Prctica de Laboratorio No. 1.

Anlisis de Homogeneidad Molecular del Ingrediente Farmacutico Activo

de H. influenzae.
Introduccin
Tambin llamada filtracin en gel es la tcnica de ms sencilla empleada en la
separacin de protenas. La separacin ocurre en columnas rellenas con geles
preparados a este fin que contiene partculas muy hidroflicas y porosas tamao de
dimetro determinado. Entre las partculas del gel (fase estacionaria) fluye una
fase acuosa (fase mvil).
Al pasar una mezcla de protenas de distintos tamaos por una columna de
exclusin molecular aquellas molculas con tamao mayor que el dimetro de los
poros del gel solo pueden atravesar la columna por los espacios entre las partculas
del gel y no se retrasan en la columna. En cambio las molculas capaces de
penetrar en los poros del gel se vern retrasadas por la fase estacionaria, en la
misma medida cuanto menor sea su tamao. Por lo que en esta cromatografa las
molculas eluyen por orden decreciente de tamao.
Este ensayo permite determinar la homogeneidad molecular del Ingrediente
farmacutico activo de la vacuna contra el Haemophilus influensae y la
determinacin de su coeficiente de distribucin.
Reactivos
Material de referencia del Hib (GFHib-06-0810) 1bb
Control positivo de AgsHB (008-1311.01) 1 vial
Un lote de IFA de Hib.
Cloruro de potasio
Cloruro de sodio
Dihidrogenofosfato de potasio
Hidrogenofosfato de disodio
HCl
Azida sdica
Agua grado HPLC (Milli Q es suficiente)
Materiales
Sistema de filtracin para las soluciones, con membrana de 0.45 m o 0.22 m.
Vaso de precipitado de 1 L (Beaker)
Matraz volumtrico de 1 L.
Matraz volumtrico de 0.5 L.
Matraz volumtrico de 10 mL.
Imn recubierto para agitar las soluciones.
Accesorios de pesada.
pHmetro
Frascos de vidrio para la Fase mvil de 1L y 0.5 L.
Jeringuillas de 100 L
Conexiones capilares para el HPLC
Equipamiento

Sistema de HPLC con bomba (isocrtica es suficiente), detector UV, desgasificador

en lnea, inyector automtico, programa de adquisicin y procesamiento de datos
cromatogrficos.
Columna TSK G5000PW (7.5 x 600 mm, 17m) (TOSOHASS).
Balanza analtica.
Agitador magntico.
pHmetro
Soluciones
1. Fase mvil: Tampn PBS (Cloruro de potasio 2.7 mM; Cloruro de sodio 0.25 M;
Dihidrgenofosfato de potasio 1.7 mM; Hidrgenofosfato de disodio 7.9 mM;
HCl para ajustar a pH 7.0)
Pese:
Cloruro de potasio 0.2 g
Cloruro de sodio 14.6 g
Dihidrogenofosfato de potasio 0.24 g
Hidrogenofosfato de disodio 1.1 g
En un vaso de precipitado disuelva las sales adicionando 800 mL de agua calidad
HPLC.
Ajuste el pH a 7.0 con HCl.
Trasvase la solucin a un frasco volumtrico de 1 L y enrace hasta el aforo.
Filtre la solucin con una membrana de 0.45 m o 0.22 m.
2. Solucin de conservacin de la columna: Azida sdica 0.05%.
Pese:
Azida sdica 0.5 g
En un vaso de precipitado disuelva la azida sdica adicionando 800 mL de agua
calidad HPLC.
Trasvase la solucin a un frasco volumtrico de 1 L y enrace hasta el aforo.
Filtre la solucin con una membrana de 0.45 m o 0.22 m.
3. Solucin de Azida sdica 0.35% (control del volumen total)
Pese:
Azida sdica 35 mg
En un vaso de precipitado disuelva la azida sdica adicionando 80 mL de agua
calidad HPLC.
Trasvase la solucin a un frasco volumtrico de 10 mL y enrace hasta el aforo.
Procedimiento
Fije en el sistema cromatogrfico los siguientes parmetros:
Flujo de trabajo: 0.6 mL/min
Longitud de onda: 226 nm
Tiempo de duracin de la corrida: 100 min
Purge el sistema cromatogrfico con la fase mvil.
Conecte la columna y lentamente suba el flujo hasta 0.6 ml/min.
Equilibre la columna hasta obtener una lnea base estable.
Volumen de inyeccin: Se inyecta el volumen equivalente a 100 g siempre que no
exceda los 200 L.

Realice la siguiente secuencia de inyeccin: 1- Mr Hib , 2- Control positivo de HB +

azida 0.35%, 3- Lote de Hib, 4-lote de Hib, 5- Mr Hib.
Integracin y clculo de los resultados
Utilizando el software apropiado integre manualmente los picos detectados
utilizando la opcin valle-valle.
El rea porcentual se calcula por el software usando la formula siguiente:
rea (%) = (rea del pico /suma del rea de todos los picos detectados)*100
Kd = (Ve-Vo) / (Vt-Vo)
Ve: Volumen de elusin (Tr pico Hib x 0,6 mL/min)
Vo: Volumen de exclusin de la columna (Tr pico agregados en MR Hib x 0,6 mL/min)
Vt: Volumen total de la columna (Tr pico azida x 0,6 mL/min)

Criterios de aceptacin del ensayo : El perfil cromatogrfico de la muestra a analizar

debe corresponder con el obtenido para el material de referencia.
Criterios de aceptacin de la muestra : Pico mayoritario con un rea 90% y una Kd
0,34.
El Coeficiente de variacin del tr y % rea entre las rplicas de la muestra debe ser
1% y 2% respectivamente.