de la glucosa con lactobacllus delbruec
!di en la entonces pequefia empresa A. Boehringer
- posteriormente una multinacional bioqumica. El
cido lctico sirve como agente de acidificacin en
la industria alimentarla y como conservante para
alimentos enlatados, corno agente de decapado
textil y para la produccin de plstico. En total, en
1995 se fabricaban en el mundo aproximadamente
50 000 toneladas anuales. En Europa, casi la mitad
del cido lctico se produce de forma microbiana,
mientras que en Estados Unidos se utilizan exclusi
va.mente procesos qumicos. El aislamiento del ci
do lctico del medio de cultivo sigue siendo caro.
En la actualidad se est volviendo a utilizar uno de
los primeros bioprocesos tcnicos en trminos
histricos: la fabricacin de cido glucnico
(Fig. 6.24) a partir de glucosa mediante Aspergillus
nger. En este proceso, la glucosa oxidasa del hon
go desempea un papel decisivo, utilizndose tam
bin en los biosensores (Cap. 1O) para medir la glu
cosa: al consumir oxgeno, oxida la glucosa a gluconolactona y perxido de hidrgeno, el cual luego se
descompone rpidamente como citotoxina mediante la catalasa. La gluconolactona se hidroliza de for
ma espontnea en cido glucnlco. El cido gluc
nico tiene mltiples aplicaciones, sobre todo como
aditivo en detergentes, ya que une Iones metlicos
y evita que se formen manchas en los cristales a causa de las sales clcicas, y disuelve ligeramente los
sedimentos existentes. De este modo, los recipientes metlicos no se oxidan. En 1997 se producan
aproximadamente 60 000 toneladas anuales de ci
do glucnico en todo el mundo.
Tambin pueden fabricarse biotecnolgicamente
otros cidos orgnicos, por ejemplo el cido fumri
co (sal fumarato) y el cido mlico (cido hidroxi
succfnico, sal malato). El cido fumrico puede sin
tetizarse mediante el hongo Rhlzopus nigricans
a partir del azcar, o de la levadura Candida a partir de los alcanos (parafinas), abaratndose cada vez
ms el proceso qumico-sinttico. Por el contrario,
para el cido mlico la compaa japonesa Tanabe
Seiyaku desarroll en 1974 un proceso biotecnol

la colada que contiene

El sulfuro de cobre poco


soluble se convierte en
sulfato de cobre soluble
en agua mediante
Thiobocil/us

bacterias se devuelve por


bombeo a la escombrera

Espesa miento

L
Precipitado con perdigones de hierro

_J

L
Precipitacin
Cobre puro

gico de elevada eficacia con microorganismos


muertos inmovilizados [ver Cap. 2). En este caso se
utiliza nicamente una enzima (la fumarasa) en
clulas muertas de Ecollpara la produccin de ci
do mlico a partir del cido fumrico.
Es rentable producir productos qumicos industria
les a partir de fuentes regenerables? La fabricacin
de productos en toneladas con poco aumento de los
costes requiere un clculo econmico preciso. En la
actualidad, la mayor parte de las veces esto recae en
las fuentes de materias primas fsiles.
En un futuro prximo no cambiar la situacin, al
menos en sectores industriales completos. Una "infil
tracin biotecnolgica" paulatina de la industria quni
ca depende de los precios del crudo ydel desarrollo de
bioprocesos econmicos que deben reducir sus costes
actuales de un 20 a un 40%. No hay que olvidar que,
por supuesto, los procesos qunicos y los catalizadores
qumicos estn en continuo perfeccionamiento.
La economa dictar, en ltima instancia, si es
mejor aplicar procesos biotecnolgicos o qumicos,

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Flg. 6.27 Principio


de la lixiviacin microbiana
del cobre.

Fig. 6.28 Factora de cobre


histrica en Estados Unidos.

fig. 6.29 Tiobacilos y una


mina de cobre con roca
pobre en cobre de Kennecott
Utah Copper.

163

BIOTECNOLOGA

Fig. 6.30 Lixiviacin micro


biana del cobre: se pulveriza
el mineral con un fluido que
contiene tiobacterias.
Las tiobacterias transforman
el hierro en hierro tres. ~ste
es un buen medio de oxidacin: se oxida pirita a cido
sulfrico y sulfuro de cobre
insoluble a sulfato de cobre
soluble. Despus, la solucin se recoge en cubas.

Fig. 6. 31 Gotas de petrleo


con microbios encima.

Fig. 6.32 Petrleo que se


filtra por los poros de la roca.

Fig. 6.33 Estas bacterias


(,4/ca/igenes o Ra/stonia
eutraphus) constan casi
en su totalidad de bioplstico (polihidroxibutirato).

164

o una combinacin de ambos. Con el correspon te, y en solucin de cido sulfrico convierte a otros
diente inters, inversiones elevadas y una presin metales a su forma oxidada fcilmente soluble. Ah
econmica, en un futuro la mayora de los produc- vuelve a aparecer el hierro dos, que las bacterias oxitos qumicos industriales podran producirse ente- dan de nuevo rpidamente a la foima tres "agresiva.
ramente mediante procesos biotecnolgicos a partir Estos mecanismos se solapan en el proceso prctico de
de materias primas regenerables. Sin embargo, hoy lixiviacin. Fmalmente, en la lixiviacin del cobre,
son interesantes los productos nuevos que no se el cido sulfrico produce sulfato de cobre soluble,
pueden sintetizar qumicamente, y los productos de color azul, a partir del sulfuro de cobre insoluble.
qumicos purificados de elevado valor y en pequeEn la lixiviacin bacteriana se transportan a puntos de
as cantidades, productos con un elevado grado de
recogida millones de toneladas de desechos que conrefinamiento, como por ejemplo los aminocidos.
tienen cantidades pequeas, pero valiosas, de cobre.
Existen
montaas de escoria de hasta 400 metros
6 .10 Minera silenciosa
de altura y 4000 millones de toneladas de rocas
El cobre, el "oro rojo", se ha explotado tanto en los lti (Fig. 6.29). Estas rocas se rocan con agua acidificada.
mos aos que los recursos minerales con un elevado Mientras el agua se filtra, se multiplican las tiobacte
contenido en cobre son ahora muy escasos. La explo- ras, que aparecen a millones en cada gramo de roca.
tacin se realiza en zonas cada vez ms profundas. Los Al pie de la montaa de escoria se filtra el lquido que
costes de energa y explotacin aumentan, pero existe contiene metales y se recoge en grandes cubas colecuna solucin: hace ya 3000 aos que parece que se toras. En ese momento ya se puede obtener cobre con
obtuvo cobre a partir de las aguas subterrneas de las facilidad. El lquido de lixiviacin exento de cobre se
minas. La extraccin del cobre por parte de los espao- vuelve a repartir por la montaa de escoria.
les en Ro Tmto en el siglo xvm mediante lixiviacin
est documentada histricamente. Hasta hace 30 aos En la lixiviacin de mineral de uranio (con iones
nadie sospechaba que las bacterias pudiesen tener un de uranio de valencia cuatro), a partir de Ja pirita de
papel activo en la extraccin. Contribuyen a convertir hierro o hierro dos soluble, mediante bacterias tamel sulfuro de cobre difcilmente soluble en una for- bin se produce hierro tres "agresivo", el cual forma
ma soluble al agua lixiviado (el sulfato de cobre) (Ag. a su vez iones de uranio seis; stos se disuelven bien
6.27). Hoy en dfa, los microbios obtienen cobre puro en cido sulfrico diluido.
de forma selectiva a partir de miles de millones de tone- Sin embargo, parece que para el medio ambiente
ladas de menas pobres de poco valor. En Estados Uni- la biosorcin vale la pena: las caas filtran las susdos, Canad, Chile, Australia y Sudfrica se obtiene tancias txicas de las aguas residuales. Se han desuna cuarta parte de todo el cobre extrado mediante cubierto algas que unen los metales pesados txi
biolixiviacin (bioleachifli en el mundo. Ms del 10% cos, por ejemplo el cadmio, en grandes cantidades
del oro y el 3% del cobalto y el nquel se obtienen por y prometen agua depurada por ser colectores de
mtodos biotecnolgicos.
metal, mientras que al mismo tiempo obtienen
Los principales encargados de la lixiviacin microbia- metales valiosos. Hay diversos tipos de carbn que
na del cobre son la~ bacterias del azufre Thiobaci!lus tambin acumulan metales pesados. Se pueden al
ferrooxidansy Thiobacillus thiooxidans. Las primeras, canzar concentraciones entre 30 y 1000 veces ms
tambin denominadas de forma abreviada "f-erros", elevadas que en las tierras circundantes.
son bacterias acdfilas (afines a los cidos) que oxidan
6.11 una nueva vida para
el hierro dos a hierro tres, y absorben el azufre soluble,
los pozos de petrleo agotados?
pero tambin los sulfuros insolubles, y los transforman
finalmente en sulfatos. Por el contrario, las "Thios" En una plataforma petrolfera aterriza un helicpte
(Th. thiooxidanS slo crecen en el azufre elemental y ro, del cua.J baja un biotecnlogo con un maletn. El
maletn transporta vida a un pozo de petrleo ago
en los compuestos solubles de azufre.
tacto: los cultivos de microbios que se bombean al
Ambos tipos de bacterias trabajan en estrecha colabotanque de petrleo se multiplican allf y forman proracin segn dos mecanismos de reaccin (Fig. 6.30):
ductos que hacen que vuelva a brotar el petrleo.
en la lixiviacin directa, las bacterias obtienen ener
ga (ATP) mediante transferencia de electrones del hie- Dos cerdos del crudo se quedan en el suelo en una
rro o el azufre al oxgeno de la membrana celular. Los extraccin primaria. Los mtodos secundarios de
productos oxidados son ms solubles; en la lixivia extraccin de petrleo utilizan agua y gas introdu
cin indirecta, las bacterias oxidan el hierro dos solu cindolos a presin en el pozo para volver a aumentar
ble a hierro tres, que asimismo es un oxidante poten la presin que ha disminuido (Fig. 6.34). Slo en los

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BIOTECNOLOGfA DEL MEDIO AMBIENTE -

campos petrolferos del Mar del Norte parece que quedan cantidades de petrleo no extralble por valor de
300 000 millones de libras esterlinas. Las inversiones
en investigacin y desarrollo supondran un pequeo
aumento del porcentaje de la produccin. La palabra
mgica es extraccin de petrleo terciaria oMEOR
(del ingls Microbial Enhanced Oil Recovery, incremento de Ja extraccin de petrleo por microbios).
Se est experimentando con diversos procesos. En los
pozos de petrleo aparentemente vacos se inyectan
mezclas de bacterias, las cuales producen in situ gases
como el dixido de carbono, el hidrgeno yel metano,
y de este modo hacen aumentar la presin de los yacimientos de petrleo_ Otras cepas de microbios parece
que fabrican biotensoactivos, que descomponen el
petrleo en gotitas ms pequeas que se pueden filtrar
por Jos pequefifslmos poros de las rocas (Rg. 6.34).
En la actualidad, el problema sigue siendo el aporte
de oxgeno y nutrientes a Jos microorganismo cuando no se pueden alimentar de los componentes del
petrleo. Adems, las condiciones in sttuson extremas; por ejemplo, en Jos yacimientos de petrleo
del Mar del Norte, por el elevado contenido en sal
y Ja escasez de oxgeno, la presin es de 200 a 400
atmsferas y las temperaturas de 90 a 120 C! Lo
que aquf se buscan son extremfilos.
Las compafifas petrolferas experimentan con micro-

Petrleo slido
depositado
en los poros de la roca

-----------------------------

Disolucin del petrleo


mediante biodetergentes

Bioplstica: icircuitos en lugar


de caminos de una direccin!

6.12

bios que forman y dividen cadenas largas de biopolmeros. Los biopolmeros como el xantano Jos produce la bacteria Xanthomonas campestris, un pat- En los supermercados japoneses se venden verduras
geno de las plantas, a partir del almidn o Ja glucosa. envasadas y platos preparados envueltos con una apeEl xantano se utiliza como espesante, que espesa el titosa lmina similar al celofn. Esta lmina se fabrica
agua. Cuando se bombea inicialmente un biotenso- a partir del nuevo producto biolgico llamado pullu
activo jabonoso en un pozo de petrleo agotado para lan (Fig. 6.35). Por una parte, este polisacrido est
disolver el petrleo de la roca, y seguidamente se constituido por componentes de glucosa, los cuales
bombea agua de xantano, el petrleo desprendido se estn, sin embargo, enlazados de tal forma (mediante
extraer mediante alta presin por el orificio de per- los tomos de carbono uno y seis en lugar de uno
y cuatro como en el almidn) que sus enlaces, al conforacin (como con un punzn en una inyeccin).
trario de los del almidn, no Jos pueden romper las
Actualmente, el xantano an es demasiado caro amilasas; por tanto, el ser humano no los puede digepara poder acelerar Ja extraccin de petrleo de for- rir y son bajos en caloras. Al igual que el xantano,
ma efectiva. Sin embargo, se utiliza en alimentacin el pul/ulan aumenta la viscosidad de los alimentos.
en todo el mundo, por ejemplo para fabricar helaLa empresa Hayashibara fabrica pullulan mediante
dos, flanes y bebidas bajas en caloras, para darles
hongos (Pul/u/aria pullulanS partiendo de azcares
consistencia y que no sean "acuosos". Aunque el
simples, y a partir del espeso jarabe de pullulan vierte
xantano sirve para espesar, no engorda. El ser
capas finas que se convierten en lminas duras cuanhumano (es decir, sus enzimas) no lo degradan y,
do se secan. Las lminas son un excelente material de
por consiguiente, es bajo en caloras y tiene un
envasado porque mantienen el contenido al vaco,
(breve!) efectosaciante para Jos que cuidan la lnea.
pero se pueden disolver fcilmente en agua caliente.
Hace 30 afios el xantano era uno de Jos primeros Por supuesto, tambin protegen el medio ambiente
productos nuevos de Ja biotecnologla moderna. Le y los microbios lo degradan en estado hmedo. Como
siguieron otros productos biolgicos. Normalmente truco especial se ofertan "lminas con sabor", por
se degradan biolgicamente con facilidad.
ejemplo con sabor de frutas o de ajo, que permiten

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Flg. 6. 34 Cmo se puede


mejorar la extraccin de
petrleo mediante microorganismos (/<licrobial Enhanced
011 Recovery, MEOR).

Fig. 6.35 Las lminas


de pullulan para aclarar
la garganta se disuelven
en la lengua.

Flg. 6.36 Pol3-hidroxibutirato (PHB).

165

BIOTECNOLOGA

Cuadro 6.5 Opinin de los expertos:


Desde la conversin de la biomasa
a la bioproduccin sostenible.
Combustibles y productos qumicos

en bruto, purificados y especiales


El trato cuidadoso de los recursos constituy
uno de los estmulos para el desarrollo de
la biotecnologa industrial, mucho tiempo
antes de que esta forma de pensar se elevara
a la categora de estrategia aceptada y cono
cida hoy por todo el mundo, de forma sensata, como "desarrollo sostenible". 1

Destilacin de etanol en la Edad Media.

Sin embargo, en la escena actual inspirada


en lo verde para el consumo industrial de
materias primas y de biomasas de residuos,
lamentablemente a menudo se olvida que
un desarrollo sostenible tiene que tener en
cuenta, por definicin, tres dimensiones:

tin de la rentabilidad. La optimizacin de


la rentabilidad debe aspirar claramente a
mejorar tanto los balances de materia y ener
ga (cuidado de los recursos) como tambin
a rentabilizar los procesos. Para la
qumica/biotecnologa del futuro, que parte
de biomasas y fracciones de biomasas,
se debera proceder, en la medida de lo posible, segn el principio de "los mnimos cambios estructurales de la materia prima''.
En otras palabras: las biomasas generadas
para obtener productos industriales deberan
utilizarse y transformarse de ia forma ms
inteligente posible, es decir, manteniendo
al mximo el elevado grado de organizacin
y de la proporcin entre C/H/O. Un ejem
plo positivo: en la "qumica de grasas y acei
tes" estos requisitos se cumplen ampliamente, ya que sta trabaja prcticamente manteniendo el peso inicial. Ms que producir productos qumicos clsicos basados en el "pen
samiento petroqumico" a partir de biomasas
(aunque esto es posible con grandes prdidas
de transformacin), habra que intentar ms
bien cubrir las "funciones" deseadas con
nuevos productos prximos a la biologa.

Tolerancia medioambiental
Tolerancia social
Rentabilidad.
Con mucha frecuencia, las estrategias
propuestas son demasiado unidimensionales
y tienden a extrapolar fcilmente una poltica
partiendo de las formas de produccin agrcola
actuales que todava dependen, en gran medi
da, de las subvenciones.

En las pruebas
de screening se
buscan nuevas
enzimas.

En un informe reciente de la OCDE,


The Application of Biotechnology to lndus
tria/ Sustaina/Jility, 2 se difunde la metodolo
gfa del Lije Cyc/e Assessment (LCA) para
juzgar la sostenibilidad (en relacin con
la energa, las materias primas, los residuos,
los productos y subproductos, los procesos
y la seguridad) y se documenta mediante 21
estudios de casos detallados.

para establecer productos y procesos


limpios, y puede constituir la base de
la sostenibilidad industrial.
La valoracin de la limpieza de los pro

duetos y procesos industriales es esencial,


pero tambin muy compleja. Por el
momento, el LCA es el mejor mtodo dis
ponible para esta valoracin.
Los estimulos principales de los procesos
de la biotecnologa industrial son la economa (fuerzas del mercado), la poltica
gubernamental, la ciencia y la tecnologa.
Alcanzar una mayor penetracin de Ja bio
tecnologa precisa aunar los esfuerzos en
I+D por parte del gobierno y la industria.
Para poder agotar todo el potencial de la
biotecnologa como base de producto y
proceso limpios - ms all de las aplicacio
nes actuales- se necesita l+D adicional.
Dado que la biotecnologa, incluyendo
la tecnologa de recombinacin del
DNA y sus aplicaciones, es cada vez
ms importante como herramienta para
crear productos muy valiosos y para
el desarrollo de biocatalizadores, existe
una mayor necesidad de disponer de
regulaciones y normativas armonizadas
y especializadas.
Las fuerzas del mercado pueden constituir
un gran atractivo para alcanzar objetivos
que pretendan mantener l!mpio el medio
ambiente.
La poltica gubernamental para mejorar
la limpieza de productos y procesos indus
triales puede constituir el nico factor
altamente decisivo para el desarrollo
y la aplicacin industrial de procesos biotecnolgicos limpios.

Las consecuencias finales de este informe


se formulan en diez preceptos principales:
la colza proporciona biodiesel.

Se requiere implantar soluciones que sean


verdaderamente sostenibles y que tambin
respondan de modo satisfactorio a la cues

166

La conciencia global medioambiental


inducir a esfuerzos mayores en vistas
a obtener procesos industriales limpios.
La biotecnologa es una tecnologa de
capacitacin (enabling technologl fuerte

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El mafz es la materia prima regenerable nmero


uno, especialmente en Amrica.

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE -

La comunicacin y la formacin sern

necesarias para alcanzar la penetracin de


la biotecnologa para productos y procesos
limpios en diversos sectores industriales.
Biotecnologa y blocat!llsis:
anlisis de la situacin en l+D
desde el punto de vista industrial

En el camino hada las estrategias de produc


dn sostenibles, la Industria qunlca debe
seguir desempeiando un papel dave y reaJlzar
un importante cambio estructural en el que se
obtengan ms y ms procesos biolgicos, e Ideas basadas en la concepcin "bio" en los esfuerzos de l+D. Esto se puede formular brevemente mediante la siguiente situacin de partida:

Un autobs que funciona con diese! de soja,


en una plantacin de soja.

Hay una enorme dilerencla entre la


percepcin y la valoracin de la Innova
cin en el sector de la blocatllsis
de la escuela superior y la Industria:
invencin (descubrimiento) no debe
confundirse con innovacin!
El "abismo" entre la Investigacin puramente acadmica y las necesidades industriales
reales se seguir agrandando en cuanto a
tendencias: el aumento de los conocimlen
tos no se traduce automticamente en nue
vas aplicaciones y soluciones de problemas.
Por parte de la escuela superior existe una
gran presin para publicar, unilateral, y se
da poca importancia a la puesta en prctica de los resultados en forma de aplicaciones innovadoras (por ejemplo en colabOradn con Ja industria o mediante sptn
ofM. Hay que reforzar los atractivos para
la puesta en prctica.

de la biotecnologa blanca, se pueden definir


los siguientes objetivos estratgicos:
La industria necesita urgentemente nuevos

tipos de biocatalizadores que catalicen nuevos tipos de reacciones (desconocidas hasta


ahora o biolgicamente no accesibles).
Las posibilidades que se obtienen a partir
de la enorme biodiversidad de los organis
mos vivos, todava no investigada slstemti
camente, deben utilizarse de forma ptima.
Se deben desarrollar mtodos de screening
rpidos y selectivos. Estos trabajos slo pue
den resolverlos conjuntamente la industria
y las escuelas superiores.
La mejora de los biocatalizadores ya cono

cldos mediante mtodos genticos, quml


coso ffsicos es, en algunos casos (aunque
ni mucho menos en todos), necesaria
y deseable. Aqu, en el sentido de la utili
zacin ptima de los recursos, deberla
tenerse ms cudado a la hora de elegir
los sistemas 'correctos", especialmente
en lo que respecta a las escuelas superiores. Para ello se necesita un dilogo ms
intenso con la industria.
Hay que comercializar lo ms rpidamen
te posible biocatalizadores3 nuevos y bien
caracterizados, con gran potencial de apli
cacin, e integrarlos en la investigacin
y desarrollo acadmicos e industriales
(l+D). Ejemplo negativo: las nitrilasas se
conocen desde hace ms de 20 afios, pero
hace muy poco tiempo que unas cuantas
compaas de enzimas las han empezado
a comercializar.

ero

<.:J

Bibliografa:
World Commission on Enviionment and Deve
lopment. Our Common Future (The Brundtland
Report), Oxford University Press, 1987.
2 The Application of Biotedlnology to Industrial
Sustainabillty, OECD 2001.
3 Oreste Ghlsalba (2000) Biocatalysed Reactions.
En: Gualtieri F (ed.) New Trends In Synthetic
Medicinal Chemisoy. Wiley-VCH, Weinheim.

Muy pocos esfuerzos de screeningpor


ambOs lados: se necesita urgentemente
aumentar la caja de herramientas
biocatalftica.
Para mejorar las futuras oportunidades
industriales de la biocatllsls, y con ello

Glucosa

El Profesor Dr. Oreste


Ghisalba, de Novartis
Pharma AG. Basilea, Suiza.

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Fig. 6.37 Las materias


primas regenerables se
emplean en una industria
sostenible. Aqu se representa la molcula ramificada del
almidn. Mediante las amila
sas (cap. 3) puede descomponerse en azcares sencillos que posteriormente fermentan de forma alcohlica.

167

BIOTECNOLOGA

Fig. 6.38 La materia prima


Biopof& es biodegradable.

conservar el aroma de los alimentos envasados durante ms tiempo. Biolgicamente hablando, tambin
son fcilmente degradables los productos derivados
del polihidroxibutirato (PHB). El PHB tiene propie
dades como el polipropileno, el cual conocemos por
los artculos de plstico de uso cotidiano. Al contrario
que este derivado del petrleo, el PHB se produce
a partir de azcar por las bacterias Alcaligenes eutro
phus (Fig. 6.33). El PHB sirve a las bacterias de sustancia acumuladora de energa. Las bacterias estn
compuestas en gran parte de plstico.
La nueva sustancia bioplstica la desarrollaron ori
ginalmente los biotecnlogos de Ja compafifa brit
nica ICI, y la comercializa con el nombre de Biopolla filial de ICI Marlborough Biopolymers Ltd.
de Cleveland (Gran Bretaa) (Fig. 6.38). El PHB
obtenido a partir de Alcaligenes result ser un termoplstico muy cristalino, con un punto de fusin
de 180 C. En la fase de pruebas se fabricaron moldes, lminas y fibras de PHB. Demostr tener buenas cualidades como material de envasado, pero no
era superior al polipropileno-til, pero no especial
mente atractivo para los tcnicos.

Fig. 6.39 Productos biode


gradables en Japn: vajilla
que se autodescompone,
mochila de polilactato (PLA).
pajitas para beber y bolsa
para residuos biolgicos.

Fig. 6.40 Un "CD vegetal


biodegradable (arriba)
y el ciclo de los bioplsticos
representado en un pster
japons (abajo).

168

El cambio profundo se produjo cuando se logr


producir con bacterias, adems del componente
3-hidroxibutirato, el 3-hidroxipentanato. Cuando
a partir de ambos componentes se polimeriza el
Bopo~ aparece un polmero que es bastante ms
elstico y ms duro, y tiene un punto de fusin de
135 C. Adems, el Bopol" es piezoelctrico, es
decir, que cuando sus cristales se deforman se produ
ce una carga elctrica mediante tensin de corte en
la superficie. Por tanto, el bioplstico tambin podra
utilizarse para sondas de medicin de presin.
La biodegradabilidad convierte al Biopo~ en un
material muy interesante para la medicina: en el futu
ro ya no se necesitar dar puntos de sutura despus
de las operaciones. En las cpsulas de Biopofi>se pueden introducir medicamentos para que se liberen en
el cuerpo durante largo tiempo. Asimismo, las sustan
cias nutritivas y los reguladores del crecimiento pueden dotarse de una envoltura de Biopo~, introducirlos en el suelo para la jardinera y la agricultura, y liberarlos lentamente al ambiente con la disgregacin
microbiana. Esto no es nada extrao: en su momen
to se aisl Alcaligenes {Ralstonia) eutrophus a partir
de pruebas en el suelo de la Llanura de Alemania del
Norte. En el suelo, los hongos, las bacterias y las enzi
mas extracelulares descomponen el Biopofi>en pocas
semanas o algunos meses. Sin embargo, el Biopofi>
an es demasiado caro para utilizarlo a gran escala.
Son interesantes los experimentos para producir
Biopofi>en plantas transgnicas (Cap. 7).

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Hay ms productos biotecnolgicos a la vista: los


hilos de seda de araa (Nephila) pueden ser tan
resistentes que en el Mar del Sur se utilizan para
pescar. Se pueden dilatar una tercera parte antes de
desgarrarse. En la actualidad se est intentando
fabricar esta protena, la espid.rona, mediante
manipulacin gentica en E. coli o incluso en las
cabras {como BioStee~, de la empresa estadouni
dense Nexia) de forma recombinada.
Aqul que en Japn reciba una factura telefnica de
la compaa NTT DoCoMo estar beneficiando al
medio ambiente: la ventanilla del sobre no empez
su vida en un pozo de petrleo sino en un campo de
maz. Est hecha de polilactato (cido polilctico,
APL). En el polilactato, el lactato [la sal del cido lctico, Cap. 2) est unido formando una cadena.
Se obtiene por fermentacin microbiana a partir del
almidn de maz (Figs. 6.39 y 6.40).
Desde 2002, en Nebraska (Estados Unidos) existe
una instalacin de McCargill-Dow que puede pro
ducir anualmente 140 000 toneladas de APL, co
mercializado con el nombre de Nature Works. Una
empresa japonesa fabrica lminas transparentes a
partir de ste. Para fabricar una hoja DIN A4 se
necesitan unos diez granos de maz.
Toyota ha comunicado recientemente que fabrica
las envolturas de las ruedas de recambio y las este
rillas con APL; Sanyo entra en el mercado con un
"CD vegetal" de APL (Fig. 6.40).
Algunos tiraran su ordenador a la basura en un ataque de clera, pero no se "eliminara" en mucho
tiempo - la eliminacin de aparatos y materiales
cada vez causa ms quebraderos de cabeza. La
empresa informtica Fujitsu tiene previsto ofrecer
un Veggie-Notebook-Computercuya carcasa pueda
convertirse en compost!
Uno de los inconvenientes an sigue siendo la sensibilidad del material al calor y tambin su precio.
A60 C, el APL se reblandece. Se estn desarrollando bolsas de t y contenedores de alimentos biode
gradables. Sin embargo, a 500 yens (unos 5 euros),
un kilo de plstico biolgico sigue siendo tres veces
ms caro que el plstico producido a partir del petrleo. Esto debera cambiar cuando exista una demanda masiva de productos de APL.
Cuando, en un futuro, los restos de plstico de nues
tro entorno realmente se "disuelvan satisfactoriamente", esto ser un logro de los nuevos bioproductos. En
ese momento se habra eliminado el camino de una
direccin (materia prima-producto-residuo) a favor
de los circuitos naturales. La tcnica gentica "ver
de" tambin est trabaando en este sentido.

BIOTECNOLOGA DEL MEDIO AMBIENTE -

Bibliografa utilizada y aplicada


Diccionario amplio de medio ambiente:
Rompp-Umweltlexikon en CD-ROM (1995) Thieme, Stuttgart.

Ocho preguntas
de autoevaluacin

Todava la mejor introduccin a la biotecnologa medioambiental:


UmweltBiotechnologie:
Dellweg H (1994) Biotechnologie verstandlich. Springer, Berlin, Heidelberg,
NewYork.

1. Por qu debe bombearse

Un buen libro bsico, tambin para la tecnologa del medio ambiente:


Leuchtenberger A (1998) Grundwissen zur mikrobiellen Biotechnologie.
BG Teubner, Stuttgart, Leipzig.

2. Qu significa un DB05 de 900


mg/L en una muestra de aguas
residuales? Et oxgeno de cuntos
litros de agua limpia a 20 C se
necesitara para depurar un solo
litro de estas aguas residuales?

Fcilmente legible sobre "biorremediacin":


Thieman WJ, Palladino MA (2004) lntroduction to Biotechnology.
Pearson/Benjamin Cummings, San Francisco.
Un captulo hermoso sobre microbiologa del medio ambiente en el libro
de microbiologa probablemente mejor ilustrado:
McKane L, Kandel J (1996) Microbiology. Essentials and applications. 2nd
edition, McGraw-Hill lnc., New York.
Historia de los campos de aguas residuales de Berln:
Meinicke I, Bernitz HM (1996) Der Gemsegarten Berlins - Bilder einer
Ausstellung. Ausstellungskatalog, Rangsdorf.
Una buena introduccin a la hidrobiologa:
Kalbe L (1985) Leben im Wassertropfen. Urania-Verlag, Leipzig.

adicionalmente oxgeno en las


instalaciones de depuracin
biolgica?

3. Wnde es verdaderamente
adecuado utilizar el blogs?
4. para qu obtuvo Ananda
Chakrabarty una patente estado
unidense? Qu haba obtenido
experimentalmente y por qu la
patente signific una innovacin?

Un compendio acadmico:
Alexander M (1999) Biodegradation and Bioremediation. Academic Press,
NewYork.

5. Por qu motivo la madera es


un material de construccin tan
apreciado? contra qu hay que
protegerla?

Dos thri/lers medioambientales recomendados:


Kegel B (2001) Sexy Sons. Fischer, Frankfurt a.M.
Schatzing F (2004) Der Schwarm. Kiepenheuer und Witsch, Kiln.

6. Qu ventajas tienen los coches


de etanol en Brasilia y qu desven
tajas?

Artculo clsico sobre bioprospeccin de minas:


Brierly CL (1984) Bakterien als Helfer im Bergbau. In: lndustrielle Mikrobio
logie (Gruss P, Hrsg.) Spektrum derWissenschaft Reader.

Enlaces de web
Enlaces sobre biotecnologa del medio ambiente:

www.i-s-b.org/wissen/umwelt.htm
Punto de transferencia de tecnologa medioambiental:

www.ruhr-unibochum.de/tsubt/

7. Qu ser vivo produce la mayor


parte del carburante domstico
metano en la Tierra?
8. Qu producto biodegradable pro
cedente de las materias primas
regenerables tiene en la actuali
dad ms posibilidades en los pro
duetos textiles y el plstico dese
cha ble?

Todo sobre la catstrofe del petrolero Exxon Valdez:

www.evostc.state.ak.us/
Zoo fotogrfico de microbios para el medio ambiente:

www.commtechlab.msu.edu/sites/dlcme/zoo/zamain.html
"Las formas artificiales de la naturaleza" de Ernst Haeckel - un placer
cientfico y artstico en la pgina web del Dr. Stber del MPI para
la investigacin de cultivos, Colonia:

http://caliban.mpizkoeln.mpg.de/-stueber/haeckel/kunstformen/
natur.html
Una galera fotogrfica de productos biodegradables:

www.ibaw.orgfeng/seiten/markets_products.html

www.FreeLibros.me

169

BIOTECNOLOGA VERDE

7.1 Los microbios son


comestibles 172

7.6 El campo en un tubo de ensayo:


cultivo de plantas in vitro 178

7.2 Algas y cianoba