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diagnóstico
Esta disciplina tem 60 h (30T e 30P) e é oferecida como eletiva pelo Curso
de Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da UFPE. Para o
roteiro deste semestre (1o. sem/2006), consulte Notícias para TMB.
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Aula 1: PCR
O capítulo comenta várias técnicas, entre elas o PCR. Fala também de forma
breve sobre a extração de DNA e de RNA. Nesta aula complementamos em
sala alguns pontos que julgamos importantes e que estavam pouco
explorados no livro ou mesmo não foram comentados.
1. Extração de DNA
material mole ou
material duro
fluido
osso ascite
tumor sólido aspirado de medula
coral tecidos moles em geral
esponjas marinhas sangue
água de reservatórios
coprólitos
naturais ou artificiais
Esta etapa está bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas alguns
pontos suplementares:
algumas células têm uma parede celular rígida (como os vegetais) ou estão
de alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas).
Em alguns casos podemos empregar uma enzima específica para estas
paredes rígidas (lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos
temos que empregar o Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra forma
muito eficiente de lise e a quebra por ultra-som.
Se a lise é feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, por
exemplo), o DNA liberado da célula vai para o sobrenadante. A manipulação
d solução com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar o
DMA em grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandes
fragmentos são úteis para quase todas as técnicas de análise de DMA.
Apenas para a análise de tamanhos de cromossomos temos que ser muito
cuidadosos na extração, mas isto não será tema de nossa disciplina.
1.3 Desproteinização
A desproteinização está bem descrita no livro e não vamos dar maior ênfase
a ela aqui.
1.4 Concentração do DNA
Uma vez que nos vimos livres das proteínas (e com elas outras moléculas,
que vão embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Para
concentrar o DNA geralmente precipitamos o dito com álcool. Para isso
adicionamos álcool 100% gelado ao mesmo volume de solução de DNA e
centrifugamos o tubo a 13.000 por 5 minutos. Após o descarte do álcool
pode-se lavar gentilmente o pellet com àlcool a 70% e deixar secar o
material. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num volume adequado
de água ou de tampão (em geral Tris-EDTA). Há outros detalhes e
comentários importantes no texto do livro.
Quando se começa um PCR, a enzima Taq polimerase vai atuar ainda durante
a rampa de aquecimento, antes que os DNAs estejam devidamente
desnaturados a 96 oC. Isto pode dar umas bandas extras no PCR e borrões
feios no gel. Para evitar isso pode-se pipetar a Taq no tubo quando a mistura
já alcançou a temperatura de desnaturação. Há hoje em dia resinas
especiais que se desmancham quando a temperatura é adequada e liberam a
Taq. Começar a ação da Taq quando a temperatura é alta é conhecido como
hot start.
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Aula 2: Desenho de primers
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
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Figura 1: A - Um segmento de DNA (em vermelho) pode ser clonado num plasmídeo (em
amarelo) e a partir de posições específicas no plasmídeo pode-se estender uma fita simples
(com o auxílio de uma DNA polimerase) ou produzir uma fita dupla (por PCR). Se
precursores de bases (dNTPs) marados forem empregados neste processo, a fita simples
ou dupla já sai marcada, sendo, poranto, uma sonda. B - uma fita previamente produzida
pode ser "marcada" pela conjugação de algumas bases com uma enzima ou outra molécula
apropriada (biotina, por exemplo). Estas moléculas auxiliarão na visualização posterior da
sonda, no ensaio de hibridização. C - A marcação da sonda pode ser feita pelo uso de um
primer previamente marcado.
Se o DNA alvo ou a sonda (ou ambos) são DNA fita dupla, é preciso separar
as duas fitas antes de iniciar a hibridização, o que é geralmente obtido por
aquecimento ou por tratamento com tampão muito alcalino. Quando se
restauram as condições adequadas para o pareamento de bases, as fitas
voltam a parear. A sonda pode então parear com sua região de
complementariedade no DNA alvo. É claro que, se a sonda era originalmente
fita dupla, ela tenderá a formar de novo a fita dupla, assim como o DNA alvo
voltará a formar uma dupla fita, se originalmente ele estava nesta forma no
ensaio. Mas o que interessa para o ensaio é a hibridização da sonda com o
DNA alvo. Em geral o DNA alvo está aderido a um suporte, enquanto a sonda
está na fase líquida, o que permite, por simples lavagem, retirar toda a
sonda que não pareou com o DNA alvo ao final do ensaio, e revelar o
resultado.
Um dos fatores que vai determinar se a sonda fica bem aderida ao DNA alvo
é o seu tamanho. Outro fator é a porcentagem de identidade
(complementariedade) entre a sonda e o DNA alvo. Com a prática (e a
leitura de manuais específicos) o experimentador vai se familiarizando com
estas variáveis do ensaio de hibridização. Vários outros fatores influenciam
na reação de hibridização e não cabe aqui uma discussão mais completa.
Ensaios padrão Sonda marcada em solução DNA alvo não marcado ligad
O Southern blot (que ganhou este nome por ter sido inventado por um
pesquisador de nome Southern) também encontrou muitas aplicações no
diagnóstico. Estranhamente, não é uma técnica trivial, mas foi de tal forma
aprimorada e padronizada pelas várias empress fornecedoras de insumos
que alcançou considerável uso na área diagnóstico, com especial aplicação na
detecção de doenças genéticas e no diagnóstico de paternidade. Vamos
focalizar um pouco mais a atenção sobre este ensaio e deixaremos os
demais para outra disciplina, que será oferecida em breve no CCB (UFPE)
pelo Gentrop (Departamento de Genética). Para uma leitura on-line (em
inglês) deste assunto, recomendamos o livro texto de Genética Molecular
Humana - Strachan e Reed, pelo link
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.
Uma variante mais moderna deste ensaio, e que não usa a etapa de Southern
blot e sim a amplificação inicial de um trecho do genoma (com as repetições
a serem estudadas), tem sido oferecida como kit e empregada em
laboratórios. Neste caso, um trecho do genoma é amplificado por PCR. O
produto do PCR é aplicado ao gel. O resultado está ilustrado na figura
abaixo, para a identificação de um suspeito de um crime.
Figura 7: Resultado de uma
investigação de um crime (estupro).
O DNA da vítima, dos suspeitos, do
namorado e do material colhido na
vagina (evidência ou corpo de delito)
foi obtido. Um DNA controle também
é empregado no ensaio. As bandas
obtidas do suspeito 1 coincidem com
as obtidas do esperma do corpo de
delito. As bandas obtidas do DNA
das células da mulher, obtidas em
mistura com o esperma, coincidem
com as bandas da vítima (de fato, o
DNA é da vítima).
Pela inspeção simples da imagem acima fica evidente que o padrão de bandas
com esta variante da técnica (que está mais detalhadamente descrita na
página da aula 7 para Genética Molecular - C. Biológicas) é bem mais simples
do que o do RAPD. Geralmente só são discernidas duas bandas,
correspondentes aos dois alelos com repetições nos cromossomos homólogos
do indivíduo.
Ainda vamos pensar o que virá aqui, o que foi comentado em aula foi o PCR
em tempo real, mas este já está revisto nas aulas de Genética Molecular de
C. Biológicas.