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1 - Introduo, 1
1.1. Histrico, 1
1.2. Classificao, 1
2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3
2.1. Cromatografia de adsoro, 3
2.2. Cromatografia de partio, 4
2.3. Cromatografia em fase lquida, 6
2.4. Fatores que influem na separao, 7
2.5. Cromatografia em fase gasosa, 11
3 - Tratamento terico da Cromatografia, 14
3.1. Equao de Van Deemter, 14
3.2. Fase estacionria, 14
3.3. Suporte, 15
3.4. Coluna, 16
3.5. Fase mvel, 16
4 - O Cromatgrafo, 18
4.1. O Cromatgrafo a Gs, 18
4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 20
4.3. Detetores, 23
5 - Anlise Qualitativa, 30
6 - Anlise Quantitativa, 31
6.1. Introduo, 31
6.2. Medio de rea, 31
6.3. Mtodos de clculo, 33
6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 37
7. Otimizao do processo analtico, 39
7.1. Parmetros analticos, 39
7.2. Projetando um mtodo analtico, 41
7.3. Validao de um mtodo analtico, 43
8. Tcnicas adicionais de identificao, 50
1 - INTRODUO
1.1. Histrico
Cromatografia um termo genrico, aplicado a um processo de separao
fsico-qumico, o qual baseado nos fenmenos de adsoro e partio. Este termo foi
escolhido porque as primeiras separaes foram realizadas com substncias coloridas.
Entretanto, o processo cromatogrfico no restrito a essa classe de substncias,
constituindo-se na atualidade no mtodo mais eficiente de separao, com aplicaes na
Qumica Analtica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgnicos e inorgnicos,
independentemente de seu estado fsico.
1.2. Classificao
Num processo cromatogrfico so envolvidas uma fase mvel e uma fase
estacionria. A fase estacionria um slido ou um lquido (Figura 1.1). No segundo caso,
este fica impregnado em um slido (suporte) e o fenmeno mais atuante a partio. No
primeiro caso, tem predominncia a adsoro. Assim, pode-se classificar a Cromatografia
em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.
Figura 1.1 - O Processo Cromatogrfico. A Fase Mvel transporta a amostra atravs da Fase
Estacionria. A velocidade mdia das partculas da amostra depende da sua natureza. Desse
modo, cada componente atingir o final da coluna em um instante diferente.
ka
Na
Nn
a) Cromatografia de Adsoro
b) Cromatografia de Partio
kp
C1
C2
kp
logo,
M1
M1
V2
V1
( M 0 M 1)
V 1 M 0 M1
V2
M 1 M 0.
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 1)
M 2 M 1.
k pV 1
V 2 k pV 1
(eq. 2)
(eq. 3)
(eq. 4)
que d a massa Mn que permanece no solvente 1 aps n extraes com o solvente 2. D-se ao
processo agora descrito o nome de extrao. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por
'
exemplo, 2 componentes, com kp kp , um dos componentes ficar preferencialmente no
solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, medida que n cresce, cada fase ficar mais
pura em um dos componentes. No caso anterior (extrao), a poro de lquido 1 era
sempre a mesma, renovando-se apenas o lquido 2. Agora, ambos so renovados. O
Esquema 2.1, onde o lquido 1 o superior, ilustra o processo, que pode ser
visualizado a nvel molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substncias A e B, onde kA maior que kB. Isto significa que o
lquido 1 vai se enriquecendo de A e o lquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a
cada etapa do processo. Os nmeros da esquerda, em cada quadrcula, indicam a frao de
A e os da direita indicam a frao de B. Do mesmo modo, os nmeros superiores indicam a
frao de A e de B no lquido 1 e os inferiores indicam a frao de A e de B no lquido 2.
No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos
coeficientes de partio valem, respectivamente, 3 e 1/3.
Para este segundo tipo de procedimento, a eq. 4 no vlida. Em seu
lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn a massa extrada aps n
etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composio da mistura (ou o
grau de pureza de cada componente) em cada solvente, aps n etapas (n parties).
(eq. 5)
IMPORTANTE ! Se kB tambm for maior que a unidade, a perda de B ser muito grande e
tambm a purificao de A ser muito demorada (exigir maior nmero de etapas).
2.3. Cromatografia em Fase Lquida
O exemplo mais simples de cromatografia a lquido a separao em uma
camada delgada de slica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em
Camada Delgada). A Figura 2.2 ilustra o processo.
O lquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os
componentes de uma mistura binria (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicao). Quando
o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta removida da cuba que
contm o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posio vertical e a um
nvel abaixo do ponto de aplicao. As razes de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 so
caractersticas de cada substncia, dependendo da natureza da fase mvel e da fase
estacionria. A Cromatografia em Camada Delgada a mais empregada em Anlise
Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada,
menos indicada para fins preparativos, quando ento se emprega a Cromatografia em
Coluna Clssica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionria colocada em um tubo
de vidro (coluna cromatogrfica) colocado na posio vertical. A coluna dotada de uma
torneira na extremidade inferior (Fig. 2.3), que utilizada para controlar a vazo da fase
mvel, que desce por gravidade.
Fig. 2.2 - Cromatografia em Camada
Delgada.
Neste exemplo, a amostra contm dois
componentes, A e B, que so identificados
pelos respectivos valores de R f
Figura 2.3
Cromatografia
em Coluna
A- n-nonano (154oC)
B- n-decano (174oC)
C- n-undecano (194oC)
no polar, no forma ponte
D- etanol (78oC)
E- n-propanol (94oC)
F- n-butanol (118oC)
G- n-pentanol (132oC)
polar, ponte de hidrognio mdia
H- gua (100oC)
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
10
a separao cromatogrfica.
onde:
11
TIPO
ADSORO
PARTIO
12
RR =
Tr2
Vr 2
Dr 2
=
=
Tr1
Vr 1
Dr1
13
H = l /n,
14
=
dp =
Dg =
=
K =
N=
df =
Dl =
v=
(eq. 7)
que a equao de uma hiprbole (Fig. 2.13). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difuso da amostra em
cada fase so fatores que devem ser seriamente considerados, quando projetada uma
coluna. Temperatura talvez o fator mais importante, embora no aparea explicitamente
na eq. 6. que K e D so altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na
prtica que esta a varivel que mais influi na resoluo, variando drasticamente a reteno
relativa. De um modo geral, o tempo de reteno depende da natureza da fase estacionria,
da temperatura de operao e da vazo da fase mvel.
3.2. Fase estacionria
A fase estacionria um slido (Cromatografia de Adsoro) altamente poroso
(mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um lquido (Cromatografia de Partio). No segundo
caso, o lquido depositado sobre um slido (suporte), que ser discutido mais adiante.
15
16
Figura 3.1 - Ausncia (a) e presena (b) de ponte de hidrognio entre FE e etanol
3.4. Coluna
O material de que constituda a coluna (tubo) pode ser ao inox 316,
alumnio, nquel, vidro ou teflon. Quando no se conhece o material a ser analisado, d-se
preferncia s colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover
centros cidos de sua superfcie) ou de teflon, sendo que a ltima tem emprego mais
restrito, devido sensibilidade ao calor e presso. As colunas so classificadas quanto ao
dimetro externo:
- Coluna microanaltica (capilar) ............
- Coluna analtica ..................................
- Coluna semi-preparativa .....................
- Coluna preparativa ..............................
0,1 a 0,5 mm
1/8, 3/16 e 1/4
3/8, 1/2 e 5/8
5, 7 e 10 cm
17
(N2)
(H2)
18
4 - O CROMATGRAFO
4.1. O Cromatgrafo a Gs
A Fig. 2.11 (p. 11) representa esquematicamente um Cromatgrafo a Gs.
possvel agora descrever mais detalhadamente o instrumento.
a) Controles de Temperatura
O cromatgrafo dispe de termostatos para controle independente do
aquecimento dos trs principais setores: cmara de vaporizao, forno da coluna e bloco do
detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistncia eltrica localizada na
base do forno, homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado aps o
final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do
forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de
resfriamento automtico.
b) Controles Pneumticos
Os cromatgrafos a gs normalmente possuem uma vlvula controladora
de presso e outra para ajuste da vazo da fase mvel. Idnticos sistemas existem para o
controle da vazo dos gases auxiliares (ver seo 4.3.2.b; p. 25). A vazo medida com o
auxlio de um fluxmetro de bolha, ou bolhmetro (Fig. 4.1). A pra (parte inferior)
contm uma soluo de sabo lquido. Comprimindo-se a pra, o nvel do lquido sobe e
o gs forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazo, suficiente
marcar com um cronmetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
19
20
f) Registrador
O registrador um instrumento acessrio, que transforma o sinal emitido
pelo detetor e amplificado pelo eletrmetro, em um sinal mecnico. Na extremidade do
sistema mecnico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da
linha de base, proporcional quantidade do componente na amostra. Como o papel est
em movimento, obtm-se uma curva (cromatograma), onde a distncia do incio da anlise
(ponto de injeo) ao mximo de cada pico a distncia de reteno (Dr). Dividindo Dr por
z (velocidade do papel), obtm-se o tempo de reteno, Tr. Idealmente, com separao
completa e condies timas (incluindo seleo perfeita da fase estacionria), obtm-se uma
curva simtrica. No Apndice 3 so discutidas outras tcnicas de aquisio de dados.
g) Programador Linear de Temperatura
Quando a reteno relativa (RR) de alguns componentes prxima da
unidade (baixa resoluo) e no entanto a temperatura de ebulio dos componentes menos
volteis muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da anlise
(temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e obter um pico mais
agudo para os ltimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na determinao de
Dr), acarretaria uma diminuio na j pequena reteno relativa dos primeiros componentes
(Cromatograma 4.4). Em situaes como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura,
com o auxlio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de
aquecimento pode ser controlada, sendo possvel tambm promover um aquecimento
isotrmico em algumas regies. Em operaes desse tipo deve-se indicar no cromatograma
a temperatura inicial (Ti), a temperatura final (Tf), que no deve diferir da temperatura de
ebulio da fase estacionria em menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que
o cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.5).
21
22
23
R = K1.C
R = K2.
dm
dt
Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os
seguintes: detetor de condutividade trmica (DCT), detetor de ionizao de chama (DIC) e
detetor de ndice de refrao (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicao.
A escolha do detetor importante e depende do material a ser analisado.
As principais caractersticas dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleo
do detetor mais apropriado, so as seguintes (ver Apndice 1, p 53):
- Sensibilidade
- Nvel de rudo
- Resposta
- Especificidade / Seletividade
- Condutividade trmica (para DCT)
S = KI2 .
(g - s)
. (Tf - Tb)
(eq. 8)
onde:
S = sensibilidade (mV.cm3/mg)
K = constante da clula
I = intensidade de corrente
R = resistncia do filamento
24
Tf = temperatura do filamento
Tb = temperatura do bloco
25
26
DCT
1 ppm
104
3
1-10 mL/min
1 - 40 L
todos
DIC
100 ppb
107
1-200 mL/min
0,05 - 5 L
orgnicos
uso geral
orgnicos
DNP
0,1 ppb
104
10-100 mL/min
1 - 5 L
nitrogenados e
fosforados
resduos de
pesticidas
DCE
0,1 ppb
102
10-100 mL/min
1 - 5 L
halogenados
resduos de
pesticidas
27
28
onde l o caminho tico (distncia percorrida pela luz dentro da soluo; espessura da
clula). A constante de proporcionalidade denomina-se absortividade molar. A
absorbncia, por sua vez, proporcional transmitncia, frao de luz transmitida.
Quando o contedo da clula (Fig. 4.8) transparente radiao
empregada (UV ou VIS), a transmitncia 100 % e evidentemente a absorbncia ZERO.
Entretanto, quando chega clula uma substncia que absorva essa luz, o
sistema de deteco mede a diferena em intensidade, gerando o cromatograma
correspondente.
Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de
radiao uma lmpada de mercrio, cujo comprimento de onda principal (90 % do total da
radiao) mede 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de
onda fixo (e nico). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemtico desse tipo de
instrumento. Como a regio til da radiao UV varia de 190 a 300 nm, de se esperar que
mesmos os compostos que absorvem luz UV no venham a ser detectados em um detetor do
tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma
varredura em toda a regio UV, primordial, evidentemente, que a fonte de radiao
(lmpada de deutrio) possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de
interesse (fonte no monocromtica). Desse modo, o instrumento (UV varivel) necessita de
um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a
amostra com uma luz monocromtica. Esse dispositivo chama-se monocromador. Para se
operar na faixa visvel (400-750 nm), emprega-se uma lmpada de tungstnio.
29
30
6 - ANLISE QUALITATIVA
O tempo de reteno (Tr) uma caracterstica fsico-qumica e como tal
permite que se faa anlise qualitativa, desde que se disponha de um padro. Na falta do
padro, necessrio coletar cada componente isoladamente e identific-lo por outros
mtodos analticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, so comercializados
cromatgrafos cujo detetor um espectrmetro de massas.
Quando uma amostra submetida anlise, preciso fornecer ao analista
alguns dados a respeito da mesma:
- Origem (de sntese, natural, etc ?).
- Componentes provveis (espcie, nmero).
- Composio quantitativa provvel.
- Faixa de ponto de ebulio (amostra lquida).
- Outros dados relacionados com as variveis do processo.
Quanto maior for o nmero de informaes, mais rapidamente o analista
encontrar as condies ideais de anlise.
Como existe apenas uma vazo ideal para cada coluna, resta ao analista
procurar a coluna e a temperatura (ou programao de temperatura) ideais.
Existem outros modos de efetuar a identificao, os quais sero estudados
mais adiante (Captulo 8).
31
6 - ANLISE QUANTITATIVA
6.1. Introduo
Para se determinar a composio de uma mistura (Anlise Quantitativa)
necessrio medir as reas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem
sempre o nmero de picos igual ao nmero de componentes, pois alm da probabilidade
de ocorrer superposio, alguns componentes podero no ser detectados, o tempo de
anlise poder ser inferior ao tempo de reteno de um componente menos voltil, etc.
O uso de uma referncia (padro) permite, contudo, determinar a
percentagem de um dado componente, mesmo que no apaream os picos dos outros
componentes.
Antes de se efetuar o clculo da composio, entretanto, preciso fazer as
correes das reas, pois a relao das reas de dois componentes quase sempre diferente
da relao entre as suas massas (composio em massa). Isto porque a sensibilidade
(Resposta) de um detetor a duas diferentes substncias normalmente diferente.
Analisando a eq. 8 (p. 23), observamos que alm de outros fatores, a
sensibilidade dos detetores de condutividade trmica depende da diferena g - s Como s
varia de substncia para substncia, podemos dizer que uma mistura binria qualquer
contendo 50% de cada componente muito provavelmente ter uma relao de reas
diferente da unidade.
Com os detetores de ionizao de chama (e tambm com os de captura de
eltrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar
eltrons) varia de substncia para substncia. Alis, essa afirmao vale para qualquer outro
tipo de detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Lquido.
Assim sendo, vale a pena repetir, necessrio primeiro determinar os
fatores de resposta para as reas e s depois efetuar o clculo da composio.
32
a) de disco (eletromecnico)
b) eletrnico
ou
iv - Determinao grfica:
a) S = h.L ou
b) S = h.L,
33
mr
mi
=
Ar
Aci
Aci =
mi
. Ar
mr
(eq. 9)
onde Aci a rea corrigida de uma substncia qualquer i. Por outro lado, podemos dizer que:
34
A ci A i. Fi
(eq. 10)
onde Fi o fator de correo. Igualando-se os segundos membros das equaes 9 e 10, fica:
Ai.Fi =
mi
. Ar
mr
ou
Fi =
mi Ar
.
mr Ai
(eq. 11)
OBS.: Para uma mesma soluo, mi / mr = Ci / Cr, logo Fi = Ci / Cr . Ar /Ai (eq. 11) aplicandose a eq. 11 a uma amostra de concentrao conhecida (mistura padro), encontra-se Fi. Ento, a
partir da eq. 10 (aplicada amostra de concentrao desconhecida), calculada a rea corrigida
Aci. Finalmente, a composio dada pela eq. 12:
Ci =
Aci
. 100
Aci
(eq. 12)
Ci
Ai
. 100
Ai
(eq. 12)
35
Ci Api
.
= Fi
Ai Cpi
(eq. 15)
Ci'
= Ri
Ai'
(eq. 16)
C'Pi
= RPi
A 'Pi
(eq. 17),
Assim,
C'Pi
C'i
.
F
i = Ri =
A 'Pi
A 'i
A 'i
C'i =
. C'Pi . Fi
A 'Pi
(eq. 18)
(eq. 19)
36
Ci
= Ri
Ai
C'i
= Ri
A 'i
C'i = A 'i .
Ci
Ai
(eq. 20)
C'i = A'i . Ri
(eq. 21)
OBS.:
1 - Os valores de Ri, obtidos num determinado laboratrio, podem ser tabelados,
ou fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilizao das anlises.
Devido a alteraes na sensibilidade do detetor (variao na relao de fluxo dos gases
auxiliares no DIC, corroso, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os
valores de Fi (ou de Ri) devem ser recalculados periodicamente. O analista dever
determinar experimentalmente a periodicidade.
2 - O mtodo do padro externo (regra de trs simples) uma simplificao do
mtodo do padro interno (regra de trs composta), onde se faz V ip = Via , onde Vip o
volume injetado de soluo padro e Via o volume injetado da amostra. Portanto, a
preciso deste mtodo de clculo depende da percia do analista na medio do volume a
ser injetado.
d) Tcnica para fechar uma anlise
37
Muitas vezes necessrio fazer duas injees. Isso acontece quando uma
nica coluna no consegue separar todos os componentes e/ou um nico detetor no detecta
todas as substncias.
Considere-se o mtodo de Normalizao de rea e uma situao em que
um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injees o
volume no foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas reas dos
dois cromatogramas fossem somadas diretamente.
No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os
componentes (1), (2) e (4) so quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2)
aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas reas, nos dois cromatogramas (Aa2
e Ab2) seriam iguais. Na prtica, geralmente encontra-se Aa 2 Ab2 . Qualquer uma das
reas correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referncia, indiferentemente.
Tomando o cromatograma A como referncia, tem-se:
A a2
= K
A b2
Aci ,
38
39
l (m)
1
2
4
9
16
4
4
4
4
Coluna *
C (%)
10
10
10
10
10
1
2
5
20
m (g)
0,13
0,24
0,57
1,24
2,15
0,05
0,12
0,26
1,18
Vazo Ideal
Fo
(mL/min)
30+5
20+5
28+5
21+5
38+5
18+5
26+5
34+5
37+5
n x 10-3
H (mm)
0,8
1,4
4,3
8,0
16,0
1,9
2,0
2,7
3,3
1,25
1,43
0,93
1,13
1,00
2,11
2,00
1,48
1,21
(*) a) Fase estacionria: Apiezon L; DE = 1/8; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.
40
Volume (L)
0,5
1,0
1,5
2,0
n
15.800
9760
6800
5270
H (mm)
1,01
1,64
2,35
3,03
70oC
1,60
3,29
7,38
18,88
100oC
1,17
1,93
3,65
7,08
130oC
0,85
1,23
1,92
3,25
160oC
0,68
0,77
1,35
2,00
Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax funo linear de l.
O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
O valor de nmax varia com C, sendo mximo quando C = 12 %, para suporte com faixa
de granulometria de 60-80 mesh ( malhas por polegada linear; equivale a um
dimetro de partcula de 175-230 mm).
A faixa de vazo ideal no varia com a temperatura.
41
Observaes:
a) na seleo do detetor, verificar se o material a ser analisado detectvel por ele e se
o seu Limite de Deteco compatvel com a faixa de concentrao de interesse
(ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 26);
b) na avaliao dos erros estatsticos, considerar todas as operaes envolvidas, tais como
pesagem, medio de volume, diluio, tcnicas de amostragem e de injeo, etc;
42
prep.
Padro
No
Sim
Sim
Sim
prep.
Amostra
No
No
No
Sim
injeo
No
No
Sim
No
comp. No
detectados
Sim
Sim
No
No
como medida da rea; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentrao.
altura(1)
Sim
Sim
No(2)
No(2)
43
Malha/polegada
nmx
60-80
4300
80-100
4600
100-120
5700
D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 %
Hmn
0,93
0,87
0,70
Fo (mL/min)
20
20
24
44
notao
Analito
Amostra
Padro
United States Pharmacopea USP
Concentrao
c
Soluo Estoque
SE
Soluo Intermediria
SI
Soluo de Trabalho
ST
descrio
Substncia-problema.
Qualquer material, independentemente de
sua origem, que contenha o analito.
O analito, comercializado com alta pureza.
Farmacopia Americana. Fonte de consulta.
Concentrao do analito (ou do padro).
Soluo do padro a alta concentrao
(pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substncia).
Soluo do padro, necessria para se
chegar Soluo de Trabalho.
Soluo do padro com concentrao
Faixa de Linearidade
FL
Curva de Calibrao
Coeficiente de Correlao r
Faixa de Trabalho
FT
Limite de Deteco do
Equipamento
Limite de Deteco da
Amostra
Limite Efetivo
LDE
Seletividade
Resoluo
Preciso
Rs
Exatido
Recuperao
Repetibilidade
Reprodutibilidade
LDA
LE
45
46
Consistncia
Robustez
7.3.3. Procedimento
a) Seletividade / Identificao
A principal fase do trabalho aquela em que testada a confiabilidade da
identificao. Isso inclui a determinao do tempo de reteno de toda e qualquer
substncia que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:
impurezas de sntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poder ser bastante penoso);
impurezas de degradao (essas informaes podem ser obtidas de estudos shelf-life);
excipientes, conservantes, aditivos e outros princpios ativos constantes da formulao (no
caso de associaes);
Deve ser lembrado que a identificao pura e simples por
cromatografia (mtodo no validado) no tem valor cientfico. Assim, o ideal, o
recomendado mesmo, associar tcnica cromatogrfica, a tcnica de Espectrometria
de Massas. Essa associao pode ser manual, atravs da separao fsica, por coleta
na sada da coluna, seguida da obteno do espectro de massas. A identificao
pode ser ainda complementada com auxlio de outra tcnica analtica, como a
Espectrometria de Ressonncia Magntica Nuclear, Espectrofotometria no
Ultravioleta-Visvel ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem
cromatgrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrmetro de massas, o qual
substitui o detetor tradicional do cromatgrafo.
Embora os exemplos aqui apresentados sejam tpicos da indstria
farmacutica, os diversos procedimentos so igualmente aplicveis a qualquer outro tipo de
amostra. De um modo geral, produtos de sntese (de uso farmacutico ou no) podem ter
seu mtodo analtico validado sem auxlio da espectrometria (embora seu emprego d maior
credibilidade validao). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso
farmacutico) exige a associao de mtodos espectromtricos.
J se sabe que a eficincia (n) de uma coluna diretamente proporcional
ao tempo de reteno. Portanto, quanto maior for o tempo de eluio, maior ser a sua
eficincia. Assim, a seletividade pode ser medida como a razo dos tempos de reteno:
47
= tr1/tr2
Essa relao tambm denominada reteno relativa (p. 12) ou ainda fator de separao e
demonstra-se que equivalente s relaes dos coeficientes de partio:
= kp1/kp2
Entretanto, esse critrio algo insatisfatrio, posto que colunas com diferentes eficincias
podem apresentar mesmos fatores de separao, conforme pode ser visto na Figura 7.1.a,b.
Porisso, em vez da seletividade, emprega-se a resoluo (Rs), como medida efetiva da
capacidade de separao:
Rs = 2(tr2 tr1)/(L1 + L2)
ou seja, a resoluo igual diferena entre os tempos de reteno dividida pela mdia da
larguras na base (Figura 2.14, p. 13).
bvio que a resoluo diminui com o alargamento do pico e
evidentemente tambm diminui se a cauda, resultante de uma interao excessiva com a
fase estacionria, bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformao do pico deve ser
considerada quando da seleo da coluna. Chama-se fator de deformao ou fator de
assimetria (TF, do ingls tailing factor) a relao
TF =
BC
AB
48
b) Detalhamento da Metodologia
A metodologia analtica inclui todos os parmetros explicitados na Seo
7.2 (pgina 41).
c) Avaliao estatstica
Para realizao dos testes estatsticos, sugere-se que qualquer
operao (preparao da soluo padro, tomada de alquotas, etc) seja realizada
em triplicata (ou mais) e que cada soluo obtida seja injetada pelo menos cinco
vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2 a estimativa do desvio padro (s R ;
Apndice 6). A 1 a estimativa (s) s deve ser empregada em conjuntos de dados
com mais de 10 itens.
d) Exemplo
A seguir, apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operao. Para
este exemplo, foi selecionado o produto aspirina. A aspirina comercializada em vrias
formas, sendo selecionado como amostra o comprimido.
A aspirina (cido acetilsaliclico) produzida industrialmente a partir do
cido saliclico:
49
50
atenuao mnima necessria para uma altura no inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por
comparao com a mdia das alturas dos picos das dez injees da soluo mais diluda resultou
em um Limite de Deteco (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.
400
8,0x10
300
rea do pico
rea do pico
6,0x10
4,0x10
r = 0,99996
2
2,0x10
200
r = 0,99999
100
0,0
0
0
500
1000
1500
2000
100
Concentrao (mg/L)
200
300
400
500
Concentrao (mg/L)
51
A relao
52
os ndices de reteno de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionria
no polar tomada como referncia (geralmente esqualano), medidos a uma mesma
temperatura. Essa relao permite avaliar a influncia, na separao, da fase estacionria e
de grupos substituintes presentes na molcula da substncia considerada.
McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco
compostos como referncia e associou o somatrio dos seus valores de I com a polaridade
da fase estacionria, chegando a classificar centenas de fases estacionrias. A Tabela 8.1
apresenta alguns exemplos (observe-se que as FEs esto colocadas em ordem crescente de
polaridade). Os valores de I, denominados constantes de McReynolds, foram
determinados a 120oC. Os valores de Ir para os cinco compostos, com a fase estacionria
esqualano, so: benzeno, 653; n-butanol, 590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e
piridina, 699. Por comparao entre os nmeros de McReynolds de duas diferentes fases
estacionrias, possvel concluir se as mesmas so equivalentes ou no. possvel tambm
prever como melhor uma separao, comparando-se a natureza de duas substnciasproblema com duas das cinco substncias tomadas como referncia.
Tabela 8.1 Valores do Nmero de McReynolds (I) para algumas fases estacionrias.
FASE
ESTACIONRIA
Esqualano (*)
Nujol
Apiezon L
SE-30
SE-52
Hallcomid M-18 OL
QF-1
Carbowax 20M
Diglicerol
DEGS
TCEP
A
0
9
32
15
32
89
144
322
371
492
593
VALORES DE I
C
D
E
0
0
0
0
5
2
6
11
22
15
32
42
53
44
64
41
72
65
98
67
280
143
239
165
233
355
463
305
536
368
572
510
826
560
676
854
733
581
833
791
857
752 1028
915
9 BIBLIOGRAFIA(*)
1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
I
0
33
143
217
334
916
1500
2308
3287
3430
4145
53
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gs. Ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tpicos em Cromatografia a Lquido. Inst. Cientficos C. G. Ltda., So Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Prticas de Cromatografia. Depto. Eng. Qumica/UFPE, 1994.
(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaborao deste texto e recomendada
queles que pretendem aprofundar-se na matria.
54
10 APNDICE 1
Caractersticas bsicas dos detetores
10.1. Sensibilidade
A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a
magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador
potenciomtrico, Integrador ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto
maior for a rea do pico de uma mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor
empregado.
10.2. Nvel de rudo
O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de
qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um
conjunto de fatores, tais como:
- impurezas dos componentes eletrnicos
- sangramento da coluna
- contaminao no detetor
- contaminao na coluna
55
56
11. APNDICE 2
Tcnicas de introduo da amostra
Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs)
introduzida com auxlio de uma microseringa (Figura 11.1). Em Cromatografia a Gs
(CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3
a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.
57
58
12. APNDICE 3
Sistemas de aquisio de dados
Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a
aquisio dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou
HPLC), o sinal gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com
registrador, obtm-se um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os
tempos de reteno e as reas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito
grande e o erro s vezes bastante expressivo (5 a 10 %).
O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na
Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %).
Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a ser
comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do
integrador eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de
integrao, pois a leitura continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os
verdadeiros integradores eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida.
Os clculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao
(medida da rea) da ordem de 0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio
complementar o trabalho. Aps a integrao, o equipamento, utilizando o mtodo de
clculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operao final, chegando a
imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se
integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em
tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo tangencial e inclusive
realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de automatizar o
acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o
fim desses equipamentos.
Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os
integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a
mesma eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro
cromatgrafos de um modo totalmente independente.
59
13. APNDICE 4
O desenvolvimento cromatogrfico
As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuio
das partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase estacionria
lquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel molecular
(pictoricamente). Na Seo 2.2 (p. 4) dado um pequeno tratamento matemtico ao
processo de separao por partio, quando ento h referncia a etapas ou pontos de
equilbrio. Entre as pginas 6 e 7 oferecida uma pequena discusso a respeito do que
acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida), quando faz-se
referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.5, ao discutir as Figuras 2.13 e
2.14 (p. 13), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da eficincia
(capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no Captulo 3 (p.
14), apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so discutidos.
O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia,
como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o
engenheiro qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a
retirada de fraes de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no
existem essas bandejas, mas evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem pontos
de remoo ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto
de ebulio. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferena que outros fatores
tambm interferem no processo, tornando-o mais complexo, porm tambm mais completo,
mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilao contm cerca de 40-60 bandejas,
uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas
(pratos tericos).
Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou
de adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma
velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou
menor com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de
residncia (tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O
material eludo comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas
proximidades da parte central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida em
que o tempo passa, a largura do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se o
tempo de eluio for muito grande, os picos coalescem e a separao ser incompleta (ver
Figura 2.9, vazo V1, na pgina 10). Por outro lado, se o tempo for muito curto, (vazo V 4
da Figura 2.9), pode ser insuficiente para permitir separao completa. Esse raciocnio
levou elaborao da equao abaixo, para o clculo da eficincia de uma coluna
cromatogrfica (Fig. 2.14, p. 13):
n = (4Dr/L)2
60
61
14. APNDICE 5
Outros detetores empregados em Cromatografia
14.1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)
O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado
especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) a nvel de
traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o
DNP utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os
mesmos gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da
chama). O polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases (que
diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir chama,
mas o potencial eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 1 4105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos, relativamente a outros compostos.
Devido a essas caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos nitrogenados e
fosforados, unicamente para solues extremamente diludas, sendo portanto ideal para a
deteco de traos de pesticidas organo-clorados e organo-fosforados.
14.2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC)
O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz
respeito ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida pelo
enxofre (e tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do espectro
eletromagntico. Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim Lei de
Beer. A radiao emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de
onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para compostos contendo
um desses elementos, sua sensibilidade da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo
portanto indicado para a deteco de traos (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados.
14.3. Detetor de ons
At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada
na anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em
paralelo de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada
da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS).
A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre
numa coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de
uma tcnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas
(deionizao). O equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico.
Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor
especfico, o detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um
62
par de eletrodos contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre os
eletrodos. O efluente da coluna passa pela clula, variando a resistncia entre os
eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutncia (L) inversamente proporcional
resistncia e medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens. Quando a
distncia entre os eletrodos de 1 cm, tem-se:
k = L/A
onde k a condutncia especfica e A a rea do eletrodo. Por outro lado, a condutncia
equivalente (Ce) relacionada com a condutncia especfica como:
Ce = 1000 k/c
onde c a concentrao do on em equivalente-grama/L.
14.4. Detetor de Fluorescncia
O Detetor de Fluorescncia, utilizado em HPLC, equivalente a um
Detetor de Ultravioleta. A nica diferena consiste na localizao (ortogonal e no linear)
em relao ao caminho tico. Desse modo, captada apenas a radiao proveniente do
processo de fluorescncia, caracterstico de certas classes de compostos. Assim, substncias
que no fluorescem podem existir na amostra sem interferir na deteco. Uma importante
aplicao a anlise de aminocidos em materiais biolgicos (ex.: teste do pezinho). Neste
exemplo, os aminocidos so transformados em derivados fluorescentes com o reagente
AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminocidos podem ser
analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternrio, com limite de deteco
menor que 10 mg/L.
14.4. Detetor Eletroqumico
O Detetor Eletroqumico, tambm utilizado em HPLC, basicamente uma
clula eletroqumica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela clula, oxidado (ou
reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente eltrica que proporcional sua
concentrao.
Existem dois tipos de detetores:
a) Detetor coulomtrico: a amostra passa atravs da clula. Desse modo, todo o
material oxidado (ou reduzido);
b) Detetor amperomtrico: a amostra passa pela superfcie do eletrodo. Assim,
apenas cerca de 1% a 5% do material realmente oxidado (ou reduzido).
63
Desenvolvido para detectar traos (ppb a ppt) de ons, este detetor exige alta
pureza de solventes e reagentes. A gua, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em
sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66) e
sua resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha que
ao sair do sistema Milli-Q a gua passe em coluna com fase mvel C18 para extrao.
64
15. APNDICE 6
Estatstica
15.1. Erro estatstico
Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata -se aqui de dois
tipos de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico.
O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e
minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um
certo nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem
com menor freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual
freqncia. O erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal (
positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente
pelo prprio mtodo de clculo (Seo 6.3; p. 33).
15.2. Avaliao do erro estatstico
Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de
resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com
auxlio da equao
s = [(xi - x )/(n 1)]1/2
(eq. 22)
onde xi um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse
parmetro denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio
padro s pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado
quando n maior que 10. Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em
paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padro (sR):
sR = Kn R
(eq. 23)
onde R a amplitude, ou seja, a diferena entre o valor (resultado analtico) maior e o valor
menor. O valor de Kn obtido da Tabela 15.1.
15.3. Avaliao da exatido
Na realidade, erro de exatido o erro sistemtico, que seria corrigido
pelo prprio mtodo analtico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode
cometer erros operacionais que resultem em erro sistemtico (ex.: uso de solventes
contendo impurezas que interfiram na identificao). O erro sistemtico pode ser avaliado
com auxlio do teste t (de Student), que compara a concentrao real de uma soluo
65
padro, preparada com todo critrio (por exemplo, preparada por um Laboratrio de
Referncia) com a concentrao do padro empregado na calibrao do equipamento. A
equao seguinte aplicada, com auxlio da Tabela 15.2:
Tabela 15.1 - Valores de Kn para clculo de sR.
n
Kn
0,8862
0,5908 0,4857
0,3512 0,3367
10
0,3249
X n
(eq.24)
n-1
90
P (%)
95
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6,314
2,920
2,353
2,132
2,015
1,943
1,895
1,860
1,833
1,812
12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262
2,228
99
63,657
9,925
5,841
4,608
4,032
3,707
3,499
3,355
3,250
3,169
66
s2A
s2B
(eq. 25)
1
161
18,5
10,1
7,7
6,6
6,0
5,6
5,3
5,1
5,0
(n - 1) PARA O MTODO A
3
4
5
6
7
8
216
225
230
234
237
239
19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4
9,9
9,1
9,0
8,9
8,8
8,8
6,6
6,4
6,3
6,2
6,1
6,1
5,4
5,2
5,1
5,0
4,9
4,8
4,8
4,5
4,4
4,3
4,2
4,2
4,4
4,1
4,0
3,9
3,6
3,7
4,1
3,8
3,7
3,6
3,5
3,4
3,9
3,6
3,5
3,4
3,3
3,2
3,7
3,5
3,3
3,2
3,1
3,1
2
200
19
8,6
6,9
5,8
5,1
4,7
4,5
4,3
4,1
9
241
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
10
242
19,4
8,8
6,0
4,8
4,1
3,6
3,3
3,1
3,0
t.s
(eq. 26)
L = 100/
(eq. 27)
Os dados so organizados no Quadro abaixo (os valores so exemplo fictcio), para facilitar
a interpretao. Na ltima coluna indicada a diferena entre o valor de L atual e o da linha
anterior. No momento em que a diferena (vale dizer, a diminuio na disperso dos
valores, ou ainda o aumento na preciso) fica desprezvel, a critrio do analista, este adota o
nmero anterior como sendo o nmero ideal de repeties.
amostra A: = 1%
L
Dif.
2
3
4
5
6
67
0,260
0,072
0,046
0,036
0,030
26,0
7,2
4,6
3,6
3,0
18,8
2,6
1,0
0,6
Re = X + R/2
Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao
estatstica completa, emprega-se a relao:
Re X t.Kn.
R
n
(eq. 28)
Ponto no
1
x.y
x2
y2
x1
y1
x1.y1
x12
y12
2
...
...
...
n
Totais
x2
...
...
...
xn
x
68
y2
...
...
...
yn
y
x2.y2
...
...
...
xn.yn
x.y
x22
...
...
...
xn2
x2
y22
...
...
...
yn2
y2