Lezione 9 Ottobre 2006

Appunti di  Alda Saldan

Argomento della lezione: Breve introduzione all’ingegneria genetica

Definizione: essenzialmente l’ingegneria genetica non è altro che un processo di “taglia e cuci” 
del DNA; il taglio viene eseguito dagli enzimi di restrizione, mentre ad agire successivamente sono 
le ligasi.

Breve cronologia

Anno Scoperta
circa  Hamilton Smith, Werner Arber e Daniel Nathans scoprono in Haemophilus influenzae 
1970 l’enzima di restrizione (dal taglio specifico) HindIII. Negli anni immediatamente successivi 
molti altri enzimi di restrizione furono scoperti
1973 Boyer e Cohen utilizzano per la prima volta un plasmide per clonare il DNA
1975 E. Southern sviluppa la tecnica del Southern blot, ancora oggi uno dei metodi più efficaci 
per individuare dei geni clonati.
1977 Glibert e successivamente Sanger mettono a punto dei metodi per sequenziare il DNA
1995 Sequenziamento completo del genoma di H. influenzae (Fleischmann, Smith e Venter)

Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono delle endonucleasi che, nel batterio, fungono da “sistema  
immunitario”. In caso di infezione fagica, infatti il batterio è in grado di “restringere”, ovvero inibire, 
la crescita dei fagi al suo interno. Il meccanismo dell’inibizione dipende dall’azione di queste 
endonucleasi, che riconoscono delle sequenze specifiche nel DNA esogeno e praticano un taglio 
nella molecola di acido nucleico. Il batterio è protetto dall’azione nucleasica di questi enzimi grazie 
a specifiche metilasi, che sono in grado di riconoscere e metilare i medesimi siti riconosciuti 
dall’enzima di restrizione a cui sono accoppiate. I due enzimi sono indicati insieme come sistema 
di restrizione­modificazione. Tuttavia, per quanto concerne l’ingegneria genetica, l’interesse è 
focalizzato principalmente sugli enzimi di restrizione e, raramente, nelle metilasi.
Gli enzimi di restrizione differiscono principalmente per la lunghezza della sequenza riconosciuta 
e per il tipo di taglio effettuato. Essi infatti:
­ Riconoscono solitamente sequenze di 4, 6 e 8 paia di basi, quasi sempre palindromiche. 
In una sequenza casuale di DNA, la frequenza di taglio di un enzima che riconosce 4 paia 
di basi sarà di 44=256 basi. Per le endonucleasi che riconoscono 6 e 8 paia di basi la 
frequenza sarà invece, rispettivamente, di 4096 e 65536.
­ Molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati, in modo da lasciare alcune basi di DNA a 
singolo filamento alle estremità 5’ o 3’ che vanno a costituire le cosiddette “estremità 
appiccicose” (in inglese “sticky ends”); oppure possono produrre due estremità piatte (in 
inglese “blunt ends” La reazione di ligazione è di solito più efficace nel caso delle sticky 
ends.
Vi sono anche alcuni enzimi di restrizione che pur tagliando in corrispondenza di siti diversi, 
riconoscono la stessa sequenza (ad esempio SmaI e XmaI: il primo lascia estremità piatte, il 
secondo effettua un taglio sfalsato, ma entrambi riconoscono la medesima sequenza di 6 paia di 
basi): questi enzimi sono chiamati isoschizomeri.

Enzima Organismo di origine Sequenza consenso Taglio

5'GAATTC 5'---G AATTC---3'
EcoRI Escherichia coli 3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'
HindIII Haemophilus influenzae 3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
5'CCTNAGG
MstII genere Microcoleus 3'GGANTCC
5'TCGA 5'---T CGA---3'
TaqI Thermus aquaticus 3'AGCT 3'---AGC T---5'
5'GCGGCCGC
NotI Nocardia otitidis 3'CGCCGGCG
5'GANTC
HinfI Haemophilus influenzae 3'CTNAG
5'AGCT 5'---AG CT---3'
AluI* Arthrobacter luteus 3'TCGA 3'---TC GA---5'
(da Wikipedia, www.wikipedia.org )

Un limite degli enzimi a taglio sfalsato è rappresentato dal fatto che le estremità appiccicose 
richiedono l’esatta complementarietà fra loro per la successiva reazione di ligazione.
Se le due estremità che devono venir legate non sono compatibili si può:
­ aggiungere un oligonucleotide che funga da “ponte” se le due estremità sono 5’ e 3’ 
protundenti;
­ aggiungere un adattatore (come quelli schematizzati in figura) le cui estremità sono 
sintetizzate in modo da risultare compatibili a quelle a cui deve legarsi;
­ utilizzare una DNA polimerasi perché sintetizzi le basi mancanti. Si crea quindi 
un’estremità piatta compatibile con altre estremità piatte create da enzimi di restrizione.

(adattatori)

Plasmidi
La lunghezza dei plasmidi che si usano in biologia molecolare è di solito compresa tra le 3000 e le 
8000 coppie di basi, a seconda dell’inserto e degli scopi per cui è utilizzato.
Un esempio di plasmide classico è pUC19. Esso è caratterizzato dalla presenza al suo interno di:
­ un gene per la resistenza all’ampicillina, che si conferisce ai batteri che portano al loro 
interno questo plasmide. Questa caratteristica permette di controllare l’efficienza della 
trasformazione e consente la rapida selezione dei cloni recanti il vettore;
­ un sito di clonaggio multiplo per gli enzimi di restrizione. È questo il sito di clonazione, 
dove il plasmide viene aperto per l’inserzione del DNA di interesse. Si parla di clonazione 
 perché è poi il clone di batterio (al cui interno è presente il plasmide) a consentire 
l’amplificazione dell’inserto di pari passo con la crescita della colonia.
Molto spesso il sito di clonaggio multiplo è inserito all’interno del gene lacZ’, che codifica per la 
porzione aminoterminale (il peptide α) dell’enzima β­galattosidasi. Questo peptide complementa 
con la restante porzione della proteina prodotta dal batterio, attivando l’enzima. A questo punto, 
l’utilizzo di un substrato indicatore, come l’X­gal, è in grado di far rilevare la presenza o assenza 
dell’inserto all’interno del plasmide. Se, infatti, il DNA di interesse si è inserito correttamente, esso 
ha provocato un’interruzione nel gene lacZ’ e l’X­gal non verrà processato; in caso contrario 
l’enzima β­galattosidasi sarà attivo e, agendo sul substrato X­gal, colorerà il batterio di blu.
Anche questo metodo, tuttavia, può segnalare dei falsi negativi: per esempio, se l’inserto che si 
lega al plasmide è troppo piccolo e non modifica la fase di lettura, il peptide α verrà prodotto lo 
stesso e il test del colore darà un risultato errato.

(da www.blc.arizona.edu )

Clonazione di DNA
1­ Digestione con enzimi di restrizione (circa 1 ora)
Per far agire l’enzima è necessaria la presenza di un tampone appropriato. Sono attualmente in 
commercio tamponi ottimizzati per più di un enzima.
Molto spesso ci si trova nella situazione di dover effettuare delle digestioni multiple, con 
endonucleasi differenti. In questo caso si può utilizzare un tampone compatibile ad entrambi gli 
enzimi, oppure, in sua assenza, si deve ricorrere a digestioni separate.
2 – Eliminazione dell’enzima di restrizione
Prima di procedere alla reazione di ligazione è essenziale eliminare l’enzima di restrizione dal 
campione: infatti, se rimane attivo, esso continua a ripetere la sua azione nucleasica vanificando la 
ligazione fra plasmide e inserto. Di solito, per inattivare un enzima di restrizione si scalda a 65° per 
circa 10 minuti: è bene ricordare, comunque, che ad enzimi diversi, possono corrispondere 
differenti condizioni per la disattivazione.
3 – Ligazione 
La reazione di ligazione è compiuta dalla DNA ligasi. Per la sua azione è richiesto un nick che 
esponga un gruppo 3’­OH e un 5’­fosfato. Alcune DNA ligasi, come la T4 ligasi, sono in grado di 
unire anche frammenti presentanti le estremità piatte (anche se con minore efficienza).
Può essere fatta a temperatura ambiente per circa 2 ore oppure a temperatura ridotta per più 
tempo. Abbassando la temperatura infatti si consente un migliore e più forte appaiamento delle 
basi a discapito, tuttavia, dell’attività enzimatica. Per una buona efficienza è inoltre consigliabile 
creare un rapporto ottimale inserto­vettore, in modo da evitare la produzione di dimeri inserto­
inserto o plasmide­plasmide. In generale, la reazione di ligazione è la tappa più lenta e difficile. 
Ciononostante non è necessario che essa avvenga sulla totalità dei plasmidi, ma in una buona 
percentuale di essi.
4 ­ Trasformazione
I batteri devono essere resi competenti per la trasformazione, dato che la loro normale capacità di 
incorporare il DNA è bassa. La competenza può essere acquisita tramite lavaggi in soluzioni 
saline e centrifugazioni. Con le attuali tecniche si può arrivare ad ottenere un’efficienza di 
trasformazione di 108­109 batteri/μg.
Dopo che i batteri hanno acquisito il plasmide, vengono trasferiti momentaneamente in un terreno 
molto ricco per consentire una loro ripresa dallo stress dei precedenti trattamenti e 
successivamente vengono piastrati.
5 – Alcuni accorgimenti
Molto spesso vengono utilizzati oligonucleotidi o sequenze geniche di mammiferi per far esprimere 
determinati geni nei batteri in modo da poterne studiare funzione e struttura. Tuttavia i batteri 
utilizzano preferenzialmente alcuni codoni sinonimo rispetto ad altri, magari utilizzati dai 
mammiferi. La traduzione di tali inserti risulta perciò molto rallentata e si ha solo una piccola 
produzione della proteina di interesse. Per ottimizzare la sintesi di proteine umane in batteri è 
perciò, a volte, più vantaggioso ri­sintetizzarlo ex novo con i codoni ottimizzati per il batterio, 
piuttosto che clonare il gene umano.
Un altro problema riguarda gli oligonucleotidi sintetizzati: essi non sono fosforilati e, come detto 
precedentemente, la DNA ligasi richiede un gruppo 5’­fosfato per dar luogo alla reazione di 
ligazione. Per fosforilare l’oligonucleotide vengono utilizzati degli enzimi appositi, chiamati 
polinucleotide chinasi, che trasferiscono il gruppo fosfato dall’ATP all’estremità 5’.
Infine, per evitare che, durante la reazione di ligazione, il plasmide si richiuda su se stesso, un 
accorgimento che viene spesso usato consiste nella defosforilazione  delle estremità  con un 
trattamento a base di fosfatasi alcalina, enzima che toglie il gruppo fosfato all’estremità 5’: in 
questo modo solo l’inserto è in grado di fornire l’estremità 5’­fosfato necessaria per l’azione 
enzimatica della ligasi.

Librerie
Librerie di c­DNA
Partendo dal materiale biologico, ovvero dagli RNA estratti direttamente dalla cellula, è difficile 
ottenere l’mRNA di interesse: questo perché nella cellula sono presenti anche notevoli quantità di 
RNA ribosomale e di tRNA. Bisogna quindi prima di tutto cercare di purificare l’mRNA cellulare. 
Nelle cellule eucariotiche un vantaggio è rappresentato dal fatto che gli mRNA presentano una 
coda di poliA aggiunta dopo la trascrizione.
L’mRNA viene convertito in c­DNA grazie all’azione della trascrittasi inversa. Successivamente il 
c­DNA va inserito in opportuni vettori, e il DNA ricombinante può essere utilizzato per trasformare 
cellule batteriche, che andranno a costituire la libreria di c­DNA.
Nell’approccio genomico, invece, è il DNA genomico a venir prima digerito e poi inserito in vettori 
per la costituzione di una libreria genomica.

Testi per consultazione e approfondimento
Enzimi di restrizione:
­ “Dai geni ai genomi” (Dale, Schantz) cap.5
Clonaggio:
­ “Dai geni ai genomi” (Dale, Schantz) cap.5
­ “Biologia molecolare” (Weaver) cap.4