CURVA DE TITULACIN DE AMINOACIDOS Y SEPARACIN DE

AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

TITRATION CURVE OF AMINO ACIDS AND AMINO
ACIDS SEPARATION THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
Guzmn C, C.
Corporacin tecnolgica de Bogot. Tecnologa en qumica industrial
Bogot, Colombia
10/09/2015

RESUMEN
La curva de titulacin de un aminocido se
da por una titulacin potenciomtrica de un
aminocido partiendo de un pH muy acido
hasta un pH muy bsico, aumentando el pH
por el constante aumento de iones OH provenientes del agente titulante, en este
caso NaOH. El pH de inicio para la
titulacin de la glicina es de 1,50 y se debe
llevar hasta un pH de 12,0 donde se deben
ir tomando valores de pH cada 0,5ml de
NaOH.
La cromatografa en capa fina es una
tcnica analtica utilizada para separar
molculas relativamente pequeas. En esta
prctica se utiliz esta tcnica para analizar
aminocidos
como:
Lisina,
cido
glutmico, Fenilalanina, glicina, adems de
estos aminocidos tambin se analiz
aspartame en agua y en HNO3 y una bebida
comercial; para realizar este proceso, se
traz una lnea de 5 mm a lo ancho de la
placa
medidos
desde
su
base,
posteriormente se sembraron las diferentes
muestras, luego de esto se coloc la placa
en la cmara cromatogrfica hasta que la
fase mvil recorri est a 5 mm del borde
superior, la placa se sac se dej secar sobre
una plancha de calentamiento y sobre ella
se agreg ninhidrina 0.2% el cual funciona
como agente revelador para lograr calcular
cada Rf respecto a cada una de las marcas.
Segn los resultados obtenidos se hace una
comparacin entre los factores de retencin
experimentales con los tericos y se
observa una variacin significativa,
atribuida a factores como el tiempo que

permaneci la placa en la cmara y a la fase

mvil utilizada.
Palabras clave: Titulacin potenciomtrica,
cromatografa, aminocidos, factor de
retencin, fase mvil, fase estacionaria.
ABSTRACT
The titration curve of an amino acid is
given by a potentiometric titration of an
amino acid starting from a very acidic pH
to a very basic pH, increasing the pH by the
steady increase in OH- ions from the titrant,
in this case NaOH. The pH titration start for
glycine is 1.50 and should lead to a pH of
12.0 where they should be taking pH values
every 0.5 ml NaOH.
The thin layer chromatography is an
analytical technique used to separate
relatively small molecules. This technique
is used in practice to analyze amino acids
such
as
lysine,
glutamic
acid,
phenylalanine, glycine, aspartame plus
these amino acids was also tested in water
and HNO3 and a commercial beverage; for
this process, a line of 5 mm was drawn
across the width of the measured plate from
the ground, then the different samples, after
this the plate was placed on the
chromatographic chamber until the mobile
phase toured planted is 5 mm of the top, the
plate was removed allowed to dry on a hot
plate and 0.2% ninhydrin on it which
functions as developing agent to achieve
calculate each Rf respect to each of the
marks are added. According to the results a
comparison between experimental factors
with the theoretical retention is made and
significant variation, attributed to factors

such as the time he spent in the chamber

plate and the mobile phase used is
observed.
Keywords:
potentiometric
titration,
chromatography, amino acids, retention
factor, the mobile phase, stationary phase.

protenas y la caracterizacin de
aminocidos, por lo cual se desarroll esta
tcnica para la prctica realizada en el
laboratorio.

INTRODUCCIN

MATERIALES Y MTODOS

Las titulaciones potenciomtricas son

mtodos donde el punto final no se puede
determinar,
por
ello
se
emplean
instrumentos como el pH-metro el cual
ayudara a llegar al lmite mximo de pH al
que debe llegar el analito. Este tipo de
mtodos son muy exactos y a esto se debe
su alta aplicabilidad. Dichas titulaciones
pueden darse de dos modos cido base y
base cido.
La cromatografa ha sido utilizada como
herramienta en la separacin de especies
qumicas estrechamente relacionadas en
mezclas complejas, este mtodo de
separacin tiene diferentes tcnicas que
varan dependiendo de la mezcla que se
posea si son gases o lquidos. Para este caso
en particular se utiliz la tcnica de
cromatografa en capa fina que bsicamente
permite comparar muestras y realizar el
seguimiento de la reaccin. Esta se basa en
separar componentes por diferencia de
solubilidad entre dos sistemas disolventes.
El movimiento de las molculas a lo largo
del sistema es el resultado del equilibrio
entre las fuerzas ejercidas por la fase mvil
(transmisin o arrastre) a lo largo de su
desplazamiento sobre la fase estacionaria.
(Jorrn Novo & Abril Daz, sf)
Las mezclas de aminocidos pueden
separarse
utilizando
esta
tcnica
cromatogrfica siendo su fase mvil
Butanol: agua: cido actico y utilizando
una solucin reveladora de ninhidrina. Los
aminocidos aparecen como manchas
prpuras sobre un fondo tenuemente
amarillo.
Aminocidos que tengan un carcter apolar,
tendrn la tendencia de desplazarse junto
con la fase mvil, mientras que los
aminocidos polares sern retenidos por la
fase estacionaria. (Gutirrez Venegas, sf)
Este mtodo es muy utilizado para
determinar la composicin de algunas

Materiales
Capilar
Es un tubo de vidrio de dimetro muy
pequeo y corta longitud.
Tubos
de
ensayo
Forma parte del material de vidrio de
un
laboratorio
qumico.
Este
instrumento permite la preparacin de
soluciones.
Placa de slica
Capa delgada de un adsorbente (como
por ejemplo gel de slice, almina o
celulosa) depositada sobre un soporte
plano como una placa de vidrio, una
lmina de aluminio o de plstico.
Pipeta aforada de 5 mL
Permiten la transferencia de un
volumen generalmente no mayor a 20
ml de un recipiente a otro de forma
exacta.
Cmara Cromatogrfica
Recipiente que contiene la fase mvil o
lquida.
Vasos de precipitado de 50 mL
Recipientes de vidrio aunque pueden
ser metlicos o de plstico, son
cilndricos con un fondo plano y sirven
para preparar o calentar sustancias y
traspasar lquidos.
Vidrio de reloj
Es una lmina de vidrio en forma
circular cncava-convexa. Se utiliza
para evaporar lquidos, pesar productos
slidos o como cubierta de vasos de
precipitados, y contener sustancias
parcialmente corrosivas
Bureta 25ml: Se utiliza para realizar
titulaciones de todo tipo, en esta va el
agente titulante, el cual puede ser cido
o base.
Plancha de calentamiento
Es un pequeo aparato de sobremesa,
porttil y autnomo, que posee uno o
ms elementos de calefaccin elctrica,
y que se emplea para calentar

recipientes con lquidos, de forma

controlada.
Mtodos
Se emple el mtodo de una titulacin
potenciomtrica, donde el analito era el
aminocido glicina al cual se le da un
carcter cido por medio de HNO3 3M,
donde el analito deba tener un pH de 1,50.
Como agente titulante se utiliz KOH
0,25M el cual se iba agregando de a 0,5ml y
tomar la medida de pH respectiva, estos
valores fueron medidos al utilizar un pHmetro calibrado, donde la titulacin se
llevaba hasta llegar a un pH de 12.
Se utiliz el mtodo o tcnica de
cromatografa de capa fina en el que la fase

mvil fue butanol: cido actico: agua.

Sobre la placa se traz una lnea de 5 mm
respecto a la base y en ella se sembraron los
diferentes aminocidos. Posteriormente esta
placa se introdujo dentro de la cmara
cromatogrfica y se dej all hasta que la
fase mvil recorri la placa hasta
aproximadamente 5 mm de la parte superior
de esta. A continuacin la placa se dej
secar sobre la plancha de calentamiento
hasta que desapareci la humedad de la
placa, luego de esto se adicion ninhidrina
que revel las manchas en la placa.
RESULTADOS Y DISCUSIN

Curva de titulacin Glicina

14
12
10

pKa NH3= 9,69

8
6
4
2
0

pKa COOH = 2,34

0

10

12

14

Grfica 1. Curva de titulacin Glicina

A pH cido la glicina se encuentra como

cido diprotico, esto est dado por que el N
terminal y el grupo carboxilo estn
totalmente protonados. Al momento de
agregar OH- el grupo carboxilo pasa a ser
carboxilato donde el pH = pK, lo que nos
indica que en esta parte de la curva de
titulacin se forme una zona buffer o
amortiguadora, donde en esta zona no se
generan cambios de pH apreciables. En esta
parte la glicina est en un 50% como catin
y el otro 50% como zwitterion. La glicina al
tener un rango de pH entre 2,94 y 3,28 se
dispara y vuelve a tener una zona constante
a un pH de 9,27, que es cuando el NH 3
terminal se desprotona y da la formacin de
NH2, dando lugar a una zona amortiguadora
y a que la glicina este en 50% como

zwitterion y el otro 50% como anin. Cabe

resaltar que en la mitad de estas dos zonas
amortiguadoras se da el punto isoelctrico
el cual se calcula de la siguiente manera:

pI =

2,34 +9,69
=6,015
2

Dicho punto isoelctrico es cuando la

molecula del aminocido en este caso la
glicina presenta una carga elctrica neutra o
igual a 0.
La separacin de los aminocidos por
cromatografa de capa fina, implica que los
que tengan un carcter ms apolar, tendrn
tendencia a desplazarse con la fase mvil,
mientras que los aminocidos que sean
polares, sern retenidos por la fase

estacionaria; la fase mvil utilizada en el

desarrollo de la prctica (butanol: cido
actico: agua) es apolar debido a que est
formada por solventes que son ms apolares
que el agua.
La separacin de los aminocidos se pudo

estructuras de los aminocidos, nos ayudan

a determinar la polaridad de la molcula y
as poder determinar la separacin en la
placa. Podemos determinar que la
fenilalanina es un aminocido apolar,
aminocidos como la glicina (sin carga),
cido glutmico y lisina (con carga) son
molculas polares.
Segn el resultado obtenido en la placa se
puede decir que los aminocidos polares
tienen mayor interaccin con la fase mvil
debido a su carcter polar, es por esto que el
cido glutmico fue el que tuvo mayor
factor de retencin.
Con respecto a la segunda placa de silica
donde se sembraron fenilalanina, aspartame
en agua, aspartame en HNO3 y Coca Cola
light.

observar en la figura 1, debido a la

aparicin de manchas de color azul-violeta.
Adems de la aparicin de dos manchas una
de color naranja y otra roja. La sustancia
que revela la posicin del aminocido es la
ninhidrina se utiliza debido a que ayuda a
determinar aminocidos con el grupo amino
libre.
Glicina
0,38
cido Glutmico
0,65
Fenilalanina
0,64
Lisina
0,48
Total X
4,2 cm
Tabla 2. Rf de los aminocidos

Sin embargo aunque en la figura 1 podemos

observar la presencia de aminocidos,
tambin se puede observar en la tabla 1 que
todos
los
aminocidos
tuvieron
movimiento, donde el cido glutmico
presenta mayor factor de retencin. Al
realizar una comparacin entre los factores
de retencin experimentales con los
tericos se observa una variacin
significativa con respecto a los clculos
realizados en la placa, ya que el cido
glutmico, presentan un Rf de 0.85. La
variacin en los valores de Rf puede estar
dado por el tiempo de duracin dentro de la
cmara cromatogrfica, la fase mvil y el
volumen de esta.
El reparto de los aminocidos en el papel se
debe a su naturaleza qumica. Las

Fenilalanina
Aspartame en agua
Aspartame en HNO3
Coca Cola light
Total X

0,77
0,32
0,4
0,37
4,0

Tabla 2. Rf de los aminocidos

Con respecto a la tabla 2 se puede

identificar que la fenilalanina fue el
aminocido que tuvo un factor de retencin
mayor lo que quiere decir que tuvo mayor
desplazamiento sobre la placa de silica.
Esta placa duro ms tiempo en la cmara
cromatogrfica, donde se evidencio que la
fase mvil tardo mucho en llegar al lmite
superior de la placa.
CONCLUSIONES
Al obtener la curva de titulacin de la
glicina se logra identificar dos zonas
amortiguadoras, las cuales estn dadas a la
igualdad entre el pH y pK tanto del grupo
carboxilo y el NH3 terminal.
El punto isoelctrico de la glicina puede
determinarse tomando los valores tericos o
los promedios de cada zona amortiguadora,
donde la diferencia entre los dos valores
obtenidos va a ser relativamente mnima.
Cabe resaltar que si el pH aumenta de 9,69
la glicina se va a encontrar a su totalidad
como anin, ya que su carga es -1 dado por
la disociacin del NH3 terminal.

El factor de retencin depende directamente

de la relacin que tenga cada aminocido
con el solvente o fase mvil, lo que fue se
puede evidenciar en la Tabla 1 adems a
partir de esto se puede determinar la
polaridad que estos tengan, partiendo de
conocer la polaridad del solvente, en este
caso polar.
Con esta tcnica se puede determinar
cualitativamente la composicin de una
muestra corrindola junto a estndares de
referencia, en este caso siendo la muestra la
bebida comercial (Coca Cola light) y los
estndares los aminocidos utilizados.
La muestra de bebida comercial presento
una movilidad corta en la placa ya que
presento mayor afinidad con la fase
estacionaria, debido a que est compuesta
por aminocidos apolares.
El aminocido con mayor movilidad en la
placa fue el cido glutmico de la placa
nmero 1 con un factor de retencin de 0,65
debido a que es una molcula polar, por lo
tanto tiene ms afinidad con la fase mvil.
BIBLIOGRAFA
Lehninger principios de bioqumica.
Nelson, David L., Michael M. Cox.

Jorrn Novo, J., & Abril Daz, M. N. (sf).

Universidad Catlica de oriente.
Recuperado el 5 de Septiembre de
2015,
de
Separacin
de
aminocidos por cromatografa:
http://www.uco.es/dptos/bioquimic
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Peinado, J., & Tobirio Melndez, F. (2014).
Universidad catlica de oriente.
Recuperado el 6 de septiembre de
2015, de Cromatografa en papel de
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http://www.uco.es/dptos/bioquimic
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