Ing.

De las Rx Qumicas
AO DE LA DIVERSIFICACION PRODUCTIVA Y FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACION

UNIVERSIDAD NACIONAL

DEL CENTRO
DEL PER
FACULTAD DE INGENIERA QUMICA
ESCUELA ACADMICA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

INDUSTRIAL

CINETICA ENZIMATICA Y MICROBIANA

CATEDRTICO
CTEDRA

Ms. HUGO SUASNABAR BUENDIA

INENIERIA DE LAS REACCIONES

QUIMICAS

INTEGRANTE :

ESPINOZA HUAMAN, SAUL

VII SEMESTRE

Huancayo Per
2015
1

Ing. De las Rx Qumicas

INTRODUCCIN
Para poder analizar y saber de qu se hablara a lo largo de este documento se
darn a conocer algunos de los conceptos bsicos que se manejaran y sus
significados.
La Cintica es la parte de la Mecnica encargada de definir y calcular los atributos
cinticos de un sistema material arbitrario X en un movimiento dado.
Recalcar el hecho de que no existe ninguna restriccin sobre el tipo de
movimiento, y eso incluye al referente del mismo, hasta el punto de que ser
habitual usar un movimiento genrico que satisfaga las ligaduras geomtricas. El
movimiento real que tenga el sistema vendr determinado a posteriori por las
ecuaciones generales de la Dinmica.
Con el movimiento, adems de las magnitudes de la geometra de masas,
hacemos intervenir el tiempo, por lo que ya tenemos las tres magnitudes
fundamentales de la Dinmica: masa, longitud y tiempo.
Los atributos cinticos de inters van a ser: Cantidad de movimiento, Momento
cintico y Energa cintica.
La cintica qumica es la parte de la qumica que trata de la velocidad con que
suceden las reacciones, de los factores que influyen en ella y del mecanismo a
travs del cual los reactivos se transforman en productos.
Velocidad de reaccin: representa la rapidez con que tiene lugar la transformacin
qumica de unas sustancias, los reactivos, en otras distintas, los productos.
Velocidad media de una reaccin se mide a partir de la disminucin de la
concentracin de un reactivo o el aumento de la concentracin de un producto en
un intervalo de tiempo.
La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms
utilizadas por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es necesario
conocer los diferentes mecanismos, sus formas de aplicacin, ventajas y
1

Ing. De las Rx Qumicas

desventajas de los diferentes mtodos, y sobre todo el monto econmico de cada

uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una
informacin general acerca de los
Diferentes mecanismos de reproduccin bacteriana, as como de dar una idea
acerca de la utilizacin de los mismos, sus caractersticas, especificaciones, y un
anlisis de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
Las enzimas son protenas (RNA) que catalizan reacciones qumicas en las
clulas. Cada enzima es altamente especfica para la reaccin que cataliza.

2. CATALISIS ENZIMATICA
Existen molculas biolgicas capaces de aumentar bastante la velocidad de
reacciones qumicas, i.e., son los llamados catalizadores. Estas molculas son
genricamente denominadas enzimas y son (en casi su totalidad) protenas. Las
enzimas no proteicas conocidas son constituidas por RNA. Las enzimas son
altamente especficas: cada enzima apenas reacciona con un conjunto muy
restringido de molculas (sus sustratos). Las enzimas no alteran el equilibrio
qumico de las reacciones catalizadas, apenas disminuyen su energa de
activacin.

El mecanismo ms simple para explicar la accin enzimtica es el modelo de

Michaelis-Menten:
E +S <-> ES -> E + P
2

Ing. De las Rx Qumicas

En este modelo la enzima (E) se liga al sustrato (S) para formar un complejo
enzima-sustrato (ES). Este puede separarse nuevamente en enzima y sustrato
libre o transformar el sustrato en producto (P). Como en cualquier reaccin
elemental (i.e. una reaccin que ocurre por simple colisin entre reactivos), la
velocidad de cada paso ser proporcional a la concentracin de los reactivos de
ese paso. En cada caso, la constante de proporcionalidad ser una funcin de la
energa de activacin de ese paso.

En la mayor parte de las enzimas se verifica que el equilibrio E +S <-> ES se

alcanza muy rpidamente (en pocas decenas de milisegundos). Una vez
alcanzado el equilibrio, la concentracin de ES se mantiene constante, una vez
que siempre que un complejo ES se disocia en producto y enzima libre, esta se
liga muy rpidamente a una nueva molcula de sustrato regenerando el complejo
ES. En estas condiciones es obvio que la velocidad de degradacin ES es igual a
la velocidad de su formacin o sea:
En principio, no nos es dado saber en cada momento cual ser la concentracin
de enzima que se encuentra libre o bajo la forma de complejo enzima sustrato. Sin
embargo, sabemos que la suma de las dos concentraciones debe igualar la
concentracin de enzima total (Et). Sustituyndola en (1)

Ing. De las Rx Qumicas

Si el paso limitante de la reaccin fuese la transformacin del complejo ES en

enzima libre y producto, la velocidad de reaccin enzimtica ser:

La expresin puede ser simplificada si juntamos todas las constantes presentes e

el denominador en una nueva constante:

Ing. De las Rx Qumicas

, que es conocida como constante de Michaelis.

Cuando

que es tambin la constante de

disociacin del complejo ES. Km es por tanto una medida de la estabilidad del
complejo enzima-sustrato. Substituyendo en la expresin (2), esta toma as la
forma:

Cuando

, que es por tanto la velocidad mxima de reaccin enzimtica. Sustituyendo

nuevamente se obtiene la forma familiar de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Ing. De las Rx Qumicas

La representacin grfica de la velocidad de reaccin en funcin de la

concentracin de sustrato es por tanto una hiprbola, que se representa debajo.
La asntota horizontal corresponde a vmax. El valor de Km tambin puede ser
obtenido a travs del grfico, una vez que cuando la [S]=KM , la ecuacin de
Michaelis-Menten prev que la velocidad sea

La constante de Michaelis Menten es por tanto la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de la
reaccin es la mitad de la velocidad mxima.

2.1. EL EFECTO DE INHIBIDORES COMPETITIVOS EN LA ACTIVIDAD

ENZIMTICA

Ing. De las Rx Qumicas

Un inhibidor competitivo de una enzima es una molcula

capaz de enlazarse a la enzima e impedir el enlace de la misma al sustrato
Para que esto suceda es necesario que el inhibidor se enlace al lugar de la enzima
normalmente ocupado por el sustrato (este lugar se denomina centro activo), lo
que obviamente solo es posible cuando el inhibidor tiene una estructura qumica
bastante semejante a la del sustrato.
Aplicando un tratamiento matemtico anlogo al utilizado anteriormente, se prueba
que en la presencia de un inhibidor competitivo, la velocidad de la reaccin
enzimtica es dada por:

La comparacin de esta ecuacin con la ecuacin de Michaelis-Menten muestra

que: en la presencia de un inhibidor competitivo, la velocidad de reaccin es
inferior a la de la reaccin no inhibida (de ah el nombre de inhibidor).
La concentracin de sustrato para la cual la velocidad es mitad de la velocidad
mxima
Es:

Este valor (llammosle KM aparente) es siempre superior al valor de K M en la

ausencia del inhibidor.

Cuando

, la velocidad de reaccin se aproxima asintoticamente

del vmax, tal como en la reaccin no inhibida.

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Ing. De las Rx Qumicas

2.2 EL EFECTO DE INHIBIDORES NO COMPETITIVOS EN LA ACTIVIDAD

ENZIMTICA
Un inhibidor no competitivo de una reaccin enzimtica a una sustancia que se
enlaza a la enzima en un lugar diferente del centro activo y que, mas all de que
no impide el enlace del sustrato al centro activo, impide su transformacin en
producto: la reaccin solo puede ocurrir luego que el sustrato se desenlace de la
enzima.

Aplicando un tratamiento matemtico anlogo al utilizado

anteriormente, se prueba que en la presencia de un inhibidor no competitivo, la
velocidad de reaccin enzimtica esta dada por:

La comparacin de esta ecuacin con la ecuacin de Michaelis-Menten muestra

que: en la presencia de un inhibidor no competitivo, la velocidad de reaccin es
inferior a la de la reaccin no inhibida (de ah el nombre de inhibidor)
8

Ing. De las Rx Qumicas

La concentracin de sustrato para la cual la velocidad es mitad de la velocidad

mxima es igual a la observada en ausencia de inhibidor.

Cuando

, la velocidad de la reaccin se aproxima asintticamente

de

, que es siempre inferior al de la reaccin no inhibida.

3. CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS

En funcin de su accin cataltica especfica, las enzimas se clasifican en 6
grandes grupos o clases:

Clase 1: OXIDORREDUCTASAS
Clase 2: TRANSFERASAS
Clase 3: HIDROLASAS
Clase 4: LIASAS
Clase 5: ISOMERASAS
Clase 6: LIGASAS
3.1.- OXIDORREDUCTASAS.Catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir, transferencia de hidrgeno (H)
o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la reaccin general:
AH2 + B
Ared + Box

A + BH2
Aox + Bred

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Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.

3.2.-TRANSFERASAS
Catalizan la transferencia de un grupo qumico (distinto del hidrgeno) de un
sustrato a otro, segn la reaccin:
A-B + C

A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reaccin representada en la Figura

de la derecha:
glucosa + ATP

ADP + glucosa-6-fosfato

3.3.- HIDROLASAS

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Catalizan las reacciones de hidrlisis:

A-B + H2O

AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin:

lactosa + agua

glucosa + galactosa

3.4.- LIASAS
Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

A-B

A+ B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reaccin:

cido acetactico

CO2 + acetona

3.5.- ISOMERASAS
Catalizan la interconversin de ismeros:

Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa isomerasa, que catalizan

las reacciones representadas en la tabla inferior:

fosfotriosa isomerasa
gliceraldehdo-3-fosfato

fosfoglucosa isomerasa

glucosa-6dihidroxiacetona-fosfato
fosfato

fructosa-6fosfato

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3.6.- LIGASAS
Catalizan la unin de dos sustratos con hidrlisis simultnea de un nucletido
trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP

A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reaccin:

piruvato + CO2 + ATP

oxaloacetato + ADP + Pi

4. CINETICA DE REACCIONES ENZIMATICAS

4.1.-EACCIONES CON UN SUSTRATO

Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas,
tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas
intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.6 Sin
embargo, existen ciertas reacciones enzimticas de nico sustrato que no
pertenecen a esta categora de mecanismos, como es el caso de la reaccin
catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una molcula de
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Ing. De las Rx Qumicas

perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar

el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de
sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un
intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en
la categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms
adelante.
4.2.-CINTICA DE MICHAELIS-MENTEN
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de
catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la
concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a una
determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la
reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S],
como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la
enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no
sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S].
El modelo de cintica michaeliana para una reaccin de nico sustrato se puede
ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica
bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose el complejo enzimasustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular
ES \rightarrow E + P puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimtica
limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica
nica cuya constante es k2.
A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio
constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la
[S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de
la reaccin hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reaccin depende de la
[ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas
[S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas
condiciones, la velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible

13

Ing. De las Rx Qumicas

a pequeos cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima

([E]tot) es aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:
.(3)

Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como
evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin.

La ecuacin de Michaelis-Menten describe cmo la velocidad de la reaccin

depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud
Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1(aproximacin del
equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuacin:

(Ecuacin 4)
Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas de
sustrato nico.
La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la
velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la V max. Esto puede verificarse
14

Ing. De las Rx Qumicas

sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la

etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la
disociacin

de

sustrato

(k2 <<< k1),

la

constante

de

Michaelis Km ser

aproximadamente la constante dedisociacin del complejo ES, aunque sea una

situacin relativamente rara.
La situacin ms comn, donde k2 > k1, es denominada cintica de BriggsHaldane.8 La ecuacin de Michaelis-Menten an se mantiene bajo estas
condiciones ms generales, como puede derivarse de la aproximacin del estado
estacionario. Durante el perodo inicial, la velocidad de la reaccin es ms o
menos constante, indicando que la [ES] tambin se mantendr constante:

De esta forma, la concentracin de ES viene dada por la siguiente expresin:

donde la constante de Michaelis Km se define as:

Con lo cual, despus de operar todos los factores, obtenemos una

frmula general para la velocidad de la reaccin que coincide con la
ecuacin de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que

una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la
definicin de la constante de Michaelis Km, la ecuacin de MichaelisMenten podra escribirse de la siguiente forma:

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Ing. De las Rx Qumicas

donde [E] es la concentracin de enzima libre. As, la constante de especificidad

se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que
reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida
por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solucin,
y ronda aproximadamente un valor de 1010 M-1 s-1 a 25 C.

4.2.1.-REPRESENTACIN DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN

La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a

bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida
que aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores,
que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser
realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales.
Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en
desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como
resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el
siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de
Virginia , se puede simular el comportamiento de una enzima variando las
constantes cinticas.
La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma
ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores
inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede
apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representacin es
una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la
recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/V max, y el punto de corte entre la recta
y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

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Ing. De las Rx Qumicas

La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes
de coordenadas, y el gradiente de la velocidad.

4.3.-REACCIONES MULTISUSTRATO
4.3.1.-MECANISMO DE COMPLEJO TERNARIO

Mecanismo de complejo ternario al azar para una reaccin enzimtica. La enzima

E une los sustratos A y B y libera los productos P y Q en un orden no definido.
Las enzimas (E) que presentan este mecanismo de reaccin unen al mismo
tiempo los dos sustratos (A y B), dando lugar a un complejo ternario EAB. El orden
secuencial de unin de los sustratos puede ser al azar (mecanismo al azar) o
seguir un orden en particular (mecanismo ordenado). Si fijamos la concentracin
del sustrato A y variamos la de B, y representamos grficamente el
17

Ing. De las Rx Qumicas

comportamiento de la enzima mediante un diagrama de Lineweaver-Burke,

obtendremos una serie de rectas con un punto de interseccin comn a todas
ellas.
Entre las enzimas que presentan este mecanismo podemos encontrar la glutation
S-transferasa,13 la dihidrofolato reductasa14 y la ADN polimerasa.15 Los siguientes
enlaces muestran animaciones del mecanismo de complejo ternario de la
dihidrofolato reductasa y de la ADN polimerasa .
4.3.2.-MECANISMO DE PING-PONG
Como se puede apreciar en la figura de la derecha, las enzimas con un
mecanismo de ping-pong pueden presentar dos estados, la conformacin normal
(E) y la conformacin modificada qumicamente (E*) o conformacin intermedia.
En este tipo de mecanismo, el sustrato A se une a la enzima E, que pasa a un
estado intermedio E*, por ejemplo, por transferencia de un grupo qumico al centro
activo de la enzima, pudiendo ya ser liberado en forma de producto P. nicamente
cuando el sustrato A ya ha sido liberado del centro activo de la enzima puede
unirse el sustrato B, que devuelve a la enzima modificada E* a su estado original
E, y liberarlo en forma de producto Q. Si fijamos la concentracin de A y variamos
la de B, y representamos grficamente una enzima con mecanismo de ping-pong
en un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas paralelas
entre s.

Mecanismo de ping-pong para una reaccin enzimtica. La unin de los sustratos

A y B tiene lugar en un orden definido y secuencial, por medio de un intermediario
enzimtico modificado, E*.
Entre

las

enzimas

con

este

tipo

de

mecanismo

podemos

encontrar

alguna oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa,16 transferasas, como

la acil-neuraminato citidil transferasa,17 y serin proteasas, como la tripsina y
18

Ing. De las Rx Qumicas

laquimiotripsina.18 Las serin-proteasas conforman una diversa familia de enzimas

muy comunes,

que

incluyen

enzimas

digestivas

(tripsina,

quimiotripsina

y elastasa), varias enzimas del proceso de coagulacin y muchas otras. En las

serin-proteasas, el estado intermedio E* es una especie acilada en una serina del
centro cataltico de la enzima. El siguiente enlace muestra una animacin del
mecanismo cataltico de la quimiotripsina .
4.3.3.-CINETICA NO MICHAELIANAS

Curva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica sigmoidea.

Algunas reacciones enzimticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser

representadas en una curva de saturacin, lo que suele indicar una unin
cooperativa del sustrato al centro cataltico de la enzima. Esto quiere decir que la
unin de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de sustrato
posteriores. Este comportamiento es el ms comn en las enzimas multimricas,
que presentan varias zonas de interaccin con el sustrato. 19 El mecanismo de
cooperacin es semejante al observado en la hemoglobina. La unin de una
molcula de sustrato a una de las zonas de interaccin altera significativamente la
afinidad por el sustrato de las dems zonas de interaccin. Las enzimas con este
tipo de comportamiento son denominadas alostricas. La cooperatividad positiva
19

Ing. De las Rx Qumicas

tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida incrementa la afinidad

del resto de zonas de interaccin. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene
lugar cuando la primera molcula de sustrato unida reduce la afinidad de la
enzima por nuevas molculas de sustrato.
Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato
transcarbamilasa bacteriana20 y

lafosfofructoquinasa,21 y

con

cooperatividad

negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mamferos.22

La cooperatividad es un fenmeno bastante comn y puede llegar a ser crucial en
la regulacin de la respuesta enzimtica a cambios en la concentracin de
sustrato. La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho ms sensible a
la concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran
medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentracin de sustrato.
Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a
pequeos cambios en la concentracin de sustrato.
La ecuacin de Hill23 suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado
de cooperatividad en cinticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n) indica
cuntas de las zonas de unin de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de
la unin del sustrato en el resto de las zonas de unin. El coeficiente de Hill puede
tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa.

n > 1: indica cooperatividad positiva.

5.-FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La eficacia de un enzima se mide por la velocidad de transformacin del sustrato
en producto. La actividad de las enzimas se ve afectada por diversos factores
entre los que destacan los siguientes:

20

Ing. De las Rx Qumicas

5.1.-CONCENTRACIN DEL SUSTRATO

En toda reaccin catalizada por un enzima, si se mantiene constante la
concentracin del E, la velocidad de la reaccin aumenta exponencialmente al
incrementarse la concentracin del sustrato, ya que al existir ms molculas de
sustrato es ms probable el encuentro con el enzima y la formacin del complejo
E-S.
Este aumento de velocidad es rpido para concentraciones bajas de sustrato y, a
medida que este aumenta, se va haciendo ms lento hasta que la concentracin
del sustrato alcanza un cierto valor, a partir del cual, aunque aumente la
concentracin del mismo, no aumenta la velocidad de la reaccin. Esto es debido
a que el enzima esta saturada por el sustrato; es decir, todas las molculas del
enzima estn unidas al sustrato formando el complejo E-S. Cuando ocurre esto, se
dice que la reaccin
Donde:
V es la velocidad de la reaccin para una determinada concentracin de sustrato.
Vmax es la velocidad mxima de la reaccin.
[S] es la concentracin del sustrato.
Km

es

una

constante

denominada

constante

de

Michaelis-Menten,

es

caracterstica de cada enzima.Si en la ecuacin (1) hacemos V = Vmax y

despejamos Km obtenemos que Km = [S]
Km. Se puede definir como la concentracin de sustrato necesario para que la
velocidad de la reaccin sea la mitad de la velocidad mxima. Se mide en
unidades de concentracin. La Km nos indica la afinidad de un enzima por su
sustrato:

21

Ing. De las Rx Qumicas

Si Km es alta indica que el enzima tiene poca afinidad por el sustrato ya que se
necesita una concentracin de sustrato elevada para alcanzar la mitad de la
velocidad mxima.
Si Km es baja indica que el enzima tiene mucha afinidad por el sustrato ya que se
necesita una concentracin de sustrato baja para alcanzar la mitad de la velocidad
mxima.

5.2.-TEMPERATURA
La T influye en la actividad enzimatica. En general por cada 10C que aumente la
temperatura la velocidad de la reaccin aumenta de 2 a 4 veces. Esta regla se
cumple hasta que la temperatura alcanza un valor mximo (T ptima) donde la
actividad es mxima. Esto se debe a que al aumentar la T aumenta el movimiento
de las molculas y, por tanto aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el
E.
Si la T aumenta por encima de la T ptima, disminuye e incluso cesa la actividad
enzimtica debido a que la enzima se desnaturaliza.
Cada enzima posee una T ptima, en las enzimas humanas suele estar alrededor
de 37C. Los animales poiquilotermos debido a que carecen de mecanismos para
regular la T corporal, se ven obligados a hibernar en la estacin fra pues la
actividad de sus enzimas debido a las bajas temperaturas es muy baja.

5.3.-pH
El pH es otro factor que influye en la actividad enzimtica, debido a que el pH
influye en la ionizacin de los grupos funcionales de los aminocidos que forman
la protena enzimtica. Cada enzima realiza su accin dentro de un determinado
intervalo de pH, dentro de este intervalo habr un pH ptimo donde la actividad
enzimatica ser mxima. Por debajo del pH minimo o por encima del pH mximo
22

Ing. De las Rx Qumicas

el enzima se inactiva ya que se desnaturaliza. En la mayora de las enzimas el pH

ptimo esta prximo a la neutralidad, aunque hay excepciones.

Inhibidores:
Son compuestos qumicos que se unen al enzima, en distintos puntos del mismo y
disminuyen o incluso impiden su actividad. Estos compuestos pueden ser de
distintos tipos: iones, molculas orgnicas y a veces el producto final de la
reaccin. A la accin que realizan se la denomina inhibicin. La inhibicin puede
ser:
Inhibicin irreversible: Cuando el inhibidor impide permanentemente la actividad
enzimtica, bien porque se une de forma permanente con grupos funcionales
importantes del centro activo o bien porque altera su estructura. A estos
inhibidores se les denomina venenos y a la inhibicin que realizan se la denomina
envenenamiento del enzima. Ej. La penicilina que inhibe las enzimas que
sintetizan la pared bacteriana. El in cianuro acta sobre la citocromo oxidasa
(enzima respiratorio).
Inhibicin reversible: El inhibidor se une al enzima de forma temporal mediante
enlaces dbiles e impide el normal funcionamiento del mism, pero no la inutiliza
permanentemente.
Puede ser de dos tipos:

Competitiva: El inhibidor es similar al sustrato y se puede unir al centro

activo del enzima impidiendo que lo haga el sustrato. Es decir ambos,
inhibidor y sustrato compiten por unirse al centro activo del enzima. La
accin suele anularse aumentando la concentracin del sustrato

No competitiva: El inhibidor no compite con el sustrato, puede actuar de 2

formas:
23

Ing. De las Rx Qumicas

-Sobre el enzima, unindose a el en un lugar diferente al centro activo y

modificando su estructura lo que dificulta que el enzima se pueda unir
con el sustrato.
-Sobre el complejo E-S unindose a l y dificultando su desintegracin y
por lo tanto la formacin de los productos.
6.- CINETICA MICROBIANA
6.1. CRECIMIENTO MICROBIANO.
Entendemos

por crecimiento

microbiano el

aumento

del

nmero

de

microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento

de un nico microorganismo (ciclo celular), sino al demogrfico. El crecimiento de
una poblacin es el aumento del nmero de clulas como consecuencia de un
crecimiento individual y posterior divisin

6. 1.1. CICLO CELULAR

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado
van utilizando los nutrientes que tienen disponibles, sintetizando sus propios comp
onentes celulares y dividindose en cuanto duplican su masa y su material
gentico. El tiempo que tarda una clula en cumplir ese proceso se denomina
tiempo de generacin () y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones
ptimas hasta varios meses en condiciones ambientales. Cada vez que transcurre
un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un
incremento exponencial.
24

Ing. De las Rx Qumicas

6.2.

CINTICA

DE

CRECIMIENTO

DE

UN

CULTIVO

DISCONTINUO.

PARMETROS.
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de
microorganismos que crecen aislados que no forman ningn tipo de estructura.
Esta es la forma de crecimiento de las levaduras (hongo unicelular) y bacterias.
Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos para
predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el
substrato y cmo se van a ir acumulando los productos del cultivo. Conociendo
estos factores es posible iniciar el cultivo a mayores escalas.
6.2.1 TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIN GEOMTRICA
Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de
individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de
generacin(). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al
cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente:
N = N0 2g (ecuacin 1)
siendo N0 el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de
generaciones se puede calcular de la siguiente forma:
g = t / (ecuacin 2)
donde t es el tiempo transcurrido.
Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2:

N = N0 2t/ (ecuacin 3)
Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello
es mejor transformarlas en otras ms simples. Para transformar una ecuacin
exponencial en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:
lnN = lnN0 + (t/) ln2 (ecuacin 4)
logN = log N0 + (t/) log2

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Ing. De las Rx Qumicas

El logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn

de una constante igual a ln2/. Si el tiempo de generacin es muy grande, el
crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si es pequeo el crecimiento
ser rpido. En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento
(nmero de clulas, biomasa de cultivo, acumulacin de metabolitos primarios,
protenas, cidos nucleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuacin
anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

6.3.- CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO

Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas

que se producen en cada divisin forman una suspensin de clulas libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento
microbiano (Fig. 2):
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo). En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas,
pero hay gran actividad metablica, aumento en el tamao individual de las
clulas, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas.

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Ing. De las Rx Qumicas

2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es

mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias
consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero
de clulas durante esta fase se explica con los modelos matemticos descritos
anteriormente.
Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio
de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de
latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad.
3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la
masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan
un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una
acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener
importancia industrial.

Fig. 2. Fases del crecimiento microbiano

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente
esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la
fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento
microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente
represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos
en los ambientes naturales.
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Ing. De las Rx Qumicas

4.- Fase de muerte: Si la incubacin contina despus de que una poblacin

microbiana alcanza la fase estacionaria, las clulas pueden seguir vivas y
continuar metabolizando, pero va a comenzar una disminucin progresiva en el
nmero de clulas viables y cuando esto ocurre se dice que la poblacin ha
entrado en fase de muerte.

6.4. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO

Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los
cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de
crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de
clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido,
el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente,
se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y
aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas
da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nmero
inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las
colonias da lugar a lo que se llama un csped cuando se realizan los cultivos en
placas de laboratorio.
En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos
filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas
sino formaciones ms difusas o miceliares.

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