Desenvolvimento de um mtodo de anlise de vitamina C em alimentos

por cromatografia lquida de alta eficincia e excluso inica

Development of a method for vitamin C analysis in food using high performance liquid
chromatography and ion exclusion
Jeane Santos da ROSA1,2*, Ronoel Luiz de Oliveira GODOY1,2, Joo OIANO NETO1,
Rodrigo da Silveira CAMPOS1,2, Virginia Martins da MATTA1, Cyntia Abreu FREIRE3,
Aline Soares da SILVA3, Rafael Santos de SOUZA4
Resumo
A vitamina C um nutriente extremamente importante para a fisiologia humana. No Brasil o consumo de vitamina C sob a forma de
concentrados vitamnicos ainda bastante restrito devido aos altos preos, restando para a maioria da populao o consumo via alimentos
como frutas e vegetais. A dosagem de vitamina C em alimentos tem, ento, um papel crucial no que diz respeito aos estudos ps-colheita para
a conservao e a minimizao das perdas deste nutriente to sensvel. Neste estudo, apresentado um mtodo para anlise de vitamina C
por cromatografia lquida de alta eficincia utilizando coluna de troca inica forma hidrognio, que demonstrou ser mais eficiente do que os
mtodos usuais por coluna de fase reversa (C18) para matrizes complexas e baixos teores do analito. A reproduo dos perfis cromatogrficos
foi em nvel de linha de base com picos de pureza espectral comprovada por detector de arranjo de diodos. Esse mtodo tambm foi avaliado
segundo a extrao mais adequada para estabilizao da vitamina C, e mostrou que a fase mvel (cido sulfrico suprapuro 0,05 M) foi
uma soluo extratora adequada para a estabilizao da vitamina C.
Palavras-chave: cido ascrbico; cido deidroascrbico; troca inica; partio por fase reversa.

Abstract
Vitamin C is an essential nutrient for human physiology. In Brazil, vitamin C supplements are expensive and most of the population obtains
vitamin C through its consumption of fruits and vegetables. Therefore, the vitamin C assay in food is crucial in post-harvest studies to conserve
and minimize losses of this highly sensitive nutrient. This study proposes a method for analyzing vitamin C by High Performance Liquid
Chromatography using a hydrogen type ion exchange column, and demonstrates that it is more efficient than the traditional methods of reverse
phase column (C18) for complex matrixes and low levels of this analyte. Chromatograms were baseline resolved and peak purity evaluation
showed spectral homogeneity by photo diode array detector. This method was also tested using the best extraction solution to stabilize vitamin
C, demonstrating that 0.05 M of superpure sulfuric acid (also the mobile phase) was the most efficient solution for this purpose.
Keywords: ascorbic acid; dehydroascorbic acid; ion exchange; reversed phase partition.

1 Introduo
Em 1912, Casimir Funk formulou uma teoria em que
dizia haver uma amina vital para a manuteno da sade do
organismo. Hoje se sabe que as vitaminas so grupos de substncias heterogneas constituintes dos alimentos, eficientes em
quantidades mnimas e essenciais vida14.
A atividade de uma vitamina medida em termos da remisso de uma leso que foi provocada pela sua ausncia no
metabolismo quando uma quantidade da vitamina em questo
ingerida.
A atividade vitamnica do cido ascrbico a ao antiescorbtica. O escorbuto uma doena que pode levar morte
e causada pela deficincia nutricional de vitamina C. Seus
principais sintomas so: o aparecimento de leses na mucosa

Recebido para publicao em 20/12/2006

Aceito para publicao em 7/6/2007 (002152)
1
Embrapa Agroindstria de Alimentos, Av. das Amricas, 29501,
CEP 23020-470, Rio de Janeiro - RJ, Brasil, E-mail: jeane@ctaa.embrapa.br
2
Departamento de Cincia e Tecnologia de Alimentos,
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRRJ, Km 7, BR 465,
Seropdica - RJ, Brasil
3
CEFET Qumica de Nilpolis, Rua Lcio Tavares, 1045, Centro,
Nilpolis - RJ, Brasil
4
Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Cidade Universitria, Ilha do Fundo, Rio de Janeiro - RJ, Brasil,
*A quem a correspondncia deve ser enviada

intestinal, hemorragias digestivas, vermelhido nas gengivas,

enfraquecimento dos dentes (reduo na ossificao), dores
agudas e inchao nos membros superiores e inferiores alm de
deficincia no processo de cicatrizao e hemorragia capilar5
Em 1965 a nomenclatura L-treo-2-hexenona-1,4-lactona ou
vitamina C foi modificada oficialmente para cido L-ascrbico
pela comisso de nomenclatura bioqumica da IUPAC (I
nternational Union of Pure and Applied Chemistry)15. O nome cido
ascrbico designa a atividade antiescorbtica da vitamina C e
deriva da antiga forma inglesa da palavra escorbuto (scorby).
Os seres humanos fazem parte do grupo de seres vivos
que no so capazes de sintetizar vitamina C. Especula-se
que estes seres vivos no possuem tal capacidade com a finalidade de aumentar as reservas de glicose, precursor do cido
ascrbico no organismo15. Devido ausncia da enzima
L-gulonalactona oxidase, os seres humanos no conseguem
transformar a glicose do sangue em cido ascrbico. A maioria
dos mamferos no primatas possui esta capacidade e tambm
um mecanismo de retorno atravs do qual o fgado aumenta a
sntese de cido ascrbico em resposta a um stress fisiolgico23. Insetos, rpteis, alguns pssaros e peixes tambm no
so capazes de sintetizar o cido ascrbico.
Desta forma, a necessidade de ingesto desta vitamina
vital para a sade e at mesmo para a sobrevivncia do ho-

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

837

Determinao de vitamina C por excluso inica

mem, pois o cido ascrbico participa de inmeras atividades

fisiolgicas. A dose diria mdia de vitamina C necessria para
prevenir o escorbuto de 46 mg2. No Brasil, a Ingesto Diria
Recomendada (IDR) de 60 mg1. Estes nveis so facilmente
atingidos com o consumo de frutas e vegetais frescos, mesmo porque no Brasil o consumo de vitamina C sob forma de
concentrados vitamnicos ainda bastante restrito devido aos
altos preos, restando para a maioria da populao o consumo
via alimentos. Os defensores da ingesto de altos teores de
vitamina C, porm, alegam que o escorbuto no o primeiro
sintoma desta deficincia e sim o colapso final, a sndrome prmorte, e h uma grande diferena entre ausncia de escorbuto
e sade completa7. Esta polmica cria dvidas na comunidade
cientfica at os dias de hoje a respeito de qual seria a melhor
IDR para a vitamina C.

determinando dois pares de estereoisomros: os cidos L

e D ascrbico (Figura 2a e 2b, respectivamente) e os cidos
D e L isoascrbicos (Figura 2c e 2d, respectivamente). So
epmeros (par de diastermeros que diferem entre si somente
na configurao de um nico tomo). Os cidos L-ascrbico
OH
HO

HO

H
(S)

OH

cido D-ascrbico
HO

OH

H
(R)

(S)

OH

cido L-isoascrbico ou
cido L-eritrbico

cido D-isoascrbico ou
cido D-eritrbico
O

HO

OH

O
O

OH
H

Ascorbato
Figura 2. Ismeros do cido ascrbico e radical livre ascorbato.

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

HO

HO

(S)

838

(R)

OH

H
cido L-ascrbico

HO

OH
HO

HO

OH

Figura 1. Estrutura da vitamina C.

(S)

OH

H
(R)

HO

OH

3
2

A molcula do cido ascrbico tem um anel lactona quase

planar com dois centros quirais nas posies 4 e 5 (Figura1),

HO

(R)

OH

ROSA et al.

e D-isoascrbico (este ltimo possui somente 5% de atividade vitamnica) e os cidos D-ascrbico e L-isoascrbico (no
possuem atividade vitamnica). A oxidao reversvel devido
perda de um tomo de hidrognio (perda de um eltron) leva
ao radical semideidroascrbico ou ascorbato (Figura 2e).
O anel 1,4 lactona estvel21 deriva de acares (hexoses).
O hidrognio ligado hidroxila no Carbono 3 (Figura 1), por
exemplo, mais cido (pK1= 4,17) do que o cido actico.
A acidez da vitamina C justificada primeiramente devido
extenso da conjugao da carbonila presente no carbono 1
(Figura 3), aumentando a caracterstica cida da hidroxila no
carbono 3. A hidroxila no carbono 2 faz parte de um enol e sua
acidez pouco maior que a do fenol (pKa= 11,57).

HO

OH HO

HO

OH

OH HO

HO

OH

O HO

OH

Figura 3. Acidez das hidroxilas na molcula do cido ascrbico.

O cido deidroascrbico (DIA) a forma oxidada do cido

ascrbico (AA) e possui atividade vitamnica idntica a este,
pois no organismo facilmente reduzido e novamente retido
como cido ascrbico nos tecidos intracelulares16. A oxidao
reversvel, que devido perda de dois eltrons (Figura 4), leva
ao cido L-deidroascrbico a propriedade qumica mais
importante e a base da atividade fisiolgica da vitamina C15.
A atividade antioxidante da vitamina C envolve doao de um
eltron e a formao do radical livre ascorbato.
O DIA pode ser reduzido a cido ascrbico in vivo por
enzimas ou glutationa, e in vitro por agentes redutores como
a homocistena, ditiotreitol (DTT) e bromina. Como extremamente lbil, pode ser rapidamente hidrolisado ao cido
2,3-diceto-L-gulnico (Figura 4) em pH neutro e 37 C, atravs de uma abertura irreversvel no anel da lactona6. O cido
2,3-diceto-L-gulnico no possui atividade antiescorbtica e a
hidrlise irreversvel in vivo.

cido ascrbico
HO
O

OH HO

OH

-2e

+2e

cido 2, 3
diceto-L-gulnico
HO
O
O HO
H
Hidrlise O
O

OH

H+/H2O

OH

OH OH

cido deidroascrbico
Figura 4. Reao de oxidao do cido ascrbico a cido deidroascrbico e de hidrlise deste ltimo ao cido 2,3 diceto-L-gulnico.

O cido deidroascrbico representa menos de 10% da

vitamina C total dos vegetais, tendendo a aumentar com o
perodo de estocagem. Por isso existem muitos trabalhos cujo
escopo dosar os teores de cido ascrbico e tambm deidroascrbico25. A separao conjunta de ambas as espcies (DIA

e AA) dificultada pela sensibilidade de deteco para o DIA

que ocorre a 210nm, aproximadamente. Este comprimento
de onda pertence a uma regio do espectro UV que possui
baixa especificidade (alta energia), desta forma a sensibilidade
para a deteco do DIA, que normalmente se apresenta em
baixos nveis, bastante complicada. Alm disso, o AA e o
DIA tambm no apresentam resposta conjunta em deteco
eletroqumica.
A estabilizao do cido deidroascrbico em soluo tambm requer timo controle de pH, pois a hidrlise deste em
cido 2,3 dicetogulnico muito dependente do pH26. Como
em alimentos naturais o cido deidroascrbico est presente
em nveis baixos, a escolha de um mtodo de dosagem de vitamina C total deve considerar o custo/benefcio dos resultados
obtidos. Esta escolha deve ser feita em nome da obteno de
uma separao cromatogrfica eficiente.
O cido ascrbico o nutriente mais afetado pelo processamento de frutas e vegetais, por isso sua reteno usada
freqentemente como indicativo da qualidade nutricional e
at mesmo de conservao dos alimentos3. Algumas vezes, at
mesmo interaes com outras substncias presentes no alimento contribuem para a diminuio dos nveis de vitaminaC. A
destruio desta, por exemplo, pode ser catalisada pela lumiflavina, produto de degradao da riboflavina (vitaminaB2)8,
que pode ser induzida pela presena de aminas (pois reaes
de escurecimento ocorrem com o cido ascrbico de forma
semelhante s que ocorrem com a glicose e outros acares)
ou ainda pela presena de enzimas como a cido ascrbico
oxidase17.
A vitamina C tambm amplamente usada na indstria de
alimentos como antioxidante para aromatizantes e gorduras
em geral, para cura de carnes, e at em farinha para melhorar
a textura das massas. Sua utilizao no po bastante importante, principalmente depois da proibio do uso de bromato
de potssio12. O uso do cido eritrbico ou D-isoascrbico vem
sendo diminudo na indstria de alimentos com a utilizao
crescente do cido ascrbico devido ao valor nutricional deste,
e tambm queda dos preos com a entrada de indstrias
chinesas no mercado, que sintetizam a vitamina C.
A determinao do cido ascrbico em alimentos bastante
complexa em funo dos baixos nveis em que este pode ser
encontrado, alm da presena de substncias interferentes da
matriz estudada que podem, inclusive, contribuir para a sua
degradao. Desta forma, mtodos empregados facilmente
para misturas multivitamnicas ou alimentos enriquecidos so
de difcil aplicao para dosar somente a vitamina C presente
naturalmente nos alimentos.
A separao de substncias que se ionizam utilizando
apenas cromatografia de fase reversa bastante complexa, necessitando de controle rgido de pH para que no haja equilbrio
entre as formas inica e molecular de uma mesma substncia
(pH de trabalho igual ao pKa do analito).
A fase estacionria de uma coluna de troca inica H+
constituda por uma resina de estireno divinilbenzeno em forma de gel e relativamente rgida devido s ligaes cruzadas
existentes. Esta coluna possui 8% de ligaes cruzadas sendo

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

839

Determinao de vitamina C por excluso inica

que, quanto menor o nmero destas, mais aberta ser a estrutura da resina e, portanto, mais permevel para substncias
de maior massa molecular.

As amostras slidas foram processadas em blender de

maneira a produzir uma polpa fina e uniforme para que a
extrao fosse homognea e reprodutiva.

A utilizao de uma coluna de troca inica torna a determinao de vitamina C bastante seletiva em funo da
combinao de tcnicas que este tipo de coluna permite, pois
na verdade o mecanismo de separao nesta coluna consiste
basicamente de excluso inica e partio por fase reversa. A
fora cida do eluente (H2SO4 0,05 M) pode ser ajustada para
melhorar a resoluo do analito ou excluir interferentes. Desta forma, cidos orgnicos, em geral, podem ser eludos em
ordem crescente de pKa. A resoluo da coluna tambm pode
ser controlada usando-se temperatura (mximo de 65 C), o
que no recomendado para o cido ascrbico. A adio de
modificadores orgnicos como acetonitrila, que reduzem as
interaes hidrofbicas e mantm a solubilidade do analito
orgnico tambm possvel. Isto ocorre porque um analito
que no possui carga interage bastante com a parte interna
da fase estacionria que apolar. Diminuindo-se a polaridade
da fase mvel pela adio de uma substncia orgnica estes
compostos eluem mais rapidamente da coluna, podendo-se
inclusive utilizar gradiente de fase mvel.

Os vegetais estudados segundo o mtodo proposto, por

coluna de troca inica, foram: batata, mandioca e tomate,
alm de sucos de goiaba, abacaxi, maracuj, ma, laranja e
gua de coco.

A separao no ocorre por mecanismo de troca inica

uma vez que o pH da fase mvel (aproximadamente 1,3) aliado ao pH dos stios SO3 H+ (trocadores de ctions) da coluna
produzem um pH de quase zero dentro da fase estacionria10,
no permitindo, portanto, que o cido ascrbico esteja na forma
ionizada. Interferentes que se ionizam neste pH so separados
pelo mecanismo de excluso inica.

A soluo de cido sulfrico suprapuro 0,05 M utilizada

como soluo extratora foi tambm escolhida como fase mvel.
A coluna BIORAD Aminex HPX87H foi escolhida como fase
estacionria do sistema cromatogrfico.

O objetivo deste estudo foi apresentar um mtodo simples

e rpido para a determinao de vitamina C em alimentos,
utilizando uma coluna de troca inica forma H+. Este mtodo
tambm foi comparado a um mtodo convencional20 por coluna
C18 e avaliado segundo o tipo de soluo extratora utilizada.

2 Materiais e mtodos

A amostra estudada durante a comparao da separao

entre os dois mtodos foi polpa de manga.
A amostra utilizada na comparao entre solues extratoras para o mtodo de troca inica foi suco de maracuj.
Todas as amostras foram obtidas no comrcio varejista da
cidade do Rio de Janeiro.

2.2 Preparo da amostra e condies de anlise

segundo mtodo proposto por coluna de troca inica
As amostras foram pesadas em balana analtica, extradas com cido sulfrico suprapuro 0,05 M em ultrassom por
10minutos, levadas a volume conhecido, filtradas em unidade
filtrante descartvel de Teflon hidroflico e colocadas em frasco
mbar com tampa de rosca e septo de silicone.

A vazo da fase mvel foi de 0,8 mL/minuto, o volume de

injeo de 20 L e o comprimento de onda, 242,6 nm.

2.3 Preparo da amostra e condies de anlise

segundo mtodo convencional por coluna C18
As amostras foram pesadas em balana analtica e levadas
a volume conhecido com cido metafosfrico 3% (m.v 1), filtradas em unidade filtrante descartvel de Teflon hidroflico
e colocadas em frasco mbar com tampa de rosca e septo de
silicone.

2.1 Reagentes e equipamentos

A fase mvel consistiu de tampo fosfato pH 2,5 e a coluna

utilizada foi uma C18 Waters Novapak 5 , 150 x 3,4 mm.

O padro de vitamina C foi obtido de Sigma-Aldrich, o cido

sulfrico suprapuro de Merck CO e a gua tipo I de sistema
de ultrapurificao Milli-Q A10.

A vazo da fase mvel foi de 1,0 mL/minuto, o volume de

injeo de 20 L e o comprimento de onda 254 nm.

A coluna de troca inica forma hidrognio Aminex

HPX87H (7,8 x 300 mm) e foi fabricada por BIORAD.

2.4 Teste de estabilizao do cido ascrbico em

funo da soluo extratora utilizada

Na comparao entre mtodos a coluna C18 utilizada foi

Waters Novapak (4,6 x 150 mm) e o cromatgrafo lquido foi
um modelo Shimadzu 10A.
Na comparao entre solues extratoras e demais anlises de frutas e vegetais o cromatgrafo lquido utilizado foi
Waters Alliance 2695 com detector de arranjo de diodos
Waters 2996.
O cido oxlico, o cido metafosfrico, o EDTA e o fosfato
de potssio utilizados foram obtidos de Merck CO.

840

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

EDTA como agente estabilizante: foram preparadas

10 repeties de solues padro de vitamina C com
concentrao aproximada de 1 mg.mL1 com soluo
de EDTA 0,05% (m.v 1) em cido sulfrico PA 0,05 M.
As solues foram injetadas no sistema cromatogrfico
imediatamente aps o preparo.
cido oxlico como agente estabilizante: foram preparadas 10 repeties de solues padro de vitamina C com
concentrao aproximada de 1 mg.mL1 com soluo de
cido oxlico 6% (m.v 1) em cido sulfrico PA 0,05 M.

ROSA et al.

As solues foram injetadas no sistema cromatogrfico

imediatamente aps o preparo.
cido metafosfrico como agente estabilizante: foram preparadas 10 repeties de solues padro de vitamina C
com concentrao aproximada de 1 mg.mL1 com soluo
de cido metafosfrico 3% (m.v 1) em cido sulfrico PA
0,05 M. As solues foram injetadas no sistema cromatogrfico imediatamente aps o preparo.
Somente cido sulfrico suprapuro como agente estabilizante: foram preparadas 10 repeties de solues
padro de vitamina C com concentrao aproximada de
1 mg.mL1 com soluo de cido sulfrico suprapuro
0,05 M, somente. As solues foram injetadas no sistema
cromatogrfico imediatamente aps o preparo.

Quantificao de amostra de suco de maracuj

Foram preparadas 10 repeties de preparo de uma amostra de suco de maracuj extrada com soluo de EDTA 0,05%
(m.v 1) em cido sulfrico PA 0,05 M e quantificadas quanto ao
teor de vitamina C a partir de um padro de calibrao preparado da mesma forma. Outras 10 replicatas da mesma amostra foram extradas somente com cido sulfrico suprapuro
0,05M e tambm quantificadas quanto ao teor de vitamina C a
partir de um padro de calibrao preparado da mesma forma.
O teor de vitamina C informado no rtulo do suco de maracuj
foi de 30 mg de vitamina C para 200 mL de suco.

3 Resultados e discusso
Com relao rapidez e simplicidade o preparo da amostra foi fundamental. O uso da coluna de troca inica diminuiu
o envolvimento do operador, pois o manuseio e as perdas de
amostra so mnimos. Os possveis erros na execuo das
atividades foram assim minimizados.
A extrao com a prpria fase mvel (cido sulfrico suprapuro 0,05 M) tambm fez parte deste processo de simplificao, pois no foi necessrio preparar solues tampo com
extremo controle de pH ou solues salinas a fim de estabilizar
a vitamina C (vide item 3.3). Optou-se somente por utilizar um
cido sulfrico de alta pureza (suprapuro) para que este no
trouxesse para o meio extrativo contaminaes por ons metlicos que pudessem degradar a vitamina C recm extrada.
A rapidez do preparo da amostra e a tima resoluo cromatogrfica deste mtodo no excluem a possibilidade de que,
frente a matrizes ainda no testadas, seja necessrio incluir
alguma etapa extra de limpeza da amostra como, por exemplo,
extrao em fase slida com cartuchos C18 ou desengorduramento para o caso de matrizes animais.
A utilizao do cido sulfrico 0,05 M (pH 1,3), como fase
mvel, faz parte do mecanismo de separao da coluna utilizada, cuja forma inica H+ proveniente do cido sulfnico ligado
resina. O cido sulfrico utilizado, pois um cido forte o
bastante para manter a maioria dos cidos orgnicos na forma
molecular. O cido sulfnico (pKa < 1) da resina permanecer
ionizado no pH da fase mvel.

O controle do pH foi requerido para que ocorresse supresso inica j que partculas com carga possuem baixa interao
com a fase estacionria apolar. No caso do cido ascrbico
(pKa14,2), a diminuio do pH para valores menores que 4,2
alm de evitar que o equilbrio entre as formas inica e molecular acontecesse, deslocou este equilbrio no sentido da forma
molecular da vitamina C devido ao aumento da concentrao
de ons hidrognio em soluo.

3.1 Avaliao de cromatogramas obtidos pelo

mtodo proposto com coluna de troca inica
As Figuras 5 e 6 representam, respectivamente, cromatogramas com espectro UV de um padro de vitamina C e de uma
amostra de tomate. Os cromatogramas obtidos demonstram
separao do pico da vitamina C em nvel de linha base, e o
espectro demonstra que a absoro mxima desta na regio
do ultravioleta foi de 242,6 nm.
A Figura 7 apresenta a avaliao de pureza espectral (peak
purity) encontrada para a amostra de tomate. Esta outra ferramenta importante do detector de arranjo de diodos. O critrio
estabelecido pelo equipamento que o ngulo de pureza (purity)
encontrado para a amostra deve ser menor que o ngulo limite
(Auto Threshold) medido, levando-se em considerao vrias
tomadas de absoro mxima no UV ao longo do pico e tambm o nvel de rudo encontrado. Como pode ser observado,
o ngulo de pureza menor que o ngulo limite. Desta forma
o pico foi considerado espectralmente puro.
A Tabela 1 se refere a teores de vitamina C encontrados
nas diversas matrizes vegetais estudadas.
A resoluo obtida nas matrizes acima foi considerada
tambm excelente, mas no exclui a possibilidade de que, frente
a matrizes ainda no testadas, seja necessrio incluir alguma
etapa extra de limpeza da amostra como, por exemplo, extrao em fase slida com cartuchos C18 ou desengorduramento
para o caso de matrizes animais para as quais o mtodo ainda
no foi testado.
A comparao do mtodo descrito por RIZZOLLO e
OLESELLO20 e o mtodo por coluna de troca inica deP
monstrada atravs das Figuras 8 e 9, respectivamente. Estas
mostram os resultados de ambos os mtodos na anlise de
uma amostra de polpa de manga irradiada. Pode-se notar a
separao insuficiente da vitamina C das substncias interferentes presentes na matriz da amostra (Figura 8b) coincidente
com o tempo de reteno do padro (Figura 8a) para o mtodo
RIZZOLLO e POLESELLO20. A Figura 9 diz respeito ao mtodo
proposto com coluna de troca inica e revela um pico deste
analito resolvido em nvel de linha base e sem deformaes
decorrentes da coeluio de interferentes (Figura 9b) que tambm coincide com o tempo de reteno do padro (Figura9a)
nesta coluna.
O mtodo por fase reversa demonstrou separao insuficiente e baixa resoluo. O mtodo por coluna de troca inica,
porm, demonstrou separao completa para o cido ascrbico. A mudana de tipo de fase estacionria (slica para polmero
com trocador inico) mostrou-se bastante eficiente, eliminando

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

841

0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
4,00

4,1097 Minutos 0.06414 AII

6,00

8,00

10,00

12,00

Minutos

0,02
0,00
300,00
5,00 10,00
Minutos

325,6
220,00

2,00

0,04

380,00

AU

0,060

0,06

360,00

0,070

0,08

340,00

0,080

AU

Vit. C - 8,400

Minutos

242,6

0,085
0,080
0,075
0,070
0,065
0,060
0,055
0,050
0,045
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000

320,00

243,8
8,00 10,00 12,00

300,00

6,00

280,00

4,00

AU

2,00

260,00

380,00
220,00

240,00

AU

Determinao de vitamina C por excluso inica

nm
Figura 5. Cromatograma de um padro de calibrao de cido ascrbico extrado do espectro a 242,6 nm, obtidos do detetor de arranjo de
diodos (PDA).

380,00

10,00

360,00

8,00

5,00
10,00
Minutos

340,00

4,00
6,00
Minutos

0,00
300,00

320,00

AU

2,00

0,02

300,00

10,00

Vit. C - 8,417

0,080
0,070
0,060
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000

8,00

0,04

280,00

4,00
6,00
Minutos

AU

2,00

0,06
AU

243,9

260,00

250,00

0,08

240,00

300,00

242,6

220,00

AU

350,00

0,090
0,085
0,080
0,075
0,070
0,065
0,060
0,055
0,050
0,045
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000

nm

Figura 6. Cromatograma e espectro de UV obtidos pelo detetor de arranjo de diodos (PDA).

os interferentes e permitindo uma resoluo cromatogrfica de

linha base. A vazo de fase mvel utilizada nesta avaliao foi
de 1,0 mL/min e o comprimento de onda 254 nm.

3.2 Teste de estabilizao do cido ascrbico em

funo da soluo extratora utilizada
Este teste foi realizado em duas partes principais com o
objetivo de verificar a capacidade de estabilizao do cido

842

ascrbico por solues extratoras diferentes em soluo padro

e em uma amostra escolhida aleatoriamente.
O processo de degradao do cido ascrbico bastante
complexo e contm um grande nmero de processos de oxidao/reduo e reaes de rearranjos intermoleculares. A
degradao iniciada com a oxidao do grupo enediol mais
reativo atravs da ao de grupos pr-oxidantes como perxidos, radicais hidroxi e tambm ons metlicos. Quando o

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Limite automtico

Pureza

Sample: vit c - manga

ID: PADRO
Sample Amount: 1
Type: Standard
Detector: Other
Operator:
Method Name: VITC3001.M01

Vit. C - 8,432

***Chromatogram*** Filename:VITC3001.C01
mV
3,565

0,150
0,140
0,130
0,120
0,110
0,100
0,090
0,080
0,070
0,060
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
-0,010

100

7,60
7,65
7,70
7,75
7,80
7,85
7,90
7,95
8,00
8,05
8,10
8,15
8,20
8,25
8,30
8,35
8,40

AU

ROSA et al.

Minutos

Tabela 1. Teor de vitamina C em matrizes vegetais diversas.

Teor de vitamina C encontrado (mg.100 g 1)
0,88
21,03
51,18
16,58
8,79
15,60
40,21
56,91
16,30
39,82
85,33

4
Minutos

***Peak Report***
PKNO TIME AREA HEIGHT MK IDNO CONC NAME
1 3,061
1246
172
1
vit c
2 3,565 640603
76346

Entre as solues mais utilizadas para extrair o cido ascrbico e tambm estabiliz-lo, pode-se citar o cido oxlico ou
o cido metafosfrico 3-6% (m.v 1). Estes cidos so capazes de
prevenir a oxidao do cido ascrbico pela ao de ons cobre
(II) ou ferro (III). Ao cido metafosfrico tambm reportada a
habilidade de precipitar protenas e com isso inativar enzimas
como a cido ascrbico oxidase13. Solues de EDTA, um agente
quelante que retira ons metlicos do meio, tambm so citadas
como fatores de estabilizao do cido ascrbico.
Uma soluo de EDTA 0,05% (m.v 1) foi reportada como
fator de aumento da estabilidade do cido ascrbico em soluo

***Chromatogram*** Filename:VITC1903.C35

20

Pico da
Vitamina C

10

5,754

mV

4,208
4,463
4,888

Em formulaes ou quando adicionada em alimentos a

vitamina C pode ser estabilizada por esterificao da hidroxila
com cidos orgnicos de cadeia longa ou ainda cidos inorgnicos4. Em uma anlise de vitamina C, no entanto, a necessidade
de aumentar a estabilidade do cido ascrbico recm extrado
da matriz de alimento est relacionada ao meio extrator e s
condies de manipulao como luz e temperatura que afetam
significantemente a recuperao do cido ascrbico19.

3,730

cido ascrbico dissolvido em gua, o pH da soluo diminui

devido ionizao parcial do grupo enediol no carbono 311. A
estabilizao do cido ascrbico se d atravs de acrscimo de
H+, dificultando sua ionizao, estabilizando o grupo hidroxila
e conseqentemente o anel da lactona, prevenindo a hidrlise
irreversvel ao cido 2,3-dicetogulnico9.

Sample: vit c - manga irr.

ID: 141-1
Sample Amount: 9,9105
Type: Unknown
Detector: Other
Operator:
Method Name: VITC1903.035

2,453

Matriz da amostra
gua de coco
Tomate
Suco de abacaxi
Suco de manga
Suco de ma
Suco de maracuj
Suco de caju
Suco de laranja
Suco de goiaba
Batata
Mandioca

50
3,061

Figura 7. Grfico de pureza espectral: o ngulo de pureza deve ser

menor que o ngulo limite (Threshold).

0
0

4
Minutos

***Peak Report***
PKNO
1
2

TIME AREA HEIGHT

2,453 71952
1266
3,730 430906
21423

MK IDNO CONC NAME

1 7,3225
vit c

Figura 8. Mtodo RIZZOLLO e POLESELLO20, sendo: a) Injeo de

padro de vitamina C; e b) Injeo de uma amostra de polpa de manga
irradiada.

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

843

Determinao de vitamina C por excluso inica

Sample: p cal final

ID: met TI e ac.
Sample Amount: 100
Type: Unknown
Detector: Other
Operator:
Method Name: VITCTI.MET

de cido sulfrico PA 0,05 M. ASHOOR et al.3 afirmam que a

utilizao de uma soluo de EDTA aumentou a rea do pico
do padro de cido ascrbico trs vezes, sendo este essencial
para aumentar a sensibilidade e reprodutibilidade do mtodo
em questo.

O mtodo acima citado tambm utilizou uma coluna HPX

87H BIORAD e cido sulfrico 0,005 M como fase mvel.
Baseando-se nesta observao, resolveu-se testar as afirmaes quanto ao uso de EDTA e tambm dos cidos oxlico e
metafosfrico na extrao e estabilizao e at mesmo no aumento da sensibilidade de deteco do cido ascrbico. Estas
hipteses foram testadas em solues padro de vitamina C.
Todas as solues foram feitas em cido sulfrico PA 0,05 M
em funo da necessidade da coluna cromatogrfica utilizar
esta fase mvel e tambm para avaliar o efeito da pureza do
cido sulfrico.

***Chromatogram*** Filename: VITC2703.C07

6,540

mV
100

50

0
0

Minutos

10

***Peak Report***
PKNO TIME
AREA HEIGHT MK IDNO
1 6,540 1279401
94089
1

CONC NAME
0,2428
vit c

Sample: teste de manga

ID:
Sample Amount: 100
Type: Unknown
Detector: Other
Operator:
Method Name: VITCTI.MET
***Chromatogram*** Filename: VITC2703.C06

Os resultados (Figura 10) demonstraram que a maior

degradao ocorreu na soluo com cido oxlico (pH 1,3),
seguida pela soluo com cido metafosfrico (pH 1,4). A soluo com EDTA (pH 1,2) obteve comportamento pouco menos
eficiente que a de cido sulfrico suprapuro 0,05 M (pH 1,3).
Desta forma, considera-se que a soluo de cido sulfrico
suprapuro 0,05 M uma boa escolha para estabilizar a vitamina C e tambm manter a idia de praticidade do mtodo, no
inserindo neste o preparo de outra soluo extratora diferente
da fase mvel.

6,536

mV

0
0

Minutos

9,680

5,475

5,143

8,172

Pico da
Vitamina C

50

Os resultados foram reportados em termos de fator de

resposta, pois quanto menor o fator de resposta, maior a rea,
e conseqentemente menor ter sido a degradao do padro
de cido ascrbico.
As solues padro foram preparadas e injetadas no
sistema cromatogrfico imediatamente aps o preparo para
evitar possveis problemas de degradao da vitamina C com
o tempo, embora estudos prvios tenham verificado que em
aproximadamente 2 horas de espera no injetor automtico,
no houve mudana na resposta da soluo padro de cido
ascrbico22.

100

cido metafosfrico, cido oxlico, EDTA e

cido sulfrico suprapuro 0,05 M como agentes
estabilizantes

10

A hiptese verificada por ASHOOR et al.3 de que a adio

de EDTA aumentaria a rea do pico da vitamina C no padro
de calibrao no foi confirmada e, portanto, no mostrou,
neste caso, aumento na sensibilidade do mtodo.

***Peak Report***
PKNO
1
2
3

TIME
AREA HEIGHT MK IDNO CONC NAME
5,143
1988
275
5,475
27977
2595
6,536 3111466 241066
1 0,5904 vit c

Figura 9. Mtodo proposto por coluna de troca inica, sendo: a) Injeo de padro de vitamina C; e b) Injeo de uma amostra de polpa
de manga irradiada.

844

Quantificao de amostra de suco de maracuj

Este experimento objetivou testar a eficincia das solues
extratoras que forneceram os melhores resultados na avaliao
da soluo padro, verificando a estabilizao da vitamina C
em soluo de EDTA 0,05% (m.v 1) e cido sulfrico PA 0,05M
contra a soluo de cido sulfrico suprapuro 0,05 M na extrao de uma amostra, e com isso avaliar o efeito de matriz. A
amostra escolhida aleatoriamente foi suco de maracuj.

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(4): 837-846, out.-dez. 2007

ROSA et al.

Concentrao: mg.100 g 1

6,00E-07

Fator de Resposta (FR)

5,00E-07

4,00E-07

3,00E-07

20,00

Recuperao de vitamina C

18,00
16,00
14,00
12,00
10,00
EDTA 0,05% em cido
sulfrico PA 0,05 M

2,00E-07

cido sulfrico suprapuro

0,05 M

Figura 11. Extrao de vitamina C em suco de maracuj utilizando

solues extratoras diferentes. Barras verticais representam o erro
padro da mdia.

1,00E-07

0,00E+00
c. sulfrico suprapuro 0,05 M
EDTA 0,05% em c. sulfrico PA 0,05 M
cido metafosfrico 3% em c. sulfrico PA 0,05 M
c. oxlico 6% em c. sulfrico PA 0,05 M
Figura 10. Comparao da resposta obtida aps anlise de cido
ascrbico em diversas solues extratoras. Os resultados esto expressos pelo fator de resposta, o qual inversamente proporcional
quantidade de AA extrada. Barras verticais representam o erro
padro da mdia.

Os teores mdios em mg de vitamina C por 100 mL de

suco, obtidos nas 10 repeties com a soluo de EDTA e somente com cido sulfrico suprapuro 0,05 M foram, respectivamente, 14,36 0,21 e 15,60 0,13 (Figura 11 e Tabela 2).
O teor informado no rtulo foi de 15 mg.100 mL1. Somente a
diferena de aproximadamente 1,2 mg de vitamina C ocorrida
entre as duas extraes no permite concluir que a soluo
de cido sulfrico suprapuro extraia e/ou estabilize melhor a
vitamina C no meio (embora no tenha ocorrido sobreposio
das barras de erro e a variao entre as medidas para esta
soluo extratora tenha sido menor), mas permite concluir
que a soluo de EDTA no imprescindvel para o mtodo e
tambm no aumenta a sensibilidade deste.
Os nveis pouco mais altos encontrados para esta extrao
podem ser justificados pela adio de cido ascrbico no suco
(indicada no rtulo do produto) que funciona como antioxidante
a fim de evitar mudanas de colorao24.

4 Concluses
A comparao entre os mtodos por coluna de troca inica
(na verdade uma combinao de partio por fase reversa e
excluso inica) e o mtodo por fase reversa demonstraram a
eficincia do primeiro at mesmo para uma matriz complexa
e com baixo teor de vitamina C.
Os perfis cromatogrficos obtidos, aliados aos dados de
espectro UV, incluindo a ferramenta de pureza espectral, permitiram concluir que o mtodo ofereceu excelente seletividade e
separao para a vitamina C presente nas amostras testadas.

Tabela 2. Teores em mg.100 mL 1 encontrados nas duas solues

extratoras testadas.
Repetio
am
am
am
am
am
am
am
am
am
am

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Mdia

c. sulfrico suprapuro
0,05 M
16,31
15,24
14,92
15,82
16,01
15,58
15,76
15,57
15,20
15,00

0,05% de EDTA em c.
sulfrico PA 0,05 M
15,70
15,33
14,21
14,27
14,53
14,23
14,11
13,70
13,82
13,67

15,54

14,36

Desvio padro

0,45

0,67

CV (%)

2,90

4,69

Os testes que avaliaram a estabilizao da vitamina C levam concluso de que o uso de fase mvel (soluo de cido
sulfrico suprapuro 0,05 M), alm de conferir maior rapidez
ao mtodo, no produz perdas de vitamina C.
Diante dos resultados obtidos pode-se afirmar que o mtodo proposto neste estudo bastante vantajoso para a anlise
de vitamina C em matrizes vegetais.

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