TEMA 10

Cultivo y aislamiento de
patgenos viables

Tema 10. Cultivo y aislamiento de patgenos viables

1. Medios de cultivo
2. Preparacin de medios de cultivo artificiales
3. Condiciones para el aislamiento de patgenos
3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxgeno
3.1.1. Incubacin de microorganismos microaerfilos y
capnfilos
3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura
3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de
incubacin
4. Medios artificiales
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario
4.1.1. Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)
4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)
4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento
4.2.1. Caldo selenito
4.3. Ejemplos de medios enriquecidos
4.3.1. Agar sangre
4.4. Ejemplos de medios diferenciales
4.4.1. Agar de MacConkey
4.4.2. Agar salino manitol (SM)

Tema 10. Cultivo y aislamiento de patgenos viables

4. Medios artificiales (continuacin)
4.5. Ejemplos de medios selectivos
4.5.1. Agentes inhibidores
4.5.2. Agar entrico de Hektoen (HE)
4.5.3. Agar alcohol fenil etlico (PEA)
4.6. Medios cromognicos
5. Recuento de patgenos
5.1. Mediante la tcnica de estra en placa
5.2. Mediante la utilizacin de asa calibrada
6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados

1. Medios de cultivo

Regla de oro de la Microbiologa

Muestra

Cultivo y
aislamiento de
microorganismos

Identificacin
Cultivo puro
Realizacin
pruebas
susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del

diagnstico microbiolgico

1. Medios de cultivo
Qu es un medio de cultivo?

2. Preparacin de medios de cultivo artificiales

Preparacin

Esterilizacin
Autoclave
Tindalizacin
Filtracin
Luz UV
Horno a 180 C
xido de etileno

Adicin de sustancias
termolbiles

Vertido en placas de Petri

(medios slidos) o tubos
(medios lquidos o medios
slidos)

3. Condiciones para el aislamiento de patgenos

Medio de cultivo
No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampn.
Exigentes: nutrientes ms sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas).

Condiciones de incubacin
Atmsfera
Temperatura
Humedad
Tiempo de incubacin
pH
Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxgeno

Aerobios
Anaerobios facultativos

Anaerobios

Microaerfilos
Frascos con vela
Agar semislido

Capnfilos
Atmsfera de CO2

Crecimiento
A: Aerobios obligados

Sistemas GasPak, Bio Bag

B: Microaerfilos

(bicarbonato y cidos)
Utilizacin de estufas de CO2

C: Anaerobios facultativos
D: Anaerobios estrictos

3.1.1. Incubacin de microorganismos microaerfilos y capnfilos

3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura

Temperatura de incubacin
35-37 C
30 C

Otras temperaturas
Elevadas (42 C)
Bajas (4C)

enriquecimiento en fro

Intermedias (22 C)

3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de incubacin.

pH

Tiempo de incubacin

4. Medios artificiales

Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos)

Medios enriquecidos

Caldos de enriquecimiento

Medios diferenciales

Medios selectivos

Medios cromognicos

4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario

Agar nutritivo

Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)

Agar triptona soja (TSA)

Agar sangre

Agar chocolate

Agar CLED (urocultivo)

Caldo con carne picada

4.1.1. Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)

Componentes

Cantidad

Propiedad

Extracto de cerebro

7,8 g/L

Fuente de nutrientes

Extracto de corazn

9,7 g/L

Fuente de nutrientes

Peptona

10 g/L

Fuente de protenas

Glucosa

2 g/L

Hidrato de carbono

Tampn fosfato

2,5 g/L

Regulacin pH

NaCl

5 g/L

Estabilizador osmtico

Agar

15 g/L

Medio rico, no selectivo, permite crecimiento

de la mayora de microorganismos no exigentes.
Ausencia de agentes inhibidores.

Agente solidificante

4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)

Componentes

Cantidad

Digerido pancretico de gelatina

Digerido pancretico de casena
Extracto de carne
Lactosa
L-cistina
Azul de Bromotimol
Agar

4 g/L
4 g/L
3 g/L
10 g/L
0,128 g/L
0,02 g/L
15 g/L

La lactosa es el nico carbohidrato presente. Permite diferenciar los

fermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presencia
del indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a pH cido.
Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de
Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.
La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.

4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Caldo selenito

Salmonella

Caldo tetrationato

Salmonella y Shigella

Caldo para Gram negativos

Salmonella y Shigella

Se debe subcultivar en medios ms selectivos al cabo de unas horas

4.2.1. Caldo selenito

Componentes

Cantidad

Propiedad

Peptona

5 g/L

Fuente de protenas

Lactosa

4 g/L

Fuente de carbono

Selenito de sodio

4 g/L

Agente inhibidor de la mayora de

enterobacterias, incluyendo muchas
especies de Shigella

Fosfato de sodio

10 g/L

Tampn

Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas

fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio ms selectivo (Agar SS o
Agar sulfito de bismuto).

4.3. Ejemplo de medios enriquecidos

4.3.1. Agar sangre
Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada
Componentes
Peptona
Triptena
Extracto de levadura
Extracto de corazn (buey)
Almidn soluble
Cloruro sdico
Agar

Cantidad
5 g/L
12 g/L
3 g/L
3 g/L
1 g/L
5 g/L
15 g/L

Medio rico y diferencial.

La sangre ms comnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estril y desfibrinada.
Una vez preparado el medio de cultivo, se enfra hasta 45C y se le aade la
sangre.

4.3.1. Agar sangre

CARACTERSTICAS DE LA BETA Y ALFA HEMLISIS

Beta hemlisis

Alfa hemlisis

Lisis completa de los glbulos rojos

Halo transparente alrededor de la colonia
Lisis parcial de los glbulos rojos
Se abren poros en la membrana
Salida de hemoglobina al medio
Oxidacin del grupo hemo
Formacin de biliverdina (color verdoso)
Halo verdoso alrededor de la colonia

4.4. Ejemplos de medios diferenciales

Agar sangre

Agar CLED

Agar EMB

Agar de MacConkey

Agar SS

Agar entrico de Hektoen (HE)

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Agar salino manitol (SM)

4.4.1. Agar de MacConkey

Componentes

Cantidad

Propiedad

Peptona

17 g/L

Fuente de protenas

3 g/L

Fuente de protenas

10 g/L

Azcar fermentable

Polipeptona
Lactosa
Sales biliares (conc. moderada)

1,5 g/L

Inhibidor de Gram positivos

Cristal violeta

0,001 g/L

Inhibidor de Gram positivos

NaCl

5 g/L

Estabilizador osmtico

Rojo neutro

0,03 g/L

Indicador de pH

Agar

13,5 g/L

Agente solidificante

Aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram negativos fermentadores

y no fermentadores de la lactosa.

4.4.1. Agar de MacConkey

Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patgenos (E. coli, Citrobacter)
Patgenos (Klebsiella,
Enterobacter)
Colonias transparentes/blancas
No fermentan la lactosa
Patgenos (Salmonella, Shigella,
Yersinia, Proteus)
Precipitacin en el medio
Fermentadores fuertes de lactosa
(E. coli, Enterobacter)

4.4.2. Agar salino manitol (SM)

Medio de Chapman
Componentes
Extracto de levadura
Triptona
Gelatina
Lactosa
Manitol
Cloruro sdico
Fosfato dipotsico
Rojo fenol
Agar

Cantidad
2,5 g/L
10 g/L
30 g/L
2 g/L
10 g/L
75 g/L
5 g/L
0,025 g/L
15 g/L

Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no

lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio cido.
La mayora de los microorganismos no crecen a una concentracin de cloruro
sdico del 7,5%, mientras que los estafilococos s lo hacen.

4.5. Ejemplos de medios selectivos

Moderadamente selectivos
MacConkey

Enterobacterias

EMB

Enterobacterias

Altamente selectivos

Agar salino manitol

Staphylococcus

Agar SS

Salmonella y Shigella

Agar entrico de Hektoen (HE)

Salmonella y Shigella

Agar sulfito de bismuto

Salmonella y Shigella

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Salmonella y Shigella

Agar alcohol fenil etlico (PEA)

Gram positivos

4.5.1. Agentes inhibidores

Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina)

Antibiticos
Metales (Se, Bi)
Sales biliares
Azida
Alcoholes (alcohol feniletlico)
Sales (cloruro sdico a alta concentracin)

4.5.2. Agar entrico de Hektoen (HE)

Componentes
Peptona

Cantidad
12 g/L

Propiedad
Fuente de C y N

Extracto de levadura

3 g/L

Fuente de N

Sales biliares (alta conc.)

9 g/L

Inhibidor de Gram positivos

Lactosa

12 g/L

Azcar fermentable

Sacarosa

12 g/L

Azcar fermentable

NaCl

5 g/L

Estabilizador osmtico

Tiosulfato de sodio

5 g/L

Fuente de azufre

Citrato frrico amnico

1,5 g/L

Fuente de hierro

Azul de timol

0,04 g/L

Indicador de pH

Agar

14 g/L

Agente solidificante

Aislamiento y diferenciacin de especies de Salmonella y Shigella de otros

bacilos entricos Gram negativos en muestras fecales.

4.5.2. Agar entrico de Hektoen (HE)

Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se

ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras.
Salmonella tiene un punto negro central por la produccin de sulfhdrico
(sulfuro de hierro precipitado). La mayora de las especies de Shigella no
producen sulfhdrico.

4.5.3. Agar Alcohol Feniletlico (PEA)

Componentes
Extracto de carne
Triptosa

Cantidad
3 g/L
10 g/L

Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N

Feniletanol

2,5 g/L

Inhibidor de Gram negativos

Cloruro de sodio

5 g/L

Estabilizador osmtico

Agar

15 g/L

Agente solidificante

Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y

estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta.
La adicin de alcohol fenil etlico inhibe o reduce drsticamente el crecimiento de
bacterias Gram negativas porque inhibe la sntesis de ADN. Adems, previene la
proliferacin de colonias invasivas tipo swarming.
El alcohol fenil etlico es un antimicrobiano, antisptico y desinfectante que
tambin se utiliza como esencia aromtica y preservativo en farmacia y
perfumera.
Las placas de este medio recin preparadas huelen a rosas.

4.5.3. Agar Alcohol Feniletlico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un

excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en
muestras clnicas donde hay una microbiota abundante y heterognea que
contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rpido tal como Proteus.

4.6. Medios cromognicos

Medios altamente selectivos y diferenciales.
Incorporan sustratos incoloros que se
transforman en productos con color
(cromognicos) tras actuar sobre ellos una
enzima especfica.
Deteccin de actividades enzimticas
caractersticas de determinados gneros o
especies de bacterias.
- galactosidasa
- glucosidasa
- glucuronidasa
La produccin de un color caracterstico permite la identificacin.
ONPG

- galactosidasa

Incoloro

ONP + galactosa
Amarillo

4.6. Medios cromognicos

Ejemplos de medios cromognicos

Agar CPS-ID3

Chromogenic UTI

CHROMAgar Orientation

URI Select 4

5. Recuento de patgenos
5.1. Mediante la tcnica de estra en placa

Estimacin del nmero de

microorganismos en la
muestra original en funcin
del crecimiento:

Escaso

Moderado

Abundante

5.2. Mediante la utilizacin de asa calibrada

6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados

Crecen slo dentro de clulas (clamidias, ricketsias, virus)

No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo

Legionella pneumophila (Agar BCYE)

Cultivos de tejidos en el laboratorio

Cultivos primarios (n cromosomas=2n)
Clulas de rin
Fibroblastos
Lneas celulares continuas (aberraciones en el n de cromosomas,
aneuploida)
Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile)
McCoy (Clamidias)
A-549, RD, MDCK (Virus)

6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados