Laboratorio 2 :

Preparacin de medios de cultivo, clasificacin de

medios y esterificacin de material.
I.

OBJETIVOS

Reconocer los distintos medios de cultivo.

Diferenciar los tipos y equipos de esterilizacin para su
adecuada forma de uso.
Conocer las principales sustancias de desinfeccin que se
usan comnmente en laboratorio de microbiologa y forma
de uso.
Ensayar con los materiales de laboratorio, en la elaboracin
de medios de cultivo y agua peptonada as tambin practicar
la tcnica para la utilizacin del autoclave como equipo de
esterilizacin.

II.

FUNDAMENTO TERICO

MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de
crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos (son fuente de
C, N, elementos metlicos, elementos no metlicos, etc.). La
diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por ello, la
variedad de medios de cultivo es tambin grande, no existiendo un
medio de cultivo universal adecuada para todos ellos. Daremos
nicamente una idea general sobre algunos de los constituyentes
habituales de un medio de cultivo. El fundamento de los medios
selectivos o diferenciales que se emplearan en otras prcticas ser
explicado en el correspondiente capitulo.
CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1- Agar: el agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez

a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar
bacteriolgico es un polisacrido, al que acompaan algunas
impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de
agar al 1-2% en agua licua hacia los 100 y se gelifica alrededor
de los 40C, dependiendo de su grado de pureza. Con la
excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es
empleado como nutriente.

2- Extractos: para su preparacin, ciertos organos o tejidos

3-

4-

5-

67-

8-

animales o vegetales (p. ej. Carne , hgado, cerebro, semillas)

son extraidos con agua y calor, y posteriormente concentrados
hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados
deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccion
de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura,
de malta, etc.
Peptonas: son mexclas complejas de compuestos organicos
nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja,
carne, gelatina, casena, etc.). las peptonas son muy ricas en
pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en
determinadas vitaminas y sales.
Fluidos corporales: sangre completa, sangre desfibrinada,
plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los
medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La
sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida
en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los
fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de
crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan
inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores: algunos componentes son
incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro
del
rango
ptimo
del
crecimiento
bacteriano.
Los
microorganismo ms comunes son neutrfilos ( el pH ptimo
para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales
como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las
peptonas, previenen una desviacin del pH.
Indicadores de pH: indicadores acido- base se aaden a
menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar
variaciones del pH.
Agentes reductores: cistena, tioglicolato y otros son agentes
reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear
condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes
microaerfilos o anaerobios.
Agentes selectivos: la adicin de determinadas sustancias al
medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo,
cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico,
antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

MEDIOS GENERALES

Permiten el desarrollo de

una gran variedad de

microorganismos.
MEDIOS
DE Favorece el crecimiento de un
determinado
tipo
de
ENRIQUECIMIENTO
microorganismo, sin llegar a
inhibir
totalmente
el
crecimiento del resto.
Permiten el crecimiento de un
MEDIOS SELECTIVOS
tipo
de
microorganismos
determinado, inhibiendo el
desarrollo de los dems.
Son aquellos en los que se
MEDIOS DIFERENCIALES
ponen de relieve propiedades
que un determinado tipo de
microorganismos posee.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

*Segn sus cualidades fsicas, se distinguen:
Lquidos
Semislidos
Slidos
*Segn su origen:
naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales
de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o
infusiones y cuya composicin qumica no se conoce
exactamente.
sintticos: son los medios que contienen una composicin
qumica definida cualitativamente y cuantitativamente. Se
utilizan para obtener resultados reproducibles.
semisintticos: son los sintticos a los que se les aaden
factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico
complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
*Segn su formulacin:
qumicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de
cada uno de los compuestos que hay en el medio.
complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto
de levadura, sangre, etc.); no se conoce exactamente cul es la
composicin del medio; sin embargo, presenta la ventaja de
que ya estn presentes todos o casi todos los elementos que
una clula puede requerir.
*Segn su uso:

 medio general: medio en donde crecen todo tipo de

microorganismos, excepto los que necesitan condiciones
especiales (por ejemplo, agar CLED).
medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una
especie
o
grupo
determinado
(hongos, bacterias
entricas, protozoos...).
medio diferencial: permite identificar una especie con otra,
ambas en el mismo medio. Puede ser por su crecimiento, su
metabolismo, su respiracin, etc. (por ejemplo, medio
de McConkey).
medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes
necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad
de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes
tipos de microorganismos en un mismo medio.
medio
de
transporte:
preparado
para
servir
como
almacenamiento temporal a especmenes transportados o en
transferencia; mantienen su viabilidad y su concentracin.
simple

TCNICAS DE ESTERILIZACIN DE MEDIOS

Tcnicas de descontaminacin fsica.

a) Tratamientos trmicos por calor seco o hmedo.

Descontaminacin por calor seco. Dependiendo de la
temperatura y del tiempo de esterilizacin se consigue o no
esterilizacin. Las tcnicas de esterilizacin por calor seco, son:
- Flameado. Consiste en exponer un objeto o parte de un
material a la llama de un mechero durante uno o varios
minutos, segn el material de que se trate. Este mtodo se
utiliza para esterilizar la punta del asa de siembra (hasta
incandescencia), las bocas de los tubos de ensayo o matraces
cuando se abren por el motivo que sea y siempre antes de
cerrarlo, puntas de pipeta, etc.
- Incineracin. Consiste en destruir el material en hornos
crematorios. Es utilizado para destruir material de un solo uso,
por ejemplo jeringas, guantes, catteres, etc.
- Horno seco. Estufas Pasteur o Poupinel. Son hornos metlicos
formados por doble pared y con bandejas ajustables a su
alrededor. Suelen calentarse mediante resistencias elctricas,
pudiendo regularse su temperatura. Externamente estas
estufas presentan un termmetro que indica en todo momento
la temperatura que existe en el interior del horno (que deber
coincidir con la temperatura elegida). Tambin incluye un
selector de temperatura y en ocasiones un reloj. La
esterilizacin se consigue a 1800C durante 2 horas o 1600C
durante 3 horas y media. Este tipo de esterilizacin acta sobre

los materiales en profundidad. La esterilizacin se llevara a

cabo de la siguiente forma:
1. Se preparan los instrumentos o materiales a esterilizar, que
debern estar debidamente protegidos, por ejemplo
envolvindose en papeles especiales, colocndolos en el
interior de cajas, etc.
2. Se introducen en la estufa y se conecta sta seleccionando
la temperatura en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo
hubiera), comenzar a contabilizar cuando alcance la
temperatura seleccionada.
3. Transcurrido el tiempo deseado a la temperatura elegida se
desconecta el interruptor y dejamos descender la
temperatura hasta unos 50-600C.
4. Abrimos la estufa y recogemos el material.
Los materiales que se pueden esterilizar por este mtodo son todo
tipo de materiales, vidrio, porcelanas, metal, etc. No se utiliza para
esterilizar medios de cultivo, productos lquidos, telas, plsticos, etc.

Descontaminacin por calor hmedo.

- Autoclave. Es un recipiente cilndrico grande o pequeo que se
cierra hermticamente. Externamente lleva un manmetro que
registra la presin que existe en el interior del autoclave cuando
ste est en marcha. Existe un sistema que nos permite
seleccionar la presin que deseamos. Adems presenta una
vlvula de seguridad que se abrir espontneamente cuando la
presin interna supere la elegida o resulte peligrosa, una llave
de purga que permite la salida del vapor y un reloj que
selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del
proceso. Interiormente en todo autoclave puede observarse en
el fondo una rejilla por debajo de la cual hay agua destilada y
un sistema de tuberas que la calienta generalmente por
electricidad. Dicho calentamiento origina vapor de agua que
asciende por la rejilla y llega a los objetos. El autoclave es un
aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras
dependern de las condiciones de presin y tiempo elegidos, es
decir, se conseguir esterilizacin si sometemos el autoclave a
0.8 atm durante 3 minutos (1180C), 1 atm durante 20 minutos
(1200C), 2 atm durante 10 minutos (134 0C) o 3 atm durante 5
minutos (1440C).

Tcnica para utilizar el autoclave:

1. Con el autoclave apagado y abierta, aadimos agua
destilada hasta la rejilla, cubrindola ligeramente.
2. Se pondr algn soporte metlico para evitar que el material
que se desee esterilizar contacte directamente con el agua.
Esto no es siempre necesario Se colocarn adecuadamente
(en cestillos, cajas, etc.) los objetos que se van a esterilizar.
Se cierra la tapa y se ajusta a presin.
3. Se pondr la llave de purga para que permita la salida de
vapor y se ajustar la presin deseada para la esterilizacin,
as como el tiempo (por ejemplo, 1 atm-20 minutos).
4. Se pondr en marcha el aparato y se esperar hasta que
salga vapor por la llave de purga.
5. Se cerrar la llave de purga y la presin comenzar a subir
hasta llegar al nivel programado. A partir de aqu comenzar
a contar el tiempo de esterilizacin.
6. Una vez realizada la esterilizacin se apagar el interruptor
del autoclave y se esperar a que el manmetro baje a 0.
7. Cuando la presin est a 0, abriremos la llave de purga para
que salga gran parte del vapor que todava se encuentra
contenido. Esto se realizar con cuidado para evitar
descomprensiones bruscas que podran originar la apertura
de aquellos recipientes tapados con algodn graso.
8. Una vez comprobado la salida de vapor, se abre la tapa del
autoclave y se extrae el material.
b) Tratamientos a temperatura ambiente.
Radiaciones no ionizantes. Las utilizadas en microbiologa
son:
- Rayos ultravioletas. Ms que para esterilizar, se usan para
mantener la esterilidad de superficies y/o recintos. Se
caracterizan porque tienen poca penetracin. Actan
impidiendo y alterando la duplicacin del ADN celular. Se debe
evitar su presencia en la piel.
Radiaciones ionizantes
- Rayos gamma. Se utilizan para conseguir esterilizacin en fro.
Son producidos por istopos radiactivos. Presentan un poder de
penetracin muy alto, constituyendo el mtodo de esterilizacin
ms utilizado a nivel industrial. Se utiliza para esterilizar
materiales de uso nico o desechable (guantes, jeringas,
vlvulas, etc.) y en general cualquier tipo de material que
pudiera alterarse por calor.
Sistemas de filtracin. Son dispositivos que, como su nombre
lo indica, van a separar del medio a filtrar todas aquellas

III.

estructuras que sobrepasen un determinado tamao, segn el

tipo de filtro. La efectividad de un filtro va a ser proporcional al
tamao del poro, pudiendo conseguirse esterilizacin. Otra
caracterstica es la presencia de presin, vaco e incluso la
carga de filtro, que generalmente suele ser positiva, ya que las
bacterias en medios neutros tienen carga negativa. Los ms
utilizados son:
Filtros de membrana. Son filtros de celulosa muy purificada y
con un tamao de poro generalmente fino o muy fino. Estos
sistemas pueden ser, desde muy sencillos a estar formados por
sistemas de piezas desmontables que en muchas ocasiones
llevan acoplada una bomba de vaco para ejercer succin sobre
el medio a filtrar.
Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio. Se utilizan en
cayos especficos y tienen ms resistencia que los anteriores.
Filtros de Chamberland. Son filtros de porcelana porosa, pero
resultan ms caros que los anteriores y son menos utilizados.
Filtros de flujo laminar. Son dispositivos de filtrado donde
entra aire contaminado y sale estril. Son utilizados como
mecanismo de esterilizacin en campanas de flujo laminar, en
quirfanos y en general, en cualquier recinto en el que se
pretenda crear o mantener un ambiente estril. Pueden ser de
flujo vertical u horizontal.
Ultrasonidos. Consiste en introducir el material en tanques de
distintos tamaos que contienen un lquido generalmente
desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo,
comienza a vibrar a gran velocidad originando pequesimas
burbujas que entran en todos los recodos del material
consiguiendo eliminar los microorganismos. Es un mtodo poco
utilizado, ya que resulta caro y poco prctico.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MATERIALES

Probeta
Erlenmeyer
Tubos de ensayo
Gradilla
pipeta
Algodn
mechero
bombillas
Rejilla de asbesto
Esptula

CARACTERSTICAS
100- 500 ml

CANTIDAD

125 ml
De 16x150
1 -10 ml
-

1
7
1
2
1
2
1
1

Papel kraf

un pliego

EQUIPOS

Hornilla
electrica
Balanza
analtica
Autoclave
Refrigerador
Incubadora
MEDIOS

Agar Plate Count (APC)

Peptona
Caldo nutritivo
Caldo BHI
REACTIVO : AGUA DESTILADA

CANTIDAD

6.75
0.15
1.04
4,81

gr
gr
gr
gr

( H 2OD)

METODOLOGA:

a) Agar Plate Count

a.1- Pesar 6.75 gr de APC y disolver 300 ml de agua destilada.
Licuar el medio en hornilla elctrica hasta fundir el agar. No
olvidar colocar tapn.
a.2- Colocar bien el tapn de algodn y cubrir con papel kraf,
ajustando con pavilo.
a.3- Llevar a autoclave a 121 C y 15 min.
a.4- Dejar enfriar y cuando este a temperatura ambiente llevar
a refrigeradora.
b)

Agua peptonada
b.1- Preparar 150 ml de agua peptonada (A.P.)
b.2- Pesar 0.15 de peptona y disolver en 150 ml de H2Od con
ayuda de hornilla elctrica.
b.3- Repartir:
* 90 ml en Erlenmeyer de 250 ml
*9 ml en 5 tubos de ensayo (16x150)
b.4- Colocar el material en canastilla para luego ser llevado al
autoclave a 121C x 15 min.
b.5- Dejar enfriar y conservar a 4C (refrigeradora).

c) Caldo Nutritivo

c.1- Pesar 1.04 gr del medio y disolver en 130 ml H2Od con

ayuda de una hornilla
elctrica.
c.2- Distribuir
*10 ml de caldo en 12 tubos de ensayo (16x150)
c.3- Colocar en canastilla para luego ser llevado al autoclave a
121C x 15 min.
c.4- Dejar enfriar, conservar a 4C en refrigeradora.
d) Caldo BHI
d.1- Pesar 4.81 gr de medio y disolver completamente en 130
ml de H2Od con ayuda de un hornilla elctrica.
d.2- Distribuir:
*10 ml de caldo en 12 tubos de ensayo (16x 150 ml)
d.3- Colocar en canastillas y autoclavar a 121C x 15 min.
d.4- Dejar enfriar y conservar en refrigerador a 4C.

IV.

RESULTADOS EXPERIMENTALES

V.

DISCUSIONES

Se obtuvo 300 ml de agar Plate Count a una

concentracin de 22.5 g/l.
El agua peptonada tena una concentracin de 0.1 %
La concentracin del Caldo Nutritivo fue 8 g/l.
La concentracin del BHI fue 37 g/l.

VI.

VII.

No se cuenta con la destreza necesaria al manejar los

instrumentos de trabajo, lo cual llevo a que la prctica
de laboratorio tarde en culminar.

CONCLUSIONES

Al trabajar con dos tipos de medios, granulado y en

polvo, se logr identificar que el granulado es ms fcil
de disolver en el agua con ayuda del calor.

Se llevaron a cabo los procedimientos para preparar

medios de cultivo y tambin se aplic bien la tcnica
de esterilizacin de los medios con el autoclave.

Esta prctica de laboratorio consista en el aprendizaje

prctico al preparar los medios de cultivo (agar Plate
Count, Agua Peptonada), los cuales sern utilizados
para el prximo laboratorio.

RECOMENDACIONES

VIII.

BIBLIOGRAFA

IX.

Es recomendable trabajar con el mechero encendido

ya
que
en
el
ambiente
existen
diversos
microorganismos que pueden ser perjudiciales para las
operaciones que se estn realizando, as tambin se
debe evitar hablar, como norma de seguridad.
El proceso de preparacin de los medios de cultivo y
agua peptonada debera durar no ms de 10 minutos,
as se evitara problemas por contaminacin.
Durante la disolucin del medio en el matraz con el
mechero, se debe tener mucho cuidado, realizar
movimientos circulares para no correr el riesgo de que
la solucin rebalse; a la vez evitar que la solucin
tenga contacto con el tapn de algodn.
Cuando se mide el volumen de agua destilada en la
probeta se suele agregar unos 0.3 ml de ms ya que
siempre ocurre una pequea variacin en el volumen
al transvasar el agua de la probeta al matraz y/o al
calentar el matraz para la disolucin.
Antes de someter a esterilizacin los componentes se
les debe cubrir adecuadamente con algodn, evitando
que estos tengan contacto con el medio; se procede de
igual
manera
con
los
tubos
de
ensayo.

URMETEA, Alonso y otros, Manual Prctico de

Microbiologa, 2da edicin. Masson.
GRANADOS, Raquel; Villaverde, Carmen. Microbiologa.
Bacteriologa. Caractersticas y clasificacin
bacteriana, virologa. Caractersticas y tcnicas
bioqumicas. Tomo I .Thomson
http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo

ANEXOS

Preparacion del agua peptonada

Fig. 1
2 Agua destilada

Fig.

Fig. 3
Fig. 4

Fig. 5 Agua peptonada lista para el proceso de

esterilizacion.

Fig. 6 Agar Plate Count listo para

Fig. 7 Agar
Caldo nutritivo listo para
el proceso de esterilizacin.
el proceso de esterilizacin.

Fig. 8 Caldo BHI listo para el proceso de esterilizacin.