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REACTIVE OXYGEN AND NITROGEN SPECIES, ANTIOXIDANTS AND MARKERS OF OXIDATIVE DAMAGE IN HUMAN
BLOOD: MAIN ANALYTICAL METHODS FOR THEIR DETERMINATION. We review here the chemistry of reactive oxygen
and nitrogen species, their biological sources and targets; particularly, biomolecules implicated in the redox balance of the human
blood, and appraise the analytical methods available for their detection and quantification. Those biomolecules are represented by
the enzymatic antioxidant defense machinery, whereas coadjutant reducing protection is provided by several low molecular weight
molecules. Biomolecules can be injured by RONS yielding a large repertoire of oxidized products, some of which can be taken as
biomarkers of oxidative damage. Their reliable determination is of utmost interest for their potentiality in diagnosis, prevention
and treatment of maladies.
Keywords: biomarkers of oxidative stress; oxidative and nitrosative stress; antioxidants.
INTRODUO
O balano redox em lquidos biolgicos, organelas, clulas ou
tecidos determinado pela presena de pares redox responsveis
pelo fluxo de eltrons. Esses sofrem freqentes interconverses
entre o estado reduzido e o oxidado. Alguns desses pares redox so
interligados (redox cycling), outros constituem sistemas redox
independentes. O balano redox, na clula, relaciona-se soma
dos produtos do potencial de reduo e da capacidade redutora de
uma srie de pares redox, acoplados, presentes. A capacidade redutora pode ser estimada pela determinao da concentrao de
espcies reduzidas em um par redox e, o potencial de reduo,
pelo emprego da Equao de Nernst1. Em termos matemticos, isto
pode ser representado por:
*e-mail: mofg@qui.ufal.br
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Figura 2. A clula como fonte de espcies reativas (ER). (A) Fontes celulares
de ERO, ERN e outras, por ao de vrias enzimas. A capacidade de uma via
especfica produzir ER varia com o tipo de clula e com o dano em curso; p.
ex., na fagocitose, as NADPH oxidases da membrana de neutrfilos e
macrfagos so particularmente ativadas e reduzem O2 a O2, a partir de um
burst respiratrio necessrio para eliminar o agente agressor. (B)
Distribuio dos antioxidantes, enzimas de desintoxicao e protenas de
ligao a metais de transio que compreendem o sistema de defesa dentro
das membranas e organelas celulares
Tabela 1. Natureza, gerao e destino de espcies radicalares (ou seus intermedirios) biologicamente importantes
Espcies derivadas do oxignio
nion-radical
superxido O2
Gerado continuamente por diversos processos celulares (cadeia de transporte de eltrons na mitocndria, no
microssomo, atravs enzimas como xantina oxidase e NADPH oxidase), ou pela reduo monoeletrnica de
O2. Rapidamente desaparece em soluo aquosa por reao de dismutao:
O2 + O2 + 2H+
H2O2 + O2 Em soluo aquosa um forte agente redutor. Sua habilidade em reduzir Fe3+
a Fe2+ pode acelerar a reao de Fenton:
O2 + Fe3+
Fe2+ + O2 Em soluo aquosa um oxidante fraco, porm pode formar ERN:
O2 + NO
ONOO permevel a membranas. Em fagcitos, como neutrfilos e macrfagos, um dos
microbicidas mais importantes.
Perxido de
hidrognio H2O2
Intermedirio formado pela reao de dismutao de O2 catalisada pela enzima SOD, pela reduo de 2 ena molcula de O2 e pela ao de diversas enzimas oxidases in vivo, localizadas nos peroxissomas. muito
difusvel dentro e entre as clulas in vivo. um fraco agente oxidante e um fraco agente redutor, reage
lentamente com tiis, com sais de ferro e cobre reduzidos, com protenas heme e peroxidases para iniciar
reaes radicalares e peroxidaes lipdicas. Em presena de metal de transio gera OH, atravs da reao
de Fenton
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + -OH + OH
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Tabela 1. continuao
Radical hidroxila OH
o mais reativo e mais lesivo radical conhecido e para o qual, uma vez formado, o organismo humano no
dispe de mecanismo de defesa, reage com uma srie de endobiticos, causa modificao no DNA (com
modificao das bases e quebras das fitas), danos nas protenas e inativao enzimtica, peroxidao lipdica.
mbito limitado de ao (poucos dimetros moleculares).
Radicais
peroxila (RO2)
alcoxila(RO)
Formados durante a decomposio de perxidos orgnicos e reaes de carbono radicalar com oxignio,
como na peroxidao lipdica.
Estado eletronicamente excitado do oxignio, produzido por reaes fotoqumicas ou por outras radiaes;
reage com um grande nmero de molculas biolgicas, incluindo lipdeos da membrana, iniciando processos
de peroxidao. 1O2* pode ser gerado, entre outras reaes, por transferncia de energia a partir de um
sensibilizador S, no estado excitado tripleto (3S*) (porfirinas, clorofila e riboflavina) para o oxignio. O
sensibilizador S absorve energia e deixa o estado fundamental singlete (S), passando para o estado excitado
singlete (1S*), a partir do qual convertido, por cruzamento intersistema, para o estado excitado triplete.
1
3
(3S*): S
S*
S* ; 3S* + 3O2*
S + 1O2*
Oznio O3
Produzido no ar atmosfrico poludo e por fonte de luz intensa de algumas fotocopiadoras e outros
equipamentos. extremamente danoso ao pulmo, oxidando rapidamente protenas, DNA e lipdeos.
Espcies derivadas do nitrognio e cloro
Espcie no radicalar, membrana-permevel, oxida um grande nmero de compostos biolgicos, como tiis
e tioteres, aminas, fenis e ligaes insaturadas, mais seletivo que o radical hidroxila, oxida ferro e protenas.
Produzido por fagcitos ativados, reage com O2 para formar OH
HOCl + O2
OH + OH + O2 produzido no miocrdio, como resultado de invaso de clulas
inflamatrias.
Sintetizado nos organismos vivos pela ao da enzima xido ntrico sintase (NOS), que converte o aminocido
L-arginina a NO + L-citrulina (outro aminocido). um radical abundante que age em uma variedade de
processos biolgicos, incluindo relaxao muscular, neurotransmisso e regulao imune. Originalmente
identificado como fator relaxante derivado do endotlio (endothelium-derived relaxing factor: EDRF)
um potente vasodilatador, envolvido na regulao da presso arterial. Difunde-se rapidamente entre e dentro
das clulas. Quando exposto ao ar, reage com oxignio para formar NO2.
2NO + O2
2 NO2. Reage rapidamente com O2 e produz o intermedirio ONOO
O2 + NO
ONOO
Formado a partir de misturas de NO2 e HOCl. Oxidante, agente de clorao e de nitrao, pode inibir
fosforilao dependente de quinase de resduos de tirosina, provoca a clorao de resduos de tirosina (3clorotirosina considerada biomarcador).
Peroxinitrito ONOO
OH + NO2 Aps protonao, rearranja-se para nitrato (NO3-) e interage com bicarbonato
ONOO + H+
(CO2/HCO3-), com alterao de sua reatividade.
[NO2 OH]
NO3
ONOOH
Em presena de CO2, o peroxinitrito forma o peroxicarboxilato nitroso, que rapidamente se decompe,
segundo as etapas 1 e 2. O CO2 est presente em elevada concentrao no compartimento intra e extracelular,
o que favorece a formao do CO3, em presena de ONOO-.
ONOO + CO2
ONOOCO2
NO2OCO2
(1) NO2OCO2
NO3 + CO2 (65%)
(2) NO2OCO2
NO2 + CO3 (35%)
O nion radical carbonato formado mediador de diversas reaes de oxidao e nitrao
Cloraminas
Oxidantes mais suaves e de vida mais longa que HOCl, reagem com tiis, tioteres e centros metlicos de ferro.
Toxicidade varivel, dependendo da polaridade e da permeabilidade da membrana. Cloraminas de -aminocidos
sofrem degradao para aldedos potencialmente txicos
2 NO2
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Tabela 1. continuao
Espcies derivadas do enxofre
Denominao genrica para um grupo de radicais com o eltron desemparelhado residindo no enxofre.
Formado quando um grupo tiol (RSH) reage com uma espcie radicalar (C, OH, RO, RO2, O2 , NO2 ou
com metais de transio).
Radical tila
RS
Miscelneos e metais
Catalisam reaes de radicais livres.
Fe2+ em presena de O2 gera O2 que, por sua vez, pode reduzir Fe3+ a Fe2+
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2
Fe2+ em presena de H2O2 gera OH (reao de Fenton)
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH
Fe3+ em presena de H2O2 gera O2
organelas intracelulares, tais como mitocndria, retculo endoplasmtico, ncleo etc., apresentam uma estrutura bilipdica e uma
variedade de protenas e acares4,5 (Figura 2). O dano celular resulta basicamente de ataque de ERO e ERN sobre as macromolculas, tais como acares (CHOH)n, DNA, protenas e lipdios,
conforme mostrado na Tabela 2.
H fortes evidncias de que o estresse oxidativo tem importncia capital nos processos de envelhecimento, transformao e morte celular, com conseqncias diretas em muitos processos patolgicos, entre eles, a induo do cncer e a propagao de AIDS em
pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de
muitas doenas crnicas, entre elas, doenas auto-imunes, cardiopatias, cncer, doenas do pulmo, intoxicao por xenobiticos e
muitas outras (Tabela 3)6-10. Por outro lado, tambm fato reconhecido que ERO e ERN desempenham papis fisiolgicos importantes como o controle da presso sangnea, na sinalizao celular, na apoptose, na fagocitose de agentes patognicos, na fertilizao de ovos e no amadurecimento de frutos. Esse tpico ser reavaliado no final deste artigo.
O reconhecimento dessa relao estimulou o desenvolvimento
Tabela 2. Atuao das principais espcies radicalares (ou seus intermedirios) sobre endobiticos
Endobitico
Acares
(CHOH)n
cidos nucleicos
ERO, principalmente OH, ataca o acar desoxirribose (principalmente em 4 e/ou 5) e as bases purnicas
(adenina e guanina) e pirimidnicas (timina, citosina e uracila), com ataque preferencial guanina, gerando 8hidroxi- ou 8-oxoguanina5, mutagnicas. Como resultado, ocorre a quebra da cadeia do DNA, a ligao cruzada
entre as fitas e modificaes nas suas bases levando a mutaes e apoptose.
Protenas
As protenas tm muitos stios reativos5. Durante o estresse oxidativo, o primeiro evento a formao de um
radical centrado no carbono, por extrao de H do carbono , em uma ligao peptdica, da, ocorre fragmentao
das cadeias e oxidao de quase todos os tipos de aminocidos, com produo freqente de compostos carbonilados,
particularmente a partir de prolina, arginina e lisina (Figura 8). Essa modificao (contedo em protenas
carboniladas) facilmente mensurvel. Adicionalmente, protenas podem conter stios de ligao com metais
que so especialmente susceptveis a reaes reversveis de oxidao e reduo, as quais podem produzir uma
seqncia de sinais que podem ser reconhecidos por proteases celulares especficas que degradam tais protenas.
Muitas protenas intracelulares tm grupos sulfidrila reativos em resduos de cistena, que podem ser oxidados a
dissulfeto ou cidos cisticos, que podem ser novamente reduzidos metabolicamente. Similarmente, muitas
protenas tm um aminocido metionina que pode sofrer modificao reversvel a sulfxido ou sulfona. Os
aminocidos aromticos formam quinurenina, grupos cateclicos e polmeros. H formao de produtos de
adio com perxidos lipdicos e com hidroxialdedos derivados de lipdeos insaturados.
OH reage com (CHOH)n por abstrao randomizada de um tomo de H de um dos tomos de C, produzindo um
radical centrado no carbono. Isto leva quebra da cadeia de importantes molculas, tais como o cido hialurnico.
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Tabela 2. continuao
Endobitico
Lipdeos
A peroxidao lipdica causada pelo ataque de uma ER (geralmente OH), que abstrai um tomo de hidrognio
(H) de um grupo metileno allico, normalmente, de um cido graxo poli-insaturado, deixando um eltron
desemparelhado no carbono, caracterizando a etapa de iniciao. Este radical usualmente estabilizado por
rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Sob condies aerbicas, o carbono radicalar do dieno
conjugado reage com O2 (que uma molcula hidrofbica e, portanto, se concentra no interior das membranas)
e forma o radical peroxila. Este radical peroxila capaz de abstrair H de molculas de lipdeos adjacentes, cujo
carbono radicalar sofre novo rearranjo, reage com O2 e forma outro radical peroxila e assim sucessivamente,
caracterizando a reao em cadeia da etapa de propagao. O radical peroxila combina-se com o H abstrado,
gerando o lipdeo hidroperxido (LOOH) que ao sofrer quebra, forma aldedos como malonaldedo e 4hidroxinonenaldedo, entre outros. Na decomposio dos hidroperxidos lipdicos so gerados radicais peroxila
e alcoxila atravs da reao de Fenton. A terceira e ltima etapa da peroxidao lipdica, a etapa de terminao
instala-se com a neutralizao dos radicais formados por ao de antioxidantes lipossolveis (-tocoferol, caroteno, NO) ou pela reao de dois radicais lipdicos formando produtos no radicalares. Nos sistemas biolgicos,
a peroxidao lipdica pode ocorrer por via enzimtica (ciclooxigenases e peroxidases) e por via no enzimtica
(auto-oxidao) cujo mecanismo supracitado envolve a participao de espcies reativas de oxignio, metais e
outros radicais livres. Pode ocorrer peroxidao de estruturas supramoleculares, como em fosfolipdeos e em
agregados de lipoprotenas5. Todas estas modificaes oxidativas causam mudanas nas propriedades fsicas e
qumicas das membranas, alterando sua fluidez e permeabilidade, com expanso do lquido intracelular e risco
de ruptura das membranas da clula e das organelas, com conseqente morte celular. Reaes envolvendo os
vrios intermedirios entre si levam a novos produtos, por ex., malondialdedo (MDA) reage com o grupo amina
de purinas e HNE reage com guanosina, entre outras reaes.
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Biomarcadores de dano
Cncer
Doena cardiovascular
Artrite reumatide
Doena de Alzheimer
Doena de Parkinson
Isquemia reperfuso
Aterosclerose
Diabetes mellitus
H2O2 + O2
2 H2O + O2
2 H2O + GSSG
(1)
(2)
(3)
O sistema antioxidante enzimtico e a glutationa esto presentes, predominantemente, no meio intracelular (Figura 2), da a utilizao do eritrcito para sua anlise. Por outro lado, o sistema
antioxidante no enzimtico localiza-se, principalmente, no meio
extracelular, sendo por isso analisado em plasma e soro. No sangue circulam importantes antioxidantes, a exemplo das vitaminas
C, E, -caroteno etc., bem como biomarcadores do dano causado
por ERO e ERN e outros, como malondialdedo (MDA), isopros-
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Exemplos de biomarcadores
Diabetes
mellitus
Hipertenso
arterial
sistmica
Artrite reumatide
Asma, DPOC
(doena pulmonar
obstrutiva crnica)
Injria cardiovascular cTroponina I e T
Doena heptica
ALT (alanina amino-transferase) e
GT (-glutamil-transpeptidase)
Fonte: Adaptada da ref.12
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N2 + 2R
RO2
(4)
(5)
Sub-grupos
Antioxidantes
Antioxidantes no enzimticos
Marcadores de
dano oxidativo
Protenas oxidadas
Lipdeos oxidados
Protenas nitradas
Oxidao das bases do DNA
Quebra de DNA
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o de gua e etanol ao plasma. As duas fraes sofrem partio eficiente entre o hexano e os solventes aquosos. Esse mtodo pode ser
empregado em outros fluidos biolgicos ou amostras de alimentos31.
FRAP (Ferric-Reducing Ability of Plasma)
Testa a fora antioxidante do plasma, via avaliao da reduo
do complexo Fe3+-TPTZ (ferritripiridiltriazina) [2,4,6-tri(2-piridil)1,3,5-triazina, C18H12N6, M.M. 312,33 g/mol] a ferroso-tripiridiltriazina (Fe2+-TPTZ) por redutores, no caso, os antioxidantes
plasmticos, em valor de pH baixo. Baseia-se no fato de que a
habilidade de um composto em produzir Fe2+ a partir de Fe3+ define
sua fora antioxidante. O complexo Fe2+-TPTZ tem uma cor azul
intensa e pode ser monitorado, a 593 nm, em espectrofotmetro. A
vitamina C e o cido rico, por ex., reduzem Fe3+ a Fe2+. Por outro
lado, um antioxidante que reduz efetivamente um pr-oxidante,
no reduz, necessariamente, Fe3+ a Fe2+.
As limitaes do mtodo so, portanto: nem todo redutor que
hbil para reduzir Fe3+ a Fe2+ antioxidante; nem todo antioxidante
tem a habilidade especfica para reduzir Fe3+ a Fe2+, como por ex.,
a glutationa. O resultado final pode ser convertido a mmol de equivalentes de trolox por litro de plasma. A atividade relativa do trolox
em FRAP de 2,0 mmol/L, ou seja, a reao direta de Fe2+ proporciona uma mudana de absorbncia que a metade de 1 equivalente molar para o trolox31.
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ou Teste
do ABTS
O TEAC baseia-se na inibio por antioxidantes do ction radical 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de
diamnio) (C18H24N6O6S4, M.M. 548,7 g/mol, ABTS+), que apresenta absorbncia caracterstica primria em 415 nm e absores
secundrias em 660, 734 e 820 nm.
O mtodo original baseia-se na ativao de metamioglobina como
peroxidase, em presena de ABTS. O complexo perferril da
hemeprotena produziria o ction radical ABTS + de cor azul
esverdeada. A adio desse radical a um meio contendo antioxidantes,
permite avaliar, atravs do grau de descolorao, a capacidade
antioxidante do mesmo. Alguns autores sugerem o uso de oxidao
qumica de ABTS, com utilizao de reagentes como dixido de
mangans ou persulfato de potssio, uma vez que outros antioxidantes
podem contribuir para reduzir o radical ferrimioglobina formado
durante a reao. O percentual de inibio de ABTS+ determinado
em funo da concentrao e do tempo. Quando a medida relativa
reatividade do trolox, como padro, sob as mesmas condies, o
teste denominado TEAC, expresso como unidades equivalentes de
trolox que correspondem a 1,0 mmol/L18,33.
Esse mtodo aplicvel para o estudo de antioxidantes lipossolveis e hidrossolveis.
A Tabela 7 ilustra valores de CAOT, obtidos em plasma e soro
Quim. Nova
Comentrios
TRAP
Ensaio da Ficoeritrina
(PE) ou ORAC
~1000
Free Radical Biol. Med. 1994, 21, 211.
1162 265
Free Radical. Biol. Med. 1995, 18, 29.
Ensaio ABTS
FRAP
que seja reduzido pelo O2 18,26 como, por ex., o 2-(4-iodofenil)-3-(4nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (INT, C19H13ClIN5O2.x H2O, M.M.
505,7 g/mol). O O2 transfere um eltron ao INT e produz formazana,
detectada em espectrofotmetro a 505 nm. A atividade da enzima
medida a partir do grau de inibio da reao a que o eritrcito foi
submetido e os valores so expressos em unidades por grama de
hemoglobina (Hb) (U/g Hb). A inibio da formao do cromgeno
proporcional atividade de SOD presente na amostra. Nessa tcnica,
uma inibio de 50% definida como uma unidade de SOD36-39.
Catalase (CAT)
A catalase (EC 1.11.1.6), cujo stio ativo contm o grupo heme,
est enclausurada no peroxissoma, a principal organela responsvel pela desintoxicao celular e pela oxidao de cidos graxos
de cadeia longa, fonte inesgotvel de perxidos orgnicos, produtos carbonlicos e oxignio singlete. A catalase , tambm, encontrada nas mitocndrias das clulas do tecido cardaco.
Os dois caminhos mais utilizados para estudo de sua atividade
referem-se medida do decaimento na concentrao de H2O2 e da
gerao do oxignio18,26. A leitura do decaimento de H2O2 feita
por espectrofotometria no ultravioleta a 240 nm. Os valores de CAT
tambm so expressos em unidades por g de hemoglobina (U/g
Hb). Uma unidade de CAT corresponde atividade da enzima necessria para o consumo de 1 mol de H2O2 em 1 min40.
Glutationa Peroxidase (GPx)
A famlia de GPx (EC 1.11.1.9) reduz H2O2 e outros perxidos
a gua ou lcool. Apresenta-se sob 4 formas: GPx 1 ou clssica,
encontrada no citosol de todas as clulas do corpo; GPx 2 ou gastrointestinal, especfica do trato gastrointestinal; GPx 3 ou plasmtica ou extracelular, encontrada no fluido do revestimento interno do pulmo e no leite materno, alm do plasma em mamferos, e
a GPx 4, que atua sobre perxidos de resduos de cidos graxos nas
membranas e lipoprotenas, reduzindo, tambm, o hidroperxido
da timina, formado como conseqncia do ataque dos radicais
base timina do DNA41,42. A famlia de GPx integra o grupo de
selenoprotenas, que tm, em seu stio ativo, o selnio (Se), obtido
da dieta ligado metionina, em alimentos de origem vegetal (selenometionina) e, ligado cistena, em alimentos de origem animal
(selenocistena). O Se reconhecidamente um nutriente antioxidante, com recomendaes de obteno na dieta considerando sua
atividade antioxidante e nutricional43,44.
No organismo humano, a selenometionina ocupa o lugar da
metionina nas protenas e a selenocistena constituinte das
selenoprotenas (selenocistena a forma na estrutura primria de
todas as selenoprotenas, inclusive GPx)41,44. Uma unidade de GPx
corresponde atividade de enzima necessria para converter 1 mol
de NADPH a NADP+ em 1 min. Como as demais enzimas antioxidantes, os valores de GPx so expressos em unidades por g de
hemoglobina (U/g Hb).
Um mtodo muito utilizado para avaliar a atividade de GPx em
eritrcitos consiste em adicionar ao lisado de hemcias uma mistura contendo NADPH, GSH, GR, EDTA (agente quelante que tem
tambm a funo de impedir a oxidao de GSH a GSSG) e tampo fosfato. Uma alquota da mistura adicionada ao hemolisado,
mantido em banho-maria a 37 C durante 1 min, adicionando-se,
em seguida, H2O2 ou hidroperxido orgnico, para iniciar a reao,
que acompanhada em espectrofotmetro.
O mtodo similar quele tradicional de Mills45,46, que mede a
velocidade de oxidao de GSH por H2O2 catalisada por GPx presente no hemolisado. O consumo de GSH medido, mantendo em
concentraes constantes a GR e o NADPH que converte imediatamente a GSSG produzida em GSH. Portanto, a anlise de GPx
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GR) ou com N-etilmaleimidina (NEM)49,53,54. Quando NEM utilizada, o derivado formado deve ser eliminado antes da anlise, pois
o mesmo inibe a GR.
Outra forma de determinar a concentrao de glutationa nas
hemcias descrita no trabalho de Calvo-Marzal e colaboradores55, onde se utilizam eletrodos de pasta de carbono modificados
com Tetratiofulvaleno Tetracianoquinodimetano (TTF-TCNQ).
Coenzima Q (CoQ)
A coenzima Q10 (Figura 5) ou ubiquinona o nico lipdio
endogenamente sintetizado atravs da via do mevalonato, que apresenta funo redox56. um AO que desempenha papel central na
cadeia respiratria mitocondrial, na cadeia de transporte de eltrons
extra-mitocondrial, participa da regulao da permeabilidade, diminui a oxidao de protenas de membrana, previne a oxidao do
DNA e impede a disfuno endotelial, provavelmente por aumentar
a disponibilidade de NO. Sua forma antioxidante, o ubiquinol
(CoQH2), produto da reduo de CoQ, inibe a iniciao e propagao da peroxidao lipdica, com conseqente impedimento da formao de ROO (radical peroxila). Alm disso, a coenzima Q regenera a vitamina E do radical tocoferila57,58.
Quim. Nova
UrH2- + Asc
(6)
por tcnicas cromatogrficas, sendo a HPLC em fase reversa, a tcnica de escolha, com deteco por espectrofotometria no UV (cujo
comprimento de onda depender do solvente), por espectrofluorimetria ou ainda por mtodos eletroqumicos26. Por ser lipoflico, o
tocoferol requer uma etapa pr-analtica de extrao com hexano,
que realizada ao abrigo da luz e sob refrigerao.
Vitamina C ou ascorbato
O cido ascrbico essencial ao homem, pois no pode ser sintetizado a partir da glicose que seu precursor, como ocorre em
plantas e na maioria dos animais. Em sistemas biolgicos, em pH
fisiolgico (7,4), 99,95% da vitamina C (AsCH2) encontra-se na forma de ascorbato (Asc-), que a forma que atua como antioxidante,
ao doar um H ou [H+ + e-] para um radical. O ascorbato (AscH-) atua
como antioxidante sobre ERO e ERN, em ambiente biolgico aquoso, resultando na formao do nion radical semidesidroascorbato
(Asc), ou ascorbila, pouco reativo. Atua eficientemente sobre o nionradical superxido (O 2), o perxido de hidrognio (H 2O2), o
hipoclorito (ClO-) e os radicais hidroxila (OH) e peroxila (OOH). O
ascorbato pode atuar diretamente nas membranas celulares, por impedir a iniciao da peroxidao lipdica ou indiretamente por regenerar a vitamina E, que atua como antioxidante na face lipoflica da
membrana5. Alm disso, pode regenerar o nion radical urato a partir de urato, fechando o ciclo de atuao antioxidante do mesmo,
como discutido anteriormente (Equao 6)18.
A deteco de vitamina C em plasma ou em soro requer precauo, uma vez que um composto facilmente oxidvel. Devido
a sua facilidade de oxidao, em pH neutro (fisiolgico) ou alcalino, recomendvel a acidificao do plasma, preferencialmente
aps sua separao por centrifugao, adicionando-se cido
tricloroactico, cido metafosfrico, ou cido oxlico, isolado ou
em associao com cido tricloroactico. HPLC a tcnica mais
comumente usada na sua separao e anlise. Recentemente,
Katepe61 desenvolveu uma tcnica para deteco simultnea de
ascorbato e malondialdedo em soro humano, utilizando HPLC com
deteco no UV.
-caroteno
Os carotenides so pigmentos intensamente coloridos,
lipossolveis, sintetizados por plantas e microrganismos, presentes em muitos alimentos, particularmente frutas, vegetais e peixes.
Existem mais de 600 tipos de carotenides e apenas 10% tm atividade pr-vitamina A, que a capacidade de converso dos
carotenides em retinol62.
As propriedades antioxidantes dos carotenides esto associadas com sua capacidade de capturar radicais e outras espcies, como
oxignio singlete, em baixas concentraes e em baixa presso
parcial de oxignio, tais como aquelas da maioria dos tecidos sob
condies fisiolgicas62. No entanto, as funes de carotenides na
dieta, na preveno de doenas no esto definitivamente estabelecidas, havendo muita controvrsia na literatura. Neste aspecto,
importante citar dois estudos de associao da suplementao de
-caroteno e preveno de cncer de pulmo e doena arterial
coronariana (DAC) em fumantes, onde se verificou, inclusive, um
aumento da mortalidade: o CARET (Carotene and Retinol Efficacy
Trial)63, com 18.314 fumantes acompanhados durante 4 anos revelou aumento de 46% na mortalidade por CA de pulmo, de 26%
na mortalidade por DAC e de 17% na mortalidade geral e, o ATBC
(Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene Lung Cancer Prevention
Study)64, de preveno secundria, com 29.133 fumantes acompanhados durante 6 anos revelou aumento de 18% na mortalidade
por CA de pulmo, de 12% na mortalidade por DAC e de 8% na
mortalidade total.
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duodeno. transportado ao fgado ligado albumina e l incorporado na protena ceruloplasmina. O Cu2+ ligado ceruloplasmina ,
ento, distribudo para as clulas. Alm do transporte de Cu2+, a
ceruloplasmina oxida Fe2+ a Fe3+ para sua subseqente transferncia
para a transferrina, da a sinonmia de ferroxidase, e catalisa a Snitrosao de biomolculas tilicas66,68,69.
A determinao de ceruloplasmina humana baseia-se na reao entre essa enzima como antgeno e o anti-soro especfico obtido em kits disponveis no mercado. O princpio do mtodo a
reao antgeno (a enzima presente no soro) com o anticorpo contido no kit. A reao d lugar a um complexo insolvel, produzindo uma turbidez que pode ser lida espectrofotometricamente. Portanto, sua anlise feita por imunoturbidimetria, a 37 C, utilizando-se espectrofotmetro, em 340 nm. A ceruloplasmina pode ser
medida diretamente em soro fresco ou refrigerado entre 2 a 8 C
por at 2 dias ou congelado a -20 C por at 3 meses.
Os valores de referncia para os antioxidantes no enzimticos
citados esto ilustrados na Tabela 8.
Tabela 8. Valores de referncia para enzimas antioxidantes em
eritrcito humano
Enzimas antioxidantes
Quim. Nova
derivam da peroxidao lipdica. Eles so classificados em primrios (os hidroperxidos lipdicos) e secundrios, que derivam da ruptura dos hidroperxidos lipdicos.
Malondialdedo (MDA)
O malondialdedo um produto secundrio da peroxidao
lipdica, derivado da -ruptura de endociclizao de cidos graxos
polinsaturados com mais de duas duplas ligaes, tais como cido
linolico, araquidnico e docosaexanico18,70-72. Atualmente, o MDA
considerado um candidato potencial para ser escolhido como um
biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14.
O MDA foi o foco de ateno da peroxidao lipdica durante
muitos anos, pelo fato de poder ser medido livre, utilizando-se o
cido tiobarbitrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma um
cromgeno de cor rosa fluorescente, cuja absoro ocorre em de
532 nm e fluorescncia em 553 nm26 (Figura 6). Considerando-se
que o teste no especfico para MDA, pois outros aldedos participam da mesma reao, a tcnica utilizando HPLC com deteco
no UV, recentemente desenvolvida por Katepe61, em soro humano,
revela-se mais especfica. Na tcnica de Katepe, o soro acidificado
para liberar o MDA ligado ao grupo amino de protenas.
6.500 14.500
16.500 26.500
30 44
5,4 8,8
Hidroxinonenal (HNE)
O HNE o produto majoritrio da oxidao de cidos graxos
polinsaturados. Vrias tcnicas foram desenvolvidas para sua determinao em amostras biolgicas, em sua forma livre, pois a recuperao de HNE do plasma muito baixa e, como acontece com
todos os aldedos, h necessidade de sua derivatizao para anlise
em HPLC 18,26,70-72. A derivatizao com 2,4-dinitrofenilidrazina
(DNFH), seguida de cromatografia em camada delgada e HPLC,
com deteco por espectrofotometria no UV, consome um tempo
considervel. Neste sentido, foi proposto um mtodo utilizando-se
1,3-cicloexanodiona, que forma um derivado que pode ser detectado por fluorescncia73. A seletividade do mtodo pode ser aumentada por utilizao de tetraidrofurano ao invs de cinco outros
solventes, porm a recuperao de HNE muito baixa (cerca de
8%)74. Mais recentemente, a quantificao de HNE em plasma passou a ser realizada com pentafluorobenzil-hidroxilamina para formar o derivado pentafluorobenziloxima (Figura 7), que analisado por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas
com ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS) usando HNE
deuterado como padro interno26. Nesse mtodo, apesar de haver
um aumento significativo na recuperao de HNE do plasma (60 a
80% versus 8%), sua concentrao permanece, ainda, mais baixa
do que a de outros aldedos marcadores de peroxidao lipdica,
devido, provavelmente, ligao aos grupos sulfidrila ou amina de
protenas26.
1335
Valores de referncia
1 3 M
1 3 M
0,4 1,0 M
0,2 0,4 mM
20 M
30 100 M
0,3 0,6 M
200 360 mg/dL
15 60 mg/dL
1336
Vasconcelos et al.
Quim. Nova
Tabela 10. Valores de referncia para alguns marcadores de dano oxidativo em macromolculas analisados em soro e plasma humanos
Marcador de dano oxidativo
Valores de referncia
Mtodo analtico
1 3 M
Isoprostano
Carbonila em protenas
35 6 pg/mL
0,4 1,0 nmol/g ptna
despeito do forte interesse, desenvolvimento e plausibilidade biolgica, a hiptese de ligao direta entre estresse oxidativo e doenas ainda de difcil comprovao, uma vez que h inmeros fatores limitantes, tais como procedimentos de coleta e armazenamento;
a tcnica analtica em si, em muitos casos, de elevado custo e de
difcil operacionalizao, a falta de uniformidade nas unidades em
que se exprimem os resultados, bem como os valores de referncia; a quantidade de fatores interferentes e, principalmente, questes ligadas variabilidade gentica. Apesar da existncia de vrios biomarcadores de balano redox em sangue (Tabela 6) e da
listagem dos valores considerados normais ou de referncia18,49,76,98,99
(Tabelas 7 a 10), til salientar que no existem ainda valores de
referncia universalmente aceitos/adotados, uma vez que os prprios mtodos de anlise e quantificao, alm de envolverem diferentes tcnicas, esto em processo de desenvolvimento e aperfeioamento. A validao dos mtodos encontra-se em curso13,14, com
utilizao do modelo murino, tratado com injeo intra-peritoneal
de CCl413,14. O desenvolvimento de outros modelos faz-se ainda
necessrio para comparao.
Nessa perspectiva, pesquisas aliando esses marcadores e novos
desenvolvimentos de ferramentas e mtodos analticos que possibilitem uma avaliao de forma menos invasiva, sensvel, rpida e
simples, com janelas de deteco cada vez menores, vm assumindo um papel relevante no avano da investigao. Estaremos, provavelmente, em condies de relacionar o ambiente redox avaliado em indivduos com diferentes aspectos demogrficos, clnicos e
nutricionais, de entender os mecanismos do estresse oxidativo, bem
como de prevenir ou minimizar os efeitos das doenas oriundas
dos mesmos, realizando diagnsticos antecipados.
AGRADECIMENTOS
Aos rgos financiadores PADCT/CNPq/CTINFRA, MCT, MS,
Fundao de Amparo Pesquisa de Alagoas (FAPEAL), Banco do
Nordeste do Brasil (BNB), PPSUS/CNPq/SESAU/FAPEAL, CAPES/COFECUB, Instituto do Milnio-INOFAR e RENORBIO/
CNPq. Ao Prof. N. A. Soares, pela reviso da linguagem, ao Prof.
E. J. H. Bechara pela cuidadosa reviso e constantes discusses na
rea e aos revisores do presente artigo pelos valiosos comentrios.
LISTA DE ABREVIAES
AAPH:
ABAP:
ABTS:
AGEs:
AIDS:
AMVN:
AO:
ATBC:
AUC:
CAT:
CAOT:
CARET:
CCl4:
(CHOH)n:
DAC:
8-OH-dG:
DNFH:
DPOC:
2,2-Azobis(2-metilpropanoamidina)
Dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina)
2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal
de diamnio
Advanced Glycation End products. Produtos finais
de glicao avanada.
Sndrome de deficincia imunolgica adquirida
2,2-Azobis-2,4-pentanonitrila
Antioxidante
Alpha-Tocopherol and Beta- Carotene Lung Cancer
Prevention Study
Area-under-curve. rea sob a curva
Catalase
Capacidade Antioxidante Total
Carotene and Retinol Efficacy Trial
Tetracloreto de carbono
Hidrocarboneto
Doena Arterial Coronariana
8-hidroxi-desoxiguanosina
Dinitrofenilidrazina
Doena pulmonar obstrutiva crnica
1337
DTNB:
EDTA:
ER:
ERO:
ERN:
ESR:
1338
Vasconcelos et al.
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