Interrupcin farmacolgica del trfico de los canales de

calcio por el ligando 2, Gabapentina

Jan Hendrich*, Alexandra Tran Van Minh*, Fay Heblich*, Manuela Nieto-Rostro*, Katrin Watschinger, Jo rg Striessnig,
Jack Wratten*, Anthony Davies*, and Annette C. Dolphin*
*Laboratorio para la Neurociencia Celular y Molecular, Departamento de Farmacologa, UniversityCollege London, Londres WC1E 6BT, Reino Unido; eInstitutfurPharmazie,
AbteilungfurPharmakologieundToxikologie, Universitat Innsbruck, A-6020 Innsbruck, Austria.
Editado por Richard W. Tsien, Escuela de Medicina Universidad de Stanford , Stanford, CA, y aprobado en Enero 15, 2008 (recibido para revisin Septiembre 20, 2007)

El mecanismo de accin de los frmacos antiepilpticos y

antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco
conocido. La gabapentina (GBP) se une a un eptopo exofacial de
las subunidades auxiliares 2-1 y 2-2 de los canales de calcio
dependientes de voltaje, sin embargo la inhibicin aguda de las
corrientes de calcio por GBP es muy baja o ausente. Formulamos la
hiptesis de que GBP deteriora la capacidad de las subunidades
2para mejorar la densidad en la membrana plasmtica de los
canales de Ca2+ abiertos por voltaje a travs de un efecto sobre el
trfico. Nuestros resultados demuestran de forma concluyente que
GBP inhibe las corrientes de calcio, imitando una falta de 2slo
cuando se aplica crnicamente, pero no agudamente, tanto en
sistemas de expresin heterloga como en neuronas ganglionares
de la raz dorsal. GBP acta principalmente en una localizacin
intracelular, lo que requiere su captacin, debido a que el efecto de
GBP aplicado crnicamente es bloqueado por un inhibidor de los
transportadores de aminocidos neutros del sistema-L y reforzado
por coexpresin de un transportador. Sin embargo, est mediado
por las subunidades 2, siendo impedido por mutaciones en
ambos 2-1 2-2 que suprimen la unin de GBP, lo que no se
observa para 2-3, al cual no se une GBP. Por otra parte, el trfico
de los canals 2-2 y Cav2 se interrumpe tanto por GBP como por la
mutacin en 2-2, lo que impide la unin de GBP, encontrndose
tambin que GBP reduce la expresin en la superficie celular de las
subunidades 2-2 y Cav2.1. Nuestra evidencia indica que GBP
puede actuar crnicamente mediante el desplazamiento de un
ligando endgeno el cual es normalmente un modulador positivo
de la funcin de la subunidad 2, afectando de esta manera la
funcin de trfico de las subunidades 2a las que se une.

L
V

os canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCCs) son

complejos heteromricos. Las subfamilias Ca V1 y CaV2 se
componen de una subunidad 1 formadora del poro, asociada con una
subunidad 2 anclada a membrana, predominantemente extracelular
(para revisar ver ref. 1) y una subunidad intracelular (para revisar
ver ref. 2). Los genes de mamferos que codifican las cuatro
subunidades 2 han sido identificados (para revisar ver refs. 2 y 3).
La topologa de la protena 2 se determin primero para 2-1 y se
cree que generaliza a todas las subunidades 2 (para revisar ver refs.
1 y 4). Ellas son protenas transmembrana de tipo I, donde la
subunidad exofacial 2 est unida por un puente disulfuro a una
subunidad transmembrana, formado por la escisin posttraduccional de la preprotena 2 (5).
El mecanismo de accin de los frmacos antiepilpticos y
antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco
conocido. La gabapentina (GBP) en s fue desarrollada originalmente
como un anlogo del cido -amino-butrico (GABA), pero ahora se
cree que no tienen ningn efecto sobre los receptores GABA o
transportadores (para revisar ver ref. 6). La primera clave para
entender el mecanismo de accin de GBP vino de la purificacin de la
protena donde se une GBP de cerebro porcino (7), la cual se identific
como la subunidad auxiliar 2-1 de VGCCs. Ahora se sabe que la
GBP se une a un eptopo exofacial presente tanto en las subunidades
2-1 y 2-2 (para revisar, vanse las referencias. 1 y 8). Sin embargo,
a pesar de que originalmente se report que la aplicacin de GBP re-

sulta en la inhibicin aguda de las corrientes de calcio (9, 10), en la

mayora de los estudios, la inhibicin aguda por GBP es o bien muy menor
o ausente (para revisin ver ref. 1). Adems, los estudios
electrofisiolgicos de la transmisin sinptica son tambin equvocos, con
algunos estudios reportando inhibicin por GBP (11), y otros estudios
reportando ninguna inhibicin (12).
Cuando la liberacin de neurotransmisores es medida, al parecer hay
poco o ningn efecto sobre la liberacin cuando es estimulada por la
despolarizacin de varios neurotransmisores diferentes, a menos que se
haya mejorado la inhibicin de la liberacin por mediadores especficos
(13-15). En general, ninguno de estos estudios apunta al mecanismo de
accin siendo una simple inhibicin de las corrientes de calcio.
Formulamos la hiptesis de que GBP deteriora la capacidad de las
subunidades 2 para mejorar la densidad de la membrana plasmtica de
VGCC, a travs de un efecto sobre el trfico. Esto estara de acuerdo con
la conclusin de que la respuesta in vivo a las drogas gabapentinoides sea
bastante lenta al inicio (16), y que GBP no inhiba el dolor agudo (para
revisar ver refs. 6 y 17).
Resultados
La Inhibicin de las corrientes de Cav2.1 y Cav2.2 por GBP es crnica
pero no aguda. Primero comparamos la habilidad de GBP para inhibir
las corrientes de calcio, ya sea de forma aguda, o cuando se le incluye
por 40 h en el medio de cultivo despus de la transfeccin de clulas
tsA-201 con Cav2.1/4 y 2-2. La incubacin crnica con GBP (1 mM)
redujo las corrientes formadas con l WT 2-2 de 72.2 4.2% a +15
mV (Fig. 1A). Adems, mientras la coexpresin de las subunidades 2
normalmente desplaza la dependencia de voltaje del estado de
equilibrio de inactivacin a potenciales ms negativos (Fig. 1B), este
fue despolarizado por 9.3 mV en la presencia continua de GBP (Fig.
1B). En consecuencia, GBP crnica imit una disminucin en la
influencia de 2 en las corrientes. Como confirmacin, un efecto
similar de GBP crnica se observ cuando Ca v2.1/4 fue transfectado
en una lnea celular estable que expresa 2-2, donde los peaks de
corrientes fueron 53.4 14.0% ms pequeos cuando las clulas
fueron cultivadas con 1 mM de GBP. [informacin de apoyo (SI) Fig.
5A]. Adems, el estado de equilibrio de inactivacin fue de nuevo
depolarizado en 11 mV por GBP (SI Fig. 5B), y las corrientes
mostraron significativas reducciones en la inactivacin (Fig. 5C y D).
En contraste, cuando GBP fue aplicado ya sea de forma aguda por 10
min (Fig. 1C), o por 3-6 h antes del registro (n=8, datos no mostrados),
no tuvo efecto en IBa en el mismo sistema.
Author contributions: J.H. and A.T.V.M. contributed equally to this work; J.H., A.T.V.M.,
and A.C.D. designed research; J.H., A.T.V.M., F.H., J.W., and A.C.D. performed research; J.H.,
A.T.V.M., M.N.-R., K.W., J.S., and A.D. contributed new reagents/analytic tools; F.H. and
A.C.D. analyzed data; and A.C.D. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
Freely available online through the PNAS open access option.
To whom correspondence should be addressed at: Department of Pharmacology, Univer-

sity College London, Gower Street, London, WC1E 6BT, United Kingdom. E-mail:
a.dolphin@ucl.ac.uk.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/
0708930105/DC1.
2008 by The National Academy of Sciences of the USA

3628 3633 1 PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105

Una alta concentracin de GBP fue usada inicialmente, porque

nuestra hiptesis requera que GBP fuera tomada ya sea por los
transportadores del sistema L y subsecuentemente se uniera a las
subunidades 2 intracelulares y afectara el trfico hacia adelante, o,
alternativamente, unirse directamente a las subunidades 2 de la
superficie celular y afectar el trfico a nivel de la endocitosis o el
reciclaje. Para ambos sitios, estar compitiendo con otros aminocidos
neutros grandes presentes en el medio de cultivo, isoleucina y leucina
ambas presentes a 800 M y valina presente a 400 M. Sin embargo,
las concentraciones en el plasma de 70-120 M de GBP son
clnicamente relevantes, y la aplicacin crnica de 100 M de GBP
tambin produce una reduccin significativa de I Ba, a 45.0 9.9% (Fig.
1E y D). Tambin disminuyo la inactivacin de las corrientes,
nuevamente un sello distintivo de las corrientes de los canales de
calcio que no son influenciadas por 2 (SI Fig. 6A y B). Ante la
presencia prolongada de GBP, la densidad de corriente de
Cav2.1/4/2-2 se aproxim a la observada en ausencia de las
subunidades 2 (Fig. 1E).
El efecto crnico de GBP tambin fue observado en la presencia de
2-1 porque 1 mM de GBP redujo los peaks de corrientes de
Cav2.1/1b/2-1 a 70.5 7.3% (Fig. 1F), y depolariz el punto medio
para el estado de equilibrio de inactivacin de -55.5 3.4 mV a -39.7
2.6 mV (n=4 para ambos, datos no mostrados). Estos resultados
tambin proveen evidencia de que GBP no es selectivo para un subtipo
en particular de composicin de canal de Ca v2.

Prevencin del efecto crnico de GBP por mutacin de 2-1 2-2.

La mutacin de un nico aminocido, R217A, en una forma RR R en

Hendrich et al.

Evidencia para un sitio de accin intracelular de GBP. La potencia in

vivo de GBP ha mostrado depender tanto de unin a la subunidad 2
y en la actividad como sustrato de sistemas transportadores de Laminocidos, atribuido a los requerimientos de drogas Zwitterionicas
para atravesar BHE. Para determinar si el efecto crnico de GBP
requiere su recaptura en un nico nivel celular (como se ha esbozado
en la Fig.2D), hemos incluido el inhibidor 2-(-)-endoaminobicyloheptane-2-carboxylic acid (BCH) en el medio, tanto solo como
junto a GBP por 40 h. BCH tiene muy baja afinidad para en el
desplazamiento de la unin de GBP a las subunidades 2 y 2-2, y
esto no tuvo efecto en la aplitud de I Ba (Fig. 2E) cuando se aplica solo,
a una concentracin 10 mM. El peak de densidad de corriente a +15
mV fue -330,2 84,7 pA/pF (n=7) para el control y -330,0 73,2 pA/pF
(n=8) en presencia de BCH. Sin embargo, BCH crnico previno el
efecto de GBP crnico tanto reduciendo IBA expresado (Fig. 2E) y
depolarizando el estado estacionario de inactivacin (datos no se
muestran). Este efecto de BCH es probablemente resultado de su
habilidad para bloquear la recaptura de GBP.
Para obtener ms evidencia de que la recaptura de GBP es
necesaria para su efecto, usamos oocytos de Xenopus, que expresaran
solo a un bajo nivel de actividad del sistema de L-transportadores.
Encontramos que la incubacin crnica con 200 M de GBP slo
disminuy significativamente las corrientes de Ca v2.2/1b/2-2 (en
un 57%, Fig. 2F) cuando la protena LAT4 del sistema de Ltransportadores fue coexpresada. Expresin de LAT4 no tuvo efecto
significativo en el peak de Iba a +5mV, la cual fue -0,49 0,12 A
(n=34) y -0,41 0,06 A (n=41) en ausencia y presencia de LAT4 resPNAS

March 4, 2008

vol. 105

no. 9

3629

PHARMACOLOGY

Fig. 1. GBP es efectivo para inhibir IBa despus de una expresin heterloga,
cuando es aplicado de manera crnica pero no aguda. (A) (izquierda)
Relaciones densidad de corrientes-voltaje (IV) para corrientes de
Cav2.1/4/2-2 en ausencia o presencia de GBP crnico (1 mM, crculos rojos,
n=11) por 40 h (o H2O como control, cuadrados negros, n=13) de inmediato
despus de la transfeccin de clulas tsA-201 hasta que los registros fueron
realizados. La reduccin en los peaks de IBa fue estadsticamente significativa
(P=0.0013 en un test t-Student). (derecha) Ejemplos de corrientes resultantes
de pasos de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en
incrementos de 5-mV, bajo condiciones control y en la presencia de GBP. Las
barras de calibracin se refieren a ambos conjuntos de trazas. (B) Datos del
estado de equilibrio de inactivacin obtenidos de clulas tratadas como se
describi en A. GBP crnico (1 mM, crculos rojos, n=12) y control (crculos
negros, n=13). El estado de equilibrio de inactivacin en la ausencia de
subunidades 2 se entrega para comparacin (lnea discontinua, n=11). Los
datos encajan en una nica ecuacin de Boltzmann. El V 50, inact fue de 37.6 2.1
mV en la presencia de 2-2, -30.8 4.4 mV en la ausencia de 2 (lnea
punteada), y -28.3 2.7 mV en la presencia continua de GBP (P=0.0103
comparado con la ausencia de GBP, en un test t-student). (C) GBP (1 mM)
aplicada de forma aguda por 10 min no tiene efecto en las corrientes de
Cav2.1/4/2-2. Ejemplos de corrientes resultantes del paso de potenciales
desde -90 mV a +10 mV, bajo condiciones control y despus de la aplicacin de
GBP por 10 min, a una clula cuya amplitud inicial de corriente estaba
estabilizada. Las corrientes son representativas de n=5 clulas, donde los peaks
de corrientes (trazo rojo) despus de la aplicacin de GBP fueron 99.0 7.1%
de su valor inicial, antes de la aplicacin de GBP (trazo negro). (D) Relaciones IV
para las corrientes de Cav2.1/4/2-2 a partir de clulas cultivadas en
ausencia o presencia de 100 M de GBP aplicada crnicamente como se
describe en A. GBP (crculos rojos, n=10) y control (cuadrados negros, n=14). La
reduccin en el peak IBa a +15 mV fue estadsticamente significativa (P=0.0215,
en un test t-student). (E) El porcentaje de inhibicin del peak de densidad de
corriente por GBP (100 M, barra roja rayada, n=10; y 1 mM, barra roja solida,
n=11) fue determinada para cada experimento y comparada con la reduccin
observada en la ausencia de 2 (barras gris, n=14). La significancia estadstica
de la reduccin fue determinada respecto a los datos en la presencia de 2-2
y ausencia de GBP para cada set individual de experimentos; *, P=0.0013; **,
P=0.021; ***, P=0.00004, en un test t-student. (F) (izquierda) Relaciones IV
para las corrientes de Cav2.2/1b/2-1 en la ausencia o presencia de GBP
crnico (1 mM, crculos rojos,=10) por 40 h o la cantidad equivalente de H 2O
como control (cuadrados negros, n=8). (derecha) Ejemplos de corrientes
resultantes de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en
incrementos de 5-mV, bajo condiciones control (trazos negros) y en la
presencia de GBP (trazos rojos).

2-1, o el residuo equivalente R282A en 2-2, se ha descubierto que

es casi completamente capaz de suprimir la unin de GBP. Para
demostrar que el efecto crnico de GBP era en efecto debido a la unin
a las subunidades 2, nosotros examinamos si poda haber algn
efecto en las corrientes formadas por Ca v2.1/4 cotransfectados con
R282A-2-2. La incubacin crnica con GBP (1 mM) no inhibi estas
corrientes (Fig. 2A) o result en ningn cambio en el estado de
equilibrio de inactivacin (Fig.2B). Adems, no hubo efecto de GBP en
las corrientes formadas por Cav2.2/1b/R217A-2-1 (Fig. 2C), o
Cav2.1/4/2-3 (los peaks IBa fueron -286.58 32.3 pA/pF a +15 mV
para el control, n=8; comparado con -258.7 46.8 pA/pF para GBP
crnico, n=9). Estos resultados estn de acuerdo con el hecho de que
ninguna de estas subunidades 2 une GBP (datos no mostrados).

pectivamente, en 4 experimentos separados.

Tambin encontramos que la incubacin crnica de oocytos por 40 h
en presencia de L-leucina (400 M) aument significativamente Iba
solo cuando LAT4 fue coexpreseada (Fig. 2G). Ms aun, L-leucina no
aument las pequeas corrientes obtenidas en ausencia de 2, a
pesar de la presencia de LAT4 (Fig. 2G). Esto es compatible con la
idea de que un ligando endgeno de bajo peso molecular, como la
misma L-leucina, podra ocupar normalmente los sitios de unin de
GBP en 2 y 2-2 y ser un modulador positivo requerido en la
funcionalidad total de las subunidades 2. La existencia de un
ligando endgeno fue previamente sugerida por la observacin de que
la afinidad aparente por GBP aumenta en un factor de 5 a 10 ante
una dilisis o una purificacin parcial de las subunidades 2.
De acuerdo con estas hiptesis, tanto para R217-2-1 y R282A- 22, el peak de corriente fue consistentemente ms pequeo, comparado
con las subunidades 2 WT, por 62,5% y 34,5% respectivamente (ver
tambin refs. 23 y 28). Sin embargo, fueron significativamente
mayores que en ausencia total de subunidades 2, donde IBa a +15mV
fue -33,9 5,8 pA/pF para Cav2.2/1b (n=9, P<0,05) y -65,1 8,8
pA/pF para Cav2.1/4 (n=13, de ref. 24). Esto es compatible con la
hiptesis de que las subunidades 2 mutantes RRA son deficientes ya
sea en el trfico frontal o en el mantenimiento de complejos VGCC
maduros en la membrana plasmtica.

Fig. 2. El efecto de GBP requiere tanto unin a la subunidad 2 como

recaptura por un transportador de aminocido neutro. (A) (Izquierda)
Relacin IV para corrientes de Cav2.1/4/R282-2-2 en ausencia o
presencia de GBP crnica (1mM, crculos rojos, n=12) por 40 h o cantidad
equivalente de H2O como control (cuadrados negros, n=12), desde
transfeccin, inmediatamente hasta que los registros fueron realizados.
(Derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de potenciales desde -90 mV
hasta (entre) -15 y +15 mV en incrementos de 5 mV bajo condiciones
control y en presencia de 1 mM GBP. Barras de calibracin refieren a
ambos sets de seales. (D) Diagrama que ilustra algunos de varios sitios en
los que GBP (crculos rojos) o el ligando putativo endgeno (crculos
verdes) podra actuar en las subunidades 2. El efecto de GBP podra ser
por desplazamiento de un ligando endgeno e impedir la habilidad de 21 y 2-2 de incrementar la concentracin de VGCC en la membrana
plasmtica. De este modo, GBP ejercera su efecto en las subunidades 2
intracelulares durante la maduracin y el trfico del complejo VGCC a la
membrana y/o unir a subunidades 2 superficiales, afectando el reciclaje
desde la membrana plasmtica. BCH es un inhibidor competitivo de del
sistema L-transportador. (E) Relacin IV para corrientes de Cav2.1/4/ 22 tanto en condiciones control (cuadrados negros, n=8) y luego de
tratamiento crnico con GBP (1mM), en ausencia (crculos rojos rellenos,
n=7) o presencia (crculos rojos sin pintar, n=10) del inhibidor del sistema Ltransportador, BCH (10 mM) aplicado crnicamente desde una hora antes
que GBP. La reduccin en el peak IBa por GBP sola a +10mV fue
estadsticamente significativa comparando con el control. (F) IBa fue
medido en oocytos de Xenopus luego de la inyeccin de cDNA para
Cav2.2/qb/2-2, junto con ya sea, cDNA control (Kir-2.1-AAA no conductor
(Izquierda)) o con mLAT4 (derecha).

3630 1 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105

GBP crnica reduce la expresin de los canales de calcio en la

membrana plasmtica. Para investigar ms a fondo si GBP afecta el
trfico de VGCC, hemos examinado a continuacin la distribucin
subcelular de las subunidades de VGCC, utilizando doble tag Cav2.1
con un hemaglutinina (HA) exofacial (Cav2.1-2HA, Fig. 3 CA). Bajo
condiciones de control, Cav2.1 y alfa2delta-2 fueron localizados, tanto
intracelularmente (Fig. 3A) y tambin en la membrana plasmtica,
como se ve ms claramente en las clulas no permeabilizadas (Fig.
3B).La expresin en la membrana plasmtica en las clulas no
permeabilizadas se cuantific a partir de imgenes de baja
magnificacin, incluyendo los de la figura 3C, en el que la expresin de
la superficie celular se ve a travs de toda la clula debido a la
profundidad de la seccin ptica (4.5 m para stas imgenes) y
aplanado natural de las clulas. La incubacin crnica con 100 M y 1
mM de GBP redujo significativamente la expresin de ambos Cav2.1 y
alfa2delta-2 en la membrana plasmtica (Fig. 3C) as como el
aumento de la agrupacin intracelular no uniforme de las dos
subunidades (Fig. 3A).Un resultado similar se observ para
Cav2.2,que se expresa en todas las clulas transfectadas Cos-7,por lo
general muestran una distribucin bastante uniforme (fig. SI.
7(29).Usando clulas permeabilizadas, encontramos que WT
alfa2delta-2 localizada con GFP-Cav2.2, tanto intracelularmente como
en la mebrana plasmtica (SI fig 7Ai).La aplicacin crnica de GBP
result en regiones de la agrupacin intracelular en la mayora de las
clulas, tanto para alfa2delta-2 y para GFP-Cav2.2 (SI fig 7Aii y iii),
cuantificado en la fig SI 7 B).
Para cuantificar an ms el efecto de GBP en las expresin de
alfa2delta2-2 en la membrana celular.Se utiliz biotinilizacin en la
membrana celular y se encontr que la incubacin crnica con GBP( 100
M y 1 mM), redujola proporcin de alfa2delta-2 expresada en la
membrana celular(fig 3D).El procedimiento de biotinilacin no induce la
permeabilizacin celular,y esto no se vio afectada por la incubacin
crnica con GBP,Debido a que no se observ biotinilacin de la protena
intracelular Akt (fig.3D).

cDNA (nonconducting Kir2.1-AAA (30) (Left) or with mLAT4 (27) (Right).

Oocytes were incubated without (black bars) or with 200 M GBP (red bars)
from 1 h after the time of injection until recording between 40 and 48 h later.
To combine data from several experiments, the mean peak control IBa at +5
mV was normalized and the effect of GBP determined relative to control. The
numbers of determinations are shown on the bars. Statistical significance: **,
P = 0.0042 for the effect of GBP in the mLAT4 condition only (two-way ANOVA
and Bonferronis post hoc test). (G) As in E, with the combinations of transfected subunits indicated below the bars. Oocytes were incubated without
(black bars) or with (white bars) 400 M L-leucine. The statistical significance
is P = 0.011 (*) for the effect of L-leucine in the mLAT4 condition and only in
the presence of a28-2.
Hendrich et al.

En contraste, GBP crnica no redujo el nivel de R282A-alfa2delta-2

expresada en la membrana celular (SI fig.8A). Adems, en la
presencia de R282A-alfa-2-delta-2,hubo una distribucin menos
uniforme tanto de la mutacin alfa-2-delta y GFP Cav 2.2, que la ob-

Hendrich et al.

Fig. 4. Efecto de la GBP en las corrientes de Ca nativos con DRGs.(A) (

superior izq).La relacin de IV para HVA Iga registrados para ratas
DRGscultivados por 3 das en ausencia (cuadrados negros) o presencia de
GBP (1 mM,circulos rojos).Ejemplo HVA corrientes de uu potencial de
reposo (Vh) de -40mV a entre -30 y +10mV en rangos de 10mV.Trazos
superiores (negro) de control; trazos menores (rojo) GBP crnico (1
mM).Iga se midi a 20ms, como se indicaven la lnea punteada.Iga a 0mV
fue significativamente inhibida por GBP crnica.(B) (P = 0.02, Students
two-tailed t test). (Lower) As above, except VH was -80 mV, and IBa
amplitude was measured at the end of the 220-ms step, as indicated by the
dotted line. IBa was obtained in the absence (black squares, n = 12), or
presence of GBP (1 mM, red circles, n = 13). (B) la aplicacin aguda de GBP
(1mM) no tuvo efecto sobre las corrientes HVA nativos DRGs.(izq) Grfico
de barras muestra la falta de activados por la corrientes de calcio (
HVA),cuando los DGR se incubaron con 1mM de GBP por 3 das (fig.4A).La
contaminacin con corriente T se evit por la medicin de corriente del
mantenimiento del pick de potencial en -40mV,aunque un resultado similar
se obtuvo cuando se mide Iga al final de un rando de 50-ms desde 80mV(fig. 4A).En contraste, la aplicacin aguda de GBP durante 10min, no
tuvo efecto en adultos DRG Iga (fig. 4B)..

servada con WT alfa2delta-2 y localizacion menos uniforme del la

subunidad R282A-alfa-2-delta y GBP Cav 2.2 (SI fig. 8B yC), no
tuvo ningn efecto adicional sobre la distribucin de la subunidad
R282Aalfa-2-delta-2 (SI fig.8 B y C).
GBP crnico inhibe las corrientes de calcio nativas en las neuronas
DRG. Para determinar la relevancia de nuestros hallazgos a VGCCs
nativas en un sistema neuronal relevante para el uso teraputico de
GBP, se examin si GBP tuvo un efecto crnico similar en la densidad
de IBA en cultivos de neuronas de raz dorsal ganglionar adultas
(DRG). Se encontr una marcada reduccin en el peak de las
corrientes de calcio activadas por alto voltaje (HVA) (por 50,7 11,2%
a 0 mV, n=19), cuando los GRD se incubaron con 1 mM de GBP
durante 3 das (Fig. 4A). La contaminacin con corriente tipo T se
evit mediante la medicin de la corriente peak desde un potencial de
mantenimiento de 40 mV, aunque se obtuvo un resultado similar se
obtuvo cuando se midi IBa al final de una etapa de 50 ms a partir de
80 mV (Fig. 4A). En contraste, la aplicacin aguda de GBP durante 10
minutos no tuvo ningn efecto en DRG Iba adultas (Fig. 4B).
PNAS

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3631

PHARMACOLOGY

Fig. 3. Efecto de GBP crnica en la localizacin de Cav 2.1 y alfa 2delta-2 en la

membrana plasmtica en clulas Cos-7. (A) Cav2.1-2HA se cotransfect con beta4
y alfa-2 delta-2 y se cultivaron durante 48hrs. Ya eea en ausencia o en presencia de
GBP (100 M y 1 mM).Las clulas fueron fijadas y permeabilizadas antes de la
localizacion inmunocitoqumica de Cav 2.1(HA Ab,izq.) y alfa-2-delta-2 ( Ab,
centro), utilizando una amplificacin objetvo 63. Imagenes fusionadas se
muestran ( derecha),(Cav2.1 se muestran en verde y alfa-2-delta-2 en rojo, con las
regiones de colocalizacin de color naranja-amarillo). Tincion nuclear (azul, DAPI)
se muestra en las imagenes fusionadas. (B) Las imgenes se obtuvieron como en A,
pero las clulas no se permeabilizaron.La clulas transfectadas en cada imagen se
identifican por una flecha, se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos
independientes (Barra Escala: 30 m.) (C) (Izquierda). .) imagenes de celulas
fusionadas no permeabilizadas tomadas con una ampliacion de objetivo 20
para mostrar un mayor campo de visin para las clulas transfectadas como en
A y se cultivaron durante 48hrs ya sea en presencia o ausencia de GBP( 100 M
y 1 mM). La seccion optica para estas imagenes es de 4,5 micras y como las
celulas son aplanadas, la tincion se ve en la mayor parte de la membrana
celular (derecha). La cuantificacin de la intensidad de la fluorescencia de
celulas de la superficie por unidad de superficie celular de Cav2.1 (barras
blancas) y alfa-2-delta-2 (barras grises) para magnificacion X20 imagenes bajo
condiciones de control (n = 22 cells) and in the presence of 100 M GBP (n = 19
cells) and 1 mM GBP (n = 24 cells). **, P < 0.01; ***, P < 0.001; one-way ANOVA,
with Bonferronis post hoc test. (D) The effect of GBP (100 M and 1 mM) was
determined on cell-surface expression of a28-2 (Upper), with the intracellular
protein Akt as control (Lower). (Left) Whole-cell lysate (WCL). (Right)
Streptavidin pull-down of biotinylated proteins, immunoblotted with a2-2 (102
117) or Akt Ab. The leftmost lane is from nonbiotinylated control cells (con). The
proportion of a28-2 at the cell surface was estimated from the ratio of the
biotinylated a28-2 to the amount of a28-2 in the WCL. Data are from five
experiments; 4.93 1.92% of total a28-2 was at the plasma membrane, and
this was reduced compared with control by 19.8 7.6% and 30.4 14.4% in the
chronic presence of 100 M and 1 mM GBP, respectively (n = 5, P < 0.05,
repeated-measures ANOVA and Bonferronis post hoc test).

Discusin
Luego del descubrimiento de que GBP se une a cierta subunidad
VGCC 2, la evidencia de que las drogas gabapentinoides tienen su
efecto teraputico a travs de esta ruta es muy fuerte ahora, ya que
un ratn R217A knockin-21 desarrolla dolor neuroptico en
respuesta a la lesin del nervio, pero esto no responde a cualquier
GBP o su anlogo pregabalina. Ahora se muestraa que GBP es un
inhibidor del trfico de VGCC, en lugar de un inhibidor directo de las
corrientes de calcio, y por lo tanto ejerce sus efectos inhibidores sobre
todo en subunidades 2 intracelulares. Hemos demostrado que las
subunidades 2 tienen su efecto principal sobre el trfico de VGCC, y
que el factor de von Willebrand-Un dominio (VWA) es clave para este
proceso. Es notable que GBP se une a las dos subunidades 2 que
tienen dominios VWA con sitios de adhesin in-metal perfectos
(MIDAS). Se ha postulado que todos esos dominios VWA se someten a
un cambio conformacional durante la unin de la protena ligando a
este dominio, y se podra especular que los frmacos gabapentinoides
podran interferir con esta funcin del dominio VWA. La reduccin en
la expresin de 2 y Cav2.1 en la superficie celular en presencia de
GBP y la disminucin en la colocalizacin de 2 de R282A con Cav2.2
proporciona evidencia de apoyo para esta hiptesis.
Los resultados presentados aqu podran explicar la falta de efecto, o
respuestas pequeas, informadas con GBP aguda en diferentes sistemas
experimentales, tanto en las corrientes de calcio como la la transmisin
sinptica. Estudios previos que examinan la exposicin ms prolongada a
GBP tambin han demostrado ya sea ninguna inhibicin o poca inhibicin
de la amplitud de la corriente. Nuestra conclusin de que el efecto de GBP
requiere su captacin en las clulas individuales explica el requisito de
una concentracin relativamente alta de GBP, ya que tendr que competir
con grandes aminocidos neutros para la captacin en este sitio. Es claro
que el trfico de VGCCs y su insercin y extraccin de la membrana
plasmtica procede dinmicamente, y estas tasas probablemente
dependern del estado fisiolgico de las neuronas, y la cantidad de
subunidades 2 presentes, que mejorarn el trfico y disminuirn el
cambio de VGCCs. La insercin de VGCCs en la membrana plasmtica de
las terminales presinpticas o axones puede ocurrir rpidamente bajo
ciertas condiciones, por ejemplo, despus de la induccin de dolor
neuroptico, cuando los niveles de las subunidades 2-1 estn elevados.
Respecto a esto, se ha informado que GBP inhibe las corrientes de calcio
lentamente durante un perodo de minutos en DRGs de ratones que
sobreexpresan 2-1 (imitando el estado de dolor neuroptico), pero no los
ratones WT. (36).
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3632 1 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105

La insercin de VGCCs en la membrana plasmtica de las terminales

presinpticas o axones puede ocurrir rpidamente bajo ciertas
condiciones, por ejemplo, despus de la induccin de dolor neuroptico,
cuando estn elevados? 2? -1 Niveles de subunidades. A este respecto, se
ha informado de que GBP inhibe las corrientes de calcio lentamente
durante un perodo de minutos en GRD de 2 -1 -? Ratones que
sobreexpresan (imitando el estado de dolor neuroptico), pero no los
ratones WT. (36)
En conclusin, la accin de GBP dilucidada aqu, para inhibir el trfico
de VGCC y la expresin en la membrana plasmtica, representa un
mecanismo de accin de frmaco no caracterizado previamente, y seala
el camino a seguir para el desarrollo de frmacos.

Mtodos
Cultivo de tejidos y expresin heterloga de ADNc. Los detalles figuran en
Mtodos SI.
Electrofisiologa. Las corrientes de los canales de calcio se registraron
esencialmente como se describe y detalla en Mtodos SI.
Inmunotransferencia. El anlisis por inmunotransferencia se realiz
esencialmente como se ha descrito. Muestras de SDS / PAGE resueltas se
transfirieron a membranas de PVDF y se probaron con Abs primarias como se
describi y con las Abs secundarias conjugadas con peroxidasa de rbano
picante respectivamente, seguida de deteccin de quimioluminiscencia.
Inmunocitoqumica e Imagen. El mtodo utilizado es esencialmente como se
describe y detalla en Mtodos SI.
Ensayo de Bioquinilacin. A las 72 h despus de la transfeccin con los
ADNc descritos, las clulas fueron lavadas tres veces con PBS y despus se
incubaron con PBS que contena 1 mg / ml de Sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce)
durante 30 min a 4 C. La solucin de biotina se elimin y se enjuag dos
veces con PBS que con glicina 100mM (pH 8,0) a temperatura ambiente
para enfriar la reaccin. Las clulas se lavaron suavemente tres veces con
PBS y se lisaron a continuacin. La mitad del lisado celular se carg en un
gel de Tris-Acetato de 3-8% para determinar la expresin de protena total.
Igual cantidad de protenas biotiniladas se precipitaron mediante la adicin
de 50microL de perlas de estreptavidina-agarosa (Pierce) y se incubaron
durante la noche a 4 C. Las perlas de estreptavidina-agarosa se lavaron
tres veces y se incubaron con DTT 100 mM en 2x Tampn de muestra
Laemmli durante 1 hora a 37 C. Las protenas eluidas fueron resueltas por
SDS / PAGE. La inmunotransferencia para la protena citoslica de Akt se
utiliz como control para determinar que las protenas intracelulares no se
biotieron como resultado de dao celular.
Statistical Analysis Data are given as means SEM, and the statistical tests
used are either ANOVA with Bonferronis post hoc test or Students two-tailed
t test, as stated.
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Hendrich et al.

PNAS

March 4, 2008

vol. 105

no. 9

3633

Step potential (mV)

-40

-20

20

40

60

80

1.0
0.8

IBa (pA/pF)

transient Ca 2.1/
V

stable -2 cell line

-200

I/I max

-100

Control
chronic GBP (1 mM)

0.6
0.4
0.2

-300
0.0
-120

**

C
400

0.0

-40

40

+20 mV

-0.2

300

-0.4
-0.6
control
chronic GBP (1 mM)

-0.8

ininact
(ms)
ac

Normalized Current

-80

Conditioning potential (mV)

200
100

-1.0
0

250

500

750

Time (ms)

1000

control

1 mM GBP

Normalized Current

A
0.0
+20 mV

-0.2
-0.4
-0.6

control
chronic GBP
(100 M)

-0.8
-1.0
0

250

500

750

1000

500
400
300

200

inact

B
(ms)

Time (ms)

100
0

control

100 M GBP

2-2
(102-117 Ab)

GFP-Cav2.2

merge

regions of
co-localization

ii
+ GBP

iii
+ GBP

% of cells with non-uniform distribution

i
Con

control
+ 1mM GBP

***
60

***

50
40
30
20
10
0

WT -2

GFP-Ca 2.2
V

A
R282A

R282A

biotinylated

GBP (mM)

0.1

biotinylated

0.1

kDa

IB

160

Pull-down

WCL
B

-2 (102-117 Ab)
2

GFP-Ca 2.2

merge

R282A- -2

controlll
+ 1mM GBP

control

R282A
2-2
+ GBP

% of cells with non-uniform distribution

70
60
50
40
30
20
10
0

-2

GFP-Ca

2.2
V